CN104087524A - 一株副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株、筛选方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有抗微生物特性的Kefir源副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株及其抑菌组合物。本发明菌株FX-6-1于2014年02月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2014043。本发明菌株发酵产生的抑菌组合物可以抑制大肠杆菌(Escherlchiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等细菌病原微生物及黄曲霉（Aspergillusflavus）、黑根霉（Rhizopusnigricans）等霉菌的生长，抗菌谱宽；本发明菌株发酵产生的抑菌组合物对热处理和酶解处理性质稳定，将可作为防腐剂应用于饲料及食品，并具有开发成为医疗组合物的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1 (Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株，特别是涉及一种可以抑制大肠杆菌(Escherlchia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等细菌病原微生物及黄曲霉（Aspergillus flavus）、黑根霉（Rhizopus nigricans）等霉菌的等病原菌的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株，以及含有该副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株发酵产生的抑菌组合物及该组合物的活性稳定性，属于微生物技术领域。
技术背景
在加工、贮藏、运输及消费过程中，导致食品腐败变质的原因较多，有物理因素、化学因素和生物性因素，其中由微生物污染所引起的食品腐败变质是最为重要和普遍的。微生物广泛分布于自然界，食品及原料中不可避免的会受到一定类型和数量微生物的污染，当环境条件适宜时，它们就会迅速生长繁殖，造成食品的腐败与变质。据估计，在世界范围内每年有超过20%的食品由于腐败变质而白白浪费(曹妍等，2011)，尤其是微生物污染导致的腐败最为严重。
微生物滋生导致食品腐败变质的同时，也给食品安全带来严重危害。全球每年发生40-60 亿例食源性疾病，发展中国家每年约有180 万人死于食源性疾病，在发达国家，每年亦有10%以上的人群感染食源性疾病(吴燕燕等，2009)。美国和欧洲曾分别因火鸡污染沙门氏菌和豆芽菜污染大肠杆菌O104(Frank et al, 2011)而爆发严重的食品安全事件。在中国，仅2012年就爆发了6685起食物中毒事件，而56.1%的事故原因是由微生物污染引起(Lam et al, 2013)。
虽然传统的加热杀菌可以有效抑制微生物的污染，但在杀菌的同时也不同程度的破坏了食品的营养、质地以及色香味型，同时产生大量能耗。在现代食品工业中，食品防腐剂被广泛应用于延长食品的保藏期，已成为现代食品生产中一种不可缺少的食品添加剂。
而在现代食品工业以及种植、养殖业中，化学防腐剂、杀虫剂及抗生素的不规范使用及残留隐患已越来越引起消费者关注，人们更倾向于消费天然来源的食品资源。因此，开发不易产生耐药性且无残留、无安全隐患的新型天然抗菌物质具有重要的现实意义， 而作为天然来源的蛋白质类抗菌物质成为急需的替代品，成为近年来研究的热点。
西藏开菲尔主要生长在我国西部高海拔地区，是极具地方特色的发酵乳产品，具有增强人体免疫力、抗肿瘤、降血压、降血脂等多种功效。西藏开菲尔中主要包含乳酸菌和酵母菌。从西藏开菲尔中分离筛选产抗菌物质菌株，对开发我国传统微生物资源具有重要意义。
针对食品工业中化学防腐剂存在的问题以及对广谱高效天然防腐保鲜剂的需求状况，本发明从西藏开菲尔乳中筛选能产生抗菌活性高、抗菌谱广的抗菌菌株，旨在获得广谱高效的新型抗菌物质及推动其开发和应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株及其发酵抑菌组合物。该发酵抑菌组合物具有良好的抗菌活性。
本发明所提供的菌株筛选自西藏开菲尔（Tibetan kefir）发酵乳。该副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株已经保藏于于2014年02月23日保藏于位于武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014043。其筛选方法是：采用选择性培养基MC固态培养基及MRS固态培养基初筛得到乳酸菌，随后将筛选到的乳酸菌接种至纯牛奶中发酵培养以获取发酵组合物。以大肠杆菌为指示菌，采用牛津杯琼脂扩散法对发酵组合物进行抑菌活性试验检测，筛选到良好抗菌活性的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株。
本发明所提供的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵抑菌组合物，来自副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)发酵乳。其制备方法是：将副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)发酵凝乳混匀后离心(4,000 r/min，20min)去除沉淀，发酵上清经抽滤过膜(0.45 μm 滤膜)进一步去除大颗粒物质，随后发酵上清经冷冻干燥获得冻干样抑菌组合物。
将本发明提供的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵抑菌组合物进行牛津杯琼脂扩散法分析，结果显示，可以抑制大肠杆菌(Escherlchia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等细菌病原微生物及黄曲霉（Aspergillus flavus）、黑根霉（Rhizopus nigricans）等霉菌的生长，甚至有杀菌效果。
本发明提供的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵抑菌组合物为乳发酵物，它们可以是食品，特别是乳制品，或是防腐剂或医用原料。
本发明所提供的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株及发酵产生的抑菌组合物，与其他现有技术相比主要具有下述优点:
1．本发明副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株经过革兰氏染色及镜检分析、
16S rDNA序列鉴定分析后，确认为一的副干酪乳杆菌坚韧亚种。且根据查阅文献发现，本抑菌菌株首次从西藏开菲尔中分离到，且目前尚未报道所产抑菌组合物既对革兰氏阴性菌和阳性菌，又对霉菌具有抑制细菌作用的副干酪乳杆菌坚韧亚种。
2．副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵产生的抑菌组合物抗菌普宽，既可以抑制细菌中的革兰氏阳性菌和阴性菌，同时对部分霉菌也有抑制作用。
3．副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵产生的抑菌组合物性质稳定，121℃下20min或100℃下60min抑菌活性保持稳定，经胃蛋白酶或胰蛋白酶酶解处理后抑菌活性并未出现显著下降。
图1是副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株菌落特征。
图2是副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株的革兰氏染色后菌体形态。
图3是副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株16S rDNA PCR产物电泳结果。
[0019]图4是副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵产生的抑菌组合物的抗菌谱。
具体实施方式
实施例1
（一）本发明副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株的筛选与分离：
将西藏开菲尔粒接种到纯牛奶中，30 ℃静态发酵培养24 h，混匀发酵后的凝乳，取液态发酵乳用0.9%无菌生理盐水稀释至10-6~10-8，涡旋混匀后吸取0.1 mL 稀释样至MC固态培养基及MRS固态培养平板表面并涂布均匀。30 ℃下密封培养24-48h 至单一菌落长出。挑取产生清晰钙圈的单菌落，并再次通过MRS琼脂板纯化以获取单菌落菌株，共收集到49株乳酸菌。
将分离到的产酸单菌落菌株接种到MRS液态培养基中，30℃下静态密封过夜培养。随后将活化乳酸菌菌液按接种量5%（v/v）加入纯牛奶中，混匀后30 ℃下静态密封培养24 h，发酵液离心(4,000 r/min，20min)过膜(0.45 μm 滤膜)后，经冷冻干燥获得冻干样。
以大肠杆菌为指示菌，采用牛津杯琼脂扩散法筛选到抗菌活性最佳的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株。该菌株培养特征如下：菌落呈圆形白色突起，菌落湿润、明亮，边缘整齐，具有典型的乳酸菌菌落特征（图1）。
所述的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株已经保藏于于2014年02月23日保藏于位于武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014043。
（二）副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株的革兰氏染色：
用接种环挑取一环MRS平板培养基上培养的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌落，涂片后革兰氏染色，油镜观察乳酸菌菌株形态特征。经显微镜油镜观察发现，菌株经革兰氏染色呈阳性，短杆状，菌株粘连成短链状排列，无鞭毛，无孢子形成，为乳酸杆菌的典型特征（图2）。
（三）副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株的16S rDNA序列分析
1. 模板DNA制备：将－80 ℃保藏的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株接种到MRS液态培养基中，30 ℃下静态密封过夜培养。取1 mL活化后菌液至1.5 mL离心管， 4 ℃离心3 min(12000 r/min)，弃上清液，收集菌体。加入1 mL 1×TE 轻轻混匀，4 ℃离心3 min(12000 r/min)，弃上清液，收集菌体（注意：弃上清过程中勿将离心管底部菌体倒掉）。向离心管中加入10 μL 1% SDS, 涡旋裂解10 min后加入390 μL 1×TE，轻轻混匀后备用。
2. 16S rDNA PCR扩增
引物：上游引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) ，下游引物1492R (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)。
PCR反应体系：采用25μL 反应体系。
Mix ：12.5 μL
上游引物：1 μL
下游引物：1 μL
模板DNA：1 μL，dd水9.5 μL。
PCR扩增反应程序：循环 35次。
预变性 94 ℃ 5 min
变性 94 ℃ 1 min
退火 55 ℃ 1 min
延伸 72 ℃ 3 min
延伸 72 ℃ 10 min
保存 4 ℃
3．16S rDNA PCR片段定序、比对：电泳结果见图3。由图3可知扩增片段约为1500 bp（标准品片段长度由上到下依次为2000 bp，1100 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp），PCR产物测序结果表明，16S rDNA碱基序列为1468bp，
具体如下：GAAGTGGGGGGTGCTATAATGCAGTCGAACGAGTTCTCGTTGATGATCGGTGCTTGCACCGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTAGGGAGCGAGCCGTCTAAGGTGAACAA
经过BLAST序列同源性比对分析，副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株序列与副干酪乳杆菌坚韧亚种（Lactobacillus. paracasei subsp. Tolerans）相似度高于99%。
实施例2
副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵抑菌组合物：
（一）、副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵产生的抑菌组合物制备
将副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株的活化菌液按接种量5%（v/v）加入纯牛奶中，混匀后35 ℃下静态密封培养24 h，发酵液离心(4,000 r/min，20min)过膜(0.45 μm 滤膜)后，经冷冻干燥获得冻干样，以备抗菌活性测定。
（二）副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵抑菌组合物抗菌谱分析
牛津杯琼脂扩散法：
副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵产生的抑菌组合物的抗菌谱采用牛津杯琼脂扩散法测定分析。
1、指示菌活化：在超净工作台中挑取4 ℃保存的试管斜面指示细菌（Escherichia coli ATCC 25922; Staphylococcus aureus ATCC 63589; Salmonella enterica CMCC 9812; Shigella dysenteriae CMCC（B）50071; Bacillus thuringiensis CMCC 9812）单菌落于5 mL LB肉汤培养基，放置于恒温摇床，37 ℃下150 r/min过夜培养。将过夜培养指示菌液稀释至菌浓度为1×108 CFU/mL)，备用。指示菌霉菌（Aspergillus niger ACCC 30005; Aspergillus flavus CGMCC 3. 2890; Rhizopus nigricans AS3.4997; Penicillium glaucum STL 3501）采用PDA固体培养基，30 ℃下培养。
2、检测平板制备：将灭菌处理的LB琼脂冷却至50~60 ℃，无菌条件下用移液器向水平放置的培养皿（9 cm）中转移20 mL培养基。琼脂平板凝固后，吸取0.2 mL指示菌液至平板，用无菌涂布器涂布均匀， 随后放置牛津杯于平板上，为了使牛津杯放置稳固，可适当轻轻按压。
[0035] 3、抑菌活性测定：吸取0.2 mL副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵产生的抑菌组合物溶液至牛津杯，细菌在37 ℃下恒温静置培养18 h（霉菌采用PDA固体培养基，30 ℃下培养24 h），游标卡尺测抑菌圈直径。
实验结果见表1和图4，可以看出，副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵产生的抑菌组合物（1 g/mL）具有较宽的抗菌谱，对细菌种的部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有显著抑制作用，同时对霉菌中的黄曲霉、黑曲霉、黑根酶和青霉也具有不同程度的抑制作用。但总体上对细菌的抑制效果优于对霉菌的抑制效果。
表1副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵产生的抑菌组合物的抗菌谱
| 指示菌 | 抑菌活性 |
| 大肠杆菌（E. coli ） | +++ |
| 金黄色葡萄球菌（S. aureus） | +++ |
| 苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis） | +++ |
| 沙门氏菌（S. enterica） | +++ |
| 痢疾杆菌（S. dysenteriae） | +++ |
| 黄曲霉（A. flavus） | + |
| 黑曲霉（A. niger） | +++ |
| 黑根霉（R. nigricans） | ++ |
| 灰绿青霉（Pen. glaucum） | ++ |
+: 抑菌圈直径 5–10 mm; ++:抑菌圈直径 10–20 mm; +++:抑菌圈直径 >20 mm。
（三）副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵产生的抑菌组合物的热稳定性和酶解稳定性
1、.温度对抗菌活性影响：将副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵产生的抑菌组合物（1 g/mL）分别在60 °C， 80 °C或100 °C条件下处理 60 min，以大肠杆菌为指示菌，采用牛津杯琼脂扩散法测定抗菌活性变化。
2、 蛋白酶对抗菌活性影响：将副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵产生的抑菌组合物(1 g/mL)分别用胰蛋白酶 (3 mg/mL, pH 8.0; Sigma) 和胃蛋白酶 (3 mg/mL, pH 2.0; Sigma) 在 37 °C酶解处理2 h, 以大肠杆菌为指示菌，采用牛津杯琼脂扩散法测定抗菌活性变化。
实验结果见表2。可以看出，80 °C下作用1 h抗菌活性未发生变化，100 °C下作用1 h 或121 °C下作用20 min副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵产生的抑菌组合物抗菌活性出现一定程度下降，但下降并不明显。经胃蛋白酶和胰蛋白酶作用后，副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵产生的抑菌组合物抗菌活性出现一定程度下降，其中胰蛋白酶下降程度较大。
表2温度和酶对副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6-1)菌株发酵产生的抑菌组合物抗菌活性影响
Claims (5)
1.一株副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株,该菌株为副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1 ，于2014年02月23日保藏于位于武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014043。
2.一种如权利要求所述的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法，其特征在于，采用选择性培养基MC固态培养基及MRS固态培养基初筛得到乳酸菌，随后将筛选到的乳酸菌接种至纯牛奶中发酵培养以获取发酵组合物,以大肠杆菌为指示菌，采用牛津杯琼脂扩散法对发酵组合物进行抑菌活性试验检测，筛选到良好抗菌活性的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1菌株。
3.一种如权利要求所述的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株发酵产生的抑菌组合物，其特征在于，由以下方法制得：将副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1发酵凝乳混匀后离心去除沉淀，发酵上清经抽滤过膜进一步去除大颗粒物质，随后发酵上清经冷冻干燥获得冻干样抑菌组合物。
4. 如权利要求3所述的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1菌株发酵产生的抑菌组合物在乳制品防腐剂方面的用途。
5.如权利要求3所述的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1菌株发酵产生的抑菌组合物在制备抗菌药物方面的用途。
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| JIANYIN MIAO 等: "Purification and characterization of bacteriocin F1, a novel bacteriocin produced by Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6 from Tibetan kefir, a traditional fermented milk from Tibet, China", 《FOOD CONTROL》, 7 February 2014 (2014-02-07) * |
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