CN109439577B - 一株广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一株广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。该菌株命名为Bacillus amyloliquefaciens JFL21，于2018年11月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO：60473。本发明的解淀粉芽孢杆菌JFL21培养条件简单、容易保存、抗逆性强，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景；其发酵上清液对19株常见食源性病原菌及水产病原菌均具有广谱抗菌活性，其中对单核细胞增生李斯特氏菌及嗜水气单胞菌的抑菌性能极为稳定，可进一步开发作为益生菌剂、生物保鲜剂或抗菌药物，用于食品防腐或防治水产养殖病害，从而在一定程度减少抗生素的使用，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株具有广谱抗菌能力的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JFL21，以及该菌株在防治食源性病原菌及水产病原菌方面的应用。
背景技术
病原微生物广泛分布于自然界，其危害严重影响了各行业的健康发展。首先，病原微生物是引起食品腐败变质和食源性疾病的主要因素，在食品的加工、储藏及运输过程中，由于病原微生物的污染而导致食品腐败变质的现象经常发生。据统计，在世界范围内每年有超过25％的食品因病原微生物污染而白白浪费，每年造成的经济损失高达几百亿美元(Papadopoulou等,2014；袁建国，2011)。此外，病原微生物滋生导致食品腐败变质给食品行业带来巨大经济损失的同时，也给食品安全带来严重危害。据世界卫生组织(WHO)发布的2007-2015年全球食源性疾病统计数据显示，全球每年有多达6亿人或近十分之一的人患食源性疾病，导致42万人死亡，5岁下儿童约12.5万人，其中细菌引起的食源性疾病最严重，常见的食源性病原菌包括李斯特氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌等(WHO，2015；陈小敏等，2017，王晓红等，2011)。其次，病原微生物还是引起水产养殖动物发病的主要原因。据统计，水产养殖病害每年发病率达50％以上，损失率在20％左右，每年因水产养殖病害而造成的直接经济损失达到百亿元(Kim等,2014；Touraki等,2012；Nair等,2011)。从水产动物的主要病害看，危害较大的细菌性病害大多由嗜水气单胞菌、弧菌、假单胞菌等所引起(吴燕燕等，2009)。因此，如何高效防治食源性病原菌和水产病原菌，有效解决食品储藏和水产养殖过程病原微生物的污染问题，对保障我国食品工业及水产养殖业的健康发展至关重要。
虽然抗生素对食品工业及集约化水产养殖的发展做出了重大贡献，但抗生素的长期大量使用正加速病原微生物的抗性进化，导致了大量耐药病原菌的出现，引发了一系列食品安全、公共卫生和生态环境等方面的问题，已严重危及人类社会健康发展。如近年来出现的耐甲氧西林青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)，耐万古霉素肠球菌(VRE)、产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)细菌，多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)以及产Ⅰ型新德里金属β-内酰胺酶细菌(NDM-1)等超级细菌，因具有多重耐药性，传播快以及致命性强的特点，一度造成无药可用的恐慌局面(高德伟等，2011；陈美恋等，2015)。此外，据WHO于2014年的评估报告，全球每年至少有70万人因耐药菌感染而死亡，预计到2050年可高达1000万人，其中欧洲每年由抗生素耐药导致的死亡人数多达2.5万人，直接经济损失高达150亿欧元(Laxminarayan等，2016；Kraker等，2016)。因此，寻找新型有效的抗生素替代物是当下人类生存发展的迫切命题。
近年来，随着国家和社会对国民健康、食品安全、环境污染的日益关注，利用有益微生物及其活性代谢产物作为生物保鲜剂或饲料添加剂，用于防控食品储藏及水产养殖过程病原微生物侵染，得到了广泛重视。然而，虽然国内外至今已经筛选获得了许多应用潜力较大的拮抗菌菌株，包括细菌、酵母、霉菌等，但已经商业化生产应用的屈指可数。其中，菌株抗菌谱较窄、防治效果不稳定、应用环境条件苛刻及生产成本高等因素限制了大量拮抗菌株的生产应用推广。因此，筛选获得高效、安全、广谱、稳定的拮抗菌菌株，对保障我国食品安全、提升我国水产品、农产品及食品的国际竞争力具有重要意义。
解淀粉芽孢杆菌是一种广泛存在于环境中的非致病性生防细菌，对人畜无毒害，其在代谢过程可产生多种丰富的抑菌活性物质，具有广泛的抑制细菌和真菌活性，已在农业生产中获得了欧洲食品安全委员会的认可。此外，由于解淀粉芽孢杆菌还具有生长快、营养简单、抗逆性强等优点，因此在生防菌剂生产加工及其它产品开发中较非芽孢杆菌具有生产成本低、有效活菌数量高、产品质量稳定等优势而备受瞩目。目前，国内外对其研究和应用主要集中在农产品生产过程中替代化学农药对各类植物病原真菌病害的抗病促生功能(陈成等，2011；马桂珍等，2013；张雪花等，2016；杨冬静等，2018)，但利用其发酵液对不同病原细菌，特别是食源性病原细菌及水产病原细菌的拮抗效果研究相对较少。鉴于食源性疾病及水产病害日趋严重以及解淀粉芽孢杆菌生物安全性逐步被认可，进一步研究开发对食源性病原细菌及水产病原细菌具有广谱拮抗效果且生产性能优异的解淀粉芽孢杆菌，不仅有利于其作为益生菌剂或生物保鲜剂应用于水产养殖业或食品工业，同时对促进水产养殖业及食品工业的健康发展也非常有意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌。
本发明的另一目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌的应用。
本发明为了克服现有技术中大量使用抗生素或化学防腐剂所引起的环境污染和食品安全等问题，提供一种可有效拮抗多种食源性病原菌及水产病原菌的解淀粉芽孢杆菌JFL21及其在食品防腐及水产养殖中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一株广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens JFL21，是由带鱼肠道分离纯化得到的。
所述的Bacillus amyloliquefaciens JFL21的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2018年11月5日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC NO：60473。
本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JFL21在防治食源性病原菌及水产病原菌方面的应用，用于非诊断和治疗目的。
本发明还提供一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JFL21在食品防腐及防治水产养殖病害中的应用。
尤其，所述的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JFL21在制备食品防腐及防治水产养殖病害的产品中的应用。
所述的产品为益生菌剂、生物保鲜剂或抗菌药物。
本发明还提供一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JFL21的发酵上清液中的抑菌活性物质在食品防腐及防治水产养殖病害中的应用。
尤其，所述的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JFL21的发酵上清液中的抑菌活性物质在制备食品防腐及防治水产养殖病害的产品中的应用。
所述的产品为益生菌剂、生物保鲜剂或抗菌药物。
本发明的解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵上清液对多种食源性病原菌及水产性病原菌均有良好的抑菌活性。所述病原菌为单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、肠出血性大肠杆菌(Escherichiacoli)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonell enterica)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、创伤性弧菌(Vibrio vulnificus)、坎氏弧菌(Vibrio campbellii)及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中的至少一种。
本发明的解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵上清液中的抑菌活性物质对低温、高温及紫外照射耐受性强，经4℃存放两个月、100℃加热1h或紫外照射1h处理后，其对单核细胞增生李斯特氏菌及嗜水单胞菌的强烈拮抗效果几乎没有减弱。
本发明的解淀粉芽孢杆菌JFL21培养条件简单、容易保存、抗逆性强，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵上清液对19株常见食源性病原菌及水产病原菌均具有广谱抗菌活性，其中对单核细胞增生李斯特氏菌及嗜水气单胞菌的抑菌性能极为稳定，可进一步开发作为益生菌剂、生物保鲜剂或抗菌药物，用于食品防腐或防治水产养殖病害，从而在一定程度减少抗生素的使用，应用前景广阔。
附图说明
图1是解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JFL21的菌落形态图；
图2是解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JFL21的显微形态特征(16×100)；
图3是解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JFL21的系统进化树；
图4是4℃冰箱存放两个月的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensJFL21发酵上清液经不同处理后对单核细胞增生李斯特氏菌的抑菌能力，1：4℃放置1h；2：37℃金属浴1h；3：60℃金属浴1h；4：100℃金属浴1h；5：紫外照射1h。
图5是4℃冰箱存放两个月的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensJFL21发酵上清液经不同处理后对嗜水气单胞菌的抑菌能力，1：4℃放置1h；2：37℃金属浴1h；3：60℃金属浴1h；4：100℃金属浴1h；5：紫外照射1h。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
本发明实施例所用LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取粉5g，NaCl 10g，加ddH2O至1000mL，调pH至7.4，加入琼脂粉20g(仅固体培养基)，121℃高压蒸汽灭菌30min。
本发明实施例所用胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)：胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，葡萄糖2.5g，NaCl 5g，K2HPO4 2.5g，加ddH2O至1000mL，调pH至7.2，加入琼脂粉20g(仅固体培养基)，115℃高压蒸汽灭菌30min。
本发明实施例所用脑心浸液肉汤培养基(BHI)：购于青岛海博生物科技有限公司(产品货号HB8297-1)，每次使用称取粉末38.5g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，调pH至7.4，加入琼脂粉20g(仅固体培养基)，115℃高压蒸汽灭菌30min。
本发明实施例所用解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵培养基(Landy)：葡萄糖20g，L-谷氨酸5g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，KH2PO4 1g，FeSO4 0.15mg，MnSO4 5mg，CuSO4 0.16mg，去离子水1L，调pH至7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。
实施例中涉及到的病原菌材料如下：
单核细胞增生李斯特氏菌为单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)ATCC 19111、蜡样芽胞杆菌为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)ATCC14579、金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC12600、表皮葡萄球菌为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)ATCC 14990、沃氏葡萄球菌为沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)ATCC 27836、嗜水气单胞菌为嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)ATCC 7966、肠出血性大肠杆菌为肠出血性大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC35150、猪霍乱沙门氏菌为猪霍乱沙门氏菌(Salmonell enterica)ATCC 10708、福氏志贺氏菌为福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)ATCC 29903、小肠结肠炎耶尔森氏菌为小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)ATCC 9610、奇异变形杆菌为奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)ATCC 29906、副溶血性弧菌为副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)ATCC 17802、阪崎肠杆菌为阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)ATCC51329、肺炎克雷伯氏菌为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 13883、产气肠杆菌为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)CMCC(B)45103、哈维氏弧菌为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ATCC 33843、创伤性弧菌为创伤性弧菌(Vibrio vulnificus)ATCC27562、坎氏弧菌为坎氏弧菌(Vibrio campbellii)ATCC 33863、铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 10145，溶血性葡萄球菌为溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)ATCC 29970。
实施例1：菌株的分离纯化
购买广州市天河区五山路五山花园菜市场的水产品及食品(新鲜解剖的带鱼肠道、泡茶及发酵豆豉)，分别加入适当的生理盐水进行研磨，并经70℃水浴处理30min后，取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释液涂布于LB培养基平板上，恒温37℃培养24h。挑取单菌落于LB平板上划线分离，反复纯化。将纯化后的菌落进行革兰氏染色、镜检，挑出呈杆状的革兰氏阳性菌株，并编号，然后用终浓度为20％的甘油作为保护剂，于-80℃超低温冰箱保存备用。
实施例2：拮抗菌的筛选
(1)芽孢杆菌发酵上清液的制备：用接种环取一环-80℃保存的液体菌种划线于LB固体平板上，37℃培养箱中过夜培养。挑取活化好的芽孢杆菌单菌落接种于装有50mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min培养24h得到活化的种子液。将种子液按1％接种量转接装有100mL的Landy发酵培养基的250mL三角瓶中，于30℃，200rpm发酵48h。将发酵液于4℃，12000rpm离心15min去除菌体，再经0.22μm水系滤膜过滤除菌，获得无菌发酵上清液，用于抑菌活性检测。
(2)指示菌平板的制备：
按1％接种量重新转接指示菌，37℃，200rpm振荡培养12～20h，使其溶液OD600nm值约为0.5～0.6，菌体浓度约为108CFU/mL。用微波炉将配制好的BHI或TSB固体培养基融化，待培养基冷却至45～50℃左右时，将25mL培养基与250μL新鲜活化的指示菌混合均匀，轻轻倒入摆放好牛津杯的平板中。静待10min，待培养基凝固后，用灭菌的镊子将牛津杯取出，即制备好指示菌平板，每组三个平行。以同批次无菌的Landy发酵培养基为对照，分别加入100μL的芽孢杆菌上清液样品，37℃培养20h，观察结果并测量抑菌圈。
(3)抑菌活性检测：
以单核细胞增生李斯特氏菌和嗜水气单胞菌作为筛选指示菌，分别使用BHI和TSB作为指示菌培养基，将分离获得的芽孢杆菌按上所述方法进行活化，摇瓶发酵，测定发酵液的抑菌活性，共筛选获得8株对单核细胞增生李斯特氏菌及嗜水单胞菌均有抑菌活性的芽孢杆菌，其中从带鱼肠道分离获得的菌株JFL21对单核细胞增生李斯特氏菌及嗜水气单胞菌的抑菌活性最强，因此选取菌株JFL21进行后续研究。
实施例3：菌种鉴定
(1)形态学鉴定：将筛选获得的菌株JFL21划线分离于LB平板上，37℃培养48h后观察其菌落特征，结果如图1所示，菌落呈乳白色，圆形，边缘不整齐，表面皱褶，中间内陷，不透明，较干燥；挑单菌落经LB液体培养基培养24h后，经革兰氏染色后呈紫色，为革兰氏阳性菌，呈杆状，结果见图2。
(2)生理生化特性：按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)和“常见细菌系统鉴定手册”(东秀珠，蔡妙英等编著，北京：科学出版社，2001.2)中描述菌种分类鉴定的方法对菌株JFL21生理生化特性进行研究，结果见表1。
表1菌株JFL21的生理生化特征
| 试验项目 | 结果 | 试验项目 | 结果 | 试验项目 | 结果 | 试验项目 | 结果 |
| 甲基红试验 | + | 蔗糖 | + | 乳糖 | - | 硝酸铵 | + |
| V.P测定 | + | D-果糖 | + | 山梨醇 | + | 乙酸铵 | + |
| 淀粉水解 | + | 木聚糖 | + | 甲醇 | - | 柠檬酸二胺 | + |
| 明胶液化 | + | 麦芽糖 | + | 葡萄糖 | + | 氯化铵 | + |
| 尿素酶试验 | + | L-鼠李糖 | - | 草酸铵 | + | L-酪氨酸 | + |
| 柠檬酸利用试验 | + | D-半乳糖 | - | 硫酸铵 | + | 酒石酸铵 | + |
| 接触酶试验 | + | D-木糖 | - | 磷酸铵 | + | L-组氨酸 | + |
| 吲哚试验 | - | 甘露醇 | + | 钼酸铵 | + |
注：+表示结果为阳性，－表示结果为阴性
(3)16S rDNA分子鉴定：
提取菌株JFL21的基因组DNA，采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增。将PCR产物送到广州天一辉远基因科技有限公司测序。
将菌株JFL21的16S rDNA序列提交GenBank进行Blast比对，用MEGA 7.0软件进行多序列同源性分析，采用Neighbor-joining方法构建系统发育树，结果如图3所示。同源性分析结果表明，菌株JFL21与已报道的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens DSM7(T)的16S rDNA基因序列同源性达到99.93％，并处于系统发育树同一分支，亲缘关系最近，结合菌株JFL21的形态学特征和生理生化特性，鉴定其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
因此，将该菌株命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JFL21，其保藏信息为保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2018年11月5日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC NO：60473。
所述的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JFL21的16S rDNA基因序列测定结果如SEQ ID NO：1所示。
实施例4：解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵上清液对不同病原细菌的抑菌能力考察
(1)解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵上清液的制备：
用接种环取一环-80℃保存的液体菌种划线于LB固体平板上，37℃培养箱中过夜培养。挑取活化好的解淀粉芽孢杆菌JFL21单菌落接种于装有50mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min培养24h得到活化的种子液。将种子液按1％接种量转接装有100mLLandy发酵培养基的250mL三角瓶中，于30℃，200rpm发酵48h。将发酵液于4℃，12000rpm离心15min去除菌体，再经0.22um水系滤膜过滤除菌，获得解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵上清液。
(2)解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵上清液对不同病原细菌的抑菌能力考察：
以解淀粉芽孢杆菌JFL21的发酵上清液作为样品，以20株食品储藏及水产养殖过程常见病原菌作为指示菌，以同批次无菌的Landy发酵培养基为对照，以BHI或TSB作为培养基，使用牛津杯打孔法进行抑菌实验。按1％接种量重新转接不同病原细菌，37℃，200rpm振荡培养12～18h，使其其菌体浓度约为108CFU/mL，取培养好的指示菌1mL与100mL经融化后保持在45℃左右的BHI或TSB培养基混匀，在无菌平板上放置2个灭过菌的牛津杯，每组三个平行，用无菌移液管吸取20mL覆盖平板。凝固后取出牛津杯，分别加入100μL的解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵上清液样品或同批次无菌的Landy发酵培养基，37℃培养20h，观察结果并测量抑菌圈，结果见表2。
本实验共测定了解淀粉芽孢杆菌JFL21的发酵上清液对20株食品储藏及水产养殖过程常见病原菌的抑菌活性，结果表明，同批次无菌的Landy发酵培养基对20株病原菌均无抑制作用，而解淀粉芽孢杆菌JFL21的发酵上清液对13株食源性病原菌和6株水产病原菌均有较强抑制活性(见表2)，其中对7株食源性病原菌(单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、肠出血性大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌、福式志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、肺炎克雷伯氏菌)及2株水产病原菌(嗜水气单胞菌和哈维氏弧菌)的抑菌效果尤为突出，说明解淀粉芽孢杆菌JFL21对食源性病原菌和水产病原菌具有广谱抑菌活性，其在食品防腐和水产动物疾病防治方面具有广大的应用前景。
鉴于解淀粉芽孢杆菌JFL21对食源性病原菌和水产病原菌具有广谱抑菌活性，为了加快其在食品工业和水产养殖业的产业化应用，因此进一步考察了解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵上清液在4℃冰箱放置两个月后的抑菌活性。实验方法同上所述，结果表明解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵上清液在4℃冰箱存放两个月后对9株食源性病原菌(单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、肠出血性大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、奇异变形杆菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和产气肠杆菌)及3株水产病原菌(嗜水气单胞菌、坎氏弧菌和沃氏葡萄球菌)仍具有抗菌活性，其中对单核细胞增生李斯特氏菌、嗜水气单胞菌和肠出血性大肠杆菌仍保持极强的抑菌效果，说明解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵上清液中的抑菌活性物质性能较为稳定，具有很好的应用开发潜力。
表2解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵上清液对不同病原细菌的抑菌能力
注：a：指病原菌较常见的污染领域，但很多病原菌除可在食品储藏和水产养殖过程造成病害、在农业生产或医疗卫生等其它领域也可造成病害；－：表示无抑菌圈。
实施例5：解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵上清液抑制单核细胞增生李斯特氏菌及嗜水气单胞菌的稳定性考察
由于实际生产加工或运输过程的环境温度通常较高，因此除菌种本身需要有很好的高温耐受性，其发酵液的抑菌活性物质的热稳定性同样至关重要。其次，由于很多食品或产品生产加工过程的安全性要求，需要适当的紫外线杀菌消毒，因此性能优异的抗菌活性产品必然需要有很强的温度耐受性和紫外照射稳定性。有鉴于此，我们取4℃冰箱存放两个月的解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵上清液，分别于4℃、37℃、60℃、100℃及紫外灭菌1h，以单核细胞增生李斯特氏菌和嗜水气单胞菌作为指示菌，进一步考察解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵上清液拮抗单核细胞增生李斯特氏菌和嗜水气单胞菌的热稳定性和紫外照射稳定性。结果如表3及图4和图5所示，不同温度或紫外照射处理1h，几乎不影响解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵上清液对单核细胞增生李斯特氏菌和嗜水气单胞菌的抑菌活性。说明解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵上清液中的抑菌活性物质不仅抗菌谱广，同时其对温度及紫外照射耐受性强，因此在实践生产应用中将更有优势。
表3解淀粉芽孢杆菌JFL21发酵上清液抑制单核细胞增生李斯特氏菌及嗜水气单胞菌的稳定性考察
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一株广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1403
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Bacillus amyloliquefaciens JFL21的16S rDNA基因序列
<400> 1
tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tctctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60
acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120
atgcttgtct gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180
ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240
ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300
ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360
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ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540
tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600
aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660
tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720
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agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840
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catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960
tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gggtgcatgg ttgtcgtcag 1020
ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080
cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140
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aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg 1260
cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1320
ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1380
ccgaagtcgg tgaggtaacc ttt 1403
Claims (7)
1.一株广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：名称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JFL21，于2018年11月5日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO：60473。
2.权利要求1所述的广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌在非疾病治疗目的的防治食源性病原菌及水产病原菌方面的应用。
3.权利要求1所述的广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌在制备食品防腐及防治水产养殖病害的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述的产品为益生菌剂、生物保鲜剂或抗菌药物。
5.权利要求1所述的广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌的发酵上清液在制备食品防腐及防治水产养殖病害的产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
所述的产品为益生菌剂、生物保鲜剂或抗菌药物。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的病原菌为单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、肠出血性大肠杆菌(Escherichia coli)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonell enterica)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、创伤性弧菌(Vibrio vulnificus)、坎氏弧菌(Vibrio campbellii)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中的至少一种。
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