CN112538436A - 一种地顶孢霉培养物的制备方法 - Google Patents

一种地顶孢霉培养物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种地顶孢霉培养物的制备方法，包括以下步骤：S1.将地顶孢霉菌种接种于固态培养基上，培养得到一级菌种；S2.将步骤S1所得一级菌种接种于摇瓶中的种子培养基，培养得到二级种子液；S3.将步骤S2所得二级种子液接种于发酵培养基中，发酵得到三级种子液；S4.将步骤S3所得三级种子液接种于液体发酵培养基中，发酵得到发酵液；S5.将复合酶液接种于步骤S4所得发酵液中，酶解得到酶解液；S6.将保护剂加入步骤S5所得酶解液中，混合均匀得到混合液，将混合液喷雾干燥得到地顶孢霉培养物。本发明制备出的地顶孢霉培养物的得率和有效成分含量较高，应用于饲料添加剂时的效果较好。

Description

一种地顶孢霉培养物的制备方法
技术领域
本发明涉及一种地顶孢霉培养物的制备方法。
背景技术
我国是全球最大的动物饲料和畜产品生产国，饲料占全球的17.5％(世界第一)，但制约我国由生产大国向强国发展的主要瓶颈是优质、安全和生态动物饲料和畜产品的生产，而饲用抗生素的使用是当前制约这一瓶颈突破的关键。饲用抗生素的禁用已经在全球范围内成为行业和社会共识，我国已于今年正式实施饲料全面禁抗。
在饲料全面禁抗的大背景下，寻找有效的替代技术成为了当务之急。以欧盟为代表的发达国家，长期开展了益生菌、酶制剂、酸化剂、植物提取物及功能性氨基酸等为核心的间接替抗综合技术研究。研究发现，地顶孢霉培养物中含有大量虫草素、虫草多糖和氨基酸等与古尼虫草相似的功能性成分，能发挥促生长、调免疫和抗应激等药理功效。近年来，地顶孢霉培养物替代抗生素作为动物饲料添加剂和免疫增强剂在家禽、家畜养殖生产中的研究与应用报道逐渐增多。地顶孢霉培养物的产业化将推动我国饲料产业从“减抗”-“替抗”-“无抗”的技术进步，为实现我国饲料的“禁抗”提供重要技术支撑。
目前地顶孢霉培养物的产业化生产存在成本高、操作繁琐、有效成分得率低等问题，大大限制了其在畜牧养殖业中的应用。发酵后处理采用简单的过滤方法除去菌丝体往往会影响产品中虫草菌有效成分的含量,且发酵废水属于高浓度有机废液，含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素、糖类及多种微量元素，具有高浓度、高悬浮物、高粘度、难降解的特点，难以采用喷雾干燥等传统干燥方式进行处理以实现资源化回收利用，一般采用高温转筒造粒机制作生物复合肥，或者作为工业废水采取末端治理技术进行污水处理，甚至直接排入自然水域中，造成了严重的环境危害、资源浪费和生产成本的提高。
申请号为CN201410024600.1的中国发明公开了一种饲料添加剂“地顶孢霉培养物”的生产方法，该生产方法通过对地顶孢霉菌种生长特性的研究，将地顶孢霉培养物生产工艺进行了改进，改进后将地顶孢霉培养物生产周期由原先的11～15天缩短至5天，主要包括“液体菌种发酵”和“固体发酵”。该专利存在的问题是其发酵后仅采用了简单的烘干、分散、过筛的处理，产物得率和有效成分含量均不高，应用于饲料添加剂时的效果不理想。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种地顶孢霉培养物的制备方法，制备出的地顶孢霉培养物的得率和有效成分含量较高，应用于饲料添加剂时的效果较好。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种地顶孢霉培养物的制备方法，包括以下步骤：
S1.将地顶孢霉菌种接种于固态培养基上，于15-28℃培养4-6天，待菌丝长满平板并产孢即可，得到一级菌种；
S2.将步骤S1所得一级菌种接种于摇瓶中的种子培养基，15-28℃、100-200转/分培养3-5天得到二级种子液；
S3.将步骤S2所得二级种子液以10-30％的接种量接种于发酵培养基中，15-28℃发酵5-7天得到三级种子液，发酵过程中pH值为7-8，搅拌转速为100-200转/分，溶氧浓度为20-40％；
S4.将步骤S3所得三级种子液以10-30％的接种量接种于发酵罐的液体发酵培养基中，15-28℃发酵2-3天得到发酵液，发酵过程中pH值为6-7，搅拌转速为100-150转/分，溶氧浓度为20-40％，流量为20-40cm3/h，发酵罐内压力为0.04-0.06MPa；
S5.将复合酶液接种于步骤S4所得发酵液中，25-70℃、pH值为3-7条件下酶解0.5-2小时得到酶解液；
S6.将保护剂加入步骤S5所得酶解液中，混合均匀得到混合液，将混合液喷雾干燥得到地顶孢霉培养物。
进一步地，本发明所述步骤S1中，固体培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.03％，CaCO3 0.05％，ZnSO4 0.01％，乙酸钠0.15％，琼脂粉2％，其余为水；固体培养基的pH值为6.5。
进一步地，本发明所述步骤S2中，种子培养基的装液量为摇瓶体积的10-30％，种子培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.03％，CaCO3 0.05％，ZnSO4 0.01％，乙酸钠0.15％，其余为水；种子培养基的pH值为6.5。
进一步地，本发明所述步骤S3中，发酵培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.03％，CaCO3 0.05％，ZnSO4 0.01％，乙酸钠0.15％，其余为水；发酵培养基的pH值为6.5。
进一步地，本发明所述步骤S4中，液体发酵培养基的组成为蔗糖1-3％，大豆糖蜜0.5-1.5％，酵母粉1-2％，大豆蛋白胨1-2％，K2HPO4 0.1-0.3％，MgSO4 0.02-0.04％，CaCO30.04-0.06％，ZnSO4 0.01％，其余为水；液体发酵培养基的pH值为6.5。
进一步地，本发明所述步骤S5中，复合酶液由β-葡聚糖酶、酸性蛋白酶、pH值为5.5的蒸馏水按照1g:1g:10mL的比例混合而成，复合酶液与发酵液的体积比为1:200。
进一步地，本发明所述步骤S6中，保护剂的重量份组成为葡萄糖40份，水溶性淀粉55份，木瓜籽提取物5份；保护剂与酶解液的重量比为1:20，喷雾干燥时的进风温度为120-130℃，进料流量为100-120kg/小时，出风温度为55-65℃。
进一步地，本发明所述的一种地顶孢霉培养物的制备方法，其特征在于：所述木瓜籽提取物的制备步骤为：
将木瓜籽烘干后粉碎得到木瓜籽粉，将木瓜籽粉加入石油醚中超声提取45分钟得到提取液一，将提取液一离心分离10分钟得到上清液一，将上清液一旋蒸浓缩得到木瓜籽粗提物；将木瓜籽粗提物加入无水乙醇中，80℃下水浴搅拌10分钟后静置分层，取上层醇相加入氢氧化钠后80℃下水浴搅拌1小时得到提取液二，将提取液二离心分离10分钟得到上清液二，将上清液二旋蒸浓缩得到木瓜籽提取物。
进一步地，本发明所述木瓜籽提取物的制备步骤中：木瓜籽粉与石油醚的比例为1:17g/mL，超声提取时的超声功率为200W；木瓜籽粗提物、无水乙醇、氢氧化钠的比例为50g:80mL:1g；提取液一、提取液二离心分离时的离心速度均为8000转/分。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明使用的液体发酵培养基的成分简单易获得，其中大豆糖蜜为大豆蛋白产品生产的废弃物，能将发酵总成本降低30％左右，应用本发明培养方法发酵的地顶孢霉在镜下观察时菌体有较多菌丝组成，菌丝较粗,生有成串的孢子，孢子短胖，呈卵形、长卵形至椭圆形,发酵后有特殊香味。
2)本发明采用酶解方法对发酵液中的菌丝体进行破壁溶菌处理，促使菌丝体内的有效成分溶出，其中有效成分虫草素和虫草多糖的含量较传统的未破壁处理能提高35％左右，提高了地顶孢霉培养物的得率，且操作简单，用时较短。
3)本发明破壁溶菌处理后无需过滤和离心处理，直接用保护剂进行喷雾干燥制得粉状的地顶孢霉培养物，酶解后直接包被的处理方式杜绝了发酵物上清液的排放，全程无废弃物排放，环保的同时提高了地顶孢霉培养物的得率，增加了地顶孢霉培养物生物量的溶出，降低了发酵成本，为地顶孢霉的工业化生产和应用推广提供了技术支持；饲喂本发明地顶孢霉培养物能有效提高禽畜的采食量，降低料肉比，减少应激反应和腹泻率。
4)本发明使用的保护剂中添加了木瓜籽提取物，其是由木瓜籽先以石油醚为提取溶剂通过超声提取制得木瓜籽粗提物再经无水乙醇皂化提取得到，该木瓜籽提取物能有效提高地顶孢霉培养物的耐光稳定性，还能进一步降低禽畜的腹泻率。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例及其说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1
按照以下步骤制备地顶孢霉培养物：
S1.将地顶孢霉菌种接种于固态培养基上，于24℃培养5天，待菌丝长满平板并产孢即可，得到一级菌种；固体培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO40.2％，MgSO4 0.03％，CaCO3 0.05％，ZnSO4 0.01％，乙酸钠0.15％，琼脂粉2％，其余为水；固体培养基的pH值为6.5；
S2.将步骤S1所得一级菌种接种于摇瓶中的种子培养基，24℃、160转/分培养4天得到二级种子液；种子培养基的装液量为摇瓶体积的20％，种子培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.03％，CaCO3 0.05％，ZnSO4 0.01％，乙酸钠0.15％，其余为水；种子培养基的pH值为6.5；
S3.将步骤S2所得二级种子液以20％的接种量接种于发酵培养基中，24℃发酵6天得到三级种子液，发酵过程中pH值为7.5，搅拌转速为160转/分，溶氧浓度为20-40％；发酵培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.03％，CaCO30.05％，ZnSO4 0.01％，乙酸钠0.15％，其余为水；发酵培养基的pH值为6.5；
S4.将步骤S3所得三级种子液以20％的接种量接种于发酵罐的液体发酵培养基中，15-28℃发酵2.5天得到发酵液，发酵过程中pH值为6.7，搅拌转速为120转/分，溶氧浓度为20-40％，流量为30cm3/h，发酵罐内压力为0.05MPa；液体发酵培养基的组成为蔗糖2％，大豆糖蜜1％，酵母粉1.5％，大豆蛋白胨1.5％，K2HPO40.2％，MgSO40.03％，CaCO30.05％，ZnSO4 0.01％，其余为水；液体发酵培养基的pH值为6.5；
S5.将复合酶液接种于步骤S4所得发酵液中，50℃、pH值为5条件下酶解1小时得到酶解液；复合酶液由β-葡聚糖酶、酸性蛋白酶、pH值为5.5的蒸馏水按照1g:1g:10mL的比例混合而成，复合酶液与发酵液的体积比为1:200；
S6.将保护剂加入步骤S5所得酶解液中，混合均匀得到混合液，将混合液喷雾干燥得到地顶孢霉培养物；保护剂的重量份组成为葡萄糖40份，水溶性淀粉55份，木瓜籽提取物5份；保护剂与酶解液的重量比为1:20，喷雾干燥时的进风温度为125℃，进料流量为110kg/小时，出风温度为60℃。
其中，步骤S6中木瓜籽提取物的制备步骤为：
将木瓜籽烘干后粉碎得到木瓜籽粉，按照为1:17g/mL的比例将木瓜籽粉加入石油醚中200W超声功率下超声提取45分钟得到提取液一，将提取液一8000转/分离心速度下离心分离10分钟得到上清液一，将上清液一旋蒸浓缩得到木瓜籽粗提物；将木瓜籽粗提物加入无水乙醇中，80℃下水浴搅拌10分钟后静置分层，取上层醇相加入氢氧化钠后80℃下水浴搅拌1小时得到提取液二，木瓜籽粗提物、无水乙醇、氢氧化钠的比例为50g:80mL:1g，将提取液二8000转/分离心速度下离心分离10分钟得到上清液二，将上清液二旋蒸浓缩得到木瓜籽提取物。
实施例2
按照以下步骤制备地顶孢霉培养物：
S1.将地顶孢霉菌种接种于固态培养基上，于15℃培养6天，待菌丝长满平板并产孢即可，得到一级菌种；固体培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO40.2％，MgSO4 0.03％，CaCO3 0.05％，ZnSO4 0.01％，乙酸钠0.15％，琼脂粉2％，其余为水；固体培养基的pH值为6.5；
S2.将步骤S1所得一级菌种接种于摇瓶中的种子培养基，15℃、200转/分培养5天得到二级种子液；种子培养基的装液量为摇瓶体积的10％，种子培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.03％，CaCO3 0.05％，ZnSO4 0.01％，乙酸钠0.15％，其余为水；种子培养基的pH值为6.5；
S3.将步骤S2所得二级种子液以10％的接种量接种于发酵培养基中，15℃发酵7天得到三级种子液，发酵过程中pH值为7，搅拌转速为200转/分，溶氧浓度为20-40％；发酵培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.03％，CaCO30.05％，ZnSO4 0.01％，乙酸钠0.15％，其余为水；发酵培养基的pH值为6.5；
S4.将步骤S3所得三级种子液以10％的接种量接种于发酵罐的液体发酵培养基中，15-28℃发酵3天得到发酵液，发酵过程中pH值为6，搅拌转速为150转/分，溶氧浓度为20-40％，流量为40cm3/h，发酵罐内压力为0.04MPa；液体发酵培养基的组成为蔗糖1％，大豆糖蜜1.5％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO4 0.1％，MgSO4 0.04％，CaCO3 0.04％，ZnSO4 0.01％，其余为水；液体发酵培养基的pH值为6.5；
S5.将复合酶液接种于步骤S4所得发酵液中，25℃、pH值为7条件下酶解2小时得到酶解液；复合酶液由β-葡聚糖酶、酸性蛋白酶、pH值为5.5的蒸馏水按照1g:1g:10mL的比例混合而成，复合酶液与发酵液的体积比为1:200；
S6.将保护剂加入步骤S5所得酶解液中，混合均匀得到混合液，将混合液喷雾干燥得到地顶孢霉培养物；保护剂的重量份组成为葡萄糖40份，水溶性淀粉55份，木瓜籽提取物5份；保护剂与酶解液的重量比为1:20，喷雾干燥时的进风温度为120℃，进料流量为120kg/小时，出风温度为55℃。
其中，步骤S6中木瓜籽提取物的制备步骤与实施例1相同。
实施例3
按照以下步骤制备地顶孢霉培养物：
S1.将地顶孢霉菌种接种于固态培养基上，于28℃培养4天，待菌丝长满平板并产孢即可，得到一级菌种；固体培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO40.2％，MgSO4 0.03％，CaCO3 0.05％，ZnSO4 0.01％，乙酸钠0.15％，琼脂粉2％，其余为水；固体培养基的pH值为6.5；
S2.将步骤S1所得一级菌种接种于摇瓶中的种子培养基，28℃、100转/分培养3天得到二级种子液；种子培养基的装液量为摇瓶体积的30％，种子培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.03％，CaCO3 0.05％，ZnSO4 0.01％，乙酸钠0.15％，其余为水；种子培养基的pH值为6.5；
S3.将步骤S2所得二级种子液以30％的接种量接种于发酵培养基中，28℃发酵5天得到三级种子液，发酵过程中pH值为8，搅拌转速为100转/分，溶氧浓度为20-40％；发酵培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.03％，CaCO30.05％，ZnSO4 0.01％，乙酸钠0.15％，其余为水；发酵培养基的pH值为6.5；
S4.将步骤S3所得三级种子液以30％的接种量接种于发酵罐的液体发酵培养基中，15-28℃发酵2天得到发酵液，发酵过程中pH值为7，搅拌转速为100转/分，溶氧浓度为20-40％，流量为20cm3/h，发酵罐内压力为0.06MPa；液体发酵培养基的组成为蔗糖3％，大豆糖蜜0.5％，酵母粉1％，大豆蛋白胨2％，K2HPO4 0.3％，MgSO4 0.02％，CaCO3 0.06％，ZnSO4 0.01％，其余为水；液体发酵培养基的pH值为6.5；
S5.将复合酶液接种于步骤S4所得发酵液中，70℃、pH值为3条件下酶解0.5小时得到酶解液；复合酶液由β-葡聚糖酶、酸性蛋白酶、pH值为5.5的蒸馏水按照1g:1g:10mL的比例混合而成，复合酶液与发酵液的体积比为1:200；
S6.将保护剂加入步骤S5所得酶解液中，混合均匀得到混合液，将混合液喷雾干燥得到地顶孢霉培养物；保护剂的重量份组成为葡萄糖40份，水溶性淀粉55份，木瓜籽提取物5份；保护剂与酶解液的重量比为1:20，喷雾干燥时的进风温度为130℃，进料流量为100kg/小时，出风温度为65℃。
其中，步骤S6中木瓜籽提取物的制备步骤与实施例1相同。
参比实施例1
与实施例1不同的是步骤S4中液体发酵培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉1.5％，大豆蛋白胨1.5％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.03％，CaCO3 0.05％，ZnSO4 0.01％，其余为水；即液体发酵培养基中缺少大豆糖蜜。
参比实施例2
与实施例1不同的是缺少步骤S5，步骤S6中的酶解液替换为步骤S4所得发酵液。
参比实施例3
与实施例1不同的是步骤S6中使用的保护剂的重量份组成为葡萄糖40份，水溶性淀粉55份，即缺少木瓜籽提取物。
对比例：申请号为CN201410024600.1的中国发明的实施例一。
试验例一：效果测试
选取420只1日龄肉仔鸡，随机平均分成6个试验组和1个对照组，每组3个重复，每个重复20只，6个试验组(试验组1-6)使用的饲料分别是市售肉仔鸡基础饲料添加实施例1-3、参比实施例1-3制得的地顶孢霉培养物，添加比例为50g/kg，对照组使用的饲料是市售肉仔鸡基础饲料添加对比例制得的地顶孢霉培养物，添加比例为50g/kg。
饲养试验：自由散养，放量发酵床养殖，24小时光照，自由采食饮水，勤通风，常规鸡免疫，记录每组生长前后期体重、每天投料情况、死亡情况。饲喂6周后统计平均日采食量、料肉比、腹泻指数。其中，腹泻标准以排出水样稀释粪便、肛门残留腹泻物为依据，记录每组每天腹泻数量，按照下式计算出腹泻指数：
腹泻指数＝(腹泻数量×腹泻天数)/(总数量×饲养天数)×100％。
测试结果如表1所示：
平均日采食量(g/只) 料肉比 腹泻指数(％)
试验组1 82.64 1.72 2.02
试验组2 82.39 1.76 2.06
试验组3 81.95 1.79 2.14
试验组4 78.46 1.85 2.02
试验组5 77.73 1.90 2.06
试验组6 82.62 1.73 2.62
对照组 75.87 1.94 2.78
表1
从表1可看出，试验组1-3的平均日采食量均高于对照组，料肉比、腹泻指数则低于对照组，表明本发明制得的地顶孢霉培养物应用于饲料添加剂时的效果较好。参比实施例1-3的部分步骤与实施例1不同，相比试验组1，试验组4、试验组5的平均日采食量均有所下降，同时料肉比均有所上升，说明本发明使用的液体发酵培养基中的大豆糖蜜以及对发酵液进行的酶解步骤均能有效提高采食量、降低料肉比；相比试验组1，试验组6的腹泻率有所上升，说明本发明使用的保护剂中的木瓜籽提取物能有效降低腹泻率。
试验例二：有效成分含量测试
分别测定实施例1-3、参比实施例1-3、对比例制得的地顶孢霉培养物的虫草素含量和虫草多糖含量，其中，虫草素含量测试方法参考NY/T 2116-2012虫草制品中虫草素和腺苷的测定高效液相色谱法；虫草多糖含量测试方法参考许峰、吴玲芳、林善、王鸿艳等《发酵冬虫夏草菌丝体中虫草多糖含量的检测及结构鉴定》。测试结果如表2所示：
Figure BDA0002853109430000081
Figure BDA0002853109430000091
表2
从表2可看出，本发明实施例1-3的虫草素含量和虫草多糖含量均高于对比例，表明本发明制得的地顶孢霉培养物的有效成分含量较高。参比实施例1-3的部分步骤与实施例1不同，相比实施例1，参比实施例2的虫草素含量和虫草多糖含量均有所下降，说明本发明对发酵液进行的酶解步骤能有效提高地顶孢霉培养物的有效成分含量。
试验例三：耐光稳定性测试
将实施例1-3、参比实施例1-3、对比例制得的地顶孢霉培养物分别置于功率为20W的紫外灯下方10cm处，照射24小时后按照试验例二中的方法再次测定虫草素含量，按照下式计算出虫草素保持率：
虫草素保持率＝照射后虫草素含量/照射前虫草素含量×100％。
虫草素保持率越高表明耐光稳定性越好，测试结果如表3所示：
虫草素保持率(％)
实施例1 96.65
实施例2 96.58
实施例3 96.62
参比实施例1 96.65
参比实施例2 96.64
参比实施例3 92.86
对比例 91.79
表3
从表3可看出，本发明实施例1-3的虫草素保持率均高于对比例，表明本发明制得的地顶孢霉培养物的耐光稳定性较好。参比实施例1-3的部分步骤与实施例1不同，相比实施例1，参比实施例3的虫草素保持率有所下降，说明本发明使用的保护剂中的木瓜籽提取物能有效提高地顶孢霉培养物的耐光稳定性。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种地顶孢霉培养物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.将地顶孢霉菌种接种于固态培养基上，于15-28℃培养4-6天，待菌丝长满平板并产孢即可，得到一级菌种；
S2.将步骤S1所得一级菌种接种于摇瓶中的种子培养基，15-28℃、100-200转/分培养3-5天得到二级种子液；
S3.将步骤S2所得二级种子液以10-30％的接种量接种于发酵培养基中，15-28℃发酵5-7天得到三级种子液，发酵过程中pH值为7-8，搅拌转速为100-200转/分，溶氧浓度为20-40％；
S4.将步骤S3所得三级种子液以10-30％的接种量接种于发酵罐的液体发酵培养基中，15-28℃发酵2-3天得到发酵液，发酵过程中pH值为6-7，搅拌转速为100-150转/分，溶氧浓度为20-40％，流量为20-40cm3/h，发酵罐内压力为0.04-0.06MPa；
S5.将复合酶液接种于步骤S4所得发酵液中，25-70℃、pH值为3-7条件下酶解0.5-2小时得到酶解液；
S6.将保护剂加入步骤S5所得酶解液中，混合均匀得到混合液，将混合液喷雾干燥得到地顶孢霉培养物。
2.根据权利要求1所述的一种地顶孢霉培养物的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，固体培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO4 0.2％，MgSO40.03％，CaCO30.05％，ZnSO4 0.01％，乙酸钠0.15％，琼脂粉2％，其余为水；固体培养基的pH值为6.5。
3.根据权利要求1所述的一种地顶孢霉培养物的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，种子培养基的装液量为摇瓶体积的10-30％，种子培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.03％，CaCO3 0.05％，ZnSO4 0.01％，乙酸钠0.15％，其余为水；种子培养基的pH值为6.5。
4.根据权利要求1所述的一种地顶孢霉培养物的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中，发酵培养基的组成为蔗糖2％，酵母粉2％，大豆蛋白胨1％，K2HPO4 0.2％，MgSO40.03％，CaCO30.05％，ZnSO4 0.01％，乙酸钠0.15％，其余为水；发酵培养基的pH值为6.5。
5.根据权利要求1所述的一种地顶孢霉培养物的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中，液体发酵培养基的组成为蔗糖1-3％，大豆糖蜜0.5-1.5％，酵母粉1-2％，大豆蛋白胨1-2％，K2HPO4 0.1-0.3％，MgSO4 0.02-0.04％，CaCO3 0.04-0.06％，ZnSO4 0.01％，其余为水；液体发酵培养基的pH值为6.5。
6.根据权利要求1所述的一种地顶孢霉培养物的制备方法，其特征在于：所述步骤S5中，复合酶液由β-葡聚糖酶、酸性蛋白酶、pH值为5.5的蒸馏水按照1g:1g:10mL的比例混合而成，复合酶液与发酵液的体积比为1:200。
7.根据权利要求1所述的一种地顶孢霉培养物的制备方法，其特征在于：所述步骤S6中，保护剂的重量份组成为葡萄糖40份，水溶性淀粉55份，木瓜籽提取物5份；保护剂与酶解液的重量比为1:20，喷雾干燥时的进风温度为120-130℃，进料流量为100-120kg/小时，出风温度为55-65℃。
8.根据权利要求7所述的一种地顶孢霉培养物的制备方法，其特征在于：所述木瓜籽提取物的制备步骤为：
将木瓜籽烘干后粉碎得到木瓜籽粉，将木瓜籽粉加入石油醚中超声提取45分钟得到提取液一，将提取液一离心分离10分钟得到上清液一，将上清液一旋蒸浓缩得到木瓜籽粗提物；将木瓜籽粗提物加入无水乙醇中，80℃下水浴搅拌10分钟后静置分层，取上层醇相加入氢氧化钠后80℃下水浴搅拌1小时得到提取液二，将提取液二离心分离10分钟得到上清液二，将上清液二旋蒸浓缩得到木瓜籽提取物。
9.根据权利要求8所述的一种地顶孢霉培养物的制备方法，其特征在于：所述木瓜籽提取物的制备步骤中：木瓜籽粉与石油醚的比例为1:17g/mL，超声提取时的超声功率为200W；木瓜籽粗提物、无水乙醇、氢氧化钠的比例为50g:80mL:1g；提取液一、提取液二离心分离时的离心速度均为8000转/分。
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