CN112899180B - 一种具有抑菌效果的解淀粉芽孢杆菌hd-1菌株及其分离方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抑菌效果的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens HD‑1菌株及其分离方法和应用，所述菌株分离自条纹斑竹鲨，并于2019年7月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.18080。本发明得到的解淀粉芽孢杆菌菌株HD‑1及其菌剂具有良好的防腐效果，可以有效的延长豆腐渣的腐败时间，对于豆腐渣的综合开发利用具有非常大的帮助，极大的减少了资源的浪费。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种具有抑菌效果的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens HD-1菌株及其分离方法和应用。
背景技术
豆腐渣是豆腐加工时所产生的一种副产品，通过对豆腐渣的营养成分进行分析，人们发现豆腐渣中含有17～19％粗蛋白、5～7％粗脂肪、36～38％总糖等，营养价值甚高；但目前我国对豆腐渣的利用率较低，除部分豆腐渣被用作饲料、少量用于制备膳食纤维以外，其余大部分的豆腐渣都作为废弃物扔掉。究其原因是，豆腐渣本身含水量很大且营养丰富，使它成为微生物的良好栖身地，未经加工或者干燥处理的豆腐渣容易在短时间内迅速腐败，再者豆腐渣干燥处理费用大，或干燥后作为原料还没有很好的销路，严重妨碍了豆腐渣的综合利用，造成了资源的大大浪费和环境污染问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服背景技术的技术缺陷，提供一种具有抑菌效果的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens HD-1菌株及其分离方法和应用。本发明主要是利用一种从条纹斑竹鲨Chiloscyllium plagiosum肠道内分离得到的一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens HD-1的菌剂处理豆腐渣延长其腐败时间的技术。该技术包括对条纹斑竹鲨肠道的处理、原菌液的获取、菌群的分离固体培养基、菌剂的制备、豆腐渣防腐处理。经防腐实验证明，本发明菌剂可有效延长豆腐渣的腐败时间，为更好的综合利用豆腐渣提供便利。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种具有抑菌效果的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens HD-1菌株，分离自条纹斑竹鲨，并于2019年7月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.18080。
所述芽孢杆菌HD-1菌株的单菌落形态如图1所示。
所述芽孢杆菌HD-1菌株的分离过程如下：
条纹斑竹鲨，来自广东海域，购回后放于遮光水箱内暂养数日后，对其进行手术取其肠道，75％的酒精擦拭外表面后于紫外超净台内解剖其肠道，取出肠道内容物及粘膜液，使用生理盐水稀释，得到原菌液。以稀释涂布的方法涂布于海水LB固体培养基内，置于37℃培养箱培养，海水LB固体培养基成分：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂13g，1000mL人工海水，摇动容器直至溶质溶解，在121℃下灭菌20min，每个玻璃平板内倒入15～30mL培养基，优选为20mL培养基。人工海水为本实验室自配，由蒸馏水加适量海盐溶解的母液配制而成，pH为6.8～7.2，pH优选为7.0。
所述芽孢杆菌HD-1菌株的遗传学特征：用细菌基因组试剂盒提取细菌基因DNA后，利用通用引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶回收纯化后，连接质粒载体，然后将连接产物转化到感受态细胞中，进行阳性克隆的筛选，培养后测序。该菌株的16S rDNA基因序列为：
GGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGACCAGCATTCAGTTGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAAGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAG(如图2所示)。将该序列与GenBank中已登录的部分菌株的16S rDNA基因序列进行相似性比较，结果表明该菌株属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
所述芽孢杆菌HD-1菌株菌剂处理豆腐渣过程如下：
按照1:100的比例接取HD-1菌株到LB液体培养基(配方：5g酵母提取物，10g胰化蛋白胨，10g氯化钠，1L去离子水)中，37℃摇床培养过夜，按照100ml菌液/1kg鲜豆腐渣的比例混合均匀即可。
本发明还提供一种具有抑菌效果的微生物菌剂，其活性成分包括芽孢杆菌HD-1菌株。
本发明还提供上述微生物菌剂的制备方法，包括芽孢杆菌HD-1菌株的扩大培养和发酵步骤。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明材料选自大豆加工成豆腐后留下的副产物，我国每年大概产生280万吨豆腐渣，除了少部分能够及时加工为饲料外，其余大部分均因豆腐渣易腐败而被大量丢弃，造成严重的环境污染问题，而本发明可有助于解决这一问题；
(2)本发明得到的解淀粉芽孢杆菌菌株HD-1及其菌剂具有良好的防腐效果，可以有效地延长豆腐渣的腐败时间，对于豆腐渣的综合开发利用具有非常大的帮助，极大地减少了资源的浪费。
附图说明
图1为本发明实施例1具有抑菌效果的解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens HD-1菌株的单菌落形态图；
图2为本发明实施例1具有抑菌效果的解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens HD-1菌株的16S rDNA序列图；
图3为本发明实施例1具有抑菌效果的解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens HD-1菌株的PCR鉴定电泳图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
以下是对实验材料的具体描述。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
实施例1
材料和试剂：
1.材料：
条纹斑竹鲨来自广东海域，鲜豆腐渣购于浙江省杭州市江干区高沙农贸市场。
2.主要试剂：
海盐购自仟湖鱼业集团；琼脂粉(Agar)购自日本BIOSHARP公司；蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)购自英国Oxoid公司；其余试剂为国产分析纯。
LB液体培养基：5g酵母提取物，10g胰化蛋白胨，10g氯化钠，1L去离子水。
3.主要仪器：
索氏抽提器、凯式定氮仪、分析天平、恒温水浴锅、蒸馏装置。
菌株HD-1对豆腐渣防腐效果的检验具体方法和步骤：
(1)接种1mL芽孢杆菌HD-1菌液至100mL LB液体培养基培养，置于220rpm，37℃摇床培养过夜；
(2)分别取1kg鲜豆腐渣作为实验组、对照组，实验组加入100ml上述菌液并混合均匀，对照组加入100ml去离子水混合均匀，各自取样10g用于检测，其余样品密封保存于阴凉干燥处，每两天取样一次；
(3)各样品经冷冻干燥后粉碎，过80目筛，得到豆腐渣粉，用于检测其中营养物质。
营养成分测定方法如下：
蛋白质含量测定：凯式定氮法(GB5009.5-2016)；脂肪含量测定：索式提取法(GB5009.6-2016)；
粗纤维含量测定：酸洗碱洗法(GB/T5009.10-2003)；总糖量测定：称取一定量豆腐渣粉放入100ml烧杯中，加入10ml 6mol/L HCL，40ml蒸馏水，在沸水浴中加热30min，去除1～2滴水解液置于白板上，加1滴I-KI溶液检验水解是否完全。水解完毕冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6mol/L NaOH溶液中和溶液至溶液呈微红色，过滤，采用DNS法测总糖含量。
表1豆腐渣样品中营养成分所占干重比
结论：根据表1中营养成分的实时变化情况以及对豆腐渣样品的实时观测，可知实验组大致在第十五天开始出现腐败，而对照组在第五～第六天开始腐败，由此可知本发明解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens HD-1大致可延长豆腐渣保鲜效果9～10天。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁波中瑞生物科技有限公司
<120> 一种具有抑菌效果的解淀粉芽孢杆菌HD-1菌株及其分离方法和应用
<130> 2020-11-19
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1066
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 1
ggaagaacaa gtgccgttca aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac 60
ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat 120
tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc 180
ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt 240
gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc 300
tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt 360
ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct 420
aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga 480
cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 540
ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg 600
acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 660
gagcgcaacc cttgaccagc attcagttga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg 720
gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac 780
cggggctaat accggatggt tgtttgaacc gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg 840
ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa 900
ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc 960
cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa gaaagtctga cggagcaacg 1020
ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttag 1066
Claims (5)
1.一种具有抑菌效果的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens HD-1菌株，其特征在于，分离自条纹斑竹鲨，并于2019年7月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.18080。
2.如权利要求1所述的一种具有抑菌效果的解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens HD-1菌株在豆腐渣防腐处理中的应用。
3.如权利要求2所述的一种具有抑菌效果的解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens HD-1菌株在豆腐渣防腐处理中的应用，其特征在于，应用方法包括如下步骤：
(1)按照1∶100的比例接取芽孢杆菌HD-1菌株到LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；
(2)按照100ml菌液/1kg鲜豆腐渣的比例混合均匀即可；
所述步骤(1)中，所述LB液体培养基成分为：5g酵母提取物，10g胰化蛋白胨，10g氯化钠，1L去离子水。
4.一种具有抑菌效果的微生物菌剂，其特征在于，其活性成分包括如权利要求1所述的一种具有抑菌效果的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens HD-1菌株。
5.如权利要求4所述的一种具有抑菌效果的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括所述解淀粉芽孢杆菌芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens HD-1菌株的扩大培养和发酵步骤。
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