CN113528375B

CN113528375B - 一种具有抑制多种致病菌微生物生长的民猪源枯草芽孢杆菌

Info

Publication number: CN113528375B
Application number: CN202110664017.7A
Authority: CN
Inventors: 石宝明; 王晓旭; 赵轩; 郭志强
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2021-06-16
Filing date: 2021-06-16
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2041-06-16
Also published as: CN113528375A

Abstract

本发明公开一种具有抑制多种致病菌微生物生长的民猪源枯草芽孢杆菌。保藏在中国典型培养微生物保藏中心，保藏日期为2021年4月25日，保藏编号为CCTCC NO:M2021440，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis JX673943.1。该菌有助于减轻致病菌微生物对动物的危害，从而提高动物对抗病性，是一株具有较高应用价值的猪源益生菌，其对畜牧业和饲料发酵工业的发展具有重要意义。

Description

一种具有抑制多种致病菌微生物生长的民猪源枯草芽孢杆菌

技术领域

本发明属于农业畜牧应用领域，具体涉及一种具有抑制多种致病菌微生物生长的民猪源枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JX673943.1。

背景技术

民猪源致病菌微生物的筛选，得到的微生物可以减轻其对动物体造成的损害。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，是我国农业农村部批准应用的一种益生菌，无毒无害，其代谢产物具有增强机体免疫力、提高饲料转化率、改善动物肠道微生物平衡、改善养殖环境、抑制氧化应激、诱导植物抗性及促进植物生长等多种功能，在畜牧饲料、食品加工、医药生产及水质净化中得到广泛应用。

近年来，养猪业由于病原微生物感染造成的经济损失日益增多。仔猪感染大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌后，会引发腹泻甚至死亡等危害。抗生素一直是预防断奶仔猪腹泻的最主要途径，然而长期使用抗生素对仔猪致病菌感染进行治疗具有诸多危害，严重污染环境，导致细菌耐药性的发生，同时在杀灭致病菌的同时也杀灭大量有益菌，进一步破坏肠道菌群结构，对人类自身也会许多造成不利的影响。民猪的优良特性必然与其特定的消化道内微生物菌群息息相关，而其消化道内丰富的微生物也为抑制致病菌物质的分离和筛选提供了丰富的来源。结肠作为流动速度慢，大量物质被发酵，微生物区系最复杂，微生物种类和数量较多，因此选用结肠作为抑菌筛选的主要部位。来自民猪肠道内的拮抗致病菌微生物的筛选，可以利用有益菌抑制有害菌，减小致病菌对动物体造成的伤害，使得动物源筛选得到的肠道微生物成为新型抗生素的替代物。益生菌具有调节动物体内的微生态平衡，刺激免疫功能等作用，因而有利于恢复动物机体正常生理功能、防治病害、增进健康，从而使养殖动物的生产性能提高。民猪肠道菌群中筛选具有抑制致病菌微生物生长的益生菌株具有现实意义。

发明内容

基于以上畜牧养殖生产过程中实际问题及需求，本发明目的在于提供一种具有抑制多种致病菌微生物生长的民猪源枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis JX673943.1，有助于提高动物的抗病性。

本发明的目的通过以下技术方案实现：一种具有抑制多种致病菌微生物生长的民猪源枯草芽孢杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮政编码：430072，保藏日期为2021年4月25日，保藏编号为CCTCC NO: M2021440，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis JX673943.1。

本发明还具有如下技术特征：

1、如上所述的民猪源枯草芽孢杆菌，其生物学特征包括：菌落为白色，边缘不整齐，表面较干燥。

2、如上所述的民猪源枯草芽孢杆菌，其生长条件为温度30℃-50℃，pH＝5.1-8，NaCl质量浓度为1％-5％。

3、进一步，所述的的民猪源枯草芽孢杆菌，其生长条件为温度37℃，pH＝6，NaCl浓度为2.4％。

4、如上所述的民猪源枯草芽孢杆菌的培养方法，如下：取种子液按体积比1％的接种量接种至培养基中，温度37℃、220r/min条件下摇床振荡培养，所述的培养基采用LB液体培养基。

5、如上所述的民猪源枯草芽孢杆菌，对大肠杆菌25922、大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、大肠杆菌1799、大肠杆菌1515、金黄色葡萄球菌43300、铜绿假单胞菌27853、铜绿假单胞菌PA01、鸡白痢沙门氏菌C7913、粪肠球菌29212、黑曲霉2377、肺炎链球菌31001、表皮葡萄球菌12228、鼠伤寒沙门氏菌C7731均具有抑菌活性。

本发明的优点及有益效果：本发明所提供的枯草芽孢杆菌菌株对大肠杆菌25922、大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、大肠杆菌17 99、大肠杆菌1515、金黄色葡萄球菌43300、铜绿假单胞菌27853、铜绿假单胞菌PA01、鸡白痢沙门氏菌C7913、粪肠球菌29212、黑曲霉2377、肺炎链球菌31001、表皮葡萄球菌12228、鼠伤寒沙门氏菌C7731均具有抑菌活性。综上所述，民猪源枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis JX673943.1是一株具有较高应用价值的猪源益生菌，其对畜牧业和饲料发酵工业的发展具有重要意义。

附图说明

图1为本发明的菌体形态图；

图2为民猪源枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis JX673943.1的系统发育树图；

图3为不同温度条件下菌株生长能力实验结果图；

图4为不同pH条件下菌株生长能力实验结果图；

图5为不同NaCl条件下菌株生长能力实验结果图；

图6为不同胆盐浓度条件下生长能力实验结果图。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明内容进一步说明，但这并不构成对本发明任何意义的限定。

供试材料：大肠杆菌ATCC 25922、大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、大肠杆菌1799、大肠杆菌1515、金黄色葡萄球菌43300、铜绿假单胞菌ATCC 27853、铜绿假单胞菌PA01、鸡白痢沙门氏菌C7913、粪肠球菌29212、黑曲霉2377、肺炎链球菌31001、表葡萄球菌12228、鼠伤寒沙门氏菌C7731，东北农业大学动物营养研究所提供；民猪粪便采集自东北农业大学阿城实验基地。

实施例1：

菌株筛选与鉴定具体按以下步骤进行：

1.培养基的配置：本实验选择LB液体培养基作为用于抑菌活性测定的筛选培养基。营养琼脂培养基：琼脂15g，酵母膏3g，胰蛋白胨5g，氯化钠5g，水1000mL，pH值调至7.4，121℃高温高压灭菌20min；LB液体培养基：酵母膏3g，胰蛋白胨5g，氯化钠5g，水1000mL，121℃高温高压灭菌20min；LB固体培养基：琼脂15g，胰蛋白胨5g，酵母膏3g，氯化钠5g，水1000mL， 121℃高温高压灭菌20min。

2.指示菌液的制备：取冻存的致病菌作为指示菌划线至营养琼脂培养基中，37℃恒温培养，活化菌株；挑取单菌落接种于LB液体培养基中，220rpm、37℃过夜培养，然后再将过夜菌传代于新的液体培养基中培养2-4h，直至指示菌处于生长对数期，离心收集细菌菌体，用无菌PBS冲洗，再将所得细菌的浓度调整为10⁵CFU/ml；

3.微生物代谢物的收集：称取1.0g民猪结肠内容物，溶解于盛有50mL灭菌去离子水的三角瓶中，于摇床中室温震荡30min，制成均一的浓度为10^-2的稀释液，取适量此稀释液，进行十倍梯度连续稀释，得到10^-3-10^-5稀释液。将30μL各浓度的稀释液均匀涂布于营养琼脂培养板，置于37℃恒温箱培养24h，挑取单菌落。将单菌落接入LB液体培养基内，37℃、220rpm震荡培养24h后，12000rpm 离心5min。吸取上清液，经0.22微米水系过滤器过滤备用；

4.抑制致病菌微生物菌株生长的筛选：初筛选用琼脂扩散法。挑取各保存菌种的单个菌落种于LB 液体培养基中，37℃摇瓶培养24h,12000rpm离心5分钟后，取50μL上清液滴加至含有指示菌的初筛培养板的牛津杯(1×10⁵CFU,8mm深×10mm外径)孔中，37℃恒温培养48h后，用游标卡尺记录每种保存菌种的抑菌圈的有无和直径(d)，作为评判菌种拮抗指示菌能力的标准。挑选抑菌圈直径较大的菌种进行摇瓶和划线培养，如此反复分离纯化培养4-5代后，置于50％甘油溶液中，-80℃保存备用。复筛：将初筛中筛选出的拮抗菌-80℃保存一周后，重新取出进行活化培养，按照琼脂扩散法，继续观察这几种菌的抑菌活性，比较菌种保存过程中拮抗菌抑菌活性的变化，以鉴别其拮抗性能是否稳定。

筛选得到的菌株生物学特性如下：如图1所示，菌落为白色，边缘不整齐。

菌株鉴定过程及结果如下所示：采用一代测序的方法对筛选得到的菌株进行了鉴定。细菌基因组DNA 的提取按照细菌DNA提取试剂盒(Omega Bio-Tek，USA)的指示进行，然后用引物进行PCR扩增：上游引物，AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和下游引物，GGTTACCTTGTTACGACTT。然后利用blast程序将菌株的序列与NCBI数据库进行比较，以确定物种，如图2所示，并绘制菌株的系统发育树。

经形态观察，生理生化反应和16S rDNA分子鉴定，将具有抑制致病菌生长能力的菌株确定为为枯草芽孢杆菌JX673943.1。

实施例2：

菌株对致病菌抑菌能力的测定

1.菌株活化：取冻存菌株划线至营养琼脂培养基上，37℃恒温培养活化菌株，挑取单菌落接种至LB液体培养基，220rpm、37℃培养24h；

2.指示菌液的制备：大肠杆菌ATCC 25922、大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、大肠杆菌1799、大肠杆菌1515、金黄色葡萄球菌43300、铜绿假单胞菌ATCC 27853、铜绿假单胞菌PA01、鸡白痢沙门氏菌 C7913、粪肠球菌29212、黑曲霉2377、肺炎链球菌31001、表皮葡萄球菌12228、鼠伤寒沙门氏菌C7731 分别作为指示菌，制备具体方法参考实施例1的指示菌液制备方法；

3.微生物代谢物的收集：具体方法参考实施例1；

4.抑菌活性测定：将菌液培养至24h，将菌液12000r离心，取上清，经0.22微米水系滤器过滤2 次备用。取100微升上清与指示菌液等量混合加入96孔板中，同时以指示菌液与灭菌PBS溶液混合物作为阳性对照组，以LB液体培养基为阴性对照组，置于37℃恒温过夜培养，液体培养基澄清作为标准，利用酶标仪进行吸光度的测定；

5.抑菌率的计算公式为：

6.菌株抑菌活性结果：菌株抑菌效果如表1所示，菌株JX673943.1对多种致病菌均具有抑制作用。

表1.菌株对致病菌的抑菌能力表

实施例3

菌株在不同温度下生长能力测定

1.菌株活化：取待复苏冻存菌株原液以1％的接种量(50μl+5ml LB)接种至LB液体培养基， 220rpm、37℃过夜培养12h；

2.不同温度下菌株的生长测定：调整OD_100nm为1时，以1％的接种量(50μl+5ml LB)传代至LB 液体培养基，于20℃、30℃、37℃、45℃、50℃、55℃培养9h，测其OD600nm值。并接稀释液100μl到营养琼脂培养基。通过吸光度值和活菌计数分析所选菌株在不同pH环境条件下的生长情况，并绘制温度生长曲线；

3.如图3所示，菌株生长能力实验结果图。

4.菌株生长能力实验结果显示：37℃时最适合菌株生长。37℃前，随着温度升高菌株的生长能力逐渐升高；超过37℃后，随着温度的升高菌株的生长能力逐渐降低。30℃-50℃为较适合菌株生长的温度范围。

实施例4

菌株在不同pH环境下生长能力测定

1.菌株活化：实验操作方法同实施例3；

2.菌株相应pH条件下的生长测定：用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH将LB液体培养基的pH调整到1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。将已经活化的菌液以1％的接种量(50μl+5ml LB) 转接至调好pH值的LB培养基中，相同条件培养6h。培养结束后，检测培养物的OD_600nm值，并接种稀释液100μL至固体培养基上，37℃培养12h，以确定所选菌株的生长情况；

3.如图4所示，菌株生长能力实验结果。

4.菌株生长能力实验结果显示：pH为6时最适合菌株生长，pH在4-9是菌株可以存活的。

实施例5

菌株在不同NaCl环境下生长能力的测定

1.菌株活化：实验操作方法同实施例3；

2.菌株相应NaCl条件下的生长测定：活化后的菌液以1％的接种量(50μl+5ml LB)接种于含1％、 2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％NaCl的LB液体培养基中，同时以不接种菌液的相同液体培养基作为对照，37℃、220rpm条件下培养3h。培养结束后，检测培养物的OD_600nm值，并接种稀释液100μL 至固体培养基上，37℃培养12h，以确定所选菌株的生长情况；

3.如图5所示，菌株生长能力实验结果。

4.菌株生长能力实验结果显示：菌株在不同NaCl浓度条件下均可存活，但随着NaCl浓度升高，菌株生长能力降低。

实施例6

菌株不同胆盐浓度条件下生长能力的测定

1.菌株活化：实验操作方法同实施例3；

2.菌株相应胆盐条件下的生长测定：活化后的菌液以1％的接种量(50μl+5ml LB)接种于含1％、 2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％胆盐的LB液体培养基中，同时以不接种菌液的相同液体培养基作为对照，37℃、220rpm条件下培养3h。培养结束后，检测培养物的OD_600nm值，并接种稀释液100μL至固体培养基上，37℃培养12h，以确定所选菌株的生长情况；

3.如图6所示，菌株生长能力实验结果。

4.菌株生长能力实验结果显示：菌株在无胆盐添加的情况下，生长情况较好。添加胆盐后，几乎无法生长。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种具有抑制多种致病菌微生物生长的民猪源枯草芽孢杆菌

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1463

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

acgaaagggc gtctataatg cagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag 60

cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa 120

accggggcta ataccggatg gttgtttgaa ccgcatggtt caaacataaa aggtggcttc 180

ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240

aaggcaacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300

cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 360

agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa 420

caagtaccgt tcgaataggg cggtaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac 480

tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt 540

aaagggctgg cagggcggtt attttcaagt gtgatttgaa tagcgcccac gctcaaccgc 600

ggagggtcat tgtaaagtgt gaaatgtgac tgcagagggg gggaacggaa ttacacgtgg 660

cgctcttaat tgcgtagcag atatggagga acactagtgt cgagggcgac cctctggtct 720

gtaatcgtcg gtgtggagtt gaaggcgtgg ggagcgaaca ggataagata cctcgttagt 780

ccacgccgta aaacgatgag tgctaagtgt taggggggtt tccgcccctt agtgctgcag 840

ctaacgcatt aagcactccg cctgggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat 900

tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc 960

ttaccaggtc ttgacatcct ttgacaatcc tagagatagg acgtcccctt agggggcagc 1020

gtgacaggtg ggtgcatggg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgtttg ggttagtccc 1080

cgcaacgagc gcaccctttg gatcttagtg accagcattc agtttgggca cctctaacgt 1140

gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1200

acctgggcta cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa 1260

gccaatccca caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgat tgcgtgaagc 1320

cggcattgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg gcccttgtac 1380

acaccgcccg tcacaccacg agagtttgta acacccgacg tcggtgaggt aacctttacg 1440

agccagccgc tgaacgaccc agt 1463

Claims

1.一种民猪源枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年4月25日，保藏编号为CCTCC NO：M2021440。

2.一种益生菌制剂，其特征在于：含有如权利要求1所述的一种民猪源枯草芽孢杆菌。