CN111671084A - 一种复合酶解-发酵偶联的发酵松花粉提取物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合酶解‑发酵偶联的发酵松花粉提取物的制备方法，包括如下步骤：(1)、将破壁松花粉与水混合，使用纤维素酶和果胶酶进行酶解处理；(2)、进行发酵环境调节，并灭菌；(3)、接种菌种，发酵5‑7天；(4)、将步骤(3)获得的发酵液分离，得上清液与沉淀；(5)、将步骤(4)获得的沉淀进行热回流提取，分离得上清液；(6)、将步骤(4)与步骤(5)获得的上清液合并，浓缩干燥得发酵松花粉提取物。本发明的工艺能显著提高发酵松花粉提取物的产率、解决松花粉制品的致敏问题、提高其抗氧化效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种复合酶解-发酵偶联的发酵松 花粉提取物的制备方法。
背景技术
现有发酵松花粉的方法通常是将松花粉破碎后直接在发酵罐内发酵， 比如公开号为CN110037271A，名称为“一种发酵松花粉的制备方法”、公开 号为CN109588598A“一种花粉的双歧杆菌发酵方法及其发酵产物的应用”、 公开号为CN103141732A“一种利用益生菌进行松花粉发酵的新工艺”、公开 号为CN109806190A“一种松花粉的发酵提取工艺”、公开号为CN104938965B “用凝结芽孢杆菌发酵的方法及其发酵产物和应用”等的中国专利申请。但 在实际生产中，经常遇到由于松花粉破壁后易氧化而贮存时间较短的问题， 或者因为有的人消化松花粉较困难而利用甚少的问题，或者因为过敏而无法 食用松花粉产品的问题，其产品不能令一部分人满意。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种复合酶解-发酵偶联的 发酵松花粉提取物的制备方法，有效提高了松花粉提取物的提取率，且有效 解决了松花粉或松花粉提取物过敏的问题；此外，本发明方法还有效提高了 松花粉提取物的抗氧化活性，并有利于黄酮、皂苷的富集。
具体技术方案如下：
一种复合酶解-发酵偶联的发酵松花粉提取物的制备方法，包括如下步 骤：
(1)将破壁松花粉与水混合，使用纤维素酶和果胶酶进行酶解处理；
(2)进行发酵环境调节，并灭菌；
(3)接种菌种，发酵5-7天；
(4)将步骤(3)获得的发酵液分离，得上清液与沉淀；
(5)将步骤(4)获得的沉淀进行热回流提取，分离得上清液；
(6)将步骤(4)与步骤(5)获得的上清液合并，浓缩干燥得发酵松花 粉提取物。
松花粉外层存在细胞壁，异常坚硬，耐酸、耐碱且抗生物分解，由于细 胞壁的“保护”作用，无论是直接发酵还是物理方式破碎后发酵，都无法使 松花粉内的多种化合物充分释放使之充分发酵，造成发酵产品效果不如预期。 此外，松花粉中的多糖类物质异常丰富，单纯的发酵难以使其彻底脱敏。
本发明在发酵前使用纤维素酶和果胶酶(具体为酸性纤维素酶和酸性果 胶酶)对松花粉进行了酶解，解决了上述技术问题，提高了发酵松花粉提取 物的得率，显著降低了发酵松花粉提取物的致敏性，且显著提高了发酵松花 粉的抗氧化活性。此外，还降低了发酵液的黏度，有助于发酵效率的提升和 产品的分离澄清。
进一步，步骤(1)中，所述的纤维素酶为酸性纤维素酶，所述的果胶酶 为酸性果胶酶。
再进一步，步骤(1)的工作条件为：
破壁松花粉与水的质量比为1：(7-12)，酸性纤维素酶与酸性果胶酶 的用量均为以破壁松花粉质量计0.08wt％-0.15wt％，调节pH至4.8-5.0，50- 55℃酶解1.5-3h。
pH值的调节可通过盐酸或氢氧化钠实现。
进一步，步骤(2)的工作条件为：
酶解完毕后向酶解产物中加入葡萄糖、蛋白胨与乳清蛋白粉,调节pH至 7.0-7.5，进行灭菌处理；
其中，葡萄糖的用量为破壁松花粉质量的0.06-0.1倍,蛋白胨的用量为 破壁松花粉质量的0.03-0.05倍，乳清蛋白粉的用量为破壁松花粉质量的 0.01-0.025倍。
其中，所述的灭菌优选为80℃以上高温灭菌。
进一步，步骤(3)中接种的菌种为植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖 乳杆菌。
本发明在研发中将上述三种菌的混合与接种单一益生菌株进行对比。所 述的单一益生菌株包括纳豆芽孢杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、啤酒酵 母、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。实验结果表明，在单位菌 活相同的前提下，本发明的混合菌显著获得了更高的提取物得率和更好的脱 敏效果。
再进一步，步骤(3)的工作条件为：
植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的接种量均为以破壁松花粉 质量计3wt％-4wt％，搅拌均匀，35-37℃静置发酵5-7天，每8-24h搅拌一 次,使物料混匀。
上述发酵结束时，发酵液的pH值≤3.0，还原糖为0.25％-0.35％。
进一步，步骤(5)中所述的热回流提取的条件为沸水回流提取20-40min。 热回流中水的用量优选为破壁松花粉质量的7-12倍。
进一步，所述的破壁松花粉为松花粉8000-12000rpm超微粉碎10-15min 获得。
上述超微粉碎无法将松花粉完全破壁。如完全通过物理方法破壁，其能 耗非常高，成本昂贵。
进一步，步骤(4)与步骤(5)中，所述的分离为离心分离。
进一步，步骤(6)中所述的干燥为喷雾干燥；优选在喷雾干燥前进行减 压浓缩。
本发明的有益效果如下：
(1)将松花粉用于发酵中，在较低的发酵温度下，有利于保留风味物 质，经发酵的辅助作用，充分浸提出其风味及营养成分，获得目标产品营养 和功能增加的效果。
(2)将松花粉经热水浸泡后加入发酵罐，可缩短前发酵的周期，提高设 备利用率，并有利于高效率的浸提出花粉中的有效成分。
(3)松花粉经复合酶水解，由于发酵醪的营养更为丰富，发酵微生物的 生长繁殖更加旺盛，既可以在较低的温度下发酵，又有利于发酵更为彻底。 另一方面，由于发酵微生物的代谢作用，可以将一些呈结合态而较难溶解的 成分游离及溶解于发酵醪。
(4)实验结果表明，本发明的工艺能显著提高发酵松花粉提取物的产 率、解决松花粉制品的致敏问题、提高其抗氧化效果。
附图说明
图1为实验3中DPPH自由基清除率对比图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本 发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例中使用的酶制剂为：
酸性纤维素酶(潍坊苏科汉生物工程有限公司)酶活15万u/g。
酸性果胶酶(潍坊苏科汉生物工程有限公司)酶活4万u/g。
实施例中使用的菌种均购买自齐鲁工业大学菌种库，经传代及种子液培 养制备,最终用于实施方式的菌悬液的菌活为2*1010-3*1010CFU/g。
菌种的传代及种子液培养制备方法如下。
(1)菌种传代与保存：
使用传代培养基，每个培养皿15mL，斜面(试管、茄瓶等)装液至倾斜 后下液面刚好没过底端，上液面至瓶口三分之一处为佳。划线接种，37℃培 养，24小时左右可见菌体生长。
(2)菌种活化与复壮：
使用传代培养基，37℃培养，由于活化培养慢于传代培养，一般24小 时可见明显菌落。
活化后的菌株用传代培养基进行复壮。一般2～3次传代后即可获得活 力较旺盛的纯种菌株。
(3)种子液(1L蓝盖瓶)培养：
使用种子液体培养基，1L瓶每瓶装液0.9～1L，在超净台用接种环从固 体传代培养基(平板、斜面)分别刮取植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖 乳杆菌菌落，转接入种子培养瓶中。
培养条件：37℃培养24小时左右。
实施例1
(1)松花粉9000rpm超微粉碎15min，得破壁松花粉，测得破壁率85％；
将破壁松花粉投入发酵罐，按投入破壁松花粉质量的9倍向罐内加水， 开搅拌；向发酵罐中投入以破壁松花粉质量计0.1wt％的酸性纤维素酶和 0.1wt％的酸性果胶酶，用盐酸或氢氧化钠调节PH至5.0；升温至50℃并保 温，酶解处理2h；
(2)酶解完毕后向罐中加入葡萄糖，用量为破壁松花粉质量的0.1倍； 加入蛋白胨，用量为破壁松花粉质量的0.05倍；加入乳清蛋白粉，用量为破 壁松花粉质量的0.025倍；用氢氧化钠调节PH至7.5；85℃保温30min灭菌 处理；
(3)灭菌结束后将发酵罐降温至37℃，接种菌种(菌悬液)，植物乳 杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的接种量均为以破壁松花粉质量计 3.3wt％,搅拌均匀,37℃静置培养7天，每12h搅拌一次，使物料混匀；每日 取样监测pH和还原糖，发酵结束时，发酵液的pH值为2.8，还原糖为0.25％；
(4)将步骤(3)获得的发酵液4000rpm离心10min，得上清液与沉淀；
(5)向步骤(4)获得的沉淀中加入以破壁松花粉质量计9倍的水，进 行沸水回流提取30min；冷却至40℃以下后，4000rpm离心10min，分离上 清液；
(6)将步骤(4)与步骤(5)获得的上清液合并，减压浓缩后喷雾干燥 得发酵松花粉提取物。
实施例2
(1)松花粉9000rpm超微粉碎15min，得破壁松花粉，测得破壁率85％；
将破壁松花粉投入发酵罐，按投入破壁松花粉质量的12倍向罐内加水， 开搅拌；向发酵罐中投入以破壁松花粉质量计0.15wt％的酸性纤维素酶和 0.15wt％的酸性果胶酶，用盐酸或氢氧化钠调节PH至5.0；升温至55℃并保 温，酶解处理2h；
(2)酶解完毕后向罐中加入葡萄糖，用量为破壁松花粉质量的0.08倍； 加入蛋白胨，用量为破壁松花粉质量的0.04倍；加入乳清蛋白粉，用量为 破壁松花粉质量的0.015倍；用氢氧化钠调节PH至7.5；85℃保温30min灭 菌处理；
(3)灭菌结束后将发酵罐降温至37℃，接种菌种，植物乳杆菌、副干 酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的接种量均为以破壁松花粉质量计3.0wt％,搅拌均 匀,35℃静置培养5天，每8h搅拌一次，使物料混匀；每日取样监测pH和 还原糖，发酵结束时，发酵液的pH值为3.0，还原糖为0.3％；
(4)将步骤(3)获得的发酵液4000rpm离心10min，得上清液与沉淀；
(5)向步骤(4)获得的沉淀中加入以破壁松花粉质量计8倍的水，进 行沸水回流提取30min；冷却至40℃以下后，4000rpm离心10min，分离上 清液；
(6)将步骤(4)与步骤(5)获得的上清液合并，减压浓缩后喷雾干燥 得发酵松花粉提取物。
实施例3
(1)松花粉9000rpm超微粉碎15min，得破壁松花粉，测得破壁率85％；
将破壁松花粉投入发酵罐，按投入破壁松花粉质量的7倍向罐内加水， 开搅拌；向发酵罐中投入以破壁松花粉质量计0.08wt％的酸性纤维素酶和 0.08wt％的酸性果胶酶，用盐酸或氢氧化钠调节PH至5.0；升温至50℃并保 温，酶解处理2h；
(2)酶解完毕后向罐中加入葡萄糖，用量为破壁松花粉质量的0.1倍； 加入蛋白胨，用量为破壁松花粉质量的0.05倍；加入乳清蛋白粉，用量为 破壁松花粉质量的0.025倍；用氢氧化钠调节PH至7.5；85℃保温30min灭 菌处理；
(3)灭菌结束后将发酵罐降温至37℃，接种菌种，植物乳杆菌、副干 酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的接种量均为以破壁松花粉质量计4wt％,搅拌均 匀,37℃静置培养6天，每24h搅拌一次，使物料混匀；每日取样监测pH和 还原糖，发酵结束时，发酵液的pH值为2.5，还原糖为0.28％；
(4)将步骤(3)获得的发酵液4000rpm离心10min，得上清液与沉淀；
(5)向步骤(4)获得的沉淀中加入以破壁松花粉质量计10倍的水，进 行沸水回流提取30min；冷却至40℃以下后，4000rpm离心10min，分离上 清液；
(6)将步骤(4)与步骤(5)获得的上清液合并，减压浓缩后喷雾干燥 得发酵松花粉提取物。
对比例1
与实施例1的区别在于：步骤(1)的酶解中，仅使用酸性纤维素酶，不 使用酸性果胶酶，酸性纤维素酶的用量与实施例1相同；
其余技术特征与实施例1相同。
对比例2
与实施例1的区别在于，不对松花粉进行酶解，直接调节发酵环境、灭 菌并发酵。
对比例3
与实施例1的区别在于，步骤(1)中，通过超微粉碎制备破壁率100％ 的松花粉；酶解中，仅使用酸性果胶酶，酸性果胶酶的用量与实施例1相同；
其余技术特征与实施例1相同。
实验1
比较实施例1和对比例1-3获得的发酵松花粉提取物的产率、黄酮、总 皂苷含量的影响，检测结果见表1。
产率＝发酵松花粉提取物质量/破壁松花粉质量×100％
表1：松花粉发酵提取物功能性成分检测
实验2
比较实施例1和对比例1-3获得的发酵松花粉提取物以大鼠嗜碱性白血 病细胞模型(RBL)进行过敏性评价，比较复合酶解-发酵偶联方法与直接发 酵方法对花粉致敏性的影响。通过检测RBL细胞脱颗粒的生物标志物——组 胺和氨基己糖苷酶来评价致敏性。检测结果见表2。
表2：RBL CELL致敏性分析
| 阴性对照 | 阳性对照 | 实施例1 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | |
| 脱颗粒效率％ | 0 | 100 | 0.6 | 4.7 | 4.1 | 2.2 |
实验3
通过体外抗氧化检测(DPPH自由基清除实验)分析实施例1和对比例1- 3获得的发酵松花粉提取物的抗氧化效果。
取DPPH自由基1mg，与24ml无水乙醇充分混合震荡，配制得到深紫红 色的DPPH自由基母液，取2ml母液分别与实施例1和对比例1-3样品混合 反应，用分光光度计在517nm处检测吸光度。DPPH自由基清除计算公式为：
DPPH自由基清除率％＝(A对照-A样品)/A对照*100
式中：A对照为未加样品的DPPH自由基吸光度；A样品为加入样品反应后的 DPPH自由基吸光度。
实验结果见图1。
结果分析：实施例1条件所得发酵松花粉提取物在产率、黄酮和总皂苷 含量、致敏性降低和抗氧化能力方面均明显优于对比例1-3。说明，本发明 的工艺能显著提高发酵松花粉提取物的产率、达到功效富集、解决松花粉制 品的致敏问题、提高其抗氧化效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明 的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种复合酶解-发酵偶联的发酵松花粉提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将破壁松花粉与水混合，使用纤维素酶和果胶酶进行酶解处理；
(2)进行发酵环境调节，并灭菌；
(3)接种菌种，发酵5-7天；
(4)将步骤(3)获得的发酵液分离，得上清液与沉淀；
(5)将步骤(4)获得的沉淀进行热回流提取，分离得上清液；
(6)将步骤(4)与步骤(5)获得的上清液合并，浓缩干燥得发酵松花粉提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的纤维素酶为酸性纤维素酶，所述的果胶酶为酸性果胶酶。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)的工作条件为：
破壁松花粉与水的质量比为1：(7-12)，酸性纤维素酶与酸性果胶酶的用量均为以破壁松花粉质量计0.08wt％-0.15wt％，调节pH至4.8-5.0，50-55℃酶解1.5-3h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)的工作条件为：
酶解完毕后向酶解产物中加入葡萄糖、蛋白胨与乳清蛋白粉,调节pH至7.0-7.5，进行灭菌处理；
其中，葡萄糖的用量为破壁松花粉质量的0.06-0.1倍,蛋白胨的用量为破壁松花粉质量的0.03-0.05倍，乳清蛋白粉的用量为破壁松花粉质量的0.01-0.025倍。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中接种的菌种为植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)的工作条件为：
植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的接种量均为以破壁松花粉质量计3wt％-4wt％，搅拌均匀，35-37℃静置发酵5-7天，每8-24h搅拌至混匀一次。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，发酵结束时，pH值≤3.0，还原糖为0.25％-0.35％。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述的热回流提取的条件为沸水回流提取20-40min。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的破壁松花粉为松花粉8000-12000rpm超微粉碎10-15min获得。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)与步骤(5)中，所述的分离为离心分离。
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