CN110229768B - 副干酪乳杆菌alac-4及其抑菌用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)ALAC‑4，其保藏号为CGMCC No.15548。本发明还涉及所述的副干酪乳杆菌ALAC‑4在制备抑制霉菌、酵母菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌和/或大肠杆菌中的用途，以及在富含Na+、K+、Ca2+或Zn2+离子的环境中抑制霉菌和/或酵母菌中的用途。本发明的副干酪乳杆菌ALAC‑4及其产蛋白类抑真菌物质对引起人类疾病及食物腐败的真菌有良好的抑制作用，其作为生物防腐剂应用于发酵食品中以延长其货架期，增加食品的安全性具有广阔的前景。

Description

副干酪乳杆菌ALAC-4及其抑菌用途
【技术领域】
本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)ALAC-4，还涉及所述副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)ALAC-4的用途。
【背景技术】
乳杆菌是一类重要的发酵微生物，在自然界里分布极为广泛，具有维持肠道菌群平衡、降低血液胆固醇含量、增强免疫能力和预防肿瘤等功能，在与人类生活密切相关的农牧业、食品和医药等重要领域具有极高的应用价值。
霉菌和酵母菌是食品中最常见的两种腐败菌，它们不仅影响食品的风味，造成明显的经济损失，还会产生真菌毒素，危害人类的健康。例如白假丝酵母菌会引发消化道、呼吸道感染等多种疾病；新型隐球酵母会引发慢性脑膜炎、肺炎；根霉会使淀粉质食品发生质变，还会造成果品菜蔬腐烂；生长在花生和大米上的黄曲霉会产生毒性比氰化钾大100倍的黄曲霉毒素B1，其致癌作用比已知化学致癌物都要强烈；被赤霉菌污染的玉米、小麦等谷物会产生具有雌激素样作用的、引起动物繁殖机能异常甚至死亡的玉米赤霉烯酮(F-2毒素)，会给畜牧场造成巨大的经济损害。
近几年，随着消费者对食品安全意识的提高，使用天然生物防腐剂代替化学防腐剂已经势在必行，而大量报道证明乳杆菌能产生有机酸、过氧化氢、细菌素等活性物质，它们对细菌、真菌、病原菌有一定的抑制作用。目前国内外对不同来源的乳酸菌产抑菌物质的研究较多，但值得注意的是，这些研究主要是在细菌领域，大多数乳酸菌产生的活性物质主要抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌的生长，酵母菌及霉菌等真菌领域的研究比较少，因此利用乳杆菌发酵生产抑真菌活性物质，对其作为生物防腐剂应用于发酵食品中以延长其货架期，增加食品的安全性具有广阔的前景。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)ALAC-4。
本发明的另一个目的是提供所述副干酪乳杆菌ALAC-4的抑菌用途。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)ALAC-4，该菌株已于2018年4月2日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.15548。
本发明还涉及所述的副干酪乳杆菌ALAC-4在制备抑制霉菌、酵母菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌和/或大肠杆菌中的用途。
根据本发明的一种优选实施方式，所述蛋白类抑菌物质的制备步骤如下：
A、副干酪乳杆菌ALAC-4活化培养与扩大培养
挑取一环穿刺保藏的副干酪乳杆菌ALAC-4接种到5mL灭菌的MRS培养基中，在培养温度35～37℃的条件下活化24～48h，然后以相同方式进行活化培养三代；
接着，按照接种量为MRS培养基体积的3～5％，把活化培养副干酪乳杆菌ALAC-4接种到MRS培养基中，在培养温度35～37℃的条件下活化24～48h，得到扩大培养液；
B、扩大培养液处理
步骤A得到的扩大培养液在离心机中离心分离，得到一种菌体沉淀物与一种上清液；所述菌体沉淀物弃去；所述上清液经0.22μm滤膜过滤，得到的滤液再在旋转蒸发仪中在温度40～50℃下浓缩至25倍，得到一种浓缩液；
C、凝胶色谱纯化
往步骤B得到的浓缩液中添加以所述浓缩液体积计60％饱和硫酸铵水溶液，混合均匀置于冰箱中，在温度4℃下放置一夜，接着使用离心机离心分离，弃去上清液，沉淀物用无菌水溶解，得到的溶液再由恒流泵以流速0.3mL/min通过26mm×50cm SephadexG-100凝胶过滤色谱柱分离，使用超纯水洗脱，使用紫外检测器在波长254nm处进行紫外光吸收检测，收集具有抑菌性的洗脱液；
D、反相高效液相色谱纯化
让步骤C得到的洗脱液在流速2mL/min的条件下，通过5μm、4.6mm×250mmAcclaimTM120 C18反相高效液相色谱柱1h，使用以乙腈与含有以重量计0.1％三氟乙酸的超纯水按照体积比70：30组成的混合物作为洗脱液，在室温下进行等浓度洗脱，使用紫外检测器在波长254nm处进行紫外光吸收检测，收集有抑菌性的洗脱液；
E、浓缩
步骤D得到的洗脱液使用3ku、15mL超滤离心管在转速4000r/min与温度25℃的条件下离心分离浓缩30min，测定其抑菌性，采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定，确定得到所述的蛋白类抑菌物质。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B中，所述的扩大培养液在转速4000rpm的条件下离心分离8～14min。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，添加饱和硫酸铵的浓缩液在温度4℃与转速12000rpm的条件下离心分离18～25min。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，使用超纯水洗脱180～240min。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C与D中，所述的洗脱液在3ku、50mL超滤离心管中在转速4000r/min与温度25℃的条件下进行离心分离30min。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤E中，所述的蛋白类抑菌物质的相对分子质量是31.04ku。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤E中，所述的蛋白类抑菌物质具有对酵母菌与霉菌具有良好的抑制作用。
本发明还提供上述副干酪乳杆菌ALAC-4在抑制霉菌和/或酵母菌中的用途。
以及，上述副干酪乳杆菌ALAC-4在抑制金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌和/或大肠杆菌中的用途。
在本发明中，所述霉菌是青霉菌属、娄地青霉、黑曲霉或冻土毛菌。
在本发明中，所述酵母菌是红酵母菌或白假丝酵母菌。
本发明还提供副干酪乳杆菌ALAC-4在富含Na+、K+、Ca2+或Zn2+离子的环境中抑制霉菌和/或酵母菌中的用途。
根据一种优选的实施方式，所述Na+、K+、Ca2+或Zn2+离子的浓度是以总重量计2％～8％。
本发明还涉及植物乳杆菌副干酪乳杆菌ALAC-4在制备蛋白类抑菌物质中的用途。
其中，所述蛋白类抑菌物质的制备步骤如下：
A、副干酪乳杆菌ALAC-4活化培养与扩大培养
挑取一环穿刺保藏的副干酪乳杆菌ALAC-4接种到5mL灭菌的MRS培养基中，在培养温度35～37℃的条件下活化24～48h，然后以相同方式进行活化培养三代；
接着，按照接种量为MRS培养基体积的3～5％，把活化培养副干酪乳杆菌ALAC-4接种到MRS培养基中，在培养温度35～37℃的条件下活化24～48h，得到扩大培养液；
B、扩大培养液处理
步骤A得到的扩大培养液在离心机中离心分离，得到一种菌体沉淀物与一种上清液；所述的菌体沉淀物弃去；所述的上清液用0.22μm滤膜过滤，得到的滤液再在旋转蒸发仪中在温度40～50℃的条件下浓缩至25倍，得到一种浓缩液；
C、凝胶色谱纯化
往步骤B得到的浓缩液中添加以所述浓缩液体积计60％饱和硫酸铵水溶液，混合均匀置于冰箱中，在温度4℃下放置一夜，接着使用离心机离心分离，弃去上清液，沉淀物用无菌水溶解，得到的溶液由恒流泵以流速0.3mL/min通过26mm×50cm SephadexG-100凝胶过滤色谱柱分离，使用超纯水洗脱，使用紫外检测器在波长254nm处进行紫外光吸收检测，收集具有抑菌性的洗脱液；
D、反相高效液相色谱纯化
让步骤C得到的洗脱液在流速2mL/min的条件下，通过5μm、4.6mm×250mmAcclaimTM120 C18反相高效液相色谱柱1h，使用以乙腈与含有以重量计0.1％三氟乙酸的超纯水按照体积比70：30组成的混合物作为洗脱液，在室温下进行等浓度洗脱，使用紫外检测器在波长254nm处进行紫外光吸收检测，收集有抑菌性的洗脱液；
E、浓缩
步骤D收集的洗脱液使用3ku、15mL超滤离心管在转速4000r/min与温度25℃的条件下离心分离浓缩30min，测定其抑菌性，采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定，得到所述的蛋白类抑菌物质。
本发明还涉及所述的副干酪乳杆菌ALAC-4在制备Cheddar干酪与酿造酱油中的用途。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)ALAC-4，该菌株已于2018年4月2日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.15548。
所述蛋白类抑菌物质制备方法详细描述如下。
所述蛋白类抑菌物质的制备步骤如下：
A、副干酪乳杆菌ALAC-4活化培养与扩大培养
挑取一环穿刺保藏的副干酪乳杆菌ALAC-4接种到5mL灭菌的MRS培养基中，在培养温度35～37℃的条件下活化24～48h，然后以相同方式进行活化培养三代；
接着，按照接种量为MRS培养基体积的3～5％，把活化培养副干酪乳杆菌ALAC-4接种到MRS培养基中，在培养温度35～37℃的条件下活化24～48h，得到扩大培养液；
有关MRS培养基的情况已经在前面描述过，因此在此不再赘述。
在本发明中，活化培养与扩大培养所使用的设备都是本技术领域里通常使用的设备。
B、扩大培养液处理
步骤A得到的扩大培养液在离心机中离心分离，得到一种菌体沉淀物与一种上清液；所述菌体沉淀物弃去；所述上清液经0.22μm滤膜过滤，再在旋转蒸发仪中在温度40～50℃下浓缩至25倍，得到一种浓缩液；
优选地，所述的扩大培养液在转速4000rpm的条件下离心分离8～14min。
本发明使用的离心机是目前市场上销售的产品，也是本技术领域里通常使用的设备，例如由上海莱睿科学仪器有限公司以商品名NU-C200R-E型NUAIRE台式离心机销售的离心机。
本发明使用的滤膜与旋转蒸发仪都是目前市场上销售的产品，例如由上海兴亚净化材料厂以商品名0.22×50有机滤膜销售的滤膜，由广州仪科实验室技术有限公司以商品名RV 10Digital V 8040325型旋转蒸发仪销售的旋转蒸发仪。
C、凝胶色谱纯化
往步骤B得到的浓缩液中添加以所述浓缩液体积计60％饱和硫酸铵水溶液，混合均匀置于冰箱中在温度4℃下放置一夜，接着使用离心机离心分离，弃去上清液，沉淀物用无菌水溶解，得到的溶液再由恒流泵以流速0.3mL/min通过26mm×50cm SephadexG-100凝胶过滤色谱柱分离，使用超纯水洗脱，使用紫外检测器在波长254nm处进行紫外光吸收检测，收集具有抑菌性的洗脱液；
在这个步骤中，往步骤B得到的浓缩液中添加饱和硫酸铵水溶液的基本目的在于使蛋白类物质得到充分沉淀。
添加饱和硫酸铵的浓缩液在温度4℃与转速12000rpm的条件下离心分离18～25min。
本发明使用的SephadexG-100凝胶过滤色谱柱是由北京瑞达恒辉公司以商品名sepure普通玻璃层析柱销售的产品。
在这个步骤中，使用的超纯水是由北京盈信恒通科技有限公司以商品名Field-X超纯水系统销售的仪器制备的。
所述的超纯水洗脱是让超纯水以流速0.3mL/min通过SephadexG-100凝胶过滤色谱柱，该洗脱的时间达到180～240min。副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑菌物质凝胶过滤色谱图见附图10。附图10的结果明显地表明副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类物质在洗脱过程中出现了三个蛋白峰。
所述的洗脱液在3ku(millipore)、50mL超滤离心管中在转速4000r/min与温度25℃的条件下进行离心分离30min。
本发明使用的紫外检测器是由上海沪西分析仪器厂有限公司以商品名HD-3紫外检测仪销售的产品。
D、反相高效液相色谱纯化
让步骤C得到的洗脱液在流速2mL/min的条件下，通过5μm、4.6mm×250mmAcclaimTM120 C18反相高效液相色谱柱1h，使用以乙腈与含有以重量计0.1％三氟乙酸的超纯水按照体积比70：30组成的混合物作为洗脱液，在室温下进行等浓度洗脱，使用紫外检测器在波长254nm处进行紫外光吸收检测，收集有抑菌性的洗脱液；
副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑菌物质反相高效液相色谱见附图11。附图11的结果明显地表明蛋白类物质在洗脱过程中出现了一个明显的蛋白峰。
本发明使用的AcclaimTM120 C18反相高效液相色谱柱是由美国戴安公司以商品名AcclaimTM120 C18反相高效液相色谱柱销售的产品。
在这个步骤中，所述的洗脱液在3ku、50mL超滤离心管中在转速4000r/min与温度25℃的条件下进行离心分离30min。
E、浓缩
步骤D得到的洗脱液使用3ku、15mL超滤离心管在转速4000r/min与温度25℃的条件下离心分离浓缩30min，测定其抑菌性，采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定，确定得到所述的蛋白类抑菌物质。
根据本发明，所述的蛋白类抑菌物质具有对酵母菌与霉菌具有良好的抑制作用。
本发明还涉及所述的副干酪乳杆菌ALAC-4在制备蛋白类抑菌物质中的用途。
本发明利用副干酪乳杆菌ALAC-4进行发酵培养，再经过离心、滤膜过滤、旋转蒸发仪浓缩、饱和硫酸铵沉淀、凝胶过滤色谱提取、反相高效液相色谱纯化、超滤离心管浓缩，得到一种蛋白类抑真菌物质。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，该蛋白类抑真菌物质达到了电泳纯，其相对分子质量约为31.04ku。蛋白类抑真菌物质具有良好的热稳定性，在pH3.0-6.0之间有抑菌性，紫外线辐射对其抑菌性无影响，甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈对其抑菌性有不同程度的抑制作用，Na+、K+、Ca2+、Zn2+对其抑菌性有不同程度的促进作用，Fe2+对其抑菌性影响不大，Tween-20、Tween-80、SDS对其抑菌性有不同程度的促进作用，甘油对其抑菌性影响不大，其最低抑菌浓度为13.66μg/mL。副干酪乳杆菌ALAC-4及其产蛋白类抑真菌物质对引起人类疾病及食物腐败的真菌有良好的抑制作用，可应用于食品的防腐保鲜或抗菌药物的生产。
本发明还涉及所述的副干酪乳杆菌ALAC-4在制备Cheddar干酪与酿造酱油中的用途。
[有益效果]
本发明的有益效果是：本发明提供一种副干酪乳杆菌ALAC-4及其产蛋白类抑真菌物质，该蛋白类抑真菌物质相对分子质量约为31.04ku，具有良好的热稳定性，在pH3.0-6.0之间有抑菌性，紫外线辐射对其抑菌性无影响，甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈对其抑菌性有不同程度的抑制作用，Na+、K+、Ca2+、Zn2+对其抑菌性有不同程度的促进作用，因此副干酪乳杆菌ALAC-4特别适合应用于含盐的发酵食品中。此外，Tween-20、Tween-80、SDS对其抑菌性有不同程度的促进作用，甘油对其抑菌性影响不大，其最低抑菌浓度为13.66μg/mL。副干酪乳杆菌ALAC-4及其产蛋白类抑真菌物质对引起人类疾病及食物腐败的真菌有良好的抑制作用，其作为生物防腐剂应用于发酵食品中以延长其货架期，增加食品的安全性具有广阔的前景。
副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)ALAC-4已于2018年4月2日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.15548。
【附图说明】
图1是排酸副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物(浓缩液)抑菌性测定结果图；
图2是副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图3是蛋白质Marker标准曲线图；
图4是Na+对副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质抑菌性的影响。
图5是K+对副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质抑菌性的影响。
图6是Ca2+对副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质抑菌性的影响。
图7是Zn2+对副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质抑菌性的影响。
图8是Fe2+对副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质抑菌性的影响。
图9是副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物对酶的敏感性结果；
图10是副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑菌物质凝胶过滤色谱图；
图11是副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑菌物质高效液相色谱图；
图12是温度对副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质抑菌性的影响；
图13是pH值对副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质抑菌性的影响；
图14是紫外线辐射对副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质抑菌性的影响；
图15是有机溶剂对副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质抑菌性的影响；
图16是Tween-20对副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质抑菌性的影响。
图17是Tween-80对副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质抑菌性的影响。
图18是SDS对副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质抑菌性的影响。
图19是甘油对副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质抑菌性的影响。
图20是副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质最低抑菌浓度的测定结果。
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
在本发明中，如无特殊说明，用于解释浓度的“％”为重量百分比，“：”为重量比，“份”为重量份。
在本发明中，涉及以下培养基：
LBS培养基：将25g乙酸钠、10g胰酪蛋白胨、6g磷酸二氢钾、5g酵母提取粉、2g柠檬酸铵、0.57g硫酸镁、0.12g硫酸锰、0.034g硫酸亚铁、20g葡萄糖、15g琼脂、1mL吐温80与1.3mL冰乙酸溶于1000mL蒸馏水中，得到的溶液调节至pH5.5，在温度115℃下灭菌15min，得到LBS培养基(其中，调节溶液pH使用的溶液是无机碱或无机酸水溶液，例如氢氧化钠水溶液、盐酸水溶液等溶液)。
MRS培养基：将10g蛋白胨、5g酵母提取粉、10g牛肉膏、2g柠檬酸铵、1mL吐温80、5g乙酸钠、2g磷酸氢二钾、0.58g硫酸镁、0.25g硫酸锰与20g葡萄糖溶于1000mL蒸馏水中，得到的溶液调节至pH6.5，在温度121℃灭菌20min，得到MRS培养基。
TSB培养基：将17g胰酪蛋白胨、2.5g磷酸二氢钾、3g大豆蛋白胨、5g氯化钠与2.5g葡萄糖溶于1000mL蒸馏水中，得到的溶液调节至pH7.0，在温度121℃灭菌15min，得到TSB培养基。
半固体TSA培养基：在TSB培养基中添加7.5g琼脂，在温度121℃灭菌15min，得到TSA培养基。
实施例1副干酪乳杆菌ALAC-4的筛选方法与鉴定
1、从内蒙古传统发酵食品酸粥中筛选乳酸菌。
取5g从巴彦淖尔市临河区各乡镇获得的酸粥样品放到50mLLBS培养基中，在温度37℃下培养至肉眼可见浑浊状态。得到的培养液采用十倍稀释法进行稀释106，然后将稀释的培养液涂布在LBS培养基上，在温度37℃下培养3天，再用无菌接种针挑取平板上的单个菌落于MRS琼脂培养基上在温度37℃下划线纯化培养3天，然后挑取单个菌落进行本领域技术人员熟知的革兰氏染色与过氧化氢酶测试。选取5株革兰氏染色呈阳性与过氧化氢酶测试呈阴性的单菌落采用甘油保藏法保藏，具体保藏方法是将500μL对数期菌液和500μL浓度为以重量计20％的无菌甘油混匀后放入菌种保藏管中混匀，在冰箱中在温度-80℃下保藏，它们分别记为ALAC-1、ALAC-2、ALAC-3、ALAC-4、ALAC-5。
2、指示菌菌液的制备。
选择由中国微生物菌种保藏管理中心购进的青霉菌属、黑曲霉菌、黄曲霉菌、冻土毛菌、地霉、红酵母菌、白假丝酵母菌、克鲁斯假丝酵母与酿酒酵母作为指示菌。用无菌生理盐水分别将这些霉菌菌体浓度调整至106cfu/mL，将这些酵母菌菌体浓度调整至102cfu/mL。然后，按照以TSB培养基重量计4％的接种量，将这些指示菌分别接种于TSB培养基中，在温度28℃下传代培养3天，得到指示菌菌液。
3、抗真菌乳酸菌筛选
取出在冰箱中在温度-80℃下保藏的乳酸菌，放置空气中，将其温度降至常温，再在温度37℃下在MRS固体培养基上划线培养2天，取出，在长菌的MRS固体培养基上覆盖10～15mL含有1mL指示菌菌液的半固体TSA培养基，待琼脂固化后，置于培养箱中在温度28℃下培养2天，观察其抑菌情况，其观察结果见表1。
表1：乳酸菌对霉菌与酵母菌抑菌性结果
菌名 ALAC-1 ALAC-2 ALAC-3 ALAC-4 ALAC-5
青霉菌属(切达干酪) +++ ++ ++ +++ ++++
青霉菌属(白干酪) ++++ ++++ +++ +++ +++
娄地青霉 + + + + +
黑曲霉 +++ ++ +++ +++ +++
黄曲霉 ++++ ++ +++ ++++ ++
冻土毛菌 +++ +++ ++++ ++++ ++++
地霉 - + - - -
红酵母菌 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
白假丝酵母菌 +++ +++ ++++ ++++ ++++
克鲁斯假丝酵母 - - - - -
酿酒酵母 - - - - -
注:-表示无抑菌性；+表示非常弱抑菌性；++表示弱抑菌性，有清晰抑菌圈；
+++表示较强抑菌性；有明显抑菌圈；++++表示强抑菌性，完全抑制真菌生长。
由表1的结果可以确定，5株均有较好抑真菌活性，其中乳杆菌ALAC-4对真菌的抑菌性强且范围广，特别是对红酵母菌和白假丝酵母菌表现出典型的强抑菌特性，能够完全抑制这两种酵母菌的生长。
通过用扫描电镜与透射电镜观察红酵母菌和白假丝酵母菌细胞的超微结构发现，ALAC-4对酵母细胞壁、细胞形态以及超维结构具有较大的破坏性影响。同时，ALAC-4会影响酵母菌的生长曲线，且使酵母菌体内电解质、可溶性蛋白、可溶性总糖外渗，导致菌液电导率、可溶性蛋白含量和可溶性总糖含量增加，说明其改变了酵母细胞膜的通透性。经抑菌物质处理后酵母菌呼吸系统的琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶活性均下降，抑菌物质使酵母菌无法正常进行磷代谢，无法正常进行蛋白质表达，导致蛋白质缺失或含量下降，从而影响酵母菌生长和繁殖。
另一方面，尽管青霉菌、娄地青霉、黄曲霉和地霉均为霉菌而存在一些共性，但同一抑菌物质在不同霉菌中表现为不同的抑菌性能，例如ALAC-4株对于黄曲霉表现为强抑菌性而对地霉不具备抑菌性能，而同时分离出的ALAC-2对黄曲霉表现为弱抑菌性，但却是5株分离株中唯一一株对地霉表现出一定抑菌活性的菌株。由此可见，尽管副干酪乳杆菌的抑菌性能在现有技术中存在一些报道，但综合抑菌实验结果可以看出，各分离株的具体抑菌特性存在较大差异而难以预测。
4、副干酪乳杆菌ALAC-4鉴定
A、副干酪乳杆菌ALAC-4生理生化鉴定
副干酪乳杆菌ALAC-4常规革兰氏染色及生理生化特征鉴定表明，它为无芽孢的革兰氏阳性菌，无鞭毛，呈杆状，过氧化氢酶测试呈阴性，不能够液化明胶，可产酸但不产气。可以在温度4～60℃的范围内生长，最适生长温度是37℃。可以在pH4.5～10.0的范围内生长，最合适pH值是6.5。可以在盐浓度为以重量计2～14％的培养基中生长。
B、副干酪乳杆菌ALAC-4的API 50CH系统鉴定
使用API 50CH系统(BioMérieux Vitek,HazelwoA,MO)对副干酪乳杆菌ALAC-4鉴定表明，副干酪乳杆菌ALAC-4能够利用阿拉伯糖、纤维二糖、七叶苷、乳糖、蔗糖、木糖、菊糖、麦芽糖、水杨苷等发酵，不能够利用鼠李糖发酵。根据以上特性，将副干酪乳杆菌ALAC-4鉴定为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。
实施例2副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物的抑菌性测定
1、制备副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物
(1)副干酪乳杆菌ALAC-4活化培养与扩大培养
挑取一环穿刺保藏的副干酪乳杆菌ALAC-4接种到5mL灭菌的MRS培养基中，在培养温度36℃的条件下活化24h，然后以相同方式进行活化培养三代；
接着，按照接种量为MRS培养基体积的3～5％，把活化培养副干酪乳杆菌ALAC-4接种到MRS培养基中，在培养温度36℃的条件下活化24h，得到扩大培养液；
(2)扩大培养液处理
步骤A得到的扩大培养液在离心机中离心分离，得到一种菌体沉淀物与一种上清液；所述菌体沉淀物弃去；所述上清液经0.22μm滤膜过滤，再在旋转蒸发仪中在温度40～50℃下浓缩至25倍，得到一种浓缩液，该浓缩液即为副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物。
2、对黑曲霉菌的抑菌性能测定
指示菌菌悬液的制备：往斜面保藏的黑曲霉菌试管中加5mL灭菌生理盐水，充分震荡，过滤菌丝，得到黑曲霉菌孢子悬液，使用灭菌生理盐水将孢子浓度调节至106cfu/mL，混匀备用。
(1)副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物抑菌性试验
采用牛津杯法将融化PDA培养基倒入无菌平板中，让琼脂凝固，再放入牛津杯中。在琼脂上层加入含有指示菌菌悬液的PDA培养基。待培养基凝固后，往牛津杯中加入200μL的副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物，在温度28℃下培养2天，然后使用游标卡尺测量抑菌圈直径(含牛津杯直径7mm)，其结果列于表2。
表2：副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物对黑曲霉菌的抑菌结果
副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物
抑菌圈直径(mm) 15.13±0.73
表2的结果表明，副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物对黑曲霉菌有强抑制作用。
(2)排酸副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物的抑菌性试验
使用浓度为1mol/L的NaOH与HCl水溶液将副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物的pH分别调节至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0与6.5，采用牛津杯法测定在不同pH下的抑菌性，同时以未调节pH的ALAC-4代谢产物作为对照，其检测结果如图1所示。
图1显示，经排酸处理的副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物仍具有抑菌性，由此推断，除副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物中含有的有机酸外，代谢产物中还有其它物质也具有抑菌作用。
(3)副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物过氧化氢排除试验
用磷酸盐缓冲液(pH7.0，1mol/mL)把由北京酷来搏科技有限公司以商品名过氧化氢酶销售的过氧化氢酶配制成浓度为5mg/mL的酶液。测定副干酪乳杆菌ALAC-4的浓缩液pH值，使用1mol/L的NaOH溶液将其浓缩液pH调节至过氧化氢酶最适宜pH值7.4，加入过氧化氢酶溶液，使其终浓度达到1mg/mL，混匀，接着置于水浴锅水浴中，在温度37℃下保持2h，再在温度100℃下灭活5min，然后将其pH调节至原浓缩液的pH值，采用牛津杯法测定抑菌性，其结果列于表3中。
表3：副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物过氧化氢排除试验结果
副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物
抑菌圈直径(mm) 12.18±0.43
表3的结果与表2的结果相比表明，副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物经过氧化氢酶处理后抑菌活性下降，但仍对指示菌有抑制作用，由此推断，在代谢产物中除过氧化氢外还有其它物质具有抑菌作用。
(4)副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物对酶的敏感性试验
用磷酸盐缓冲液(pH7.0，1mol/mL)把由北京酷来搏科技有限公司公司以商品名胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K销售的蛋白酶配制成浓度为5mg/mL的酶液。测定副干酪乳杆菌ALAC-4浓缩液的pH值，使用浓度为1mol/L的HCl与NaOH水溶液将浓缩液pH值调节至不同酶的最适宜pH值，再分别加入胰蛋白酶(pH7.8)、胃蛋白酶(pH2.0)、糜蛋白酶(pH7.0)、木瓜蛋白酶(pH5.7)、蛋白酶K(pH4.0)溶液，使它们的终浓度达到1mg/mL，混匀，在温度37℃下反应2h，然后在温度100℃下灭活5min，然后将其pH调节至原浓缩液的pH值，采用牛津杯法测定抑菌性，同时设未经酶处理的浓缩液作对照，其结果列于附图9。
附图9的结果表明，副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物经蛋白酶处理后抑菌活性明显减弱，说明副干酪乳杆菌ALAC-4代谢产物对蛋白酶敏感，由此推断，抑菌物质中包含有蛋白质或者肽类物质，这类蛋白类物质对指示菌具有拮抗作用。
以上结果均说明，副干酪乳杆菌ALAC-4及其代谢产物均有良好的抗菌性能。
实施例3副干酪乳杆菌ALAC-4蛋白类抑菌物质的抑菌性测定
1、制备副干酪乳杆菌ALAC-4蛋白类抑菌物质
A、副干酪乳杆菌ALAC-4活化培养与扩大培养
挑取一环穿刺保藏的副干酪乳杆菌ALAC-4接种到5mL灭菌的MRS培养基中，在培养温度36℃的条件下活化24h，然后以相同方式进行活化培养三代；
接着，按照接种量为MRS培养基体积的4％，把活化培养副干酪乳杆菌ALAC-4接种到MRS培养基中，在培养温度35℃的条件下活化36h，得到扩大培养液；
B、扩大培养液处理
步骤A得到的扩大培养液在转速4000rpm的条件下离心分离11min，得到一种菌体沉淀物与一种上清液；所述菌体沉淀物弃去；所述上清液经0.22μm滤膜过滤，再在旋转蒸发仪中在温度40℃下浓缩至25倍，得到一种浓缩液；
C、凝胶色谱纯化
往步骤B得到的浓缩液中添加以所述浓缩液体积计60％饱和硫酸铵水溶液，混合均匀置于冰箱中在温度4℃下放置一夜，接着使用离心机在温度4℃与转速12000rpm的条件下离心分离18min，弃去上清液，沉淀物用无菌水溶解，得到的溶液再由恒流泵以流速0.3mL/min通过26mm×50cm SephadexG-100凝胶过滤色谱柱分离，使用超纯水洗脱210min，得到的洗脱液在3ku、50mL超滤离心管中在转速4000r/min与温度25℃的条件下进行离心分离30min，使用紫外检测器在波长254nm处进行紫外光吸收检测，收集具有抑菌性的洗脱液；
D、反相高效液相色谱纯化
让步骤C得到的洗脱液在流速2mL/min的条件下，通过5μm、4.6mm×250mmAcclaimTM120 C18反相高效液相色谱柱1h，使用以乙腈与含有以重量计0.1％三氟乙酸的超纯水按照体积比70：30组成的混合物作为洗脱液，在室温下进行等浓度洗脱，得到的洗脱液在3ku、50mL超滤离心管中在转速4000r/min与温度25℃的条件下进行离心分离30min，使用紫外检测器在波长254nm处进行紫外光吸收检测，收集有抑菌性的洗脱液；
E、浓缩
步骤D得到的洗脱液使用3ku、15mL超滤离心管在转速4000r/min与温度25℃的条件下离心分离浓缩30min。
2、副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑菌物质的相对分子质量测定
首先，配制浓度为以重量计12％的分离胶、5％的浓缩胶，以10～200ku蛋白质标准品作为Marker，在先为80mv、后为100mv的条件下进行电泳3h，用考马斯亮蓝R-250染色液染色2h，然后放入TS-2000A脱色摇床中脱色4h，其结果如附图2所示。
图2的结果表明，副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质达到了电泳纯。然后，采用游标卡尺测量Marker蛋白质条带迁移距离和上样缓冲液迁移距离，利用Rf＝蛋白质条带迁移距离/上样缓冲液迁移距离计算出相对迁移率，即Rf值，再以Rf值为横坐标，以已知蛋白质相对分子质量的常用对数值为纵坐标绘制Marker标准曲线，具体地见附图3。
采用游标卡尺测量，副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质迁移了4.6cm，上样缓冲液迁移了6.5cm，其Rf值约为0.708。根据附图3的Maker标准曲线y＝-0.9126x+5.1381计算出副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质的相对分子质量约为31.04ku。
2、副干酪乳杆菌ALAC-4蛋白类抑菌物质对黑曲霉菌抑菌性测定
取所得蛋白类抑菌物质，按蛋白类抑菌物质：黑曲霉菌悬液：TSB培养基＝4:1:10的比例混匀，28℃培养30h后加入到96孔板中，以未加抑菌物质的装有黑曲霉菌悬液的TSB培养基为对照，用酶标仪测定A630，结果如表4。
表4副干酪乳杆菌ALAC-4蛋白类抑菌物质对黑曲霉菌的抑菌结果
副干酪乳杆菌ALAC-4蛋白类物质 黑曲霉
A<sub>630</sub> 0.043 0.453
表4的结果表明，副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑菌物质对黑曲霉菌有良好的抑制作用。
3、对白假丝酵母菌抑菌性测定
按照以培养基体积计4％接种量，把由中国微生物菌种保藏管理中心购进的斜面保藏白假丝酵母菌接种到YEPD培养基中，在温度28℃条件下活化24h以相同方式活化三代，得到的第三代发酵液用无菌生理盐水将其菌液浓度调节至102cfu/mL，混匀备用。
白假丝酵母菌抑菌性测定：按照蛋白类物质：白假丝酵母菌悬液：TSB培养基的体积比为4：1：10，将副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类物质、白假丝酵母菌悬液与TSB培养基混匀，在温度28℃下培养24h，再加到96孔板中，以未加蛋白类物质的含有白假丝酵母菌菌悬液的TSB培养基作为对照，使用由美国伯腾仪器有限公司以商品名BioTek Gen5酶标仪销售的酶标仪测定A600，其测定结果列于表5。
表5：副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类物质对白假丝酵母菌的抑菌结果
副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类物 白假丝酵母菌
A<sub>600</sub> 0.599 1.172
表5表明，副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类物质对白假丝酵母菌有良好的抑制作用。
3、对金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌及大肠杆菌抑菌性测定
按照以培养基体积计4％接种量，把由中国微生物菌种保藏管理中心购进的大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 11775-3、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC26003-3、沙门氏菌(Salmonella)ATCC 14028接种到TSB培养基中，在温度37℃条件下活化24h，以相同方式活化三代，得到的第三代发酵液用无菌PBS将其菌液浓度调节至102cfu/mL，混匀备用。
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌抑菌性测定：用Bradford法调整抑菌物质的蛋白含量为800ug/ml，按照蛋白类物质：细菌菌悬液：TSB培养基的体积比为1：1：1，将副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类物质、细菌菌悬液与TSB培养基于96孔板中混匀后在温度37℃下培养24h，以未加蛋白类物质的含有三种细菌菌悬液的TSB培养基作为对照，使用由美国伯腾仪器有限公司以商品名Synergy H1全功能微孔板检测仪测定A600，其测定结果列于表6。
表6：副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类物质对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌结果
Figure GDA0003417105550000191
表6表明，副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑菌物质对大肠杆菌和沙门氏菌具有较好的抑制作用，但对金黄色葡萄球菌无明显的抑菌性。
实施例4金属离子对ALAC-4蛋白类抑菌物质抑菌特性的提高
取实施例3制备得到的副干酪乳杆菌ALAC-4蛋白类抑菌物质，分别将NaCl、KCl、CaCl2、FeSO4、ZnSO4加到蛋白类抑菌物质与无菌水中混匀，使其金属离子达到以总重量计2％、4％、6％、8％、10％，室温静置2h后，将含有金属离子的蛋白类抑菌物质添加到装有酵母菌悬液的TSB培养基中(TSB培养基:酵母菌悬液:蛋白类物质＝100μL:10μL:40μL)，30℃培养24h后加到96孔板中，用酶标仪测定其吸光值。以不含金属离子的抑菌物质添加到装有菌悬液的TSB培养基中培养后测得的吸光度值作对比，判断金属离子对抑菌物质的抑菌性的影响，结果如图4-8所示。
实验结果表明，相对于常规的乳酸菌在富含金属离子的环境下表现出抑菌特性的下降，本发明的ALAC-4在存在适量金属离子的环境下却表现出抑菌特性的提高，特别是在含有2％Na+离子的环境下，表现出显著优于不含Na+离子的环境的抗菌特性，然后随着Na+离子浓度的进一步提高而趋于平缓。类似地，在环境中添加一定量的K+、Ca2+或Zn2+也起到提高ALAC-4抗菌特性的用途。值得一提的是，在食品领域中，特别对于发酵食品，Na+、K+、Ca2+或Zn2+在食品中的含量通常不高于8％，由此可见，ALAC-4特别适应于在含盐环境下的抑菌用途。
实施例5其他因素对ALAC-4蛋白类抑菌物质抑菌特性的影响
采用与前面描述的产蛋白类抑真菌物质抑菌性试验方法进行了温度、pH值、紫外线辐射、有机溶剂、Tween-20、Tween-80、SDS与甘油的抑菌性试验，其结果列于附图9～附图20。
根据附图9～附图20的结果可以确定，本发明副干酪乳杆菌ALAC-4产蛋白类抑真菌物质具有良好的热稳定性，在pH3.0～6.0有抑菌性，紫外线辐射对其抑菌性无影响，甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈对其抑菌性有不同程度的抑制作用，而常作为食品工业领域的乳化剂的Tween-20、Tween-80、SDS均对其抑菌性有不同程度的促进作用，甘油对其抑菌性影响不大，其最低抑菌浓度为13.66μg/mL。
实施例6：本发明蛋白类抑菌物质的制备
作为实施例3.1的替代，本实施例的步骤如下：
A、副干酪乳杆菌ALAC-4活化培养与扩大培养
挑取一环穿刺保藏的副干酪乳杆菌ALAC-4接种到5mL灭菌的MRS培养基中，在培养温度35℃的条件下活化48h，然后以相同方式进行活化培养三代；
接着，按照接种量为MRS培养基体积的3％，把活化培养副干酪乳杆菌ALAC-4接种到MRS培养基中，在培养温度37℃的条件下活化24h，得到扩大培养液；
B、扩大培养液处理
步骤A得到的扩大培养液在转速4000rpm的条件下离心分离8min，得到一种菌体沉淀物与一种上清液；所述菌体沉淀物弃去；所述上清液经0.22μm滤膜过滤，再在旋转蒸发仪中在温度50℃下浓缩至25倍，得到一种浓缩液；
C、凝胶色谱纯化
往步骤B得到的浓缩液中添加以所述浓缩液体积计60％饱和硫酸铵水溶液，混合均匀置于冰箱中在温度4℃下放置一夜，接着使用离心机在温度4℃与转速12000rpm的条件下离心分离25min，弃去上清液，沉淀物用无菌水溶解，得到的溶液再由恒流泵以流速0.3mL/min通过26mm×50cm SephadexG-100凝胶过滤色谱柱分离，使用超纯水洗脱180min，得到的洗脱液在3ku、50mL超滤离心管中在转速4000r/min与温度25℃的条件下进行离心分离30min，使用紫外检测器在波长254nm处进行紫外光吸收检测，收集具有抑菌性的洗脱液；
D、反相高效液相色谱纯化
让步骤C得到的洗脱液在流速2mL/min的条件下，通过5μm、4.6mm×250mmAcclaimTM120 C18反相高效液相色谱柱1h，使用以乙腈与含有以重量计0.1％三氟乙酸的超纯水按照体积比70：30组成的混合物作为洗脱液，在室温下进行等浓度洗脱，得到的洗脱液在3ku、50mL超滤离心管中在转速4000r/min与温度25℃的条件下进行离心分离30min，使用紫外检测器在波长254nm处进行紫外光吸收检测，收集有抑菌性的洗脱液；
E、浓缩
步骤D得到的洗脱液使用3ku、15mL超滤离心管在转速4000r/min与温度25℃的条件下离心分离浓缩30min，测定其抑菌性，采用本说明书描述的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定，确定得到相对分子质量为31.04ku的蛋白类抑菌物质。
实施例7：本发明蛋白类抑菌物质的制备
作为实施例3.1的替代，本实施例的步骤如下：
A、副干酪乳杆菌ALAC-4活化培养与扩大培养
挑取一环穿刺保藏的副干酪乳杆菌ALAC-4接种到5mL灭菌的MRS培养基中，在培养温度37℃的条件下活化36h，然后以相同方式进行活化培养三代；
接着，按照接种量为MRS培养基体积的5％，把活化培养副干酪乳杆菌ALAC-4接种到MRS培养基中，在培养温度36℃的条件下活化48h，得到扩大培养液；
B、扩大培养液处理
步骤A得到的扩大培养液在转速4000rpm的条件下离心分离11814min，得到一种菌体沉淀物与一种上清液；所述菌体沉淀物弃去；所述上清液经0.22μm滤膜过滤，再在旋转蒸发仪中在温度45℃下浓缩至25倍，得到一种浓缩液；
C、凝胶色谱纯化
往步骤B得到的浓缩液中添加以所述浓缩液体积计60％饱和硫酸铵水溶液，混合均匀置于冰箱中在温度4℃下放置一夜，接着使用离心机在温度4℃与转速12000rpm的条件下离心分离22min，弃去上清液，沉淀物用无菌水溶解，得到的溶液再由恒流泵以流速0.3mL/min通过26mm×50cm SephadexG-100凝胶过滤色谱柱分离，使用超纯水洗脱240min，得到的洗脱液在3ku、50mL超滤离心管中在转速4000r/min与温度25℃的条件下进行离心分离30min，使用紫外检测器在波长254nm处进行紫外光吸收检测，收集具有抑菌性的洗脱液；
D、反相高效液相色谱纯化
让步骤C得到的洗脱液在流速2mL/min的条件下，通过5μm、4.6mm×250mmAcclaimTM120 C18反相高效液相色谱柱1h，使用以乙腈与含有以重量计0.1％三氟乙酸的超纯水按照体积比70：30组成的混合物作为洗脱液，在室温下进行等浓度洗脱，得到的洗脱液在3ku、50mL超滤离心管中在转速4000r/min与温度25℃的条件下进行离心分离30min，使用紫外检测器在波长254nm处进行紫外光吸收检测，收集有抑菌性的洗脱液；
E、浓缩
步骤D得到的洗脱液使用3ku、15mL超滤离心管在转速4000r/min与温度25℃的条件下离心分离浓缩30min，测定其抑菌性，采用本说明书描述的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定，确定得到相对分子质量为31.04ku的蛋白类抑菌物质。
试验实施例1：用副干酪乳杆菌ALAC-4生产Cheddar干酪的抑菌效果试验
根据文献范帅，添加具有抑真菌特性乳杆菌生产Cheddar干酪工艺条件的研究[D].内蒙古农业大学,2016描述的方法生产Cheddar干酪
将添加副干酪乳杆菌ALAC-4生产的干酪与利用乳酸乳球菌乳脂亚种和乳酸乳球菌亚种生产的干酪分别在温度4℃与25℃条件下贮藏，再根据GB/T 4789.15-2010规定的方法测定其酵母菌数与霉菌数，同时根据GB 25192-2010规定标准50CFU/g，由在温度4℃与25℃下酵母菌数和霉菌数超过这个标准的日期，可以判断副干酪乳杆菌ALAC-4的抑菌效果，其结果列于表6-9。表6-9的结果表明，在放置温度为4℃的条件下，在添加副干酪乳杆菌ALAC-4生产的干酪中，酵母菌数超标日期比传统菌株生产的干酪晚3天，霉菌数超标日期比传统菌株生产的干酪晚5天。在放置温度为25℃的条件下，添加副干酪乳杆菌ALAC-4生产的干酪中的酵母菌数及霉菌数显著低于利用传统菌株生产的干酪(p<0.05)，且酵母菌数超标日期比传统菌株生产的干酪晚1天，霉菌数超标日期比传统菌株生产的干酪晚3天。综上所述，可以确定产蛋白类抑真菌物质的副干酪乳杆菌ALAC-4作为生物防腐剂用于Cheddar干酪生产具有可行性。
表7：在温度4℃下干酪中的酵母菌测定结果
Figure GDA0003417105550000231
注：-表示菌数超标；不同小写字母表示数据间差异显著((p<0.05)
表8：在温度4℃下干酪中霉菌测定结果
Figure GDA0003417105550000232
注：-表示菌数超标；不同小写字母表示数据间差异显著((p<0.05)
表9：在温度25℃下干酪中酵母菌测定结果
Figure GDA0003417105550000241
注：-表示菌数超标；小写字母不同表示数据间差异显著((p<0.05)
表10：在温度25℃下干酪中霉菌测定结果
Figure GDA0003417105550000242
注：-表示菌数超标；不同小写字母表示数据间差异显著((p<0.05)
试验实施例2：本发明副干酪乳杆菌ALAC-4用于酿造酱油
根据文献李幼筠，酱油生产实用技术[M].北京:化学工业出版社,198(2015)描述的方法，在后发酵的步骤中添加具有抑真菌特性的副干酪乳杆菌ALAC-4，酿造出一种酱油，同时在没有添加任何菌株的情况下，以相同方式酿造出一种酱油。
选取由佛山市海天调味食品股份有限公司销售的海天黄豆酱油作为对照样品。
添加副干酪乳杆菌ALAC-4酿造的酱油与海天黄豆酱油分别用无菌水稀释三倍，再装到敞口瓶置于实验室。根据GB 4789.15-2016规定的方法，测定这些酱油中的霉菌及酵母菌总数，其结果列于表10中。试验连续进行五天，添加副干酪乳杆菌ALAC-4酿造的酱油中的霉菌及酵母菌总数均低于未添加该菌株酿造的酱油及市售海天黄豆酱油，由此可以确定，将副干酪乳杆菌ALAC-4添加到酿造酱油的生产过程中以抑制真菌的生长，延长其货架期。
表11：不同酱油中霉菌及酵母菌测定结果
Figure GDA0003417105550000243
Figure GDA0003417105550000251
试验实施例3：本发明蛋白类抑真菌物质在酿造酱油中抑制真菌试验
试验实施例的实施方式如下：
把本发明蛋白类抑真菌物质按照最低抑菌浓度添加到自制无添加酱油中，使用无菌水将这种自制酱油与市售海天黄豆酱油稀释三倍，再装入敞口瓶置于实验室。根据GB4789.15-2016规定的方法，测定这些酱油中的霉菌及酵母菌总数，其结果列于表11中。试验连续进行五天，添加本发明蛋白类抑真菌物质酱油的霉菌及酵母菌总数均低于自制无添加酱油及市售海天黄豆酱油，由此可以确定本发明蛋白类抑真菌物质作为生物防腐剂添加到酿造酱油中，能够抑制真菌生长，延长其货架期。
表12：酱油中霉菌及酵母菌测定结果
Figure GDA0003417105550000252

Claims (8)

1.一种副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）ALAC-4，该菌株已于2018年4月2日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.15548。
2.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ALAC-4在抑制霉菌和/或酵母菌中的用途，所述霉菌是青霉菌属、黑曲霉或冻土毛菌；所述酵母菌是红酵母菌或白假丝酵母菌。
3.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ALAC-4在抑制沙门氏杆菌和/或大肠杆菌中的用途。
4.权利要求1所述的副干酪乳杆菌ALAC-4在富含Na+、K+、Ca2+或Zn2+离子的环境中抑制霉菌和/或酵母菌中的用途，所述霉菌是青霉菌属、黑曲霉或冻土毛菌；所述酵母菌是红酵母菌或白假丝酵母菌。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述Na+、K+、Ca2+或Zn2+离子的浓度是以总重量计2%~8%。
6.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ALAC-4在制备蛋白类抑菌物质中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述蛋白类抑菌物质的制备步骤如下：
A、副干酪乳杆菌ALAC-4活化培养与扩大培养
挑取一环穿刺保藏的副干酪乳杆菌ALAC-4接种到5mL灭菌的MRS培养基中，在培养温度35～37℃的条件下活化24～48h，然后以相同方式进行活化培养三代；
接着，按照接种量为MRS培养基体积的3～5%，把活化培养副干酪乳杆菌ALAC-4接种到MRS培养基中，在培养温度35～37℃的条件下活化24～48h，得到扩大培养液；
B、扩大培养液处理
步骤A得到的扩大培养液在离心机中离心分离，得到一种菌体沉淀物与一种上清液；所述的菌体沉淀物弃去；所述的上清液用0.22μm滤膜过滤，得到的滤液再在旋转蒸发仪中在温度40～50℃的条件下浓缩至25倍，得到一种浓缩液；
C、凝胶色谱纯化
往步骤B得到的浓缩液中添加以所述浓缩液体积计60%饱和硫酸铵水溶液，混合均匀置于冰箱中，在温度4℃下放置一夜，接着使用离心机离心分离，弃去上清液，沉淀物用无菌水溶解，得到的溶液由恒流泵以流速0.3mL/min通过26mm×50cm SephadexG-100凝胶过滤色谱柱分离，使用超纯水洗脱，使用紫外检测器在波长254nm处进行紫外光吸收检测，收集具有抑菌性的洗脱液；
D、反相高效液相色谱纯化
让步骤C得到的洗脱液在流速2mL/min的条件下，通过5μm、4.6mm×250mm AcclaimTM120C18反相高效液相色谱柱1h，使用以乙腈与含有以重量计0.1%三氟乙酸的超纯水按照体积比70：30组成的混合物作为洗脱液，在室温下进行等浓度洗脱，使用紫外检测器在波长254nm处进行紫外光吸收检测，收集有抑菌性的洗脱液；
E、浓缩
步骤D收集的洗脱液使用3ku、15mL超滤离心管在转速4000r/min与温度25℃的条件下离心分离浓缩30min，测定其抑菌性，采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定，得到所述的蛋白类抑菌物质。
8.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ALAC-4在制备Cheddar干酪与酿造酱油中的用途。
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