CN105969674A - 一种富硒地顶孢霉菌株及其应用 - Google Patents

一种富硒地顶孢霉菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种富硒地顶孢霉菌株及其应用。本发明提供的地顶孢霉FA1603，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M2016331。本发明还保护一种地顶孢霉培养物和培养地顶孢霉FA1603的方法。地顶孢霉FA1603发酵生产高虫草素含量的富硒地顶孢霉培养物产品的有机硒含量高，尤以活性的硒蛋氨酸为主，而且富含虫草活性成分，特别突出虫草素的含量，其对于饲料添加方面，安全无毒、无副作用，可显著改善动物肉质营养，提高肉质品质，同时促进动物健康发育，提高机体免疫力，具有重大的经济和社会效益。

Description

一种富硒地顶孢霉菌株及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种富硒地顶孢霉菌株及其应用。
背景技术
传统上，虫草菌是麦角菌科Clavicipitaceae中虫草属Cordyceps sensu lato的所有真菌的统称，是形成“虫草”的真菌。目前，全世界报道记载和虫草菌有关的名称已超过500多个，中国已报道约120种。虫草菌的寄主范围十分广泛，可以寄生动物(包括昆虫、蜘蛛、螨类和线虫等)或者其他真菌(如大团囊菌属Elaphomyces Nees和麦角菌属Claviceps Tul.的真菌)。部分虫草菌与寄主的复合物在传统中药中可直接入药，如冬虫夏草、蛹虫草及蝉花等，而且多数虫草菌还能产生多种生物活性物质。现代研究表明，虫草菌中的活性成分在临床医学与保健中发挥着重要的作用，尤其是虫草素具备抑菌、抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、清除自由基等多种生物学活性。作为虫草类产品标志性的有效成分，虫草素一直是虫草菌相关活性成分的研究重点。在众多虫草菌中，冬虫夏草菌和蛹虫草菌无论是基础研究还是开发利用都在虫草菌中处于突出的地位，已成为虫草菌研究中的“模式物种”。近年来，科学工作者们在虫草菌及其无性型的生物学特征、人工栽培、液体深层发酵培养、培养基组成、培养条件优化、菌丝体及代谢产物的化学成分检测、分离、提取、纯化极其功能、优良菌株选育、功能性食品研制、保健药物开发等方面进行了大量的研究，但效果并不理想，反而针对虫草类产品的质疑越来越多。
地顶孢霉是一种虫草真菌，它多是寄生于虫草之中，能够合成多种药理活性物质，其菌丝体及培养物含有多类药理活性成分，经测试，这些药理活性成分具有体外抗肿瘤活性以及增强动物体内免疫活性的功能，因此可用于饲料添加剂及药品和保健食品的制备。国内已开发出多种地顶孢霉及其培养物等相关产品，但这些产品(包括饲料添加剂和保健食品)均未在宣传和包装上标明虫草素含量。其中最主要的原因是其虫草素含量普遍不高。虫草的几种主要活性成分中，唯有虫草素是虫草类的特有成分，其他活性成分都有各自的功能，但若能提高虫草及其产品的虫草素含量，不仅可以提高应用效果，还可以在宣传和包装上突出虫草素含量，促进虫草及其产品的销售推广，为开发带来可观利润。
在我国，硒的缺乏是一个普遍存在的问题。对缺硒地区而言，通过补充无机硒源——亚硒酸钠，其吸收利用率低、安全性差，补硒还应主要以富含有机硒为好，因有机硒在利用率方面要优于无机硒，而通过微生物吸收、转化、富集的硒就是一类生物利用率非常高的硒源。一般而言，食用菌型微生物都具有较强的富硒能力和较高的产率，而富硒酵母的产率仅为1％左右，因此，富硒虫草菌将较富硒酵母具有更高的产量。不仅如此，虫草菌含有多种活性成分，虫草菌富硒之后将较其他富硒产品更具生物活性。但目前发现的地顶孢霉菌株，其次级代谢产物虫草素等活性成分的含量均不高，限制了对地顶孢霉的进一步利用。不仅如此，目前，还未有富硒地顶孢霉菌株及其培养物制备方面的报道，如何在提高地顶孢霉菌株最主要活性成分虫草素的基础上，实现菌株对硒的转化与富集，开发集虫草真菌和硒的诸多生理功能于一体的新型地顶孢霉培养物产品成为一个新的研究课题，其对进一步开发地顶孢霉及其培养物的应用方面具有显著创新价值和经济效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种富硒地顶孢霉菌株及其应用。
本发明提供的地顶孢霉FA1603(Acremonium terricola FA1603)，已于2016年06月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M2016331。地顶孢霉FA1603(Acremonium terricolaFA1603)CCTCC NO：M2016331简称为地顶孢霉FA1603。
本发明还保护一种地顶孢霉培养物，是通过培养所述地顶孢霉FA1603得到的。
所述地顶孢霉培养物的用途为如下(1)或(2)或(3)：
(1)制备富硒饲料添加剂；
(2)制备富硒保健品；
(3)制备富硒食品。
所述培养物的硒含量大于等于800mg/kg，甚至可达1000mg/kg，且大于等于80.23％的硒为有机硒形态，甚至可达99％的硒为有机硒形态，其中硒蛋氨酸占富硒酵母产品有机硒含量的至少40％，甚至可达60％。
所述培养物中的虫草素含量大于等于6.0g/kg培养物干重，甚至可达8.0 g/kg培养物干重。
本发明还保护所述地顶孢霉FA1603或所述培养物的应用，为如下(1)或(2)或(3)：
(1)制备富硒饲料添加剂；
(2)制备富硒保健品；
(3)制备富硒食品。
本发明还保护一种产品，其活性成分为所述地顶孢霉FA1603或所述地顶孢霉FA1603的培养物。
所述产品为食品、保健品或饲料添加剂。
所述产品的有机硒含量大于等于800mg/kg，甚至可达1000mg/kg，且大于等于80.23％的硒为有机硒形态，甚至可达99％的硒为有机硒形态，其中硒蛋氨酸占富硒酵母产品有机硒含量的至少40％，甚至可达60％。
所述产品的虫草素含量大于等于6.0g/kg，甚至可达8.0 g/kg。
本发明还保护一种培养所述地顶孢霉FA1603的方法，依次包括如下步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)：
步骤(a)：采用种子强化培养基培养地顶孢霉FA1603；
步骤(b)：将步骤(a)的产物接种至液体发酵培养基进行培养；
步骤(c)：将步骤(b)的产物接种至固体发酵培养基上进行培养。
本发明还保护一种制备地顶孢霉培养物的方法，包括如下步骤：培养所述地顶孢霉FA1603。
所述方法依次包括如下步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)：
步骤(a)：采用所述的种子强化培养基培养地顶孢霉FA1603；
步骤(b)：将步骤(a)的产物接种至所述的液体发酵培养基进行培养；
步骤(c)：将步骤(b)的产物接种至所述的固体发酵培养基上进行培养。
以上任一所述步骤(a)具体可为将地顶孢霉FA1603接种至种子强化培养基(地顶孢霉FA1603在培养体系中的初始浓度为0.5×105个/ml)，25℃培养3天，得到强化种子培养物(地顶孢霉FA1603在培养体系中的孢子浓度为1012个/克培养物)。
以上任一所述步骤(b)具体可为：将100g步骤(a)的产物接种至15L液体发酵培养基进行培养。
以上任一所述步骤(b)的培养条件为：发酵罐通气量为10-20L/min，搅拌控制为150-250rpm，温度控制在25℃，控制溶解氧(DO)为30％-50％。
以上任一所述步骤(b)的培养过程具体可为：发酵周期为96小时。发酵起始时，培养体系的pH为7.0，在发酵培养过程中实时监测培养体系中的还原糖浓度及pH，通过加入70％的葡萄糖水溶液控制培养体系中的还原糖浓度在0.5-1.0g/100mL(每当培养体系中的还原糖浓度低于0.5g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的还原糖浓度达到1.0g/100mL)，通过流加氨水控制发酵全过程中pH为7.0。培养全程参数为：发酵罐通气量为15L/min，搅拌控制为200rpm，温度控制在25℃，控制溶解氧(DO)为40％。
以上任一所述步骤(b)的培养过程具体可为：发酵周期为96小时。发酵起始时，培养体系的pH为6.5，在发酵培养过程中实时监测培养体系中的还原糖浓度及pH，通过加入70％的葡萄糖水溶液控制培养体系中的还原糖浓度在0.5-1.0g/100mL(每当培养体系中的还原糖浓度低于0.5g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的还原糖浓度达到1.0g/100mL)，通过流加氨水控制发酵全过程中pH为6.0。培养全程参数为：发酵罐通气量为10L/min，搅拌控制为150rpm，温度控制在25℃，控制溶解氧(DO)为30％。
以上任一所述步骤(b)的培养过程具体可为：发酵周期为96小时。发酵起始时，培养体系的pH为7.5，在发酵培养过程中实时监测培养体系中的还原糖浓度及pH，通过加入70％的葡萄糖水溶液控制培养体系中的还原糖浓度在0.5-1.0g/100mL(每当培养体系中的还原糖浓度低于0.5g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的还原糖浓度达到1.0g/100mL)，通过流加氨水控制发酵全过程中pH为7.5。培养全程参数为：发酵罐通气量为20L/min，搅拌控制为250rpm，温度控制在25℃，控制溶解氧(DO)为50％。
以上任一所述步骤(c)具体可为将步骤(b)的产物接种至固体发酵培养基进行培养(每1L的液体发酵产物接种至5kg的固体发酵培养基上)。
以上任一所述步骤(c)的培养条件具体可为：固体发酵温度25℃，湿度为60％-80％，光照强度为100-200Lx，发酵时间为3-5天，每天光照时间10小时、黑暗14小时。
以上任一所述步骤(c)的培养条件具体可为：固体发酵温度25℃，湿度为70％，光照强度为150Lx，发酵时间为4天，每天光照时间10小时、黑暗14小时。
以上任一所述步骤(c)的培养条件具体可为：固体发酵温度25℃，湿度为60％，光照强度为100Lx，发酵时间为5天，每天光照时间10小时、黑暗14小时。
以上任一所述步骤(c)的培养条件具体可为：固体发酵温度25℃，湿度为80％，光照强度为200Lx，发酵时间为3天，每天光照时间10小时、黑暗14小时。
本发明还保护一种用于培养所述地顶孢霉FA1603的试剂盒，包括所述种子强化培养基、液体发酵培养基和固体发酵培养基。
本发明还保护一种用于制备地顶孢霉培养物的试剂盒，包括所述种子强化培养基、液体发酵培养基和固体发酵培养基。
所述试剂盒的用途为如下(1)或(2)或(3)：
(1)制备富硒饲料添加剂；
(2)制备富硒保健品；
(3)制备富硒食品。
本发明还保护所述试剂盒的应用，为如下(1)或(2)或(3)：
(1)制备富硒饲料添加剂；
(2)制备富硒保健品；
(3)制备富硒食品。
以上任一所述种子强化培养基的原料配比为：1L营养液：0.5-1.5kg小米；所述营养液由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述营养液中的浓度如下：黄豆粉1-3g/100ml、蔗糖0.5-1.5g/100ml、酵母膏0.4-0.6g/100ml、蛋白胨0.2-0.4g/100ml、磷酸二氢钾0.04-0.06g/100ml、硫酸镁0.005-0.015g/100ml、硫酸亚铁8-12mg/100ml、维生素B1 1-3mg/100ml、维生素B2 0.5-1.5mg/100ml、维生素B6 0.5-1.5mg/100ml、维生素B12 4-6μg/100ml；所述溶剂为水。
所述种子强化培养基的原料配比具体可为：1L营养液：1.0kg小米。
所述种子强化培养基的制备方法具体可为：将营养液与小米混合均匀，隔水蒸(时间具体可为45min)。
以上任一所述液体发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度如下：葡萄糖4-6g/100ml、大豆粉1-3g/100ml、玉米粉0.6-1.0g/100ml、蛋白胨1-2g/100ml、酵母膏0.6-1.0g/100ml、磷酸二氢钾0.3-0.4g/100ml、硫酸镁0.04-0.06g/100ml、亚硒酸钠4-5mg/100ml；所述溶剂为水。
所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体可为：葡萄糖5g/100ml、大豆粉2g/100ml、玉米粉0.8g/100ml、蛋白胨1.5g/100ml、酵母膏0.8g/100ml、磷酸二氢钾0.35g/100ml、硫酸镁0.05g/100ml、亚硒酸钠4.5mg/100ml。
所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体可为：葡萄糖4g/100ml、大豆粉1g/100ml、玉米粉0.6g/100ml、蛋白胨1.0g/100ml、酵母膏0.6g/100ml、磷酸二氢钾0.3g/100ml、硫酸镁0.04g/100ml、亚硒酸钠4.0mg/100ml。
所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体可为：葡萄糖6g/100ml、大豆粉3g/100ml、玉米粉1.0g/100ml、蛋白胨2.0g/100ml、酵母膏1.0g/100ml、磷酸二氢钾0.4g/100ml、硫酸镁0.06g/100ml、亚硒酸钠5.0mg/100ml。
以上任一所述固体发酵培养基豆粕粉、小麦粉和麸皮粉组成；所述豆粕粉、小麦粉和麸皮粉的质量比为3-5∶2-4∶2-4。
所述豆粕粉、小麦粉和麸皮粉的质量比具体可为4∶3∶3。
固体发酵培养基乙中，豆粕粉、小麦粉和麸皮粉的质量比具体可为3∶4∶2。
固体发酵培养基丙中，豆粕粉、小麦粉和麸皮粉的质量比具体可为5∶2∶4。
本发明提供了地顶孢霉FA1603、培养地顶孢霉FA1603和地顶孢霉FA1603培养物。地顶孢霉FA1603能够高效积累虫草素，同时能够提高菌株的好氧生长能力，具有高浓度亚硒酸钠耐受性和转化能力，其在进行高生物量发酵的同时具有较高的硒转化能力，可以用来制备高虫草素含量的富硒地顶孢霉培养物产品，该产品中有机硒含量高达1000mg/kg，且99％的硒为有机硒形态，其中硒蛋氨酸占富硒酵母产品有机硒含量的60％。地顶孢霉FA1603发酵生产高虫草素含量的富硒地顶孢霉培养物产品的有机硒含量高，尤以活性的硒蛋氨酸为主，而且富含虫草活性成分，特别突出虫草素的含量，其对于饲料添加方面，安全无毒、无副作用，可显著改善动物肉质营养，提高肉质品质，同时促进动物健康发育，提高机体免疫力，具有重大的经济和社会效益。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
黄豆粉：西安文竹生物科技有限公司。
PDA固体培养基：马铃薯浸出粉20g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，蒸馏水定容至1000mL，调pH至7.0；121℃高压蒸汽灭菌22min。
PDA液体培养基：马铃薯浸出粉20g，葡萄糖20g，蛋白胨15g，磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁0.3g，维生素B1 20mg，蒸馏水定容至1000ml，调pH至7.0；121℃高压蒸汽灭菌22min。
再生液体培养基：在PDA液体培养基中添加20％(W/V)甘露醇作为渗透压稳定剂。
再生固体培养基：在PDA固体培养基中添加20％(W/V)甘露醇作为渗透压稳定剂。
种子强化培养基的制备方法：黄豆粉20g，蔗糖10g，酵母膏5.0g，蛋白胨3.0g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.1g，硫酸亚铁100mg，维生素B1 20mg，维生素B2 10mg，维生素B6 10mg，维生素B12 50μg，蒸馏水定容至1000ml，制成营养液；1000ml营养液与1000g小麦混合均匀，隔水蒸45min，121℃高压蒸汽灭菌20-30min，得到种子强化培养基。各溶质在营养液中的浓度如下：黄豆粉2g/100ml、蔗糖1g/100ml、酵母膏0.5g/100ml、蛋白胨0.3g/100ml、磷酸二氢钾0.05g/100ml、硫酸镁0.01g/100ml、硫酸亚铁10mg/100ml、维生素B1 2mg/100ml、维生素B2 1mg/100ml、维生素B6 1mg/100ml、维生素B12 5μg/100ml。
液体发酵培养基的制备方法：取葡萄糖，大豆粉，玉米粉，蛋白胨，酵母膏，磷酸二氢钾，硫酸镁，亚硒酸钠，加蒸馏水定容至100ml；125℃高压蒸汽灭菌30min。按照上述方法分别制备得到液体发酵培养基甲、液体发酵培养基乙及液体发酵培养基丙。
液体发酵培养基甲中，各溶质的浓度如下：葡萄糖5g/100ml、大豆粉2g/100ml、玉米粉0.8g/100ml、蛋白胨1.5g/100ml、酵母膏0.8g/100ml、磷酸二氢钾0.35g/100ml、硫酸镁0.05g/100ml、亚硒酸钠4.5mg/100ml。
液体发酵培养基乙中，各溶质的浓度如下：葡萄糖4g/100ml、大豆粉1g/100ml、玉米粉0.6g/100ml、蛋白胨1.0g/100ml、酵母膏0.6g/100ml、磷酸二氢钾0.3g/100ml、硫酸镁0.04g/100ml、亚硒酸钠4.0mg/100ml。
液体发酵培养基丙中，各溶质的浓度如下：葡萄糖6g/100ml、大豆粉3g/100ml、玉米粉1.0g/100ml、蛋白胨2.0g/100ml、酵母膏1.0g/100ml、磷酸二氢钾0.4g/100ml、硫酸镁0.06g/100ml、亚硒酸钠5.0mg/100ml。
固体发酵培养基的制备方法：取豆粕粉、小麦粉和麸皮粉混合，125℃高压蒸汽灭菌30min。按照上述方法分别制备得到固体发酵培养基甲、固体发酵培养基乙及固体发酵培养基丙。
固体发酵培养基甲中，豆粕粉、小麦粉和麸皮粉的质量比为4∶3∶3。
固体发酵培养基乙中，豆粕粉、小麦粉和麸皮粉的质量比为3∶4∶2。
固体发酵培养基丙中，豆粕粉、小麦粉和麸皮粉的质量比为5∶2∶4。
菌丝体干重：将液体发酵菌丝体80℃烘干至恒重。
培养物干重：将固体二次发酵培养物80℃烘干至恒重。
检测虫草素含量的方法：NY/T 2116-2012虫草制品中虫草素和腺苷的测定高效液相色谱法。
检测硒含量的方法：参照参考文献“王莹，铁梅，康平利，等.ICP-MS等三种测定蛹虫草硒含量方法的比较[J].光谱学与光谱分析，2009，29(3)：815-818.”中的3，3-二氨基联苯胺分光光度法。
检测硒蛋氨酸含量的方法：参照参考文献“杨文婕，张明，陈竞，等.LC-MS-MS同时定量检测硒蛋氨酸和硒胱氨酸[J].中国食品卫生杂志，2008，20(3)：204-207.”中的方法。
实施例1、地顶孢霉FA1603的选育
一、出发菌株菌丝体的收集
1、以分离筛选自辽宁长白山的野生蛹虫草子实体中的得到的地顶孢霉菌株为出发菌株，将出发菌株接种至PDA固体斜面培养基，25℃培养4天。
2、用无菌的生理盐水将步骤1培养好的PDA固体斜面培养基上的孢子洗脱，并通过无菌滤纸过滤得到孢子悬液，孢子悬液中含孢子浓度为0.5×106个/mL。
3、将步骤2制备的孢子悬液按5％接种量转接于PDA液体培养基培养(25℃，200rpm，48h)，获得液体培养物。
4、将步骤3获得的液体培养物6000rpm离心30min收集菌丝体，用无菌生理盐水洗涤二次，用无菌滤纸吸干水分，得到菌丝体。
二、出发菌株原生质体悬液的制备
1、取步骤一得到的菌丝体，采用由溶壁酶、蜗牛酶和纤维素酶混合得到的酶解液对菌丝体进行酶解反应，得到反应后的酶解液。酶解反应中：溶壁酶的使用浓度为1.2％，蜗牛酶的使用浓度0.8％，纤维素酶的使用浓度为1.0％，酶解温度为28℃，酶解时间为4h，调节酶解pH为6.5。
2、采用20％(W/V)甘露醇水溶液重悬步骤2得到的原生质体细胞沉淀，得到原生质体悬液。
三、出发菌株原生质体的常压室温等离子体(ARTP)诱变处理
1、进行预实验选择诱变处理时间，方法如下：
取10-20μL的步骤二制备的原生质体悬液，均匀涂布在金属载片的上表面，干燥后用镊子将载片转移至载物台。采用高纯氦气作为等离子体的工作气体处理菌物载片，设置电源功率60W，照射距离3mm，等离子体的温度26℃，气流量10L/min，设置不同的处理组，各组的处理时间分别为0(对照)、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55s，每组设置三次重复。将处理后的载片转移到装有1mL再生液体培养基的EP管中，在振荡器上再生培养60min，把附着在载片上的微生物洗脱到再生液体培养基中，形成菌悬液。将菌悬液涂布至再生固体培养基后置于25℃培养箱内培养3天后对平板菌落进行计数，计算致死率，致死率计算方法如下所示：
致死率％＝(未经诱变处理菌落数-经诱变处理菌落数)/未经诱变菌落数×100％
通过统计各处理组的致死率，选择致死率为85％的照射处理时间进行正式实验，处理时间为25s。
2、根据步骤1的结果，进行正式实验，方法如下：
取10μL的步骤二制备的原生质体悬液，均匀涂布在金属载片的上表面，干燥后用镊子将载片转移至载物台。采用高纯氦气作为等离子体的工作气体处理菌物载片，设置电源功率60W，照射距离3mm，等离子体的温度26℃，气流量10 L/min，处理时间为25s。样品处理完毕后，用无菌镊子将载片放至装有1mL再生培养基的EP管中，在振荡器上再生培养60min，把附着在载片上的微生物洗脱到再生液体培养基中，形成新的菌悬液。
四、优良高效积累虫草素的富硒地顶孢霉菌株的筛选
1、将步骤三得到的新的菌悬液稀释105倍，取500μL稀释液涂布到含亚硒酸钠的抗性平板，将在亚硒酸钠抗性平板长出的菌落进行影印至含有不同浓度的亚硒酸钠的抗性平板上(浓度依次从低到高)。经过多次的抗性筛选过程，获得在含亚硒酸钠50mg/L的平板上生长的菌落。
2、将步骤1的平板上的生长快速的突变菌株接种到装有1mL PDA液体培养基的96孔微孔板振荡培养，培养温度为25℃，转速为200 rpm，培养3天，离心收集菌丝体，检测菌丝体虫草素含量和硒含量。
统计得到硒耐受浓度达50mg/L的3000株突变菌株，其中虫草素含量提高的正突变菌株为209株，虫草素含量降低的负突变菌株为2791株。与出发菌株相比，正突变菌株中的202株的虫草素含量提高幅度为100％-300％，7株的虫草素含量提高幅度为500％以上。
3、收集步骤2中虫草素含量明显提高的正突变菌株(7株)，继续进行摇瓶复筛，250ml摇瓶，装液量30ml，亚硒酸钠的添加浓度为45mg/L，培养条件为25℃，200rpm，培养3天，收集菌丝体，检测其虫草素含量、硒含量及硒转化率。
硒转化率＝(突变菌株液体发酵菌丝体中的硒含量/液体发酵培养基中总的硒含量)×100％。
7株正突变菌株中，6株的虫草素含量为“3.0g/kg菌丝体干重”以下，硒含量为“200mg/kg菌丝体干重”以下，硒转化率为85％以下，另外1株菌(即编号FA 1603的菌株)的虫草素含量达到“8.0g/kg菌丝体干重”，硒含量达到“1000mg/kg菌丝体干重”，硒转化率达到99.68％”。将编号FA 1603的菌株命名为菌株FA1603，进行斜面保存及甘油保种。
五、菌株FA1603的形态鉴定及分子鉴定
1、将菌株FA1603接种至PDA固体斜面培养基(18×180mm试管)，25℃培养5天。5天后，形态学特征如下：形成白色菌落，整体呈圆形，正面淡灰白色，背面由外至内呈淡黄至棕色，中央皱缩，菌苔较稀薄，直径为25.1±0.3mm；营养菌丝无色，光滑、宽度为1.2-2.0μm，具隔膜，偶聚成绳索状的菌索或孢梗束，孢子梗直接从菌丝上长出，呈锥形，多单生，大小为9.0-17.2×1.0-2.0μm。分生孢子无色、光滑成链状，梭形，大小为2.9-4.0×1.0-1.5μm。
2、菌株FA1603的18S rDNA序列如序列表的序列1所示。
经过形态学及18S rDNA鉴定，可以确定菌株FA1603属于地顶孢霉，因此重新将其命名为地顶孢霉FA1603。
六、地顶孢霉FA1603的保藏
地顶孢霉FA1603(Acremonium terricola FA1603)于2016年06月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M2016331。地顶孢霉FA1603(Acremonium terricola FA1603)CCTCCNO：M2016331简称为地顶孢霉FA1603。
七、地顶孢霉FA1603的遗传稳定性
将地顶孢霉FA1603进行传代培养以考察其遗传稳定性，每3天传代一次，传代15代，每隔一代进行摇瓶发酵测定菌株的虫草素含量及硒的转化与富集能力，结果显示地顶孢霉FA1603传代过程中，发酵合成虫草素的含量及硒的转化与富集能力基本维持稳定，具有良好的遗传稳定性。
实施例2、地顶孢霉FA1603的应用
一、地顶孢霉FA1603的种子强化培养
1、将地顶孢霉FA1603接种至PDA固体培养基斜面(18×180mm试管)，25℃培养5天。
2、将步骤1培养的菌株转接至含20μg/mL亚硒酸钠的PDA固体培养基斜面(18×180mm试管)，25℃，培养3天。
3、用20mL无菌的生理盐水将步骤2得到的PDA固体培养基斜面上的孢子洗脱(得到的洗脱液中的孢子浓度为0.5×105个/mL)，将洗脱液全部转接至装有100g含50μg/mL亚硒酸钠的种子强化培养基的茄子瓶中，于培养箱中25℃培养3天，得到强化种子培养物(培养物孢子浓度可达到1012个/克培养物)。
二、地顶孢霉FA1603液体深层发酵培养
1、取100g步骤一制备的强化种子培养物接种于含有15L液体发酵培养基的30L发酵罐中进行培养，得到液体发酵产物。
试验组甲采用的液体发酵培养基为液体发酵培养基甲。
试验组乙采用的液体发酵培养基为液体发酵培养基乙。
试验组丙采用的液体发酵培养基为液体发酵培养基丙。
试验组甲的培养过程：发酵周期为96小时。发酵起始时，培养体系的pH为7.0，在发酵培养过程中实时监测培养体系中的还原糖浓度及pH，通过加入70％的葡萄糖水溶液控制培养体系中的还原糖浓度在0.5-1.0g/100mL(每当培养体系中的还原糖浓度低于0.5g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的还原糖浓度达到1.0g/100mL)，通过流加氨水控制发酵全过程中pH为7.0。培养全程参数为：发酵罐通气量为15L/min，搅拌控制为200rpm，温度控制在25℃，控制溶解氧(DO)为40％。
试验组乙的培养过程：发酵周期为96小时。发酵起始时，培养体系的pH为6.5，在发酵培养过程中实时监测培养体系中的还原糖浓度及pH，通过加入70％的葡萄糖水溶液控制培养体系中的还原糖浓度在0.5-1.0g/100mL(每当培养体系中的还原糖浓度低于0.5g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的还原糖浓度达到1.0g/100mL)，通过流加氨水控制发酵全过程中pH为6.0。培养全程参数为：发酵罐通气量为10L/min，搅拌控制为150rpm，温度控制在25℃，控制溶解氧(DO)为30％。
试验组丙的培养过程：发酵周期为96小时。发酵起始时，培养体系的pH为7.5，在发酵培养过程中实时监测培养体系中的还原糖浓度及pH，通过加入70％的葡萄糖水溶液控制培养体系中的还原糖浓度在0.5-1.0g/100mL(每当培养体系中的还原糖浓度低于0.5g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的还原糖浓度达到1.0g/100mL)，通过流加氨水控制发酵全过程中pH为7.5。培养全程参数为：发酵罐通气量为20L/min，搅拌控制为250rpm，温度控制在25℃，控制溶解氧(DO)为50％。
2、取100g步骤一制备的强化种子培养物接种于含有15L液体发酵培养基的30L发酵罐中进行培养。
试验组甲采用的液体发酵培养基为液体发酵培养基甲。
试验组乙采用的液体发酵培养基为液体发酵培养基乙。
试验组丙采用的液体发酵培养基为液体发酵培养基丙。
试验组甲的培养过程：发酵周期为96小时。发酵起始时，培养体系中的还原糖浓度为50g/L，培养体系的pH为7.0，在发酵培养过程中实时监测培养体系中的还原糖浓度及pH，通过加入70％的葡萄糖水溶液控制培养体系中的还原糖浓度在0.5-1.0g/100mL(每当培养体系中的还原糖浓度低于0.5g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的还原糖浓度达到1.0g/100mL)，通过流加氨水控制发酵全过程中pH为7.0。培养全程参数为：发酵罐通气量为15L/min，搅拌控制为200rpm，温度控制在25℃，控制溶解氧(DO)为40％。
试验组乙的培养过程：发酵周期为96小时。发酵起始时，培养体系中的还原糖浓度为30g/L，培养体系的pH为6.5，在发酵培养过程中实时监测培养体系中的还原糖浓度及pH，通过加入70％的葡萄糖水溶液控制培养体系中的还原糖浓度在0.5-1.0g/100mL(每当培养体系中的还原糖浓度低于0.5g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的还原糖浓度达到1.0g/100mL)，通过流加氨水控制发酵全过程中pH为6.0。培养全程参数为：发酵罐通气量为10L/min，搅拌控制为150rpm，温度控制在25℃，控制溶解氧(DO)为30％。
试验组丙的培养过程：发酵周期为96小时。发酵起始时，培养体系中的还原糖浓度为70g/L，培养体系的pH为7.5，在发酵培养过程中实时监测培养体系中的还原糖浓度及pH，通过加入70％的葡萄糖水溶液控制培养体系中的还原糖浓度在0.5-1.0g/100mL(每当培养体系中的还原糖浓度低于0.5g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的还原糖浓度达到1.0g/100mL)，通过流加氨水控制发酵全过程中pH为7.5。培养全程参数为：发酵罐通气量为20L/min，搅拌控制为250rpm，温度控制在25℃，控制溶解氧(DO)为50％。
完成发酵培养后，取整个培养体系，通过3000rpm离心15min的方式收集地顶孢霉FA1603液体发酵菌丝体。
三、地顶孢霉FA1603的固体二次发酵
取步骤二的1得到的液体发酵产物直接接种至固体发酵培养基上(每1L的液体发酵产物接种至5kg的固体发酵培养基上)，进行固体发酵培养，得到固体发酵培养物。
试验组甲采用的固体发酵培养基为固体发酵培养基甲。
试验组乙采用的固体发酵培养基为固体发酵培养基乙。
试验组丙采用的固体发酵培养基为固体发酵培养基丙。
试验组甲的固体发酵培养的培养条件为：固体发酵温度25℃，湿度为70％，光照强度为150Lx，发酵时间为4天，每天光照时间10小时、黑暗14小时。
试验组乙的固体发酵培养的培养条件为：固体发酵温度25℃，湿度为60％，光照强度为100Lx，发酵时间为5天，每天光照时间10小时、黑暗14小时。
试验组丙的固体发酵培养的培养条件为：固体发酵温度25℃，湿度为80％，光照强度为200Lx，发酵时间为3天，每天光照时间10小时、黑暗14小时。
四、地顶孢霉FA1603固体培养物的收集
完成步骤三的培养后，收集固体培养物，直接60-80℃烘干至水分＜10％，然后将其粉碎并过使用40目筛网过滤，得到富硒地顶孢霉FA1603固体二次发酵培养物。
五、对照菌株培养物的制备
将出发菌株代替地顶孢霉FA1603按照步骤一、二、三、四进行操作，收集出发菌株液体发酵菌丝体及固体二次发酵培养物。
六、富硒能力和虫草素含量的测定
1、液体发酵菌丝体中硒含量及富硒效率测定
检测步骤二的2收集的地顶孢霉FA1603液体发酵菌丝体和步骤五得到的出发菌株液体发酵菌丝体的硒含量及富硒效率。
富硒效率(硒转化率)＝(液体发酵菌丝体中的硒含量/液体发酵培养基中总的硒含量)×100％。
检测结果为如下：
实验组甲的地顶孢霉FA1603液体发酵菌丝体的硒含量达1000mg/kg菌丝体干重，每1L发酵液可获得菌丝体干重20.5g，而每1L液体发酵培养基中总的无机硒含量为20.565mg，菌株的硒转化率达99.68％。
实验组乙的地顶孢霉FA1603液体发酵菌丝体的硒含量达800mg/kg菌丝体干重，每1L发酵液可获得菌丝体干重16.5g，而每1L液体发酵培养基中总的无机硒含量为20.565mg，菌株的硒转化率达80.23％。
实验组丙的地顶孢霉FA1603液体发酵菌丝体的硒含量达900mg/kg菌丝体干重，每1L发酵液可获得菌丝体干重18.5g，而每1L液体发酵培养基中总的无机硒含量为20.565mg，菌株的硒转化率达89.96％。
出发菌株由于在含亚硒酸钠浓度为45mg/L的液体发酵培养基中菌丝体生长的不好，每1L发酵液可获得菌丝体干重2.5g，菌丝体中硒含量为5.0mg/kg菌丝体干重，而每1L液体发酵培养基中总的无机硒浓度为20.565mg，硒转化率为6.08％。
2、液体发酵菌丝体中硒蛋氨酸含量的测定
检测步骤二的2收集的地顶孢霉FA1603液体发酵菌丝体和步骤五得到的出发菌株液体发酵菌丝体中的硒蛋氨酸含量。
检测结果为如下：
实验组甲的地顶孢霉FA1603液体发酵菌丝体中的硒蛋氨酸的含量为600mg/kg菌丝体干重，占富硒培养物产品有机硒含量的60％。
实验组乙的地顶孢霉FA1603液体发酵菌丝体中的硒蛋氨酸的含量为400mg/kg菌丝体干重，占富硒培养物产品有机硒含量的40％。
实验组丙的地顶孢霉FA1603液体发酵菌丝体中的硒蛋氨酸的含量为500mg/kg菌丝体干重，占富硒培养物产品有机硒含量的50％。
出发菌株菌丝体中的硒蛋氨酸的含量为0.5 mg/kg菌丝体干重，占富硒培养物产品有机硒含量的10％。
3、固体二次发酵培养物中虫草素含量的测定
检测步骤四收集的地顶孢霉FA1603固体二次发酵培养物和步骤五得到的出发菌株固体二次发酵培养物中的虫草素含量。
检测结果为如下：
实验组甲的地顶孢霉FA1603固体二次发酵培养物中的虫草素含量达到8.0g/kg培养物干重。
实验组乙的地顶孢霉FA1603固体二次发酵培养物中的虫草素含量达到6.0g/kg培养物干重。
实验组丙的地顶孢霉FA1603固体二次发酵培养物中的虫草素含量达到7.0g/kg培养物干重。
出发菌株固体二次发酵培养物中的虫草素含量为0.25g/kg培养物干重。

Claims (10)

1.地顶孢霉FA1603(Acremonium terricola FA1603)，其保藏编号为CCTCC NO：M2016331。
2.一种地顶孢霉培养物，是通过培养权利要求1所述地顶孢霉FA1603得到的。
3.权利要求1所述地顶孢霉FA1603或权利要求2所述地顶孢霉培养物的应用，为如下(1)或(2)或(3)：
(1)制备富硒饲料添加剂；
(2)制备富硒保健品；
(3)制备富硒食品。
4.一种产品，其活性成分为权利要求1所述地顶孢霉FA1603或权利要求2所述地顶孢霉培养物。
5.一种培养权利要求1所述地顶孢霉FA1603的方法，依次包括如下步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)：
步骤(a)：采用种子强化培养基培养地顶孢霉FA1603；
步骤(b)：将步骤(a)的产物接种至液体发酵培养基进行培养；
步骤(c)：将步骤(b)的产物接种至固体发酵培养基上进行培养；
所述种子强化培养基的原料配比为：1L营养液：0.5-1.5kg小米；所述营养液由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述营养液中的浓度如下：黄豆粉1-3g/100ml、蔗糖0.5-1.5g/100ml、酵母膏0.4-0.6g/100ml、蛋白胨0.2-0.4g/100ml、磷酸二氢钾0.04-0.06g/100ml、硫酸镁0.005-0.015g/100ml、硫酸亚铁8-12mg/100ml、维生素R1 1-3mg/100ml、维生素B2 0.5-1.5mg/100ml、维生素B6 0.5-1.5mg/100ml、维生素R12 4-6μg/100ml；所述溶剂为水；
所述液体发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度如下：葡萄糖4-6g/100ml、大豆粉1-3g/100ml、玉米粉0.6-1.0g/100ml、蛋白胨1-2g/100ml、酵母膏0.6-1.0g/100ml、磷酸二氢钾0.3-0.4g/100ml、硫酸镁0.04-0.06g/100ml、亚硒酸钠4-5mg/100ml；所述溶剂为水；
所述固体发酵培养基由豆粕粉、小麦粉和麸皮粉组成；所述豆粕粉、小麦粉和麸皮粉的质量配比为3-5∶2-4∶2-4。
6.一种制备地顶孢霉培养物的方法，包括如下步骤：培养权利要求1所述地顶孢霉FA1603。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法依次包括如下步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)：
步骤(a)：采用权利要求5中所述的种子强化培养基培养地顶孢霉FA1603；
步骤(b)：将步骤(a)的产物接种至权利要求5中所述的液体发酵培养基进行培养；
步骤(c)：将步骤(b)的产物接种至权利要求5中所述的固体发酵培养基上进行培养。
8.一种用于培养权利要求1所述地顶孢霉FA1603的试剂盒，包括权利要求5中所述的种子强化培养基、液体发酵培养基和固体发酵培养基。
9.一种用于制备地顶孢霉培养物的试剂盒，包括权利要求5中所述的种子强化培养基、液体发酵培养基和固体发酵培养基。
10.权利要求7或8所述试剂盒的应用，为如下(1)或(2)或(3)：
(1)制备富硒饲料添加剂；
(2)制备富硒保健品；
(3)制备富硒食品。
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