CN104910262B - 枯草芽孢杆菌抗菌肽及其分离纯化方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种枯草芽孢杆菌抗菌肽及其分离纯化方法和应用。本发明的方法包括步骤：S1，对枯草芽孢杆菌发酵液进行菌液分离，除去菌体；S2，加入硫酸铵，静置分离出蛋白沉淀，用缓冲液重溶蛋白沉淀，后于超滤系统下收集滤出液；S3，对粗提液进行脱盐层析，收集UV280下的首个吸收峰产物；S4，对步骤S3脱盐层析产物进行离子交换层析，收集洗脱液100％时UV280下的吸收峰产物并进行冻干浓缩；S5，将冻干的离子交换层析产物重溶，后用蛋白质纯化系统进行疏水层析，收取缓冲液15％时的UV280产物峰产物，能获得高纯度的单一组分，无杂质蛋白，对植物病原菌具有显著抑菌活性。

Description

枯草芽孢杆菌抗菌肽及其分离纯化方法、应用

技术领域

本发明涉及生物防治领域，具体涉及微生物农药，更具体的涉及一种枯草芽孢杆菌抗菌肽及其分离纯化方法、应用和农药制剂。

背景技术

过去几十年中，在农业生产过程中应用了大量的化学药物以达到防治或减轻病虫、杂草造成的危害的目的，为保护农业生产提供了有力的支持。在一段时间内，化学防治仍是重要且有效的植物病害防治方法之一。20世纪初，DDT、六六六和有机磷农药的出现，推动了化学农药在世界范围内的扩展。但是化学农药的毒性高，结构相对稳定而难以降解，大量使用易残留，并且会渗透至土壤和地下水中，降低土壤质量，造成环境破坏，影响生态平衡，同时危害人体健康。在长期使用某些化学农药的过程中，病原菌逐渐形成了耐药机制，农药用量不断加大，而效果却不增反减。此外，化学农药研发成本高，周期长等难题困扰着研发人员。为此，活性抑病原菌物质等生物农药的研制被列入议程。

枯草芽孢杆菌作为一种安全的有益微生物被人们所公认，对环境无污染，对人畜无毒害，在其代谢过程中所产生的多种肽类、氨基酸和多烯类都表现出一定的抗菌能力，对于黄瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、番茄灰霉病菌等多种病原菌、以及细菌和病毒的生长具有抑制作用，对于植物生长病害、果蔬采后病害和保鲜等方面的生物防治均具有较大应用价值。

枯草芽孢杆菌抗菌物质的分离纯化及鉴定为阐明其抑菌作用的物质基础和作用机理具有重要意义，同时也是大规模生产抗菌物质的简化实例。研究表明枯草芽孢杆菌可以分泌多种抑菌物质，以合成途径为依据可以划分为核糖体合成途径产生以及非核糖体合成途径产生。经由核糖体合成途径合成的抗菌物质主要为抑菌蛋白以及多肽；非核糖体合成途径主要合成具有两亲性的脂肽类抗生素，部分抑菌素可以经由核糖体途径合成，如subtilosin A，sublancin，TasA等。野生型枯草芽孢杆菌菌株能够合成超过40种结构和功能不尽相同的抑菌物质，其中部分抑菌功能基因已被克隆和表达。枯草芽孢杆菌的表达产物复杂，其表达的小肽难以用常规方式进行分离纯化，给其应用带来了障碍。

发明内容

为了解决枯草芽孢杆菌的表达产物复杂，其表达的小肽难以用现有方式进行分离纯化，给其应用带来了障碍的技术问题，本发明提供一种能获得高纯度的单一组分蛋白的枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离纯化方法及其制备的枯草芽孢杆菌抗菌肽及其应用。

本发明的第一方面提供一种枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离纯化方法，其步骤包括：S1，对枯草芽孢杆菌发酵液进行菌液分离，除去菌体得无菌发酵液；S2，0-4℃下缓慢向无菌发酵液中加入硫酸铵至硫酸铵的饱和度为89-90％，静置分离出蛋白沉淀，用pH＝7.0-7.2的三羟甲基氨基甲烷与盐酸的缓冲液重溶蛋白沉淀，后于超滤系统下收集0.35-0.4Mpa压力下的滤出液得粗提液，所述超滤系统的滤膜为Ultracell 3kDa滤膜；S3，对粗提液进行脱盐层析，收集UV280下的首个吸收峰产物；S4，对步骤S3脱盐层析产物进行离子交换层析，收集洗脱液100％时UV280下的吸收峰产物并进行冻干浓缩；S5，将冻干的离子交换层析产物重溶，后用蛋白质纯化系统进行疏水层析，收取缓冲液百分比为15％时的UV280吸收峰产物得枯草芽孢杆菌抗菌肽。

本发明的第二方面提供一种枯草芽孢杆菌抗菌肽，由上述分离纯化方法制得。

本发明的第三方面提供上述枯草芽孢杆菌抗菌肽的应用，所述枯草芽孢杆菌抗菌肽用于防治植物病害。

经抑菌实验证明，本发明的枯草芽孢杆菌抗菌肽能有效抑制小麦赤霉，且浓度越高抑制作用越明显，尤其在50mg/mL浓度可显著抑制小麦赤霉活性。

本发明的枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离纯化方法是一种以抗菌肽为代表的细菌蛋白产物的分离纯化方法，通过多步分离纯化对枯草芽孢杆菌SY-ND(已于2011年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.5224)所表达的抗菌肽进行纯化分离获取其单一组分。采用本发明枯草芽孢杆菌表达抗菌肽的分离纯化方法可以得到高纯度的枯草芽孢杆菌SY-ND表达的抗植物病原菌肽，无杂质蛋白，对水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌等植物病原菌具有显著抑菌活性。

附图说明

图1是本发明实施例1中枯草芽孢杆菌SY-ND表达抗菌肽SY-ND-BSp在步骤3中进行脱盐层析的图谱。

图2是本发明实施例1中步骤4离子交换层析的结果图谱。

图3是本发明实施例1中步骤5疏水层析的结果图谱。

图4是本发明实施例1中步骤6中对疏水层析单一性检测的结果图谱。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离纯化方法，其步骤包括：S1，对枯草芽孢杆菌发酵液进行菌液分离，除去菌体得无菌发酵液；S2，0-4℃下缓慢向无菌发酵液中加入硫酸铵至硫酸铵的饱和度为89-90％，静置分离出蛋白沉淀，用pH＝7.0-7.2的三羟甲基氨基甲烷与盐酸的缓冲液(Tris-Cl缓冲液)重溶蛋白沉淀，后于超滤系统下收集0.35-0.4Mpa压力下的滤出液得粗提液，所述超滤系统的滤膜为Ultracell 3kDa滤膜；S3，对粗提液进行脱盐层析，收集UV280下的首个吸收峰产物；S4，对步骤S3脱盐层析产物进行离子交换层析，收集洗脱液100％时UV280下的吸收峰产物并进行冻干浓缩；S5，将冻干的离子交换层析产物重溶，后用蛋白质纯化系统进行疏水层析，收取缓冲液百分比为15％时的UV280产物峰产物得枯草芽孢杆菌抗菌肽，可以得到高纯度的枯草芽孢杆菌SY-ND表达的抗植物病原菌肽，无杂质蛋白，对水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌等植物病原菌具有显著抑菌活性。

其中，枯草芽孢杆菌发酵液为对菌株进行发酵培养所得发酵液。优选，通过以下步骤实现，挑取冻存保藏的枯草芽孢杆菌菌株至少量的LB液体培养基(胰蛋白胨Tryptone10g/L、酵母提取物Yeast extract 10g/L、氯化钠NaCl 5g/L，用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4)中，进行复苏培养，后再在稍多的LB液体培养基中进行扩大培养，最后转入更多的LB培养基进行发酵培养。

其中，枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌SY-ND，其菌株从土壤样品中分离筛选获得，已于2011年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.5224，经抑菌试验证实其表达产物具有显著的抑制植物病原菌的活性，其发酵液经蛋白酶处理后丧失活性，表明其活性物质为蛋白，经抑菌试验确定抗植物病原菌有活性的分子量<3kDa。

优选，步骤S1包括将发酵液离心，取上清，上清依次通过滤纸、0.45μm、0.22μm孔径滤膜抽滤除去菌体，能更好的去除菌体。

优选，步骤S2的超滤系统为amicon8400超滤系统。

优选，步骤S3的脱盐层析的填料为Sephadex G25Fine，洗脱液为pH＝7.0-7.2的三羟甲基氨基甲烷与盐酸的缓冲液，洗脱速度为0.8-1.0mL/min。

优选，步骤S4的离子交换层析的填料为弱阴离子交换填料，洗脱液为pH＝8.0-8.2的三羟甲基氨基甲烷与盐酸的缓冲液和浓度为1.8-2.0的NaCl，洗脱速度为0.8-1.0mL/min。

优选，步骤S5的疏水层析采用HiPrep Butyl FF预装柱，洗脱液为pH＝7.0-7.2的三羟甲基氨基甲烷与盐酸的缓冲液和浓度为1.8-2.0M的硫酸铵，洗脱速度为0.8-1.0mL/min。优选，步骤S5的蛋白质纯化系统AKTA Primeplus蛋白质纯化系统。

本发明的分离纯化方法具体可以为：

步骤包括：

S1，枯草芽孢杆菌发酵液装至500mL离心桶，9500rpm离心15min，取上清；上清依次通过滤纸、0.45μm、0.22μm孔径滤膜抽滤；

S2，在冰水浴及搅拌下缓慢向无菌发酵液中加入研磨过的硫酸铵粉末至硫酸铵的饱和度为90％，静置后离心获取析出的蛋白沉淀；将沉淀用pH＝7.2的20mM Tris-Cl重溶蛋白沉淀，后通过加装了Ultracell 3kDa滤膜的amicon8400超滤系统，在0.4Mpa压力下收集滤出液得粗提液；

S3，室温下对含有分子量<3kDa组分的粗提液进行分子筛分离，使用XK26层析柱空柱装载Sephadex G25Fine填料，以super loop上样柱进行上样，每次10mL，缓冲液为pH＝7.2的20mM Tris-Cl体系，流速1mL/min，收集UV280下的首个吸收峰产物；

参见图1，示出枯草芽孢杆菌SY-ND表达抗菌肽SY-ND-BSp在步骤3中进行脱盐层析的图谱。图中C代表电导曲线，P代表蛋白样品的紫外吸收曲线。从图1可见，初步可以得到一大一小两个蛋白吸收峰，经抑菌试验分析有效成分存在于第一峰。

S4，将步骤S3所得产物以super loop上样柱上样至装载了Capto DEAE填料的XK16层析柱，每次上样100mL，洗脱液为pH＝8.2的20mM Tris-Cl和2M NaCl，以10mL体积达到100％洗脱液的梯度进行洗脱，收集洗脱液100％时UV280下的吸收峰产物并进行冻干浓缩；

参见图2，示出该离子交换层析的结果图谱。图中C代表电导曲线，P代表蛋白样品的紫外吸收曲线，E％代表洗脱液浓度。从图2可见，在洗脱液百分比达到70-80％时出现第一个洗脱峰，有且只有该峰在抑菌试验中具有抑菌效果，说明抑菌蛋白存在于该峰。

S5，室温下使用AKTA Primeplus蛋白质纯化系统进行Hiprep Butyl FF疏水层析：将冻干的离子交换层析产物重溶后通过2mL上样环上样至HiPrep Butyl FF预装柱，进行疏水层析，使用pH＝7.2的20mMTris-Cl和2M硫酸铵在10mL内由100％降至0％进行洗脱，流速1mL/min，收取缓冲液15％时的UV280产物峰产物。

参见图3，示出该疏水层析的结果图谱。图中C代表电导曲线，P代表蛋白样品的紫外吸收曲线，E％代表洗脱液浓度。从图3可见，当洗脱液百分比达到40-30％时，洗脱峰出现，经抑菌试验证实该产物具有抑菌活性。

S6，将疏水层析洗脱峰产物进行冻干浓缩，上样至Hiprep Butyl FF进行单一性检测。

参见图4，示出疏水层析单一性检测的结果图谱。图中P代表蛋白样品的紫外吸收曲线。从图4可见，疏水层析获得的产物在当前实验条件下为单一峰，无其他杂质。

本发明同时提供了上述分离纯化方法制得的枯草芽孢杆菌抗菌肽。

本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌抗菌肽的应用，该枯草芽孢杆菌抗菌肽用于防治植物病害。

本发明的分离纯化方法可以得到高纯度的枯草芽孢杆菌SY-ND表达的抗植物病原菌肽，无杂质蛋白，对水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌等植物病原菌具有显著抑菌活性。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详述。

实施例1

分离纯化枯草芽孢杆菌SY-ND表达的抑植物病原菌活性多肽SY-ND-BSp

1.挑取冻存保藏的SY-ND菌株至10mL LB液体培养基(胰蛋白胨Tryptone 10g/L、酵母提取物Yeast extract 10g/L、氯化钠NaCl 5g/L，用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4)中，28℃150rpm进行过夜复苏培养，转入100mL LB液体培养基进行8h的扩大培养，而后转入3L LB培养基进行发酵，28℃150rpm培养72h。

2.发酵液分装至500mL离心桶，9500rpm离心15min，取上清；依次通过滤纸、0.45μm、0.22μm孔径滤膜抽滤。

3.在冰水浴及搅拌下缓慢加入研磨过的硫酸铵粉末至硫酸铵饱和度为90％，静置过夜后离心获取析出的蛋白沉淀；将沉淀以pH＝7.2 20mM Tris-Cl缓冲液重溶蛋白沉淀，通过amicon8400超滤系统加装Ultracell 3kDa滤膜在0.4Mpa压力下收集经抑菌试验确定有活性的分子量<3kDa的组分。

4.室温下对含有<3kDa组分的粗提液进行分子筛分离，使用XK26层析柱空柱装载Sephadex G25Fine填料，以super loop上样柱进行上样，每次10mL，缓冲液为pH＝7.2的20mM Tris-Cl体系，流速1mL/min，收集UV280下的首个吸收峰产物。

5.室温下对Sephadex G25Fine层析产物进行活性验证，以super loop上样柱上样至装载了Capto DEAE填料的XK16层析柱，每次上样100mL，洗脱液为pH＝8.2的20mM Tris-Cl和2M NaCl，以10mL体积达到100％洗脱液的梯度进行洗脱，收集洗脱液100％时UV280下的吸收峰产物并进行冻干浓缩。

6.室温下使用AKTA Primeplus蛋白质纯化系统进行Hiprep Butyl FF疏水层析，将冻干的离子交换层析产物重溶后通过2mL上样环上样至HiPrep Butyl FF预装柱，进行疏水层析，使用pH＝8.2的20mMTris-Cl和2M NaCl在10mL内由100％降至0％进行洗脱，流速1mL/min，收取缓冲液15％时的UV280吸收峰产物。

7.将疏水层析洗脱峰产物进行冻干浓缩，上样至Hiprep Butyl FF1mL预装柱进行单一性检测，可知得到的枯草芽孢杆菌抗菌肽纯度高，无杂质蛋白，能得到单一组分，较好的分离出了抑植物病原菌活性多肽SY-ND-BSp，具有较好的应用前景，进一步促进微生物农药的发展。

抑菌实验

在PDA固体培养基平板上接种小麦赤霉菌饼，在其四周的牛津杯中分别添加100微升50mg/mL、25mg/mL、5mg/mL浓度的提取物枯草芽孢杆菌抗菌肽，以及对照物(CK)Tris-Cl缓冲液，在28℃培养1周，观察其抑菌效果。

经对比证实，本发明的枯草芽孢杆菌抗菌肽能有效抑制小麦赤霉，且浓度越高抑制作用越明显，尤其在50mg/mL浓度可显著抑制小麦赤霉活性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (4)

1.一种枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离纯化方法，其特征在于，包括步骤：

S1，对枯草芽孢杆菌发酵液进行菌液分离，除去菌体得无菌发酵液；

S2，0-4℃下向无菌发酵液中加入硫酸铵至硫酸铵的饱和度为85-90％，静置分离出蛋白沉淀，用pH＝7.0-7.2的三羟甲基氨基甲烷与盐酸的缓冲液重溶蛋白沉淀，后于超滤系统下收集0.35-0.4Mpa压力下的滤出液得粗提液，所述超滤系统的滤膜为Ultracell 3kDa滤膜；

S3，对粗提液进行脱盐层析，收集UV280下的首个吸收峰产物；脱盐层析的填料为Sephadex G25Fine，洗脱液为pH＝7.0-7.2的三羟甲基氨基甲烷与盐酸的缓冲液，洗脱速度为0.8-1mL/min；

S4，对步骤S3脱盐层析产物进行离子交换层析，收集洗脱液100％时UV280下的吸收峰产物，并进行冻干浓缩；离子交换层析的填料为弱阴离子交换填料，洗脱液为pH＝8.0-8.2的三羟甲基氨基甲烷与盐酸的缓冲液和浓度为1.8-2.0M的NaCl，洗脱速度为0.8-1mL/min；

S5，将冻干的离子交换层析产物重溶，后用蛋白质纯化系统进行疏水层析，收取缓冲液百分比为15％时的UV280吸收峰产物，得到枯草芽孢杆菌抗菌肽；疏水层析采用HiPrepButyl FF预装柱，洗脱液为pH＝7.0-7.2的三羟甲基氨基甲烷与盐酸的缓冲液和浓度为1.8-2.0M的硫酸铵，洗脱速度为0.8-1.0mL/min；

所述枯草芽孢杆菌抗菌肽为枯草芽孢杆菌抗菌肽SY-ND-BSp，枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌SY-ND。

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤S1包括将发酵液离心，取上清，上清依次通过滤纸、0.45μm、0.22μm孔径滤膜抽滤除去菌体。

3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤S2的超滤系统为amicon8400超滤系统；

步骤S5的蛋白质纯化系统AKTA Primeplus蛋白质纯化系统。

4.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤包括：

S1，枯草芽孢杆菌发酵液装至500mL离心桶，9500rpm离心15min，取上清；上清依次通过滤纸、0.45μm、0.22μm孔径滤膜抽滤；

S2，在冰水浴及搅拌下缓慢向无菌发酵液中加入研磨过的硫酸铵粉末至硫酸铵的饱和度为90％，静置后离心获取析出的蛋白沉淀；将沉淀用pH＝7.2的20mM Tris-Cl重溶蛋白沉淀，后通过加装了Ultracell 3kDa滤膜的amicon8400超滤系统，在0.4Mpa压力下收集滤出液得粗提液；

S3，室温下对含有分子量<3kDa组分的粗提液进行分子筛分离，使用XK26层析柱空柱装载Sephadex G25Fine填料，以super loop上样柱进行上样，每次10mL，缓冲液为pH＝7.2的20mM Tris-Cl体系，流速1mL/min，收集UV280下的首个吸收峰产物；

S4，将步骤S3所得产物以super loop上样柱上样至装载了Capto DEAE填料的XK16层析柱，每次上样100mL，洗脱液为pH＝8.2的20mM Tris-Cl和2M NaCl，以10mL体积达到100％洗脱液的梯度进行洗脱，收集洗脱液100％时UV280下的吸收峰产物并进行冻干浓缩；

S5，室温下使用AKTA Primeplus蛋白质纯化系统进行Hiprep Butyl FF疏水层析：将冻干的离子交换层析产物重溶后通过2mL上样环上样至HiPrep Butyl FF 1mL预装柱，进行疏水层析，使用pH＝7.2的20mMTris-Cl和2M硫酸铵在10mL内由100％降至0％进行洗脱，流速1mL/min，收取缓冲液15％时的UV280吸收峰产物。