CN111040975B - 一株产酶、喜盐芽孢杆菌及其在咸水水产养殖防治病原菌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产酶、喜盐芽孢杆菌及其在咸水水产养殖防治病原菌中的应用。该芽孢杆菌命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CYZF1‑2，保藏号为GDMCC NO:60904。该解淀粉芽孢杆菌CYZF1‑2具有良好的产酶能力：对蛋白质、淀粉和脂肪水解效果均较好；在盐浓度为4％的培养基中，该菌株的生长最好，培养48h后菌液OD600值接近1.0；菌株CYZF1‑2对常见水产病原菌具有高效抑能力，且抑菌物质主要为蛋白多肽类物质，用于防治病原菌不会产生耐药性、无二次污染，在咸水水产养殖病害防治中有较大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及水产微生物应用技术领域，具体涉及一株产酶、喜盐芽孢杆菌及其在咸水水产养殖防治病原菌中的应用。
背景技术
我国是世界上唯一的海水养殖产量超过海洋捕捞量的国家，依据FAO发布的《世界渔业和水产养殖状况》报告显示，2013年以来，我国海水养殖产量常年占世界海水养殖产量的80％以上。海水或咸水养殖在我国水产养殖中占有重要地位。但近年来，水产养殖业向规模化、集约化方向迅速发展，在促进农业经济发展、提高人民生活质量之余，也带来很多环境问题和生态危机。随着海水或咸水养殖规模的扩大和养殖环境的持续恶化，水产养殖中的病害问题特别是细菌性病害在高密度养殖系统中发生频繁且影响严重，呈暴发性流行，已成为制约全球海水养殖业可持续健康发展的重要因素，也极大地限制了我国水产养殖业健康可持续发展。其中，水产养殖过程中的弧菌病如哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、气单胞菌病如嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、爱德华氏菌病如迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)等是最常见病原菌，常常造成水产养殖动物相关病害的大规模暴发。此外，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、大肠杆菌(Escherichia coli)等是肠道中或饲料附带的常见病原菌，易被忽视但对养殖动物的健康影响很大。目前，抗生素类药物作为高效的抗菌药物被广泛应用于细菌性疾病的治疗，在取得良好治疗效果的同时，也使养殖水体的正常菌群遭到破坏、导致病原菌株的耐药性增强、耐药基因在鱼体内富集，对生态环境和人类健康都有严重威胁。
微生物制剂(益生菌)，因其安全、无毒、无残留、无污染等优点，逐渐受到市场青睐。利用微生物间的拮抗作用开展生物防治，已成为防控水产细菌性病原的重要有效途径。但是其相关研究仍然十分有限，尤其是高效喜盐的咸水水产养殖拮抗益生菌鲜有报道，菌种资源十分匮乏。因此，分离筛选喜盐、具有高效抑水产病原菌能力的菌株并将其应用于咸水养殖中，对于水产养殖业实现真正的无抗养殖具有重要实际意义。
发明内容
本发明的第一个目的提供一株产酶、喜盐，具有高效拮抗常见水产养殖病原菌能力的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CYZF1-2，为水产养殖病原菌防治提供了一种良好的生物材料。
本发明的第二个目的是提供所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) CYZF1-2在水产养殖中防治病原菌中的应用，特别是在咸水水产养殖中防治病原菌的应用。
优选，是在制备咸水水产养殖中防治迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)制剂中的应用。
进一步优选，是芽孢杆菌CYZF1-2在盐度为0～8％的水产养殖中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种咸水水产养殖防治病原菌制剂，其含有芽孢杆菌CYZF1-2作为活性成分。
所述的咸水水产养殖防治病原菌制剂是咸水水产养殖中防治迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)制剂。
本发明的第四个目的是提供芽孢杆菌CYZF1-2在制备蛋白酶、淀粉酶和/或脂肪酶中的应用。
本发明的第五个目的是提供芽孢杆菌CYZF1-2在制备抗迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌药物中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种抗迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌或鼠伤寒沙门氏菌药物，含有芽孢杆菌CYZF1-2作为活性成分。
本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CYZF1-2是由发明人于2019年 3月从猪粪中经过二次驯化富集分离得到，该菌株生理生化特征为：革兰氏阳性菌，细胞形状为短杆状，有芽孢，大小为0.5～1.0×1.5～2.5μm(见图1)；菌落呈白色、表面粗糙、边缘不规则。可在盐度为4％的条件下旺盛生长。
提取上述喜盐抑菌芽孢杆菌CYZF1-2的基因组DNA，利用27F/1492R引物扩增其16SrDNA基因，测序后得到的基因序列见SEQ ID NO.1。将该序列在NCBI及EzBioCloud网站上进行同源性比对分析、构建系统发育树，并结合形态学观察，结果表明，该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CYZF1-2有较强的产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力。
(2)本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CYZF1-2是个喜盐菌株，在盐度为4％的环境条件下生长最为旺盛，比较低盐度(盐度≤2％)环境更适宜生长；在盐度为6％仍能生长良好，在盐度为8％的条件下生长才受到明显抑制。
(3)本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CYZF1-2能产生抗菌肽类抑菌物质，对常见水产养殖病原菌有很好的抑菌效果。
综上所述，本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CYZF1-2在海水或咸水中生长适应性强，对常见水产养殖病原菌抑菌效果好，在咸水水产养殖中有较大的应用潜力。
本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CYZF1-2，于2019年12月25 日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100 号大院59号楼，保藏编号为GDMCC NO:60904。
附图说明
图1为解淀粉芽孢杆菌CYZF1-2经结晶紫染色后在光学显微镜下(100×)的照片。
图2为解淀粉芽孢杆菌CYZF1-2产酶能力评估的柱形示意图，水解不同底物，水解透明圈直径与菌落直径比值越大表明产酶能力越强。
图3为盐浓度条件对解淀粉芽孢杆菌CYZF1-2生长影响的曲线示意图。
图4为解淀粉芽孢杆菌CYZF1-2对5种病原菌抑制效果的柱形示意图。
图5为解淀粉芽孢杆菌CYZF1-2发酵液离心后的上清液对病原菌菌株GDMCC 1.781(Vibrio harveyi 1.781)和GDMCC 1.379(Edwardsiella tarda 1.379)抑菌圈照片，其中，a 为菌株GDMCC 1.781，b为菌株GDMCC 1.379。
图6为解淀粉芽孢杆菌CYZF1-2及相近菌株的系统进化树；其中，使用NJ法建树，图中仅显示＞70％的bootstrap系数(重复1000次)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。若无特别说明，实施例中所述方法均为常规方法，所用试剂均为常规试剂或按常规方式配制的试剂。
实施例1解淀粉芽孢杆菌CYZF1-2的富集培养与分离纯化及保存
(1)富集培养
富集培养基：NH4Cl 0.4g/L、NaNO20.25 g/L、KH2PO42.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、Na2CO30.4 g/L，溶剂为水；配制方法是：将上述各成分混合均匀，于121℃高温高压灭菌20min。分装至250mL三角瓶中，每瓶90mL。
取采集后4℃冷藏的鲜猪粪10g，放入装有上述培养基的锥形瓶中，30℃，180rpm，培养48h，进行富集培养。后转接10mL至新的装有上述富集培养基的锥形瓶中，30℃，180rpm，培养48h，进行二次富集，得到的二次富集培养物。
(2)芽孢杆菌CYZF1-2的分离纯化与保存
分离培养基(营养肉汤培养基)：牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g，琼脂15g，加水定容至1000mL，调pH至7.4，分装至250mL三角瓶中，每瓶100mL；于121℃高温高压灭菌20min，倒平板。
将步骤(1)得到的二次富集培养物，采用稀释涂布法涂布到含分离培养基的平板上；肉眼观察菌落形态，菌落呈白色、表面粗糙、边缘不规则；同时通过结晶紫染色，在100倍油镜下观察细胞形状为短杆状，有芽孢，大小为0.5～1.0×1.5～2.5μm，为革兰氏阳性菌(图1)，结果见图1；进一步划线纯化，对纯化后的菌株，扩大培养并将菌种于甘油管(-80℃)和冻干管(4℃)中保藏，由此获得菌株CYZF1-2。
实施例2解淀粉芽孢杆菌CYZF1-2的16S rDNA鉴定
提取菌株CYZF1-2的基因组DNA，用细菌16S rDNA基因扩增通用引物27F/1492R(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’)扩增得到 PCR产物，并送至上海美吉生物医药科技有限公司(广州分公司)进行序列测序，测序后得到的16S rRNA序列长度为1410bp，序列见SEQ ID NO.1。将测序结果与NCBI及EzBioCloud数据库中的16SrDNA序列进行同源性比对分析，然后，选取菌株CYZF1-2及相近菌株使用MEGA 6.0、Kimura2-parameter模型、NJ算法建系统进化树(bootstrap重复 1000次)，得到的进化树结果见图6。
结果分析表明其与菌株Brevibacteriumfrigoritolerans的16S rDNA基因序列相似性最高 (99.48％)。
在EzBioCloud数据库中，芽孢杆菌(Bacillus sp.)CYZF1-2(即菌株CYZF1-2)的16S rRNA基因序列与B.subtilis subsp.stercoris D7XPN1具有最高的相似性(99.59％)，但覆盖率仅有86.2％，接下来是B.siamensis KCTC 13613(99.57％)。根据进化树结果显示，菌株 CYZF1-2与暹罗芽孢杆菌B.siamensis KCTC 13613(99.57％)和解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciens DSM 7(99.36％)聚在了一枝上，但结合形态学观察暹罗芽孢杆菌的菌落圆形，表面扁平，边缘微突起，呈白色，菌落直径为1-3mm，明显与菌株CYZF1-2不同。基于以上结果分析，初步鉴定本发明实施例1分离得到的菌株CYZF1-2是解淀粉芽孢杆菌。将其命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CYZF1-2。该菌株于2019年12月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100 号大院59号楼，保藏编号为GDMCC No:60904。
实施例3芽孢杆菌CYZF1-2的产酶能力评估
产酶能力评估采用平板水解圈检测法：
主要用到的培养基及试剂如下：
蛋白质培养基：脱脂奶粉40.0g、可溶性淀粉10.0g、酵母膏3.0g、马铃薯粉2.0g，琼脂15.0g，加蒸馏水定容到1000mL，pH 7.0～7.2。121℃高温高压灭菌20min，倒平板。
淀粉培养基：可溶性淀粉5.0g、蛋白胨5.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加蒸馏水定容到1000mL，pH 7.0～7.2。121℃高温高压灭菌20min，倒平板。
脂肪培养基(三丁酸甘油酯)：使用营养肉汤作为基础培养基，每100mL基础培养基添加2mL脂肪源，琼脂15.0g/L，加蒸馏水定容到1000mL，pH 7.0～7.2；其中脂肪源为 2％的聚乙烯醇溶液与三丁酸甘油酯按1:9(v/v)混合得到。121℃高温高压灭菌20min，倒平板。
将活化后的菌株CYZF1-2分别点接到蛋白质、淀粉和脂肪培养基平板上，置于30℃培养箱中培养48h后，测定其水解的透明圈直径和菌落直径比值(淀粉培养基平板需加入质量分数0.1％的碘指示剂)，可定性的直接反映出菌株分泌产生蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的能力。
通过上述方法检测得到菌株CYZF1-2水解蛋白质、淀粉和脂肪的透明圈直径和菌落直径比值分别为1.41、2.30、2.71，结果见图2。如图2所示，菌株CYZF1-2显示出了较强的产生蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力。
实施例4盐度对解淀粉芽孢杆菌CYZF1-2生长适应性评估
(1)不同盐度梯度的营养肉汤培养基配制：使用营养肉汤作为基础培养基，每100mL 基础培养基分别添加2g、4g、6g、8g、10g氯化钠，配成盐度分别为2％、4％、6％、8％和10％的培养基，调pH为7.2，121℃下高温高压灭菌。
(2)接种培养：将菌株CYZF1-2接种至不同盐度梯度的营养肉汤培养基中，于30℃，180rpm/min恒温摇床培养，在培养0、8、12、24、48h后取样，检测OD600值，结果见图 3。
如图3所示，菌株CYZF1-2在一定盐度范围内有喜盐性，在盐度为4％的培养基中生长最好，培养24h时OD600值已经超过了0.8，培养48h后OD600值接近1.0；而在较低盐度下(如2％)，菌体生长反而受到限制，培养48h后OD600值才接近0.8，但在盐度很高时 (如8％)，菌体生长也明显受到抑制，培养48h后OD600值接近0.6，并已经达到了稳定期。
实施例5解淀粉芽孢杆菌CYZF1-2抑菌效果测定
(1)供试菌清液制备：将活化好的菌株CYZF1-2接到营养肉汤培养基中，置于30℃、180r/min摇床中培养24h；培养液离心后取上清液，分为两部分，一部分置于4℃中备用；另外一部分置于121℃高压灭菌锅中加热10min后备用。
(2)含菌平板制作：将培养好的供试菌株(如下表1)，用紫外分光光度计调节OD600值到0.1，然后分别吸取适量菌液加入到45℃左右熔融的相应培养基中(哈维氏弧菌用2216E 培养基，其他用营养肉汤培养基)，充分摇匀后倒平板，待其自然凝固后，用打孔器分别在同一平皿上均匀打孔(孔径9mm)。
(3)抑菌试验
吸取菌株CYZF1-2离心后的上清菌液100μL分别加入到各个含供试病原菌平板中，置于37℃(或30℃)培养箱中培养约48h后，观察抑菌效果(结果见图5)，并测量抑菌圈直径(结果见图4)。
表1.解淀粉芽孢杆菌CYZF1-2抑菌效果试验供试菌株
(4)菌株CYZF1-2抗菌物质解析
1)对高温的稳定性测试
吸取菌株CYZF1-2在121℃高压灭菌锅中加热10min后的上清液100μL加入到含菌株GDMCC 1.1220平板中，置于30℃培养箱中培养约48h后，观察抑菌效果，并测量抑菌圈直径，结果发现抑菌圈仍明显，直径与灭菌前比略小(14.60±0.21mm)，说明菌株CYZF1-2 抗菌物质有良好的热稳定性。
2)对蛋白酶的稳定性测试
取2份经0.22μm孔径滤头过滤后的菌清液(菌株CYZF1-2的上清液，未灭菌)1mL，分别加入5g/L中性蛋白酶和5g/L复合蛋白酶(蛋白酶K和木瓜蛋白酶，质量比1:1)溶液 30μL，对照组加入30μL生理盐水，实验组和对照组分别于37℃水浴处理1h。通过上述打孔法测定处理后菌清液的抑菌效果。与对照组(抑菌圈直径为15.0±0.08mm)相比，经蛋白酶处理的菌清液抑菌活性显著降低，抑菌圈不明显(中性蛋白酶和复合蛋白酶处理的抑菌圈直径分别为10.34±0.089mm和9.8±0.17mm)，表明该拮抗物质对蛋白酶敏感，由此判断该拮抗物质为蛋白类物质。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
<120> 一株产酶、喜盐芽孢杆菌及其在咸水水产养殖防治病原菌中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1410
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌CYZF1-2(Bacillus amyloliquefaciens CYZF1-2)
<400> 1
aaaggttacc tcaccgactt cgggtgttac aaactctcgt ggtgtgacgg gcggtgtgta 60
caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc gattccagct 120
tcacgcagtc gagttgcaga ctgcgatccg aactgagaac agatttgtgg gattggctta 180
acctcgcggt ttcgctgccc tttgttctgt ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat 240
aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtcacc 300
ttagagtgcc caaactgaat gcctggcaac taagattcaa agggttgcgc tcgttgcggg 360
gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc tgtcactctg 420
cccccgaagg ggacgtccta tctctaggat tgtcagagga tgtcaagacc tggtaaggtt 480
cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc 540
ctttgagttt cagtcttgcg accgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc gttagctgca 600
gcactaaggg gcggaaaccc cctaacactt agcactcatc gtttacggcg tggactacca 660
gggtatctaa tcctgttcgc tccccacgct ttcgctcctc agcgtcagtt acagaccaga 720
gagtcgcctt cgccactggt gttcctccac atctctacgc atttcaccgc tacacgtgga 780
attccactct cctcttctgc actcaagttc cccagtttcc aatgaccctc cccggttgag 840
ccgggggctt tcacatcaga cttaagaaac cgcctgcgag ccctttacgc ccaataattc 900
cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt 960
tctgggttag gtaccgtcaa ggtgccgccc ctatttgaac ggcacttgtt cttccctaac 1020
aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc gtcagacttt 1080
cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt 1140
cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg tgagccgtta 1200
cctcaccaac tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag tggtagccga agccaccttt 1260
tatgtctgaa ccatgcggtt cagacaacca tccggtatta gccccggttt cccggagtta 1320
tcccagtctt acaggcaggt tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct aacatcaggg 1380
agcaagctcc catctgtccg ctcgactgca 1410
Claims (8)
1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CYZF1-2，其保藏编号为：GDMCC NO： 60904。
2.权利要求1所述的芽孢杆菌CYZF1-2直接作为活性成分在制备咸水水产养殖防治病原菌制剂中的应用，所述的咸水水产养殖防治病原菌制剂是防治迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)的制剂。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于，芽孢杆菌CYZF1-2在盐度为0～8％的水产养殖中的应用。
4.一种咸水水产养殖防治病原菌制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的芽孢杆菌CYZF1-2作为活性成分。
5.根据权利要求4所述的咸水水产养殖防治病原菌制剂，其特征在于，所述的咸水水产养殖防治病原菌制剂是防治迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的制剂。
6.权利要求1所述的芽孢杆菌CYZF1-2在制备蛋白酶、淀粉酶和/或脂肪酶中的应用。
7.权利要求1所述的芽孢杆菌CYZF1-2直接作为活性成分在制备抗迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌药物中的应用。
8.一种抗迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌或鼠伤寒沙门氏菌药物，其特征在于，含有权利要求1所述的芽孢杆菌CYZF1-2作为活性成分。
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