CN114081854A - 一种具有屏障修复功能的松花粉提取物及其发酵制备工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有屏障修复功能的松花粉提取物，所述松花粉提取物由植物乳杆菌发酵制得，所述的植物乳杆菌保藏编号为CCTCC NO：M 20211332，保藏于中国典型培养物保藏中心。本发明提供的松花粉提取物中引入植物乳杆菌，可以有效促进松花粉提取物中蛋白类成分的转化和分解，在保证安全性的同时，有效地提升了松花粉的屏障修复功能，可以应用于具有角质修复作用的护肤品中。

Description

一种具有屏障修复功能的松花粉提取物及其发酵制备工艺
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有屏障修复功能的松花粉提取物及其发酵制备工艺。
背景技术
松花粉，药名。为松科植物马尾松PinusmassonianaLamb.、油松PinustabuliformisCarr.或同属数种植物的干燥花粉。春季花刚开时，采摘花穗，晒干，收集花粉，除去杂质。松花粉被自古以来整整37部药典收录，包括《中华人民共和国药典》。其中，在药典中对其功能是这样记载的“主治：用于湿疹，黄水疮，皮肤糜烂，脓水淋漓，外伤出血；尿布性皮炎”。“用法用量：外用适量，撒敷患处”。
在实际的应用研究中，发现松花粉提取物具有一定的屏障修复功能，但是由于使用效果不理想，并未见大规模的产业化应用。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种具有屏障修复功能的松花粉提取物及其发酵制备工艺，松花粉提取物中引入植物乳杆菌(保藏编号：CCTCC NO：M20211332)，可以有效促进松花粉提取物中蛋白类成分的转化和分解，在保证安全性的同时，有效地提升了松花粉的屏障修复功能，可以应用于具有角质修复作用的护肤品中。
本发明的第一个目的在于，提供一种具有屏障修复功能的松花粉提取物，所述松花粉提取物由植物乳杆菌发酵制得，所述的植物乳杆菌保藏编号为CCTCC NO：M 20211332，保藏于中国典型培养物保藏中心。
本发明的有益效果是：本发明的松花粉提取物中引入植物乳杆菌(保藏编号：CCTCC NO：M 20211332)，从自然发酵食品中分离植物乳杆菌，该菌种自天然发酵食品中分离纯化所得。该菌种具有良好的生长特性，且能够充分发酵转化植物源材料，可作为植物源底物发酵转化的良好菌株；可以有效促进松花粉提取物中蛋白类成分的转化和分解，在保证安全性的同时，有效地提升了松花粉的屏障修复功能，可以应用于具有角质修复作用的护肤品中。
本发明的第二个目的在于，提供上述具有屏障修复功能的松花粉提取物的发酵制备工艺，包括如下步骤：
(1)经过料液比1：(15～20)提取松花粉；
(2)向步骤(1)提取后的松花粉中加入如权利要求1所述的植物乳杆菌，进行发酵，得松花粉提取物。
进一步，步骤(1)中，所述的松花粉采用沸水提取0.3～1h。
进一步，步骤(1)中，向提取后的松花粉中加入碱性蛋白酶0.18％～0.25％，调整pH值5.5～6.5，在60～70℃下搅拌酶解1.5～2.5h。
进一步，步骤(2)中，加入2％～3％的植物乳杆菌。
进一步，步骤(2)中，加入2％～3％的植物乳杆菌之前，先按照1：(0.3～0.8)的体积比通入无菌高纯二氧化碳气体，再发酵5～7天。
本发明的第三个目的在于，提供上述具有屏障修复功能的松花粉提取物在具有角质修复作用的护肤品中的作用。
【生物保藏说明】
中国典型培养物保藏中心登记入册编号：CCTCC NO：M 20211332；
参椐的生物材料(株)：F-B18-1；
上述请求保藏的生物材料(株)附有建议的分类命名：植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)；
该生物材料(株)已于2021年10月28日由国典型培养物保藏中心收到，并登记入册。
中国典型培养物保藏中心地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明引入植物乳杆菌(保藏编号：CCTCC NO：M 20211332，从自然发酵食品中分离植物乳杆菌，该菌种自天然发酵食品中分离纯化所得；
(2)本发明提供的植物乳杆菌具有良好的生长特性，且能够充分发酵转化植物源材料，可作为植物源底物发酵转化的良好菌株；
(3)本发明提供的植物乳杆菌，可以有效促进松花粉提取物中蛋白类成分的转化和分解，在保证安全性的同时，有效地提升了松花粉的屏障修复功能，可以应用于具有角质修复作用的护肤品中。
附图说明
图1为实施例4中松花粉提取物对兜甲蛋白(LOR)的修复作用的荧光显微镜图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明实施例中使用的碱性蛋白酶购自广西庞博生物工程有限公司。
实施例1
一种具有屏障修复功能的松花粉提取物的发酵制备工艺，包括如下步骤：
(1)经过料液比1：15提取松花粉，加入碱性蛋白酶0.2％，调整pH值5.5，在60℃下搅拌酶解2h；
(2)先向步骤(1)提取并酶解后的松花粉中按照1：0.5的体积比通入无菌高纯二氧化碳气体，再加入2.5％植物乳杆菌进行发酵，发酵6天，得松花粉提取物。
实施例2
一种具有屏障修复功能的松花粉提取物的发酵制备工艺，包括如下步骤：
(1)经过料液比1：15提取松花粉，沸水提取0.5h；
(2)先向步骤(1)沸水提取后的松花粉中按照1：0.5的体积比通入无菌高纯二氧化碳气体，再加入2.5％植物乳杆菌进行发酵，发酵6天，得松花粉提取物。
实施例3
一种具有屏障修复功能的松花粉提取物的发酵制备工艺，包括如下步骤：
(1)经过料液比1：15提取松花粉；
(2)先向步骤(1)提取后的松花粉中按照1：0.5的体积比通入无菌高纯二氧化碳气体，再加入2.5％的植物乳杆菌进行发酵，发酵6天，得松花粉提取物。
实施例4
一种具有屏障修复功能的松花粉提取物的发酵制备工艺，包括如下步骤：
(1)经过料液比1：15提取松花粉，沸水提取0.5h，加入碱性蛋白酶0.2％，调整pH值5.5，在60℃下搅拌酶解2h；
(2)先向步骤(1)沸水提取并酶解后的松花粉中按照1：0.5的体积比通入无菌高纯二氧化碳气体，再加入2.5％植物乳杆菌，此时反应体系中的菌活为2.5*103cfu/L，进行发酵，发酵6天，得松花粉提取物。
对比例1
参照实施例1，与实施例1的区别在于，加入酸性果胶酶代替碱性蛋白酶，调整pH值4，在60℃下搅拌酶解2h。
对比例2
参照实施例1，与实施例1的区别在于，加入酸性纤维素酶代替碱性蛋白酶，调整pH值4，在60℃下搅拌酶解2h。
对比例3
参照实施例1，与实施例1的区别在于，加入碱性果胶酶代替碱性蛋白酶，调整pH值6，在60℃下搅拌酶解2h。
对比例4
参照实施例1，与实施例1的区别在于，加入脂肪酶代替碱性蛋白酶，调整pH值6.5，在60℃下搅拌酶解2h。
实施例1与对比例1-4的实验结果如表1所示。
表1实施例1与对比例1-4的实验结果
实验 底物/g 干沉淀/g 得率/％
实施例1 100 67.85 32.15
对比例1 100 78.03 21.97
对比例2 100 72.91 27.09
对比例3 100 83.01 16.99
对比例4 100 86.79 13.21
由表1可知，相比于对比例1-4，本发明实施例1中松花粉提取物的得率最高，说明本发明实施例1中所使用的碱性蛋白酶的酶解效率最高。
实施例2与实施例3的实验结果如表2所示。
表2实施例2与实施例3的实验结果
实验 底物/g 干沉淀/g 得率/％
实施例2 100 57.85 33.92
实施例3 100 71.02 28.98
由表2可知，本发明实施例2中松花粉提取物的得率高于实施例3中松花粉提取物的得率，说明本发明实施例2中所使用的沸水提取工艺对松花粉提取物的制备具有重要影响。
对比例5
参照实施例3，与实施例3的区别在于，加入纳豆枯草芽孢杆菌代替植物乳杆菌。
对比例6
参照实施例3，与实施例3的区别在于，加入副干酪乳杆菌代替植物乳杆菌。
对比例7
参照实施例3，与实施例3的区别在于，加入啤酒酵母代替植物乳杆菌。
实施例3与对比例5-7的实验结果如表3所示。
表3实施例3与对比例5-7的实验结果
实验 底物/g 干沉淀/g 得率/％
实施例3 100 71.02 28.98
对比例5 100 81.7 18.13
对比例6 100 80.56 19.44
对比例7 100 84.27 15.73
由表3可知，相比于对比例5-7，本发明实施例3中松花粉提取物的得率最高，说明本发明实施例3中所使用的植物乳杆菌的发酵效率最高。
对比例8
参照实施例4，与实施例4的区别在于，只进行步骤(1)中的沸水浸提和酶解工艺，不进行步骤(2)。
实施例4与对比例8的实验结果如表4所示。
表4实施例4与对比例8的实验结果
实验 底物/g 干沉淀/g 得率/％
实施例4 100 66.08 42.15
对比例8 100 72 27.9
由表4可知，相比于对比例8，本发明实施例4中松花粉提取物的得率更高，可进一步说明本发明实施例4中所使用的植物乳杆菌具有很高的发酵效率。
实验1
制备工艺对各个功能成分富集的影响，如表5所示。
表5制备工艺对各个功能成分富集的影响
Figure BDA0003364703340000071
由表5可知，该制备工艺可以有效富集功能成分皂苷，尤其实施例4对皂苷的富集能力更强。
实验2
皮肤修复作用的测试实验
以3D表皮皮肤模型
Figure BDA0003364703340000072
为测试对象，通过一定剂量的UVB辐照建立皮肤损伤模型，模型各项指标同光敏感肌肤类似。
将实施例4的样品涂抹于UVB-EpiKutis损伤模型表面后，通过测屏障相关蛋白表达，评估样品在抵抗屏障功能受损方面是否具有修复作用。
角质屏障相关蛋白测试主要利用Hoechest染色的方法，滴加1滴抗荧光淬灭封片剂封片，48h内采用荧光显微镜进行图片采集，图片放大倍数为400倍(目镜10×，物镜40×)。应用IPP软件，各组取3张图片，如图1所示，BC为空白组，未进行UVB辐照；NC为阴性对照组，只进行UVB辐照；PC为阳性对照组，进行UVB辐照后涂抹地塞米松；实验组为进行UVB辐照后涂抹实施例4的样品；分别用IPP软件计算出相对积分光密度值(相对IOD/Area)，后取平均值进行统计学分析。
由图1可知，正常组的积分光密度为0.311，受到角质屏障损伤后(阴性对照组)降到0.018，涂抹实施例4的样品后，积分光密度上升到0.183，证明实施例4的松花粉提取物具有较好TGM1屏障蛋白修复作用。
实验3
对炎症因子1L-1α的影响实验
3D表皮皮肤模型
Figure BDA0003364703340000081
为测试对象，通过一定剂量的UVB辐照建立皮肤损伤模型，模型各项指标同光敏感肌肤类似。
分别使用实施例1-4松花粉提取物(实验组)和地塞米松(阳性对照组)进行孵育。孵育结束后，收集模型培养液。根据炎症因子的ELISA(酶联免疫吸附剂测定)检测试剂盒的操作说明书进行检测分析，测试炎症因子1L-1α的浓度，如表6所示。
表6对炎症因子1L-1α的影响实验
Figure BDA0003364703340000091
由表6可知，实施例4的样品能有效抑制皮肤角质屏障损伤带来的炎症因子异常升高。
需要注意的是，本发明中的照片类图片的原图为彩图，如有需求，可提供原图作为证据。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种具有屏障修复功能的松花粉提取物，其特征在于，所述松花粉提取物由植物乳杆菌发酵制得，所述的植物乳杆菌保藏编号为CCTCC NO：M20211332，保藏于中国典型培养物保藏中心。
2.一种如权利要求1所述的松花粉提取物的发酵制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：
(1)经过料液比1：(15～20)提取松花粉；
(2)向步骤(1)提取后的松花粉中加入如权利要求1所述的植物乳杆菌，进行发酵，得松花粉提取物。
3.根据权利要求2所述的发酵制备工艺，其特征在于，步骤(1)中，所述的松花粉采用沸水提取0.3～1h。
4.根据权利要求2或3所述的发酵制备工艺，其特征在于，步骤(1)中，向提取后的松花粉中加入碱性蛋白酶0.18％～0.25％，调整pH值5.5～6.5，在60～70℃下搅拌酶解1.5～2.5h。
5.根据权利要求4所述的发酵制备工艺，其特征在于，步骤(2)中，加入植物乳杆菌之前，先按照1：(0.3～0.8)的体积比通入无菌高纯二氧化碳气体，再发酵5～7天。
6.一种如权利要求1所述的松花粉提取物在具有角质修复作用的护肤品中的作用。
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