CN114958618A - 一种提高饲用冬虫夏草发酵菌体粉制备稳定性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种提高饲用冬虫夏草发酵菌体粉制备稳定性的方法，该方法包括试管斜面菌种培养、三角瓶液体种子培养、液体种子罐培养、发酵罐发酵培养、菌丝体固液分离、菌丝体干燥。本发明通过在发酵培养基中初始控制pH、碳酸钙的添加量，液体种子接种量、发酵温度及周期等培养方法能提高菌丝体的生理稳定性，促进菌丝体的生长及腺苷的合成，有效的预防后期菌丝粉制备过程中的功效成分流失。同时在发酵完成后调整pH值、在发酵液中添加玉米芯粉，控制板框压滤的温度，采用闪蒸干燥方法，控制进风和出风温度。可使制备过程中腺苷损失率在1%以下，易于工业化大规模生产，降低生产成本，适于在畜牧养殖业中的推广及应用。

Description

一种提高饲用冬虫夏草发酵菌体粉制备稳定性的方法

技术领域

本发明属于畜牧养殖技术领域，具体涉及一种提高饲用冬虫夏草发酵菌体粉制备稳定性的方法。

背景技术

我国是畜禽、水产养殖大国，也是兽用抗菌药物生产和使用大国，兽用抗菌药物在防治动物疾病、提高养殖效益、保障畜禽水产品有效供给中，发挥了重要的作用。但是，兽用抗菌药物市场秩序不规范、养殖环节科学用药意识不强，国家动物源细菌耐药性风险评估和防控体系薄弱等多方面因素作用下，细菌耐药形势日趋严峻，动物源细菌耐药率持续上升，抗菌药物残留超标风险加剧，不仅严重影响了动物食品安全，而且给人类健康造成了巨大的威胁。2017年6月22日，农业农村部印发了关于《全国遏制动物源细菌耐药行动计划（2017-2020年）》，该计划将兽用抗菌药物规范化、减量化使用作为行动目标，并提出将推动促生长抗菌药物的逐步退出。2019年7月9日，农业农村部第194号公告中，正式发布了药物饲料添加剂的退出计划和相关管理政策，公告指出：自2020年1月1日起，退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂及品种，自2020年7月1日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料。因此，研发安全、高效的新型抗生素替代物用于畜牧业生产是大势所趋并迫在眉睫。寻找合适的饲用抗生素替代品一直是研究的热点，具有深远的意义和非常广阔的应用前景。

近年来，饲用抗生素替代产品在市场上层出不穷，主要包括酸化剂、酶制剂、微生态制剂、寡糖、抗菌肽、中药及植物提取物等产品。其中，中药及其植物提取物属于天然的活性物质，中药兼具营养和药物的双重作用，具有无抗药性、功能多样性、经济实用等特点，是目前临床上应用最广的抗生素替代产品。冬虫夏草是我国传统名贵中药，具有很高的药用价值和营养价值。现代药理研究表明：虫草含有核苷、虫草素、虫草酸、虫草多糖、甾醇等多种生物活性物质；具有多种显著的生理功能，具有增强免疫力、调节内分泌、抗疲劳、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗肿瘤、抗缺氧、镇静、降血糖、保护肝肾及呼吸系统等多种生理功能。由于野生虫草的稀缺性，人们将目光转向了人工发酵培养的虫草菌丝体。现代药理学证明，发酵培养的虫草菌丝体与野生虫草有效成分非常类似，具有相似的药理作用。由于发酵条件易控制，成本相对较低等优势，利用发酵方法进行工业化生产虫草菌丝体，已成为解决当前虫草资源匮乏的重要途径之一。但由于目前用于医药工业、保健品生产的虫草菌种及发酵工艺存在菌丝体生理状态不稳定，过滤困难，得率低，其主要活性物质腺苷、虫草多糖等制备过程中损失较大。有时会导致整罐报废，同时生产周期长，生产成本高，产品难以在畜禽养殖业应用及推广。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种提高饲用冬虫夏草发酵菌体粉制备稳定性的方法的技术方案。

本发明通过以下技术方案加以实现：

一种提高饲用冬虫夏草发酵菌体粉制备稳定性的方法，该方法包括依次进行的试管斜面菌种培养、三角瓶液体种子培养、液体种子罐培养、发酵罐发酵培养、菌丝体固液分离、菌丝体干燥，

其中，试管斜面菌种培养具体步骤为：配制斜面种子培养基，将配制好斜面种子培养基于115℃灭菌20分钟，取出试管摆斜面，冷却后，无菌环境下接入蝙蝠蛾拟青霉菌种(Paecilomyces Hepialid)，置于22℃恒温培养培养96小时，斜面种子培养基配方为：马铃薯20%、葡萄糖2.0 %、KH₂PO₄0.2%、MgSO₄ 0.1%，琼脂2%，余量水；

三角瓶液体种子培养具体步骤为：配制液体种子培养基，将配制好的液体种子培养基装入三角瓶中后于115℃灭菌20分钟，冷却至30℃以下，无菌环境下用无菌水将蝙蝠蛾拟青霉固体斜面上的菌丝体洗入液体种子培养基中，置于恒温振荡培养箱22℃培养60小时，

三角瓶液体种子培养基配方为：葡萄糖1-3%，蛋白胨0.3-0.7%，麸皮浸出液4-6%、KH₂PO₄ 0.5-1.5%、MgSO₄ 0.01-0.03%，余量水；

液体种子罐培养具体步骤为：配制液体种子罐培养基，将配制好的液体种子罐培养基于121℃灭菌25分钟，装液量为种子罐体积的70%，无菌操作下接入蝙蝠蛾拟青霉三角瓶液体菌种，接种量为5％，罐压0.03Mpa，通气量为0.8 VVM，22℃培养50小时，

液体种子罐培养基配方为：葡萄糖1-3%，蛋白胨0.3-0.7%，酵母浸出粉0.6-0.7%，KH₂PO₄ 0.05-0.15%、MgSO₄ 0.01-0.03%、泡敌0.01%，余量水；

发酵罐发酵培养具体步骤为：配制发酵培养基，装液量为发酵罐体积的70%，121℃灭菌25分钟，通过压力差将培养好的蝙蝠蛾拟青霉种子罐液体菌种接种到发酵培养基上，接种量为2-5%，发酵过程中罐压0.03Mpa，通气量为1.0 VVM，15-25℃发酵50-66小时结束发酵，调整pH值为3.5，并在发酵液中添加1.5%玉米芯粉，

发酵罐发酵培养基配方为：豆粕粉1-3%，蔗糖3-5%，蛋白胨0.2-0.8%，酵母浸出粉0.3-0.7%，KH₂PO₄ 0.1-0.2%、MgSO₄ 0.04-0.06%、碳酸钙 0.4-0.7%，豆油0.04-0.07%、泡敌0.01%，pH5-6；

菌丝体固液分离具体步骤为将发酵好的发酵液通过泵打入板框压滤机，压滤后收集菌丝，板框压滤机房环境温度控制在22℃，板框内温度不超过25℃；

菌丝体干燥具体步骤为：采用闪蒸干燥工艺，闪蒸进风口正压800Pa，出风口负压3200Pa，进风温度180℃，出风温度控制在55℃，样品含水量在5%以下，腺苷损失率在0.8-1.0%；

或采用冷冻干燥-50℃下预冷冻5小时后，在真空冷冻干燥机放置25小时，真空度为40 Pa以下，温度为25℃以下，样品含水量在5%以下，样品中腺苷损失在0.1%以下。

进一步地，马铃薯为去皮，煮沸0.5小时，取滤液。

进一步地，三角瓶液体种子培养基配方为：葡萄糖2.0%，蛋白胨0.5％，麸皮浸出液5.0％、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄ 0.02%，余量水。

进一步地，液体种子罐培养基配方为：葡萄糖2.0%，蛋白胨0.5%，酵母浸出粉0.5%，KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄ 0.02%、泡敌0.01%，余量水。

进一步地，蝙蝠蛾拟青霉种子罐液体菌种接种到发酵培养基上的接种量为3%，发酵温度20℃，发酵时间56小时。

进一步地，发酵罐发酵培养基配方为：豆粕粉2.0%，蔗糖4.0%，蛋白胨0.5%，酵母浸出粉0.5%，KH₂PO₄ 0.15%、MgSO₄ 0.05%、碳酸钙 0.6%，豆油0.05%、泡敌0.01%，pH 5.5。

本发明通过对现有技术进行改进，确定发酵培养基初始pH值，以及在发酵培养基中添加合适量的碳酸钙，确定种子接种量及控制发酵温度、发酵时间等，使得最终制得的菌丝体粗壮、染色深、易过滤，促进菌丝体的生长及腺苷的合成，有效的预防后期菌丝粉中的功效成分流失。同时在发酵完成后调整pH值为3.5，在发酵液中添加1.5%玉米芯粉，控制板框压滤的温度不超过25℃，采用闪蒸干燥方法，进风温度180℃，出风温度控制在55℃。可使制备过程中腺苷损失率在1%以下，易于工业化大规模生产，降低生产成本，适于在畜牧养殖业中的推广及应用。

附图说明

图1为腺苷标准品HPLC图谱；

图2为腺苷标准曲线；

图3为菌体提取液HPLC图；

图4为超声时间对腺苷溶出的影响；

图5为温度对菌体生长及腺苷合成的影响；

图6为温度对菌丝形态的影响（A：20℃，B：27.5℃）；

图7为发酵时间对腺苷合成及生物量影响；

图8为不同发酵时间菌丝状态（A：66小时，B：78小时）；

图9为初始pH对腺苷合成及生物量影响；

图10为不同初始pH菌丝状态（A：pH 自然，B：pH8）；

图11为接种量对腺苷合成及生物量影响；

图12为不同接种量菌丝状态（A：接种量3%，B：接种量11%）；

图13为碳酸钙对腺苷合成及生物量影响；

图14为不同碳酸钙浓度的菌丝状态（A：0.6%，B：1.2%）；

图15为不同温度及时间对发酵样品中的腺苷影响（A：菌丝体，B：发酵滤液）；

图16为不同温度放置3小时的发酵液（A：25℃，B：35℃）；

图17为不同pH对发酵菌丝体中的腺苷及腺苷损失率影响；

图18为玉米芯添加量对发酵样品中腺苷损失率影响；

图19为干燥方式对发酵菌体粉中腺苷的稳定性影响。

具体实施方式

以下结合说明书附图及具体实施例对本发明做进一步详细描述，以便更好地理解本技术方案。

实施例1

蝙蝠蛾拟青霉接种前首先在试管斜面上进行活化，22℃培养96小时，培养使用的斜面培养基组成及灭菌方式为：培养基成分马铃薯20%（去皮，煮沸0.5小时，取滤液）、葡萄糖 2.0%、KH₂PO₄ 0.2%、MgSO₄ 0.1%，琼脂2.0 %，pH值自然，115℃高压灭菌20分钟；然后用无菌水洗下菌体细胞接入含100 mL种子培养液的三角瓶（500mL）中，进行种子培养（22℃培养60小时），培养基组成及灭菌方式为葡萄糖2.0%，蛋白胨0.5%，麸皮浸出液5.0%、KH₂PO₄0.1%、MgSO₄ 0.02%，pH自然，115℃高压灭菌20分钟，种子生长完成后，镜检无杂菌备用。配制21L种子罐培养基，培养基配方为葡萄糖2.0%，蛋白胨0.5%，酵母浸出粉0.5%，KH₂PO₄0.1%、MgSO₄ 0.02%、泡敌0.01%，pH自然；装入到30L种子罐中，121℃高压灭菌25分钟，接种5%已培养好的三角瓶种子。罐压0.03Mpa，通气量为0.8 VVM，搅拌转速300转/分钟。22℃培养50小时，镜检无杂菌备用；配制发酵培养基，发酵培养基配方为：豆粕粉2.0%，蔗糖4.0%，蛋白胨0.5％，碳酸钙 0.6%，酵母浸出粉0.5％，KH₂PO₄ 0.15%、MgSO₄ 0.05%、豆油0.05%、泡敌0.01%，pH自然（pH在5.5左右）。装入1000L的发酵罐，装量为发酵罐体积的70%，121℃灭菌25分钟，通过压力差将培养好的种子罐液体菌种，接种量为3%，发酵过程中罐压0.03Mpa，搅拌转速180转/分钟，通气量为1.0VVM，20℃发酵56小时结束发酵。

发酵结束后，调整pH值为3.5左右，并在发酵液中添加1.5%玉米芯粉搅拌30分钟，使其与发酵菌丝体充分结合，然后通过泵打入板框压滤机，压滤后收集菌丝，板框压滤机房环境温度控制在22℃以下，板框内温度不超过25℃。菌丝体从滤布刮下，滤液放弃，收集至干净容器，采用闪蒸干燥，闪蒸进风口正压800Pa，出风口负压3200Pa，进风温度控制在180℃，出风温度控制在55℃。样品含水量在5%以下，腺苷损失率在1%以下。

实施例2

蝙蝠蛾拟青霉接种前首先在试管斜面上进行活化，22℃培养96小时，培养使用的斜面培养基组成及灭菌方式为：培养基成分马铃薯20%（去皮，煮沸0.5小时，取滤液）、葡萄糖 2.0%、KH₂PO₄ 0.2%、MgSO₄ 0.1%，琼脂2.0%，pH值自然，，115℃高压灭菌20分钟；然后用无菌水洗下菌体细胞接入含100 mL种子培养液的三角瓶（500mL）中，进行种子培养（22℃培养60小时），培养基组成及灭菌方式为葡萄糖2.0%，蛋白胨0.5%，麸皮浸出液5.0%、KH₂PO₄0.1%、MgSO₄ 0.02%，pH自然，115℃高压灭菌20分钟，种子生长完成后，镜检无杂菌备用。配制21L种子罐培养基，培养基配方为葡萄糖2.0%，蛋白胨0.5%，酵母浸出粉0.5%，KH₂PO₄0.1%、MgSO₄ 0.02%、泡敌0.01%，pH自然；装入到30L种子罐中，121℃高压灭菌25分钟，接种5%已培养好的三角瓶种子。罐压0.03Mpa，通气量为0.8 VVM，搅拌转速 300转/分钟。22℃培养50小时，镜检无杂菌备用；配制发酵培养基，发酵培养基配方为：豆粕粉2.0%，蔗糖4.0%，蛋白胨0.5%，酵母浸出粉0.5％，KH₂PO₄ 0.15%、MgSO₄ 0.05%、豆油0.05%、碳酸钙 0.6%、泡敌0.01%，pH自然（pH在5-6范围）。装入1000L的发酵罐，装量为发酵罐体积的70%，121℃灭菌25分钟，通过压力差将培养好的种子罐液体菌种，接种量为3%，发酵过程中罐压0.03Mpa，搅拌转速180转/分钟，通气量为1.0VVM，20℃发酵56小时结束发酵。

发酵结束后，调整pH值为3.5以下，并在发酵液中添加1.5%玉米芯粉搅拌30分钟，使其与发酵菌丝体充分结合，然后通过泵打入板框压滤机，压滤后收集菌丝，板框压滤机房环境温度控制在22℃以下，板框内温度不超过25℃。菌丝体从滤布刮下，滤液放弃，收集至干净容器，在-50℃下预冷冻5小时以上，在真空冷冻干燥机放置25小时，真空度为40 Pa以下，温度为25℃以下，样品含水量在3%以下，样品中腺苷基本无损失。

试验例1：培养条件对菌丝生长、腺苷合成及菌丝生理状态的影响

1. 菌丝中腺苷测定方法

腺苷标准曲线绘制：准确称取腺苷标准品，用去离水溶解并稀释成一系列浓度梯度的样品，采用Waters e2695高效液相色谱仪进行分析，色谱柱：C₁₈（250mm*4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-水（5:95，V:V）；流速：1.0mL/min；进样量：20μL；柱温：30℃；检测波长：260nm的条件下进样，绘制并拟合得到腺苷标准曲线，腺苷标准品HPLC图谱见图1，标准曲线见图2。

以进样量（μg/mL）为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程：Y=31100X+985，R²为0.9999，线性关系良好。

菌体中腺苷测定样品处理方法：精确称取样品0.5克，加40mL水悬浮后，分别超声提取60到240分钟，0.22μm过滤制备进样液，高效液相色谱仪进样，测定并计算腺苷含量。菌体提取液HPLC图见图3，超声时间对腺苷溶出的影响见图4。

由图3可知，在现有的HPLC条件下，菌体样品中腺苷能较好的分开，出峰时间在8.11分钟左右，菌体样品中前处理通过超声辅助能较好的溶出腺苷，其随着超声时间延长而溶出增加，在180分钟达到最高，因此样品前处理超声时间选定为180分钟。

2. 发酵温度对菌体生长、腺苷合成及菌丝生理状态的影响

分别以15-27.5℃摇瓶培养66小时，测定发酵的生物量及腺苷合成量，结果见图5，菌丝形态见图6。

温度直接影响微生物的生长繁殖和产物合成，只有在合适的温度条件下，才能保证微生物的生长与代谢，从图5可知，在15-27.5℃范围内，蝙蝠蛾拟青霉均能生长，温度在22.5℃范围内，生物量随着温度升高而不断增加，随后生物量开始下降，超过25℃后菌体开始自溶，生物量大幅下降。菌丝中腺苷合成的最佳温度为20℃，超过该温度后开始下降，27.5℃时其菌丝内腺苷含量下降幅度极大。从图6可以看出，培养温度在20℃时，菌丝粗壮，菌丝生理状态稳定，着色深，菌丝易过虑。而在27.5℃，菌体生长受到明显的抑制，菌丝着色浅，菌丝边缘模糊，部分菌丝呈竹节状彭大，生理状态不稳定，菌丝开始自溶，难以过滤，滤液有大量泡沫。

3. 发酵时间对菌体生长、腺苷合成及菌丝生理状态的影响

摇瓶培养78小时，隔时测定发酵的生物量及腺苷合成量。结果见图7，菌丝形态见图8。

由图7可知，在本研究的培养条件下，蝙蝠蛾拟青霉接种后经过30小时的延迟期后，开始进入对数生长期，至50小时左右达到稳定性，在72小时后进入衰亡期，菌丝中腺苷在前45小时内合成速度较快，随后进入缓慢增长期，至66小时达到最高，后期因菌丝自溶而快速下降。在不同时间内菌丝生理状态也表现出明显的不同，由图7可以看出，在培养66小时菌丝粗壮，着色深，而在78小时，菌丝细长，边缘模糊，着色较浅，菌丝体不易过滤。

4. 初始pH对菌体生长、腺苷合成及菌丝生理状态的影响

将发酵培养基分别调整在3-8范围内，以培养基的自然pH为对照（约为5.5），发酵66小时后，测定发酵的生物量及菌丝中腺苷合成量。结果见图9，菌丝形态见图10。

由图9可知，蝙蝠蛾拟青霉在初始pH在3-8范围均能生长，表明其能适应较宽的pH环境，但初始pH为5-6范围内生长更好。菌体腺苷合成在pH为4-6的范围差异相对较小，在pH为5-6范围时合成量最高，与其生长相一致，但初始pH低于4以下，腺苷的合成下降明显。从菌丝形态看（图10），初始pH值自然条件下（pH约为5.5），菌丝粗壮，染色深。而初始pH为8时的菌丝边缘模糊，着色较浅，不易过滤。

5. 接种量对菌体生长、腺苷合成及菌丝生理状态的影响

三角瓶摇瓶种子分别按发酵培养基的体积接种1，3，5，7，9，11%，测定发酵的生物量及菌丝中腺苷合成量。结果见图11，菌丝形态见图12。

由图11可知，随着接种量的增加，菌丝的生物量不断增加。但超过5%的接种量后生物量略有所下降，接种量超过9%下降较为明显，表明适量的增加接种量有利于发酵生物量的提高，但接种量超过3%后，菌体内腺苷合成量明显减少，可能因为接种量过多时，菌体生长过于迅速，生物量增大，使发酵液的物理状态发生改变，黏度增加，影响发酵基质传氧与传质，造成溶解氧的不足，从而使腺苷的产量和菌丝生物量发生下降。由图12显示，不同接种量菌丝状态也有显著的差异，在3%接种量的条件下，菌丝粗壮，染色深。而在11%接种量时的菌丝边缘模糊，着色较浅，且菌丝中有大量的液泡。

6. 碳酸钙对菌体生长、腺苷合成及菌丝生理状态的影响

在发酵培养基中分别添加0.3，0.6，0.9，1.2%（W/V）的碳酸钙，以未加碳酸钙为对照，测定发酵的生物量及菌丝中腺苷合成量。结果见图13，菌丝形态见图14。

从图13看出，随着碳酸钙的添加，菌体生物量及腺苷合成量不断增加，当发酵液中碳酸钙的浓度达到为0.6%（W/V）时发酵液的菌体生物量及腺苷合成均达到最高。表明碳酸钙对菌体生长及腺苷的合成有促进作用，但添加量过高则会影响发酵菌体的生长发育及代谢产物的合成。由图14显示，碳酸钙添加量为0.6%，菌丝粗壮，短小，染色深，菌丝周围能见小量的碳酸钙晶体，菌丝过滤快。而碳酸钙添加量为1.2%时，菌丝细长，边缘模糊，着色较浅，在菌丝周围能见大量碳酸钙晶体。

实验例2：制备工艺对菌体中腺苷的稳定性影响

1. 温度对菌丝中腺苷的稳定性影响

发酵结束后，将发酵液分别置于25，35，45，55℃条件下3小时，每隔1小时发酵液过虑后分别收集滤液及菌体，滤液直接用高效液相色主谱法测定腺苷含量，菌体干燥后再加水超声提取后再测定腺苷含量，其结果见图15。

由图15可知，温度对菌丝体的稳定性影响较大，25℃时，菌丝中的腺苷下降趋势较慢，3小时后菌丝中腺苷的损失率为9.9%，而在35℃时，3小时后菌丝中腺苷的损失率为67.3%，55℃对腺苷的损失更大，其1小时损失率就达到了82.5%，对菌丝过虑液中的腺苷分析显示，随着温度升高及时间延长，腺苷的含量大幅上升，与菌丝体中的腺苷含量的变化有明显对应关系。此外，从图16也可以看出不同温度处理下的发酵液也有明显差异，25℃条件下放置3小时，发酵液外观没有明显改变，发酵液呈乳白色，有清香，发酵液易过滤，而35℃条件下放置3小时的发酵液外观色泽变深、变稀，发酵液难过滤。其原因可能是由于温度的升高，导致菌丝生理状改变，菌体开始自溶，菌丝体内的腺苷流向菌丝体外。因此，菌丝体的生理状态对后处理加工过程的活性物质含量有重的影响，维持菌丝体健康的生理状态，能保留后续制品中生物活性的含量。

2. pH对菌丝中腺苷的稳定性影响

发酵结束后，将发酵液pH调整至2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5等条件下静置3小时后过滤后收集菌体，菌体干燥后再加水超声提取后再测定腺苷含量，其结果见图17。

由图17可知，发酵液的pH对菌丝体的稳定性也有一定的影响，但与温度相比，影响相对较小，在pH为3.5时其菌丝体的状态最稳定，腺苷的损失率最小。pH降为2.5时，其损失相对较大，超过了15%。而pH增大后，其菌丝的稳定性也明显下降，当pH为8.5时处3小时后，其菌丝体中的腺苷损失率达到24%，为了保持菌丝的稳定性，发酵结束后可以将pH调整到3.5左右。

3. 玉米芯对发酵菌体粉中腺苷的稳定性影响

发酵结束后，将发酵液中添加0.5-2.0%（W/V）的玉米芯粉充分搅拌，使菌丝体与玉米芯充分混合，3小时后过滤收集菌体，干燥后再加水超声提取后再测定腺苷含量，其结果见图18。

玉米芯的组织比较均匀，内部呈网状结构，具有较强的吸附性。同时无毒无害，可以作为动物饲料的配料。由图18可以看出，添加1.5%以上的玉米芯粉可以将腺苷的损失率减少到0.3%以下。其主要原因可能与玉米芯的结构有关，一方面玉米芯可以作为菌丝体的支撑物，稳定菌丝体，同时可以很好的吸附发酵液中的腺苷等物质，减少腺苷的损失，另一方面玉米芯的加入对发酵液的过滤有很好的促进作用，可以大大缩短过滤的时间，从而减少菌丝体的自溶机率。

4. 干燥方式对发酵菌体粉中腺苷的稳定性影响

发酵结束后，调整pH值为3.5左右，并在发酵液中添加1.5%玉米芯粉搅拌30分钟，使其与发酵菌丝体充分结合，然后通过泵打入板框压滤机，压滤后收集菌丝，板框压滤机房环境温度控制在22℃以下，板框内温度不超过25℃。菌丝体从滤布刮下，滤液放弃，收集至干净容器，取一部分样品在-50℃下预冷冻5小时以上，在真空冷冻干燥机放置25小时，真空度为40 Pa以下，温度为25℃以下。别取一部分采用闪蒸干燥，闪蒸进风口正压800Pa，出风口负压3200Pa，出风温度分别控制在55、65、75、85℃。其结果见图19。

闪蒸干燥是一种将固态物料搅拌分散采用高速热气流使之流态化进行干燥的一种气流干燥技术，具有快速、高效、可靠等特点，已广泛应用于饲料、食品、医药等行业。与热风循环干燥相比，闪蒸干燥器提高了物料的干燥速率和干燥物料粒度的均匀性。目前冬虫夏草发酵菌丝粉主要采用真空干燥方法制备，而闪蒸干燥用于冬虫夏草发酵菌丝的报道较少。出风温度是影响闪蒸干燥的重要因素之一，温度过高使虫草菌丝粉易发生褐变，产生焦糊味，也会破坏菌丝中的腺苷等生物功能组分，温度过低将延长干燥时间，降低干燥效率。在低于55 ℃的出风温度，干燥样品结块严重，易贴壁，水分含量高，干燥不充分。而高于65℃干燥时，菌体粉品质差，呈棕黄色，腺苷损失率较高（图19）。与闪蒸干燥方法相比，冷冻干燥对虫草菌丝中腺苷等活性物质几乎无损失。色泽呈乳白色，产品品质更高，但由于冷冻干燥设备贵，运行成本高，对于饲用冬虫夏草发酵菌丝粉工业化制备难以适用。

Claims (6)

1.一种提高饲用冬虫夏草发酵菌体粉制备稳定性的方法，该方法包括依次进行的试管斜面菌种培养、三角瓶液体种子培养、液体种子罐培养、发酵罐发酵培养、菌丝体固液分离、菌丝体干燥，其特征在于：

试管斜面菌种培养具体步骤为：配制斜面种子培养基，将配制好斜面种子培养基于115℃灭菌20分钟，取出试管摆斜面，冷却后，无菌环境下接入蝙蝠蛾拟青霉菌种(Paecilomyces Hepialid)，置于22℃恒温培养培养96小时，

斜面种子培养基配方为：马铃薯20%、葡萄糖2.0 %、KH₂PO₄0.2%、MgSO₄ 0.1%，琼脂2%，余量水；

三角瓶液体种子培养具体步骤为：配制液体种子培养基，将配制好的液体种子培养基装入三角瓶中后于115℃灭菌20分钟，冷却至30℃以下，无菌环境下用无菌水将蝙蝠蛾拟青霉固体斜面上的菌丝体洗入液体种子培养基中，置于恒温振荡培养箱22℃培养60小时，

三角瓶液体种子培养基配方为：葡萄糖1-3%，蛋白胨0.3-0.7％，麸皮浸出液4-6％、KH₂PO₄ 0.5-1.5%、MgSO₄ 0.01-0.03%，余量水；

液体种子罐培养具体步骤为：配制液体种子罐培养基，将配制好的液体种子罐培养基于121℃灭菌25分钟，装液量为种子罐体积的70%，无菌操作下接入蝙蝠蛾拟青霉三角瓶液体菌种，接种量为5%，罐压0.03Mpa，通气量为0.8 VVM，22℃培养50小时，

液体种子罐培养基配方为：葡萄糖1-3%，蛋白胨0.3-0.7%，酵母浸出粉0.6-0.7%，KH₂PO₄0.05-0.15%、MgSO₄0.01-0.03%、泡敌0.01%，余量水；

发酵罐发酵培养具体步骤为：配制发酵培养基，装液量为发酵罐体积的70%，121℃灭菌25分钟，通过压力差将培养好的蝙蝠蛾拟青霉种子罐液体菌种接种到发酵培养基上，接种量为2-5%，发酵过程中罐压0.03Mpa，通气量为1.0 VVM，15-25℃发酵50-66小时结束发酵，调整pH值为3.5，并在发酵液中添加1.5%玉米芯粉；

发酵罐发酵培养基配方为：豆粕粉1-3%，蔗糖3-5%，蛋白胨0.2-0.8%，酵母浸出粉0.3-0.7%，KH₂PO₄0.1-0.2%、MgSO₄0.04-0.06%、碳酸钙0.4-0.7%，豆油0.04-0.07%、泡敌0.01%，pH5-6；

菌丝体固液分离具体步骤为将发酵好的发酵液通过泵打入板框压滤机，压滤后收集菌丝，板框压滤机房环境温度控制在22℃，板框内温度不超过25℃；

菌丝体干燥具体步骤为：采用闪蒸干燥工艺，闪蒸进风口正压800Pa，出风口负压3200Pa，进风温度180℃，出风温度控制在55℃，样品含水量在5%以下，腺苷损失率在0.8-1.0%。

2.如权利要求1所述的一种提高饲用冬虫夏草发酵菌体粉制备稳定性的方法，其特征在于马铃薯为去皮，煮沸0.5小时，取滤液，斜面种子培养基配方为：马铃薯20%、葡萄糖2.0%、KH₂PO₄ 0.2%、MgSO₄ 0.1%，琼脂2.0%，余量水。

3.如权利要求1所述的一种提高饲用冬虫夏草发酵菌体粉制备稳定性的方法，其特征在于三角瓶液体种子培养基配方为：葡萄糖2.0%，蛋白胨0.5％，麸皮浸出液5.0％、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄ 0.02%，余量水。

4.如权利要求1所述的一种提高饲用冬虫夏草发酵菌体粉制备稳定性的方法，其特征在于液体种子罐培养基配方为：葡萄糖2.0%，蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.5%，KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄ 0.02%、泡敌0.01%，余量水。

5.如权利要求1所述的一种提高饲用冬虫夏草发酵菌体粉制备稳定性的方法，其特征在于蝙蝠蛾拟青霉种子罐液体菌种接种到发酵培养基上的接种量为3%，发酵温度20℃，发酵时间56小时。

6.如权利要求1所述的一种提高饲用冬虫夏草发酵菌体粉制备稳定性的方法，其特征在于发酵罐发酵培养基配方为：豆粕粉2.0%，蔗糖4.0%，蛋白胨0.5%，酵母浸出粉0.5%，KH₂PO₄ 0.15%、MgSO₄ 0.05%、碳酸钙 0.6%，豆油0.05%、泡敌0.01%，pH 5.5。

Images