CN103060411B - 一种甲醇蛋白肽的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及甲醇蛋白肽的生产方法，有效解决单细胞蛋白作为饲料添加剂后，出现消化不良、转化效率低的问题，巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株接种至YPD斜面培养基上，得试管斜面种子，试管斜面种子接种到YPD液体培养基上，得摇瓶一级种子，摇瓶一级种子接种到BSM液体培养基上，得二级种子，二级种子移种到发酵培养基中发酵得发酵液，灭活后过滤收集滤饼，加水稀释得滤饼稀释液，蛋白酶粉加水溶解，倒入滤饼稀释液中酶解，得酶解液，灭活，过滤，收集滤液、滤饼，回流再次酶解，收集压滤酶解液，超滤浓缩，加淀粉搅拌，喷雾干燥，本发明具有蛋白肽含量高，氨基酸组成合理，B族维生素丰富的特点，可作为替代畜禽饲料蛋白的理想原料。

Description

一种甲醇蛋白肽的生产方法
技术领域
本发明涉及生物领域，特别是一种甲醇蛋白肽的生产方法。
背景技术
应用发酵法生产单细胞蛋白作为饲料，在国内外已有较多报导，部分加工工艺较为成熟，如用假丝酵母、酿酒酵母等作为发酵菌种，以甜菜渣、啤酒糟、柑橘废渣、糖蜜等一些农副产品为原料生产的单细胞蛋白报道较多。目前，以甲醇为主要碳源生产单细胞蛋白的报道还不多，国内外生产甲醇蛋白的方法主要有细菌发酵法和酵母菌发酵法，细菌法包括英国的ICI法、德国的Hoechst-Uhde法和瑞典的Norprotein法；酵母菌种生产法包括日本的MGC法、法国的IFP法和美国的Philips Petroleum法，除ICI法工业化生产外（目前已停产），其他均未工业化。我国部分研究单位公布的实验室小试生产甲醇蛋白方法多是利用酵母菌生产单细胞蛋白，此蛋白的主要用作动物饲料添加。但研究表明，动物对此类蛋白的消化利用率较低，甚至出现消化不良的情况。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种甲醇蛋白肽的生产方法，可有效解决单细胞蛋白作为饲料添加剂后，出现消化不良、转化效率低的问题。
本发明解决的技术方案是，包括如下步骤：首先将巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株接种至YPD试管斜面培养基上，培养得试管斜面种子，试管斜面种子接种到YPD液体培养基上，培养得摇瓶一级种子，摇瓶一级种子接种到pH值为4.5～5.0的BSM液体培养基上，培养得二级种子，将二级种子全部移种到发酵罐内的发酵培养基中进行甲醇蛋白的发酵生产，发酵72～84小时后，取样测定发酵液菌体湿重达300～360g/L，得发酵液，经灭活后用箱式隔膜压滤机进行板框过滤收集滤饼（即菌体蛋白），然后将滤饼置于发酵液储罐中，加入滤饼体积3倍的水稀释并搅拌均匀，得滤饼稀释液，再对滤饼稀释液降温至45～50℃，然后取蛋白酶粉（苏柯汉生物工程有限公司，产品型号SUKAPro AC PW 50，50000U/g），加水溶解，倒入滤饼稀释液（又称菌体蛋白稀释液）中，蛋白酶粉的用量为每立方米滤饼稀释液中加5Kg蛋白酶粉，酶解，当水解度达到75%以上时，得酶解液，灭活后，经箱式隔膜压滤机（820-U型，徐州市添缘压滤机厂）过滤，收集滤液、滤饼，回流再次酶解，收集压滤酶解液后用超滤膜（上海赛奥分离技术工程有限公司）进行超滤浓缩，最后向浓缩液添加淀粉并搅拌均匀，进行喷雾干燥，收集蛋白肽干粉，即得甲醇蛋白肽。
本发明所用巴斯德毕赤酵母HGD-01菌体蛋白含量高达56%，能以甲醇为主要碳源，以氨水为氮源，辅以磷酸，二水硫酸钙，硫酸钾，七水硫酸镁，甘油和微量元素溶液等制成无机盐发酵培养基进行甲醇蛋白生产。本发明已对50L、500L及5m3发酵罐获得的甲醇蛋白进行甲醇蛋白肽的生产，经过5m3发酵罐中试验生产表明，本发明生产的单细胞蛋白具有蛋白肽含量高，氨基酸组成合理，B族维生素丰富的特点，可作为替代畜禽饲料蛋白的理想原料。
具体实施方式
以下结合实际情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明包括如下步骤：
1）、摇瓶一级种子培养
分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）HGD-01的菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2012342，保藏日期为：2012年9月12日；将巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株 0.5mL用划线法接种至YPD试管斜面培养基（试管规格180mm×20mm）上，30℃培养48小时，得试管斜面种子，取1支试管斜面种子，用10mL无菌水将斜面种子全部冲洗下来，接种到装有300mL YPD液体培养基的三角瓶中，瓶口用8层纱布包好，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养24～30小时后，菌体OD600达到3～5，获得摇瓶一级种子；所述的YPD试管斜面培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物（oxiod公司产品，公知技术，以下同）、2%胰蛋白胨（oxiod公司产品，公知技术，以下同）、2%葡萄糖、2%琼脂（北京奥博星化学试剂有限公司产品，公知技术，以下同）和余量的水混合在一起组成；所述的YPD液体培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起组成； 
2）、二级种子培养
二级种子培养在50L发酵罐中进行，具体如下：50L发酵罐装30L的BSM液体培养基，BSM液体培养基灭菌后，用氨水调BSM液体培养基pH值至4.5～5.0，然后将摇瓶一级种子300mL全部接种到50L发酵罐内pH值为4.5～5.0的BSM液体培养基上，移种前检查种子质量，镜检菌体整齐，健壮，出芽数在2～3个，无杂菌污染，接种时罐压为0.05-0.10MPa，培养时，培养温度30～32℃，通风比1：1~1.5 vvm，罐压0.05MPa，pH4.5～5.0，培养周期24~30h，得二级种子；所述的BSM液体培养基为：质量浓度85%磷酸15mL/L，二水硫酸钙0.4g/L，硫酸钾8 g/L，七水硫酸镁6 g/L，甘油36g/L和微量元素溶液3 mL/L加水制成，也就是说BSM液体培养基为质量浓度85%磷酸15mL，二水硫酸钙0.4g，硫酸钾8 g，七水硫酸镁6 g，甘油36g和微量元素溶液3 mL加水至1 L；所述的微量元素溶液为：五水硫酸铜14g/L，碘化钾0.08g/L，一水硫酸锰4g/L，二水钼酸钠0.1g/L（北京奥博星化学试剂公司产品，公知技术，以下同），硼酸0.1g/L，六水合氯化钴1g/L（北京奥博星化学试剂公司产品，公知技术，以下同），氯化锌36g/L、七水合硫酸亚铁65g/L和质量浓度为98%的浓硫酸5mL/L加水制成，也就是说微量元素溶液为五水硫酸铜14g，碘化钾0.08g，一水硫酸锰4g，二水钼酸钠0.1g，硼酸0.1g，六水合氯化钴1g，氯化锌36g、七水合硫酸亚铁65g和质量浓度为98%的浓硫酸5mL加水至1L；
3）、发酵生产甲醇蛋白
A、发酵培养基的配方和比例与上述BSM液体培养基相同：5m3发酵罐内装发酵培养基3m3，打开蒸汽阀，通蒸汽进入罐体外盘管及罐体内，用蒸汽将发酵罐中发酵培养基进行灭菌，打开压力表，待罐内压力升到0.15MPa时，调节蒸汽阀门使罐体温度保持在120℃～125℃，保温30min，同时对与罐体连接的空气过滤器进行蒸汽灭菌，灭菌结束后，对发酵培养基进行降温，当罐内发酵培养基温度降至30～35℃时，用质量浓度为35%的氨水调节发酵培养基pH至4.5～5.0；
B、将二级种子30L移种到5m3发酵罐内pH为4.5～5.0的发酵培养基中开始发酵，发酵温度30～32℃，通风比1：1.5~2 vvm，罐压0.04MPa，pH4.5～5.0，培养16~20h，发酵培养基中的甘油消耗完，溶氧开始持续上升，罐内菌体OD600达到32～35，湿重达到80～100g/L，向罐内流加甲醇，甲醇流加量为5～6克/升·小时，打开空气进口阀门，保持罐内溶氧在30%以上，当溶氧高于60%以上时，加大甲醇流加量，最大流加量达到10～15克/升·小时，发酵过程中，每12小时补加一次微量元素溶液，每次流加2升，直至发酵结束，发酵72～84小时后，取样测定菌体湿重达300～360g/L，得发酵液；用蒸汽对罐内发酵液进行灭活处理，发酵液温度达100℃，保温时间30min后，对发酵液降温至60℃～65℃；
4）、单细胞菌体蛋白的收集与酶解
降温至60℃～65℃的发酵液用箱式隔膜压滤机（820-U型，徐州市添缘压滤机厂）过滤，板框过滤面积30m2，过滤流速0.5～1.5m3/h，板框工作压力0.3～0.5MPa，过滤完成后，将箱式隔膜压滤机上的滤饼清洗下来，投加到5m3的发酵液储罐中，向罐中加入清水将滤饼稀释，清水和滤饼的体积比为3：1，搅拌均匀，得菌体蛋白稀释液，用向外盘管输入热蒸汽或冷水方式将菌体蛋白稀释液温度调整到45～50℃，然后称取蛋白酶粉（苏柯汉生物工程有限公司，产品型号SUKAPro AC PW 50，50000U/g）用水溶解，得蛋白酶溶液，以每立方米菌体蛋白稀释液中添加5Kg蛋白酶粉的量，将蛋白酶溶液倒入2m3菌体蛋白稀释液中并搅拌均匀，在45～50℃，酶解，酶解过程中，每30min取样测定水解度，当水解度达75%以上时，得酶解液，打开蒸汽阀门，对罐内酶解液中的蛋白酶进行灭活，罐内温度达100℃，保温时间20min；
5）、酶解液的板框压滤及甲醇蛋白肽的提取
将上述酶解液经箱式隔膜压滤机（820-U型，徐州市添缘压滤机厂）过滤，收集滤液和滤饼，滤液和滤饼再回收到步骤4）中的5m3发酵液储罐内用步骤4）同样的方法和用量进行酶解，得压滤酶解液；
压滤酶解液用超滤膜（上海赛奥分离技术工程有限公司，膜元件型号SG-UE-P5-4040）进行浓缩，超滤膜面积22m2，过滤压力0.6MPa，温度30℃，得浓缩液，浓缩液中为截获的分子量在5000Da以上的小分子蛋白肽；
6）、浓缩液喷雾干燥
在浓缩液中添加浓缩液体积5%的淀粉并搅拌均匀，用喷雾干燥机，进行喷雾干燥，调节进口温度至130～150℃、出口温度至65-80℃，调节进料流量为0.5吨/小时，收集蛋白肽干粉（即甲醇蛋白肽）。
实施例1：
1）、摇瓶一级种子培养
将巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株用划线法接种至YPD试管斜面培养基上，30℃培养48小时，得试管斜面种子，取1支试管斜面种子，用10mL无菌水将斜面种子全部冲洗下来，接种到装有300mL YPD液体培养基的三角瓶中，瓶口用8层纱布包好，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养28小时后，菌体OD600达到4，获得摇瓶一级种子；
2）、二级种子培养
50L发酵罐装30L的BSM液体培养基，BSM液体培养基灭菌后，用氨水调BSM液体培养基pH值至4.8，然后将摇瓶一级种子300mL全部接种到50L发酵罐内pH值为4.8的BSM液体培养基上，移种前检查种子质量，镜检菌体整齐，健壮，出芽数在2～3个，无杂菌污染，接种时罐压为0.05-0.10MPa，培养时，培养温度30℃，通风比1：1~1.5 vvm，罐压0.05MPa，pH4.8，培养周期28h，得二级种子；
3）、发酵生产甲醇蛋白
A、发酵培养基的配方和比例与BSM液体培养基相同：5m3发酵罐内装发酵培养基3m3，打开蒸汽阀，通蒸汽进入罐体外盘管及罐体内，用蒸汽将发酵罐中发酵培养基进行灭菌，打开压力表，待压力升到0.15MPa时，调节蒸汽阀门使罐体温度保持在120℃～125℃，保温30min，同时对与罐体连接的空气过滤器进行蒸汽灭菌，灭菌结束后，对发酵培养基进行降温，当罐内发酵培养基温度降至32℃时，用质量浓度为35%的氨水调节发酵培养基pH至4.8；
B、将二级种子30L移种到5m3发酵罐内pH为4.8的发酵培养基中开始发酵，发酵温度30℃，通风比1：1.7 vvm，罐压0.04MPa，pH4.8，培养18h，发酵培养基中的甘油消耗完，溶氧开始持续上升，罐内菌体OD600达到33，湿重达到90g/L，向罐内流加甲醇，甲醇流加量为5～6克/升·小时，打开空气进口阀门，保持罐内溶氧在30%以上，当溶氧高于60%以上时，加大甲醇流加量，最大流加量达到12克/升·小时，发酵过程中，每12小时补加一次微量元素溶液，每次流加2升，直至发酵结束，发酵80小时后，取样测定菌体湿重达330g/L，得发酵液；用蒸汽对罐内发酵液进行灭活处理，发酵液温度达100℃，保温时间30min，将发酵液降温至65℃；
4）、单细胞菌体蛋白的收集与酶解
降温至65℃的发酵液用箱式隔膜压滤机过滤，板框过滤面积30m2，过滤流速1m3/h，板框工作压力0.4MPa，过滤完成后，将箱式隔膜压滤机上的滤饼清洗下来，投加到发酵液储罐中0.5m3滤饼，向罐中加入1.5m3的清水将滤饼稀释，搅拌均匀，得菌体蛋白稀释液，降温至48℃，然后称取10Kg蛋白酶粉，用水溶解，倒入菌体蛋白稀释液中并搅拌均匀，在48℃，酶解4～5h，酶解过程中，每30min取样测定水解度，水解度达75%以上，得酶解液，打开蒸汽阀门，对罐内酶解液进行灭活，罐内温度达100℃，保温时间20min；
5）、酶解液的板框压滤及甲醇蛋白肽的提取
将上述酶解液经箱式隔膜压滤机（820-U型，徐州市添缘压滤机厂）过滤，收集滤液和滤饼，滤液和滤饼再回收到步骤4）中的发酵液储罐内用步骤4）同样的方法和用量进行酶解，得压滤酶解液；
取1.8～2.0m3压滤酶解液用超滤膜进行浓缩，超滤膜面积22m2，过滤压力0.6MPa，温度30℃，得浓缩液，浓缩液中为截获的分子量在5000Da以上的小分子蛋白肽，浓缩液体积0.6～0.8m3；
6）、浓缩液喷雾干燥
在浓缩液中添加浓缩液体积5%的淀粉并搅拌均匀，用喷雾干燥机，进行喷雾干燥，调节进口温度至130～150℃、出口温度至65-80℃，调节进料流量为0.5吨/小时，收集蛋白肽干粉，称重，25公斤/袋，包装。
本发明用甲醇和氨水作为主要碳源和氮源，配以无机盐和微量元素溶液配制成发酵培养基，利用巴斯德毕赤酵母HGD-01在该培养基中发酵获得单细胞菌体蛋白，再对菌体进行灭活处理，对灭活菌体蛋白进行酶解获得小分子甲醇蛋白肽。其中，发酵液先经100℃处理30min以使单细胞蛋白变性，用酶活力1×105 U/g的蛋白酶进行酶解，酶解结束后再用100℃高温处理20min使酶蛋白失活；酶解液需先经压滤板框过滤去除部分未酶解菌体，再用超滤膜截获5000Da以上的小分子蛋白肽，最后将超滤浓缩液添加5%的淀粉再进行喷雾干燥，获得小分子甲醇蛋白肽成品；本发明甲醇蛋白肽的粗蛋白含量≥56%，蛋白小肽≥40%，细胞壁多糖含量大于5%；大大提高了甲醇蛋白饲料的功能性作用。
其中，甲醇转化率达45%以上，发酵周期短、遗传稳定性和安全性好，经50吨发酵罐进行工业化中试表明，本发明实现了工业化生产，具体如下：
对8批次的5L和10L发酵罐中发酵的甲醇蛋白产量分别进行检测（见表1），5L发酵罐中各批次湿菌体产量均在108-150g/L之间，其平均值为125g/L；10L发酵罐中各批次湿菌体产量均在180-250g/L之间，其平均值为212.5g/L。
表1. 8批次的5L和10L发酵罐甲醇蛋白产量
Figure 262458DEST_PATH_IMAGE001
对10批次50L发酵罐发酵并对甲醇蛋白产量分别进行检测（见表2），50L发酵罐中各批次湿菌体产量均在250- 300g/L之间，其平均值为272g/L。该发酵结果比较稳定，每批次甲醇蛋白产量的偏差在8%以内。
表2 50L发酵罐10批次甲醇蛋白发酵结果
Figure 255821DEST_PATH_IMAGE002
对甲醇蛋白生产菌株在5m3发酵罐进行的6批次发酵结果进分析，发现发酵罐中各批次湿菌体产量均在310-355g/L之间，其平均值为331g/L（表3）。
表3. 6批次的5m3发酵罐甲醇蛋白产量
    对甲醇蛋白生产菌株在50m3发酵罐的6批次产品进行跟踪检测，发酵罐中各批次湿菌体产量均在350-400g/L，其平均值为374g/L (表4)。
表4. 6批次的50m3发酵罐甲醇蛋白产量
Figure 684846DEST_PATH_IMAGE004
本发明甲醇蛋白肽的喂养统计数据：
试验组是在饲料中添加20-30%的本发明蛋白干粉，对照组是不添加本发明蛋白粉的饲料，饮水和饲养制度两组均相同。各选227只生畜，其中，仔猪112只，肉牛115只，选择体重5-12公斤，体重差异25%的仔猪，每天加料6次，平均每头仔猪日采食量为512g，喂养10天，测试结果：试验组每头平均日增重412g，成活率96%，对照组每头平均日增重350g，成活率85%，仔猪试验组的体况明显优于对照组仔猪的体况；选用260公斤的肉牛，日喂2次，间隔12小时，早晚各喂1次，平均每头肉牛日采食量为6.5公斤，喂养15天，试验组肉牛的精神状态明显优于对照组，基本未出现畜群闹栏骚动，皮毛较光亮，肢蹄强健，试验组采食量高于对照组10%；试验组比对照组平均增重5-8%，试验组肉牛未出现疾病，未出现食欲不振及消化不良的现象，而对照组出现5例食欲不振，少食；肉牛试验组的体况明显优于对照组肉牛的体况，本发明生产的单细胞蛋白中活细胞数达180亿/g，加到饲料中喂养动物，改善动物体内微生态环境，改善动物体质。本发明生产的甲醇蛋白肽是应用在功能性动物饲料原料的生产与添加中，可作为替代畜禽饲料蛋白的理想原料。并经大、小鼠急性毒性试验表明，本发明产品是一种安全、无副作用的的饲料添加剂，具有消化转化好的功能，对增加动物体重效果好，缩短出栏率，是饲料上的一大创新。

Claims (2)

1.一种甲醇蛋白肽的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）、摇瓶一级种子培养
分类命名为巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2012342；将巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株 0.5mL用划线法接种至YPD试管斜面培养基上，30℃培养48小时，得试管斜面种子，取1支试管斜面种子，用10mL无菌水将斜面种子全部冲洗下来，接种到装有300mL YPD液体培养基的三角瓶中，瓶口用8层纱布包好，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养24～30小时后，菌体OD600达到3～5，获得摇瓶一级种子；所述的YPD试管斜面培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂和余量的水混合在一起组成；所述的YPD液体培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起组成； 
2）、二级种子培养
二级种子培养在50L发酵罐中进行，具体如下：50L发酵罐装30L的BSM液体培养基，BSM液体培养基灭菌后，用氨水调BSM液体培养基pH值至4.5～5.0，然后将摇瓶一级种子300mL全部接种到50L发酵罐内pH值为4.5～5.0的BSM液体培养基上，接种时罐压为0.05-0.10MPa，培养时，培养温度30～32℃，通风比1：1~1.5 vvm，罐压0.05MPa，pH4.5～5.0，培养周期24~30h，得二级种子；所述的BSM液体培养基为：质量浓度85%磷酸15mL/L，二水硫酸钙0.4g/L，硫酸钾8 g/L，七水硫酸镁6 g/L，甘油36g/L和微量元素溶液3 mL/L加水制成，也就是说BSM液体培养基为质量浓度85%磷酸15mL，二水硫酸钙0.4g，硫酸钾8 g，七水硫酸镁6 g，甘油36g和微量元素溶液3 mL加水至1 L；所述的微量元素溶液为：五水硫酸铜14g/L，碘化钾0.08g/L，一水硫酸锰4g/L，二水钼酸钠0.1g/L，硼酸0.1g/L，六水合氯化钴1g/L，氯化锌36g/L、七水合硫酸亚铁65g/L和质量浓度为98%的浓硫酸5mL/L加水制成，也就是说微量元素溶液为五水硫酸铜14g，碘化钾0.08g，一水硫酸锰4g，二水钼酸钠0.1g，硼酸0.1g，六水合氯化钴1g，氯化锌36g、七水合硫酸亚铁65g和质量浓度为98%的浓硫酸5mL加水至1L；
3）、发酵生产甲醇蛋白
A、发酵培养基的配方和比例与上述BSM液体培养基相同：5m3发酵罐内装发酵培养基3m3，打开蒸汽阀，通蒸汽进入罐体外盘管及罐体内，用蒸汽将发酵罐中发酵培养基进行灭菌，打开压力表，待罐内压力升到0.15MPa时，调节蒸汽阀门使罐体温度保持在120℃～125℃，保温30min，同时对与罐体连接的空气过滤器进行蒸汽灭菌，灭菌结束后，对发酵培养基进行降温，当罐内发酵培养基温度降至30～35℃时，用质量浓度为35%的氨水调节发酵培养基pH至4.5～5.0；
B、将二级种子30L移种到5m3发酵罐内pH为4.5～5.0的发酵培养基中开始发酵，发酵温度30～32℃，通风比1：1.5~2 vvm，罐压0.04MPa，pH4.5～5.0，培养16~20h，罐内菌体OD600达到32～35，湿重达到80～100g/L，向罐内流加甲醇，甲醇流加量为5～6克/升·小时，打开空气进口阀门，保持罐内溶氧在30%以上，当溶氧高于60%以上时，加大甲醇流加量，最大流加量达到10～15克/升·小时，发酵过程中，每12小时补加一次微量元素溶液，每次流加2升，直至发酵结束，发酵72～84小时后，菌体湿重达300～360g/L，得发酵液；用蒸汽对罐内发酵液进行灭活处理，发酵液温度达100℃，保温时间30min后，对发酵液降温至60℃～65℃；
4）、单细胞菌体蛋白的收集与酶解
降温至60℃～65℃的发酵液用箱式隔膜压滤机过滤，板框过滤面积30m2，过滤流速0.5～1.5m3/h，板框工作压力0.3～0.5MPa，过滤完成后，将箱式隔膜压滤机上的滤饼清洗下来，投加到5m3的发酵液储罐中，向罐中加入清水将滤饼稀释，清水和滤饼的体积比为3：1，搅拌均匀，得菌体蛋白稀释液，用向外盘管输入热蒸汽或冷水方式将菌体蛋白稀释液温度调整到45～50℃，然后称取蛋白酶粉用水溶解，得蛋白酶溶液，以每立方米菌体蛋白稀释液中添加5Kg蛋白酶粉的量，将蛋白酶溶液倒入2m3菌体蛋白稀释液中并搅拌均匀，在45～50℃，酶解，当水解度达75%以上时，得酶解液，打开蒸汽阀门，对罐内酶解液中的蛋白酶进行灭活，罐内温度达100℃，保温时间20min；
所述的蛋白酶粉型号SUKAPro AC PW50,50000U/g；
5）、酶解液的板框压滤及甲醇蛋白肽的提取
将上述酶解液经箱式隔膜压滤机过滤，收集滤液和滤饼，滤液和滤饼再回收到步骤4）中的5m3发酵液储罐内用步骤4）同样的方法和用量进行酶解，得压滤酶解液；
压滤酶解液用超滤膜进行浓缩，超滤膜面积22m2，过滤压力0.6MPa，温度30℃，得浓缩液，浓缩液中为截获的分子量在5000Da以上的小分子蛋白肽；
6）、浓缩液喷雾干燥
在浓缩液中添加浓缩液体积5%的淀粉并搅拌均匀，用喷雾干燥机，进行喷雾干燥，调节进口温度至130～150℃、出口温度至65-80℃，调节进料流量为0.5吨/小时，收集蛋白肽干粉。
2.根据权利要求1所述的甲醇蛋白肽的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：1）、摇瓶一级种子培养
将巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株用划线法接种至YPD试管斜面培养基上，30℃培养48小时，得试管斜面种子，取1支试管斜面种子，用10mL无菌水将斜面种子全部冲洗下来，接种到装有300mL YPD液体培养基的三角瓶中，瓶口用8层纱布包好，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养28小时后，菌体OD600达到4，获得摇瓶一级种子；
2）、二级种子培养
50L发酵罐装30L的BSM液体培养基，BSM液体培养基灭菌后，用氨水调BSM液体培养基pH值至4.8，然后将摇瓶一级种子300mL全部接种到50L发酵罐内pH值为4.8的BSM液体培养基上，接种时罐压为0.05-0.10MPa，培养时，培养温度30℃，通风比1：1~1.5 vvm，罐压0.05MPa，pH4.8，培养周期28h，得二级种子；
3）、发酵生产甲醇蛋白
A、发酵培养基的配方和比例与BSM液体培养基相同：5m3发酵罐内装发酵培养基3m3，打开蒸汽阀，通蒸汽进入罐体外盘管及罐体内，用蒸汽将发酵罐中发酵培养基进行灭菌，打开压力表，待压力升到0.15MPa时，调节蒸汽阀门使罐体温度保持在120℃～125℃，保温30min，同时对与罐体连接的空气过滤器进行蒸汽灭菌，灭菌结束后，对发酵培养基进行降温，当罐内发酵培养基温度降至32℃时，用质量浓度为35%的氨水调节发酵培养基pH至4.8；
B、将二级种子30L移种到5m3发酵罐内pH为4.8的发酵培养基中开始发酵，发酵温度30℃，通风比1：1.7 vvm，罐压0.04MPa，pH4.8，培养18h，罐内菌体OD600达到33，湿重达到90g/L，向罐内流加甲醇，甲醇流加量为5～6克/升·小时，打开空气进口阀门，保持罐内溶氧在30%以上，当溶氧高于60%以上时，加大甲醇流加量，最大流加量达到12克/升·小时，发酵过程中，每12小时补加一次微量元素溶液，每次流加2升，直至发酵结束，发酵80小时后，菌体湿重达330g/L，得发酵液；用蒸汽对罐内发酵液进行灭活处理，发酵液温度达100℃，保温时间30min，将发酵液降温至65℃；
4）、单细胞菌体蛋白的收集与酶解
降温至65℃的发酵液用箱式隔膜压滤机过滤，板框过滤面积30m2，过滤流速1m3/h，板框工作压力0.4MPa，过滤完成后，将箱式隔膜压滤机上的滤饼清洗下来，投加到发酵液储罐中0.5m3滤饼，向罐中加入1.5m3的清水将滤饼稀释，搅拌均匀，得菌体蛋白稀释液，降温至48℃，然后称取10Kg蛋白酶粉，用水溶解，倒入菌体蛋白稀释液中并搅拌均匀，在48℃，酶解4～5h，水解度达75%以上，得酶解液，打开蒸汽阀门，对罐内酶解液进行灭活，罐内温度达100℃，保温时间20min；
5）、酶解液的板框压滤及甲醇蛋白肽的提取
将上述酶解液经箱式隔膜压滤机过滤，收集滤液和滤饼，滤液和滤饼再回收到步骤4）中的发酵液储罐内用步骤4）同样的方法和用量进行酶解，得压滤酶解液；
取1.8～2.0m3压滤酶解液用超滤膜进行浓缩，超滤膜面积22m2，过滤压力0.6MPa，温度30℃，得浓缩液，浓缩液中为截获的分子量在5000Da以上的小分子蛋白肽，浓缩液体积0.6～0.8m3；
6）、浓缩液喷雾干燥
在浓缩液中添加浓缩液体积5%的淀粉并搅拌均匀，用喷雾干燥机，进行喷雾干燥，调节进口温度至130～150℃、出口温度至65-80℃，调节进料流量为0.5吨/小时，收集蛋白肽干粉。
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