CN109055241A - 一种制备地顶孢霉培养物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备地顶孢霉培养物的方法,主要包括四个步骤:将地顶孢霉接种到斜面培养基中,培养制得斜面试管菌种;再将斜面试管菌种进行摇瓶培养,然后移至种子罐中培养,得种子培养液;再将种子培养液接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵;最后将发酵液经膨化玉米粉、麸皮、碳酸钙粉吸附烘干。本发明提供的制备方法具有生产成本低、有效成分含量高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及真菌分离、培养和发酵领域,具体涉及一种地顶孢霉培养物的制备方法。
背景技术
地顶孢霉(Acremonium terricola)是一种虫草真菌,它多是寄生于虫草之中,能够合成多种药理活性物质,其菌丝体及培养物含有多类药理活性成分。目前分离鉴定的虫草真菌,大多在实验室条件下生长缓慢,培养周期长,而且其菌丝体中营养物质和功能活性物质的含量也较低。
专利CN1091150C中公开了地顶孢霉CGMCC0346及分离培养方法和发酵工艺方法,其所用液体发酵培养基成分为白砂糖,蚕蛹粉和酵母粉和水,而发酵得到的地顶孢霉培养物中虫草素等功能成分含量较少。
专利CN107475132A公开了一种地顶孢霉培养物及其应用,该发明通过发酵培养获得地顶孢霉发酵液,经超滤膜过滤、喷雾干燥获得地顶孢霉培养物。该发明还发现由该制备方法获得的地顶孢霉培养物具有缓解视疲劳的作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种制备地顶孢霉培养物的方法,以及该方法制备得到的地顶孢霉培养物。本发明提供的制备方法在发酵过程中采用较高的搅拌速度,显著提高了地顶孢霉中虫草酸的含量。
本发明提供一种制备地顶孢霉培养物的方法,包括以下步骤:
步骤一.将地顶孢霉接种到斜面培养基中,于20-30℃培养4-9天,制得斜面试管菌种;
步骤二.将步骤一制得的斜面试管菌种进行摇瓶培养,然后移至种子罐中进行种子培养,25-35℃,200-250rpm,培养20-50小时,得种子培养液;
步骤三.将步骤二制备得到的种子培养液按接种量20-25%接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵,发酵过程中pH控制为5-7,培养温度控制在25-27℃,搅拌转速控制在200-250rpm,培养2-5天;
步骤四.将步骤三得到的发酵液,经膨化玉米粉、麸皮、碳酸钙粉吸附,吸附混合成分湿样烘干至水分小于10%。
在本发明的一个实施方案中,步骤一中所述斜面培养基包含马铃薯150-200g/L、葡萄糖15-25g/L、水1000ml和琼脂粉20g/L,pH6-7。
在本发明的一个实施方案中,步骤一中所述斜面培养基包含马铃薯150g/L、葡萄糖15g/L、水1000ml和琼脂粉20g/L,pH6。
在本发明的一个实施方案中,步骤一中所述斜面培养基包含马铃薯150g/L、葡萄糖25g/L、水1000ml和琼脂粉20g/L,pH7。
在本发明的一个实施方案中,步骤一中所述斜面培养基包含马铃薯200g/L、葡萄糖15g/L、水1000ml和琼脂粉20g/L,pH6。
在本发明的一个实施方案中,步骤一中所述斜面培养基包含马铃薯200g/L、葡萄糖25g/L、水1000ml和琼脂粉20g/L,pH7。
在本发明的一个实施方案中,步骤二中所述种子培养使用的培养基包含蔗糖30-50g/L、蛋白胨5-10g/L、酵母粉5-10g/L、玉米淀粉10-25g/L、硫酸镁0.1-1g/L和磷酸二氢钾1-5g/L,pH5-7。
在本发明的一个实施方案中,步骤二中所述种子培养使用的培养基包含蔗糖30g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、玉米淀粉10g/L、硫酸镁0.1g/L和磷酸二氢钾1g/L,pH5。
在本发明的一个实施方案中,步骤二中所述种子培养使用的培养基包含蔗糖50g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、玉米淀粉25g/L、硫酸镁1g/L和磷酸二氢钾5g/L,pH7。
在本发明的一个实施方案中,步骤二中所述种子培养使用的培养基包含蔗糖30g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、玉米淀粉10g/L、硫酸镁1g/L和磷酸二氢钾5g/L,pH5。
在本发明的一个实施方案中,步骤二中所述种子培养使用的培养基包含蔗糖50g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、玉米淀粉25g/L、硫酸镁0.1g/L和磷酸二氢钾1g/L,pH7。
在本发明的一个实施方案中,其特征在于,步骤三中所述的发酵培养基包含蔗糖5-20g/L、葡萄糖20-55g/L、蛋白胨10-20g/L、酵母粉10-20g/L、玉米淀粉20-40g/L、硫酸镁0.1-1g/L、磷酸二氢钾0.1-1g/L、磷酸氢二钾0.1-2g/L和硫酸铵0.001-0.1g/L,pH5-7。
在本发明的一个实施方案中,其特征在于,步骤三中所述的发酵培养基包含蔗糖5g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、玉米淀粉20g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、磷酸氢二钾0.1g/L和硫酸铵0.001g/L,pH5。
在本发明的一个实施方案中,其特征在于,步骤三中所述的发酵培养基包含蔗糖20g/L、葡萄糖55g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉20g/L、玉米淀粉40g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾2g/L和硫酸铵0.1g/L,pH7。
在本发明的一个实施方案中,其特征在于,步骤三中所述的发酵培养基包含蔗糖5g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、玉米淀粉20g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾2g/L和硫酸铵0.1g/L,pH5。
在本发明的一个实施方案中,其特征在于,步骤三中所述的发酵培养基包含蔗糖20g/L、葡萄糖55g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉20g/L、玉米淀粉40g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、磷酸氢二钾0.1g/L和硫酸铵0.001g/L,pH7。
本发明还提供一种根据以上任意所述的制备方法制备得到的地顶孢霉培养物。
本发明还提供一种给仔猪增重的方法,包括使用以上任意方法制备得到的地顶孢霉培养物饲养仔猪。
本发明提供的制备地顶孢霉培养物的方法具有生产成本低、有效成分含量高等优点。
本发明中的地顶孢霉培养物(Acrermonium terricola culture,ATC)是将分离自古尼虫草的地顶孢霉菌经发酵制得的虫草饲料添加剂。本发明发现在发酵过程中采用较高的搅拌速度,可以显著提高地顶孢霉中有效成分虫草算的含量。本发明提供的制备方法地顶孢霉培养物含有虫草酸、虫草素和虫草多糖等与天然古尼虫草相同的功能性成分,具有广泛的促生长、提高抗氧化、调节免疫等益生作用。
具体实施方式
以下结合实施例用于进一步描述本发明,但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂,为市场购买的常规试剂。
实施例1:地顶孢霉培养物的制备方法
1、种子培养
筛选优良的地顶孢霉分为四组,接种到斜面培养基中,25℃培养4天,斜面培养基成分见表1,制得斜面试管菌种;再将制得的斜面试管菌种进行摇瓶培养,然后移至种子罐中进行种子培养,种子培养基成分见表2,培养温度为30℃,转速为250rpm,培养20小时,得种子培养液。
表1斜面培养基
组别 | 马铃薯g/L | 葡萄糖g/L | 琼脂粉g/L | 水mL | pH |
1 | 150 | 15 | 20 | 1000 | 6 |
2 | 150 | 25 | 20 | 1000 | 7 |
3 | 200 | 15 | 20 | 1000 | 6 |
4 | 200 | 25 | 20 | 1000 | 7 |
表2种子培养基
2、发酵
将制备得到的种子培养液按接种量20-25%接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵,发酵培养基的成分见表3,发酵过程中pH控制为6左右,培养温度控制在25-27℃,搅拌转速控制在200-250rpm,培养48小时,培养终止,得到含有虫草素的地顶孢霉培养物发酵液。
将各组发酵液取相同体积的样品后过200目筛网,用蒸馏水冲洗菌体至洗出液无色,收集菌丝于60℃烘箱中烘干至恒重,各组发酵后菌丝体产量见表4。
将烘干的菌体并以1:10料液比添加50%乙醇,于48℃超声波中超声提取1小时后离心,将上清液用50%的乙醇溶液定容至10mL,取1mL用0.45μm滤膜过滤后,滤液用安捷伦液相色谱测定,流动相为甲醇和0.02mol/L的磷酸二氢钾,虫草素检测结果见表5,由表中可见,本发明各组的发酵培养基均能够促进地顶孢霉的快速大量繁殖,而且显著提高了菌体中虫草素的含量。
表3发酵培养基
表4各组发酵后菌丝体产量
组别 | 菌体干重g/L |
1 | 21.3 |
2 | 19.5 |
3 | 18.9 |
4 | 21.7 |
表5各组虫草素含量
组别 | 虫草素含量mg/kg |
1 | 336.8 |
2 | 315.4 |
3 | 310.8 |
4 | 332.8 |
3、吸附、混合
将地顶孢霉液体深层发酵液经膨化玉米粉、麸皮、碳酸钙粉吸附,并搅拌混合均匀。
4、烘干、粉碎
将地顶孢霉培养物的吸附混合成分湿样,经控温控湿烘干房烘干至水分小于10%,后粉碎过筛、包装得产品。
实施例2:对仔猪生长性能及免疫功能效果试验
选用60头体重相近的25日龄刚断奶仔猪,正式试验开始前随机分为6组,
每组10头,每组分栏饲养。6组分别设为:
第1组:低剂量组(虫草素添加量:300mg/kg饲料)
第2组:中计量组(虫草素添加量:500mg/kg饲料)
第3组:高计量组(虫草素添加量:700mg/kg饲料)
第4组:药物对照组(10%硫酸粘杆菌素添加量:200mg/kg饲料)
第5组:药物对照组(50%黄芪多糖添加量:500mg/kg饲料)
第6组:空白对照组(断奶小猪料,不添加任何药物)
每组从25日龄开始连续饲喂20天,自由采食,从25日龄开始至45日龄结束,在给药第一天所有试验猪均单次接种猪瘟疫苗,各组增重及料重比见表6。
表6各组增重及料重比
Claims (6)
1.一种制备地顶孢霉培养物的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一.将地顶孢霉接种到斜面培养基中,于20-30℃培养4-9天,制得斜面试管菌种;
步骤二.将步骤一制得的斜面试管菌种进行摇瓶培养,然后移至种子罐中进行种子培养,25-35℃,200-250rpm,培养20-50小时,得种子培养液;
步骤三.将步骤二制备得到的种子培养液按接种量20-25%接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵,发酵过程中pH控制为5-7,培养温度控制在25-27℃,搅拌转速控制在200-250rpm,培养2-5天;
步骤四.将步骤三得到的发酵液,经膨化玉米粉、麸皮、碳酸钙粉吸附,吸附混合成分湿样烘干至水分小于10%。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤一中所述斜面培养基包含马铃薯150-200g/L、葡萄糖15-25g/L、水1000ml和琼脂粉20g/L,pH6-7。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤二中所述种子培养使用的培养基包含蔗糖30-50g/L、蛋白胨5-10g/L、酵母粉5-10g/L、玉米淀粉10-25g/L、硫酸镁0.1-1g/L和磷酸二氢钾1-5g/L,pH5-7。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤三中所述的发酵培养基包含蔗糖5-20g/L、葡萄糖20-55g/L、蛋白胨10-20g/L、酵母粉10-20g/L、玉米淀粉20-40g/L、硫酸镁0.1-1g/L、磷酸二氢钾0.1-1g/L、磷酸氢二钾0.1-2g/L和硫酸铵0.001-0.1g/L,pH5-7。
5.一种根据权利要求1所述的制备方法制备得到的地顶孢霉培养物。
6.一种给仔猪增重的方法,包括使用权利要求5所述的地顶孢霉培养物饲养仔猪。
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