CN109055240A - 一种地顶孢霉种子培养基及其应用 - Google Patents

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    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Abstract

本发明涉及一种地顶孢霉的种子培养基及其制备方法，本发明的种子培养基包括以下成分：蔗糖、蛋白胨、酵母粉、玉米淀粉、硫酸镁、磷酸二氢钾和保护剂，pH5‑7。本发明的种子培养基能够促进地顶孢霉快速大量繁殖，且能够显著提高地顶孢霉中虫草素的含量。

Description

一种地顶孢霉种子培养基及其应用
技术领域
本发明涉及真菌培养和发酵领域，具体涉及一种地顶孢霉种子培养基及其应用。
背景技术
古尼虫草是我国稀有的虫草类药材，具有提高睡眠、调节免疫、镇静和止痛等作用。古尼虫草中存在很多重要的次级代谢产物，如虫草酸、虫草素、虫草多糖等，但是古尼虫草昂贵的价格限制其的应用和发展。因此，替代古尼虫草的人工培养物应运而生。地顶孢霉(Acremonium terricola)培养物是由从古尼虫草分离的地顶孢霉菌经人工发酵而得到的产品，拥有虫草素、虫草酸、多糖等与古尼虫草相似的功能性成分，人工发酵得到的地顶孢霉培养物成本大大降低。
专利CN107475132A公开了一种地顶孢霉培养物及其应用，该发明通过发酵培养获得地顶孢霉发酵液，经超滤膜过滤、喷雾干燥获得地顶孢霉培养物。该发明还发现由该制备方法获得的地顶孢霉培养物具有缓解视疲劳的作用。
专利CN107502555A公开了一种地顶孢霉的发酵培养基及其发酵工艺，所述发酵培养基包括以下成分：蔗糖、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、玉米淀粉、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、保护剂和混合剂；保护剂由聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖组成；混合剂由蚯蚓粉、发芽糙米浆和耕土组成。
但是，目前地顶孢霉的培养仍然存在生长速度慢，培养周期长，虫草素含量低的缺点，本发明中提供的地顶孢霉种子培养基可以显著提高地顶孢霉中有效成分虫草酸的含量，且缩短培养时间，便于地顶孢霉的大规模培养。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种地顶孢霉的种子培养基，以及利用该培养基制备地顶孢霉培养物的方法。本发明的种子培养基与传统的种子培养基相比，加入了保护剂，缩短了培养时间，显著提高了地顶孢霉中虫草酸的含量。
本发明提供一种地顶孢霉的种子培养基，包括以下成分及其含量：蔗糖30-50g/L、蛋白胨5-10g/L、酵母粉5-10g/L、玉米淀粉10-25g/L、硫酸镁0.1-1g/L、磷酸二氢钾1-5g/L和保护剂5-10g/L。
在本发明的一个实施方案中，所述保护剂包括聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖。
在本发明的一个实施方案中，所述保护剂中聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖重量比为2:1:5。
在本发明的实施方案中，所述种子培养基包括以下成分及其含量：蔗糖30g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、玉米淀粉10g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钾1g/L和保护剂5g/L。
在本发明的实施方案中，所述种子培养基包括以下成分及其含量：蔗糖35g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉7g/L、玉米淀粉15g/L、硫酸镁0.3g/L、磷酸二氢钾2g/L和保护剂6g/L。
在本发明的一个实施方案中，所述种子培养基包括以下成分及含量：蔗糖40g/L、蛋白胨7g/L、酵母粉8g/L、玉米淀粉20g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾3g/L和保护剂8g/L。
在本发明的实施方案中，所述种子培养基包括以下成分及其含量：蔗糖45g/L、蛋白胨8g/L、酵母粉9g/L、玉米淀粉23g/L、硫酸镁0.8g/L、磷酸二氢钾4g/L和保护剂9g/L。
在本发明的实施方案中，所述种子培养基包括以下成分及其含量：蔗糖50g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、玉米淀粉25g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾5g/L和保护剂10g/L。
在本发明的一个实施方案中，种子培养基灭菌后的培养基pH可以为5、6或7。
本发明还提供了一种利用以上所述的种子培养基培养地顶孢霉的方法，包括以下步骤：将地顶孢霉接种到斜面培养基中，培养4-9天，制得斜面试管菌种；将斜面试管菌种进行摇瓶培养，然后移至种子罐中进行种子培养，得种子培养液；最后将种子培养液接种到发酵罐中发酵，得到地顶孢霉发酵液。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述地顶孢霉在种子罐中培养时，培养温度为25-35℃，搅拌速度为200-250rpm，培养时间为20小时。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述斜面培养基包含马铃薯150-200g/L、葡萄糖15-25g/L、水1000ml和琼脂粉20g/L，pH6-7。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述的发酵培养基包含蔗糖5-20g/L、葡萄糖20-55g/L、蛋白胨10-20g/L、酵母粉10-20g/L、玉米淀粉20-40g/L、硫酸镁0.1-1g/L、磷酸二氢钾0.1-1g/L、磷酸氢二钾0.1-2g/L和硫酸铵0.001-0.1g/L，pH5-7。
本发明提供的制备地顶孢霉种子培养基具有培养时间短、有效成分含量高等优点。
具体实施方式
以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1：地顶孢霉种子培养基的制备方法
按照表1中各组分的含量配置种子培养基，配置完成后高压灭菌、冷却，并用无菌空气保压。灭菌后的种子培养基无杂菌培养，灭菌后调节pH为6。
表1中所述保护剂组成为：聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖，各组分重量比为2：1：5。
表1种子培养基成分
实施例2：地顶孢霉培养物的制备
1、种子培养
筛选优良的地顶孢霉分为四组，接种到斜面培养基中，25℃培养4天，斜面培养基成分为：马铃薯150g/L、葡萄糖15g/L、水1000ml和琼脂粉20g/L，pH6，制得斜面试管菌种；再将制得的斜面试管菌种进行摇瓶培养，然后移至种子罐中进行种子培养，培养温度为30℃，转速为250rpm，培养20小时，得种子培养液。
2、发酵
将制备得到的种子培养液按接种量20-25％接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵培养基的成分为：蔗糖5g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、玉米淀粉20g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、磷酸氢二钾0.1g/L和硫酸铵0.001g/L，pH5。发酵过程中pH控制为6左右，培养温度控制在25-27℃，培养48小时，培养终止，得到含有虫草素的地顶孢霉培养物发酵液。
将各组发酵液取相同体积的样品后过200目筛网，用蒸馏水冲洗菌体至洗出液无色，收集菌丝于60℃烘箱中烘干至恒重，各组发酵后菌丝体产量见表2。
将烘干的菌体并以1:10料液比添加50％乙醇，于48℃超声波中超声提取1小时后离心，将上清液用50％的乙醇溶液定容至10mL，取1mL用0.45μm滤膜过滤后，滤液用安捷伦液相色谱测定，流动相为甲醇和0.02mol/L的磷酸二氢钾，虫草素检测结果见表3，由表中可见，加入保护剂的种子培养基均能够促进地顶孢霉的快速大量繁殖，而且显著提高了菌体中虫草素的含量。
表2各组发酵后菌丝体产量
组别 菌体干重g/L
1 16.4
2 21.7
3 18.7
4 20.4
表3各组虫草素含量
组别 虫草素含量mg/kg
1 303.7
2 335.8
3 315.2
4 322.1
3、吸附、混合
将地顶孢霉液体深层发酵液经膨化玉米粉、麸皮、碳酸钙粉吸附，并搅拌混合均匀。
4、烘干、粉碎
将地顶孢霉培养物的吸附混合成分湿样，经控温控湿烘干房烘干至水分小于10％，后粉碎过筛、包装得产品。
实施例3：对仔猪生长性能及免疫功能效果试验
选用40头体重相近的25日龄刚断奶仔猪，正式试验开始前随机分为4组，每组10头，每组分栏饲养。4组分别设为：
第1组：虫草素组(虫草素添加量：300mg/kg饲料)
第2组：药物对照组(10％硫酸粘杆菌素添加量：200mg/kg饲料)
第3组：药物对照组(50％黄芪多糖添加量：500mg/kg饲料)
第4组：空白对照组(断奶小猪料，不添加任何药物)
每组从25日龄开始连续饲喂20天，自由采食，从25日龄开始至45日龄结束，在给药第一天所有试验猪均单次接种猪瘟疫苗，各组增重及料重比见表4。
表4各组增重及料重比

Claims (7)

1.一种地顶孢霉的种子培养基，其特征在于，包括以下成分及其含量：蔗糖30-50g/L、蛋白胨5-10g/L、酵母粉5-10g/L、玉米淀粉10-25g/L、硫酸镁0.1-1g/L、磷酸二氢钾1-5g/L和保护剂5-10g/L。
2.根据权利要求1所述的种子培养基，其特征在于，所述保护剂包括聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖。
3.根据权利要求2所述的种子培养基，其特征在于，所述保护剂中聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖重量比为2:1:5。
4.根据权利要求1所述的种子培养基，其特征在于，包括以下成分及其含量：蔗糖40g/L、蛋白胨7g/L、酵母粉8g/L、玉米淀粉20g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾3g/L和保护剂8g/L。
5.根据权利要求1所述的种子培养基，其特征在于，灭菌后的培养基pH为5-7。
6.一种利用权利要求1所述的种子培养基培养地顶孢霉的方法，其特征在于，包括以下步骤：将地顶孢霉接种到斜面培养基中，培养4-9天，制得斜面试管菌种；将斜面试管菌种进行摇瓶培养，然后移至种子罐中进行种子培养，得种子培养液；最后将种子培养液接种到发酵罐中发酵，得到地顶孢霉发酵液。
7.根据权利要求6的培养方法，其特征在于，地顶孢霉在种子罐中培养时，培养温度为25-35℃，搅拌速度为200-250rpm，培养时间为20小时。
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