CN107460145B

CN107460145B - 海洋解淀粉芽孢杆菌bmf01及其抗菌蛋白的分离方法及产品

Info

Publication number: CN107460145B
Application number: CN201710719461.8A
Authority: CN
Inventors: 暴增海; 李欢; 马桂珍; 曹雪梅; 汪晶晶; 王军强
Original assignee: Huaihai Institute of Techology
Current assignee: Huaihai Institute of Techology
Priority date: 2017-08-21
Filing date: 2017-08-21
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2037-08-21
Also published as: CN107460145A

Abstract

本发明是一种海洋解淀粉芽孢杆菌BMF01，其保藏号为CCTCC NO：M2017153。本发明还公开了一种从海洋解淀粉芽孢杆菌BMF01中分离抗菌蛋白的方法与产品。本发明提供了新的源自海洋的解淀粉芽孢杆菌菌株，并以小麦根腐病菌为指示菌进行活性追踪，采用硫酸铵沉淀、弱阴离子交换层析和凝胶层析对BMF01发酵液中抗菌蛋白进行分离纯化，采用SDS‑PAGE电泳检验纯度。得到40 kD大小的抗菌蛋白产品，所得到的抗菌蛋白对小麦根腐病菌具有明显抑菌效果。该抗菌蛋白的抑菌作用具有热稳定性，在100℃处理30min后仍保留80%以上的抑菌活性。同时具有蛋白酶稳定性和酸稳定性，与已报道的抗菌蛋白明显不同。

Description

海洋解淀粉芽孢杆菌BMF01及其抗菌蛋白的分离方法及产品

技术领域

本发明涉及一种来自海洋的细菌，特别是一种海洋解淀粉芽孢杆菌（Ｂacillus amyloliquefaciens）BMF01。本发明还涉及一种从该海洋解淀粉芽孢杆菌（Ｂacillus amyloliquefaciens）BMF01中分离抗菌蛋白的方法及产品。

背景技术

微生物抗菌蛋白是微生物产生的一类具有抑菌活性的肽类或蛋白质。不同学者从微生物代谢产物中分离到了对植物病原菌具有抑制作用的抗菌蛋白，目前认为抗菌蛋白主要通过抑制植物病原菌代谢来限制其生长，或是协助其他细胞壁水解酶水解植物病原菌真菌细胞壁来杀死植物病原菌。因此生防菌株产生抗菌蛋白是其重要的抑菌机理之一。

自Johnson等研究发现枯草芽孢杆菌可以产生抑菌物质以来，学者从不同芽孢杆菌中分离得到多种抑菌物质。海洋微生物因其生存环境特殊，可产生独特的代谢产物，越来越受到学者的关注，国内外学者从海洋微生物代谢产物中分离到了具有抑菌活性的抗菌蛋白。如Isnansetyo等从海洋Pseudoalteromonas phenolica中分离到一种可以抑制耐青霉素葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗生素MC21-A(2)。徐长安从海滩污泥中分离到的枯草芽孢杆菌LHB02，该菌株发酵液经硫酸铵沉淀及层析法分离得47 ku的糖蛋白，该蛋白对哈维氏弧菌（Vibro harveyi）等具有很强的抑制作用。因此，分离提供新的菌株以及从菌株中分离新的抑菌蛋白具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，如目前多数蛋白分离自陆源微生物，提供一种新的可以分离抑菌蛋白的海洋解淀粉芽孢杆菌（Ｂacillus amyloliquefaciens）BMF01菌株。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供了从海洋解淀粉芽孢杆菌BMF01中分离得到的具有热稳定性的抗菌蛋白及其分离的方法及产品。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种海洋解淀粉芽孢杆菌（Ｂacillus amyloliquefaciens）BMF01，其特点是，其保藏号为CCTCC NO：M2017153。

本发明涉及的海洋解淀粉芽孢杆菌（Ｂacillus amyloliquefaciens）BMF01菌株（以下简称BMF01菌株或者BMF01）已由申请人于2017年3月30日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号为CCTCC NO：M2017153。保藏单位地址为：中国武汉市武汉大学，邮编430072，电话027－68754052。

本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明还提供了从权利要求1所述的海洋解淀粉芽孢杆菌BMF01中分离抗菌蛋白的方法，其特点是，其步骤如下：

（1）菌株BMF01发酵液的制备

将活化培养24h的BMF01菌株斜面用5 mL种子液培养基洗下菌苔制成BMF01菌株菌悬液，接种到装有55ml种子液培养基的250ml三角瓶中，28 ℃下，摇床转速180 r/min，振荡培养24 h，即得发酵用种子液，调整浓度为10⁸cfu/mL；15L发酵罐装10 L发酵培养基，按接种量为10%接种BMF01菌株种子液，发酵温度为28 ℃，通气量为3 L/min，搅拌转速为180 r/min，发酵过程中调节进气与排气阀门，使发酵罐罐压保持在0.04 Mpa，发酵时间为60 h，发酵液于4℃、10000r/min的条件下离心15min，上清液经孔径为0.22μm微孔滤膜过滤，得到无菌发酵液；所述的种子液培养基和发酵培养基为：蔗糖10 g/L，牛肉膏16 g/L，酵母膏3 g/L，FeSO₄ 0.4 g/L，水1000 mL，pH 7.0；

（2）抗菌蛋白的分离

冰浴条件下向BMF01菌株发酵液中加入硫酸铵固体粉末，边加入边搅拌，使其饱和度达到60%，硫酸铵全部溶解后放入4 ℃冷藏过夜；然后在4 ℃，8000 r/min条件下离心10min，分别收集上清液和沉淀，将得到的上清液和沉淀分别装入透析袋在 PBS缓冲液中透析；每2 h更换一次缓冲液，换4次后透析过夜；以小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）为指示菌，采用牛津杯法测定上清液和沉淀的抑菌活性；确认透析后的BMF01菌株发酵液硫酸铵沉淀处理的沉淀对小麦根腐病菌具有抑菌活性；BMF01菌株发酵液经硫酸铵沉淀后得到粗蛋白液经弱阴离子交换层析和Sephadex G-75凝胶层析分离，得到抗菌蛋白。

该抗菌蛋白的分子质量为40 kD，其抑菌作用具有热稳定性，100℃处理30 min后仍保留80%以上的抑菌活性，同时具有蛋白酶稳定性和酸稳定性。

本发明所述的从海洋解淀粉芽孢杆菌BMF01中分离抗菌蛋白的方法，其进一步优选的技术方案或者技术特征是：

1、步骤（2）中，粗蛋白液经弱阴离子交换层析方法如下：采用DEAE SepharoseFast Flow阴离子柱层析方法，将粗蛋白液倒入洁净干燥培养皿内，置于-80℃冷冻直至成为固态，再放入真空冷冻干燥仪中，抽真空冷冻成干粉，即得BMF01菌株粗蛋白；称取0.5 g粗蛋白溶于5 mL PBS中，制成粗蛋白溶液，将粗蛋白溶液用细菌过滤器过滤除菌后，采用弱阴离子柱进行分离；

用30 mL pH 9.0的Tris-HCl缓冲液平衡弱阴离子层析柱，以2 mL上样量，1 mL/min流速上柱；使用150 mL NaCl溶液以1mL/min进行线性洗脱，见峰即收集洗脱液，每管收集2 mL，合并相同洗脱峰的洗脱液，冷冻干燥浓缩制成干粉；将不同的洗脱峰洗脱液冻成的干粉用2 mL的蒸馏水复溶，分别检测其抑菌活性和纯度，得到对小麦根腐病菌具有抑菌活性的组份。

2、步骤（2）中，所述的Sephadex G-75凝胶层析分离方法如下：将经弱阴离子交换层析分离后具有抑菌活性的组分，用孔径为0.22微米的细菌过滤器过滤除菌后，采用Sephadex G-75层析柱进行分离纯化：用5 mL pH 8.0的Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，以2mL上样量，0.5 mL/min流速上柱，以150 mL pH 8.0的Tirs-HCl缓冲液作为洗脱液，洗脱速率为0.5 mL/min；见峰即进行收集；按峰收集洗脱液，每管2 mL，合并相同洗脱峰的洗脱液，冷冻干燥浓缩制成干粉；将不同的洗脱峰洗脱液干粉用2 mL的蒸馏水复溶，分别检测其抑菌活性和纯度。

3、步骤（2）中，抗菌蛋白的抑菌活性检测方法如下：以小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）为指示菌；在平板中央分别接入小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）菌苔，在病原菌周围距离平板边缘10 mm处等距离放置牛津杯，取无菌滤液200 μL加入牛津杯中，28℃恒温培养，以无菌水为对照，采用十字交叉法测量抑菌带宽度，计算抑菌率。

4、步骤（2）中，抗菌蛋白的纯度检测方法如下：采用SDS-PAGE电泳法;浓缩胶和分离胶分别为5%和15%的丙烯酰胺；样品和样品缓冲液按照1:5的比例混合，100℃水浴5min后上样；电泳时浓缩胶使用100V电压，分离胶使用120V电压；采用考马斯亮蓝G-250染色法，观察条带数目，并比较蛋白Maker与样品的分子量大小。

本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明还提供了一种以上技术方案所述的海洋解淀粉芽孢杆菌BMF01中分离的抗菌蛋白产品，其特点是：该产品为采用以上技术方案中任何一项所述的方法制得的抗菌蛋白，该抗菌蛋白的分子质量为40 kD，其抑菌作用具有热稳定性，100℃处理30 min后仍保留80%以上的抑菌活性。同时具有蛋白酶稳定性和酸稳定性。

本发明提供了新的海洋解淀粉芽孢杆菌（Ｂacillus amyloliquefaciens）BMF01，并以小麦根腐病菌为指示菌进行活性追踪，采用硫酸铵沉淀、弱阴离子交换层析和Sephadex G-75凝胶层析对BMF01发酵液中抗菌蛋白进行分离纯化，得到40 kD大小的抗菌蛋白产品，并可以采用SDS-PAGE电泳检验纯度。所得到的抗菌蛋白对小麦根腐病菌具有明显抑菌效果。其抑菌作用具有热稳定性，在100℃处理30 min后仍保留80%以上的抑菌活性。同时具有蛋白酶稳定性和酸稳定性。该蛋白与已经报道的抗菌蛋白的分子量及其性质明显不同。

附图说明

图1为酸铵饱和度沉淀蛋白对小麦根腐病菌抑菌作用图；

图2为抗菌蛋白的阴离子柱层析图；

图3为抗菌蛋白峰3的SDS-PAGE分析图；

图4 抗菌蛋白的Sephadex G-75柱层析图；

图5为Sephadex G-75柱层析洗脱峰对小麦根腐病菌的抑制作用图；其中：a 峰1-1；ck 对照；

图6为抗菌蛋白峰3的SDS-PAGE分析图。

具体实施方式

以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例：一种海洋解淀粉芽孢杆菌BMF01菌株发酵液中分离得到抗菌蛋白的方法：

1 材料方法

1.1试验材料

试验菌株：海洋解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）BMF01和小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）均由本实验室保藏。

小麦根腐病菌、BMF01菌体活化以及抑菌试验培养基：PDA。

菌株BMF01种子液和发酵用培养基：蔗糖10 g/L，牛肉膏16 g/L，酵母膏3 g/L，FeSO₄ 0.4 g/L，水1000 mL，pH 7.0。

1.2 菌株BMF01发酵液的制备

将活化培养24h的BMF01菌株斜面用5 mL种子液培养基洗下制成BMF01菌株菌悬液，接种到60 mL（250 mL三角瓶）种子液培养基中，28 ℃下，摇床转速180 r/min，振荡培养24 h，即得发酵用种子液（浓度为10⁸cfu/mL）。15L发酵罐装10 L发酵培养基，按接种量为10%接种BMF01 菌株种子液，发酵温度为28 ℃，通气量为3 L/min，搅拌转速为180 r/min发酵时间为60 h，发酵过程中调节进气与排气阀门，使发酵罐罐压保持在0.04 Mpa左右。发酵液于4℃、10000r/min的条件下离心15min，取上清液经孔径为0.22μm微孔滤膜过滤，得到无菌发酵液。

1.3BMF01菌株发酵液抑菌物质的初步定位

采用硫酸铵沉淀法。

（1）冰浴条件下向BMF01菌株发酵液中加入硫酸铵固体粉末，使其饱和度达到80%，硫酸铵全部溶解后放入4 ℃冷藏过夜；

（2）在4 ℃，8000 r/min条件下离心10 min，收集上清液和沉淀，将得到的上清液和沉淀放入装有200 mL PBS的250 mL三角瓶中透析；

（3）每2 h换一次透析液，换3次，第4次透析过夜；

（4）以小麦根腐病菌为指示菌，采用牛津杯法测定上清液和沉淀的抑菌活性。

1.4BMF01菌株发酵液硫酸铵的分级沉淀

冰浴条件下向200 mLBMF01菌株发酵液中分别缓缓加入35.2 g、48.6 g、62.6 g、78 g、94.4 g固体硫酸铵，将硫酸铵饱和度调节至30%、40%、50%、60%、70%。按7.1.3的方法处理样品，分别收集每一个饱和度的沉淀蛋白。将沉淀蛋白在4 ℃透析，测定沉淀对小麦根腐病菌的抑菌活性，确定BMF01菌株发酵液的硫酸铵沉淀最佳饱和度。

1.5DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱层析

BMF01菌株发酵液在最佳硫酸铵饱和度条件下沉淀，4 ℃、10000 r/min离心10min后，收集沉淀蛋白，沉淀蛋白透析后得粗蛋白溶液。将粗蛋白溶液倒入洁净干燥培养皿内，置于-80℃冷冻直至成为固态，再放入真空冷冻干燥仪中，抽真空冷冻成干粉，即得BMF01菌株粗蛋白。称取0.5 g粗蛋白溶于5 mL PBS中，制成粗蛋白溶液，将粗蛋白溶液用孔径为0.22μm细菌过滤器过滤除菌后，采用弱阴离子柱进行分离。

用30 mL pH 9.0的Tris-HCl缓冲液平衡弱阴离子层析柱，以2 mL上样量，1 mL/min流速上柱。使用150 mL NaCl溶液以1mL/min进行线性洗脱，见峰即收集洗脱液，每管收集2 mL，合并相同洗脱峰的洗脱液，冷冻干燥浓缩制成干粉。将不同的洗脱峰洗脱液冻成的干粉用2 mL的蒸馏水复溶，分别检测其抑菌活性和纯度。

1.6 Sephadex G-75柱层析分离

将阴离子层析柱分离后具有抑菌活性的组分，用孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤除菌后，采用Sephadex G-75层析柱进行分离纯化。

用5 mL pH 8.0的Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，以2 mL上样量，0.5 mL/min流速上柱，以150 mL pH 8.0的Tirs-HCl缓冲液作为洗脱液，洗脱速率为0.5 mL/min。见峰即进行收集。按峰收集洗脱液，每管2 mL，合并相同洗脱峰的洗脱液，冷冻干燥浓缩制成干粉。将不同的洗脱峰洗脱液干粉用2 mL的蒸馏水复溶，分别检测其抑菌活性和纯度。

1.7抗菌蛋白的抑菌活性检测

采用牛津杯法。以小麦根腐病菌为指示菌。在平板中央分别接入小麦根腐病菌菌苔（8 mm），在病原菌周围距离平板边缘10 mm处等距离放置牛津杯，取无菌滤液200 μL加入牛津杯中，28 ℃恒温培养，以无菌水为对照，采用十字交叉法测量抑菌带宽度，计算抑菌率。

1.8抗菌蛋白的纯度检测

采用SDS-PAGE凝胶电泳法。

浓缩胶和分离胶分别为5%和15%的丙烯酰胺，配方见表1。样品和样品缓冲液按照1:5的比例混合，100℃水浴5min后上样。电泳时浓缩胶使用100V电压，分离胶使用120V电压。采用考马斯亮蓝G-250染色法，观察条带数目，比较蛋白Maker与样品的分子量大小。

表1 SDS-PAGE浓缩胶和分离胶配方

1.9抗菌蛋白稳定性测定

采用60℃和100℃水浴处理抗菌蛋白液30 min；将抗菌蛋白液pH调至3-10，处理2h后将pH调至7.0；采用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K 37℃水浴处理抗菌蛋白液60 min。以上每个处理重复3次，以不处理的抗菌蛋白液为对照。以小麦根腐病菌为指示菌，采用牛津杯法测定处理组的抑菌活性，以未处理的样品作对照，比较抑菌活性的变化。

2 结果与分析

2.1 BMF01菌株发酵液抑菌物质的初步定位

经80%硫酸铵沉淀、透析后的BMF01菌株沉淀对小麦根腐病菌具有明显的抑菌活性，其抑菌带宽度达到31.80 mm，而上清液抑菌作用较小，仅为10.30 mm。

2.2 BMF01菌株发酵液硫酸铵的分级沉淀

实验表明，随着硫酸铵饱和度的增加，沉淀的抑菌带宽度越来越大，当硫酸铵饱和度达到60%时，沉淀的抑菌带宽度达到最大为35.20 mm，故认为BMF01菌株发酵液抗菌蛋白提取的硫酸铵饱和度为60%。不同硫酸铵饱和度沉淀蛋白对小麦根腐病菌抑菌作用参照图1。

2.3DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱层析

发酵液经60%饱和度硫酸铵沉淀后，并经过透析除盐和冷冻干燥后得到BMF01菌株粗蛋白。取0.5 g粗蛋白溶于5 mL PBS缓冲液中，过滤除菌后，制成粗蛋白溶液。粗蛋白溶液经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱层析，分离得到3个洗脱峰，记为峰1、峰2和峰3，分别出现在第14.9 min、30.3 min和152.3 min，如图2示。分别收集3个洗脱峰，冷冻干燥后测定抑菌活性。结果表明，峰1和峰2均无抑菌活性，峰3对小麦根腐病菌的抑菌效果明显，抑菌带宽度达到34.00 mm。

采用SDS-PAGE电泳检测峰3样品的纯度，出现2个条带，条带1分子质量约为66 kD，条带2分子质量约为40 kD，结果如图3所示，因此需要对峰3组分进一步分离纯化。

2.4 Sephadex G-75柱层析分离

经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱层析分离后得到峰3进一步采用SephadexG-75柱层析进行分离。如图5所示，在80.1 min时出现单一洗脱峰1，且洗脱峰1对小麦根腐病菌的抑菌效果明显，抑菌带宽度达到30.50 mm。采用SDS-PAGE电泳检测洗脱峰1的纯度，出现单一条带（如图6），其分子质量约为40 kD。

2.4抗菌蛋白稳定性研究

BMF01菌株产生的抗菌蛋白经60和100℃水浴处理后对小麦根腐病菌的抑菌带宽度分别为27.0 mm和25.0 mm，对照组处理的抗菌蛋白液抑菌带宽度为30.0 mm。高温处理使该蛋白的抗菌活性略有下降，但抑菌活性仍达到对照组的80%以上，说明该蛋白较耐高温。

表2表明，起始pH值为3.0时，该蛋白的抑菌活性随pH的升高而升高，pH为7.0时抑菌活性最高，抑菌带宽度为30.0 mm。随后酶活性随着pH值的升高酶活性下降。该蛋白在碱性环境下抑菌活性较低，在偏酸和中性环境下酶活力较高。但该蛋白在pH 3.0-10.0范围内的抑菌活性均在对照组的70%以上，说明该蛋白抑菌活性有较好的酸碱稳定性。

表2 BMF01菌株抗菌蛋白的酸碱稳定性测定结果

BMF01菌株抗菌蛋白经对胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K处理后的抑菌带宽度分别为30.0 mm、31.0 mm和31.0 mm，与对照组抑菌带宽度31.0 mm无显著差异。说明BMF01菌株抗菌蛋白对胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K均不敏感。

Claims

1.一种从海洋解淀粉芽孢杆菌（Ｂacillus amyloliquefaciens）BMF01中分离得到的抗菌蛋白的用途，其特征在于，所述的用途为将抗菌蛋白作有效成分用于制备抑制小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）的抑菌化合物或组合物的用途；

海洋解淀粉芽孢杆菌（Ｂacillus amyloliquefaciens）BMF01的保藏号为CCTCC NO：M2017153；

从海洋解淀粉芽孢杆菌BMF01菌株的发酵液中分离得到抗菌蛋白的方法步骤如下：

（1）菌株BMF01发酵液的制备

（2）抗菌蛋白的分离

冰浴条件下向BMF01菌株发酵液中加入硫酸铵固体粉末，边加入边搅拌，使其饱和度达到60%，硫酸铵全部溶解后放入4 ℃冷藏过夜；然后在4 ℃，8000 r/min条件下离心10 min，分别收集上清液和沉淀，将得到的上清液和沉淀分别装入透析袋在 PBS缓冲液中透析；每2h更换一次缓冲液，换4次后透析过夜；以小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）为指示菌，采用牛津杯法测定上清液和沉淀的抑菌活性；确认透析后的BMF01菌株发酵液硫酸铵沉淀处理的沉淀对小麦根腐病菌具有抑菌活性；BMF01菌株发酵液经硫酸铵沉淀后得到粗蛋白液经弱阴离子交换层析和Sephadex G-75凝胶层析分离，得到抗菌蛋白。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤（2）中，粗蛋白液经弱阴离子交换层析方法如下：采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱层析方法，将粗蛋白液倒入洁净干燥培养皿内，置于-80℃冷冻直至成为固态，再放入真空冷冻干燥仪中，抽真空冷冻成干粉，即得BMF01菌株粗蛋白；称取0.5 g粗蛋白溶于5 mL PBS中，制成粗蛋白溶液，将粗蛋白溶液用细菌过滤器过滤除菌后，采用弱阴离子柱进行分离；

用30 mL pH 9.0的Tris-HCl缓冲液平衡弱阴离子层析柱，以2 mL上样量，1 mL/min流速上柱；使用150 mL NaCl溶液以1mL/min进行线性洗脱，见峰即收集洗脱液，每管收集2mL，合并相同洗脱峰的洗脱液，冷冻干燥浓缩制成干粉；将不同的洗脱峰洗脱液冻成的干粉用2 mL的蒸馏水复溶，分别检测其抑菌活性和纯度，得到对小麦根腐病菌具有抑菌活性的组份。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤（2）中，所述的Sephadex G-75凝胶层析分离方法如下：将经弱阴离子交换层析分离后具有抑菌活性的组分，用孔径为0.22微米的细菌过滤器过滤除菌后，采用Sephadex G-75层析柱进行分离纯化：用5 mL pH 8.0的Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，以2 mL上样量，0.5 mL/min流速上柱，以150 mL pH 8.0的Tirs-HCl缓冲液作为洗脱液，洗脱速率为0.5 mL/min；见峰即进行收集；按峰收集洗脱液，每管2 mL，合并相同洗脱峰的洗脱液，冷冻干燥浓缩制成干粉；将不同的洗脱峰洗脱液干粉用2 mL的蒸馏水复溶，分别检测其抑菌活性和纯度。

4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于，步骤（2）中，抗菌蛋白的抑菌活性检测方法如下：以小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）为指示菌；在平板中央分别接入小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）菌苔，在病原菌周围距离平板边缘10 mm处等距离放置牛津杯，取无菌滤液200 μL加入牛津杯中，28 ℃恒温培养，以无菌水为对照，采用十字交叉法测量抑菌带宽度，计算抑菌率。

5.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于，步骤（2）中，抗菌蛋白的纯度检测方法如下：采用SDS-PAGE电泳法;浓缩胶和分离胶分别为5%和15%的丙烯酰胺；样品和样品缓冲液按照1:5的比例混合，100℃水浴5min后上样；电泳时浓缩胶使用100V电压，分离胶使用120V电压；采用考马斯亮蓝G-250染色法，观察条带数目，并比较蛋白Maker与样品的分子量大小。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述抗菌蛋白的分子质量为40 kD。