CN103333937A - 一种利用枯草芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用枯草芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，属于生物工程技术领域。以产生广谱高效抗菌肽的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRT39为生产菌株，通过液体种子制备、发酵液制备、发酵液预处理、抗菌肽提取与精制、抗菌肽干粉制备等工艺方法制备高纯抗菌肽成品，活力回收率达到43.5％以上。本发明工艺简单，抗菌肽产量高、纯度高，所制的抗菌肽干粉属于天然抗菌剂，无毒副作用，可以用作食品防腐剂、饲料添加剂、农用生物防治剂和动物防病剂，具有无毒、无残留、不产生耐药性、安全性高的优点。

Description

一种利用枯草芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体是一种利用枯草芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法。
背景技术：
抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMP)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。与抗生素相比，抗菌肽安全性高，对人和动物正常细胞无害，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类生物防腐剂，在医药工业、食品工业以及饲料工业中有广阔的应用前景。
在医药领域，抗菌肽可以中和革兰氏阴性菌脂多糖、革兰阳性菌胞壁酸和细菌未甲基化CpGDNA等细菌信号分子。多种来源的抗菌肽都具有平衡和调节炎症应答的作用，它们抑制内毒素诱导的前炎症基因表达，阻止分泌型蛋白炎症介质，产生和释放出多种趋化因子来维持其他前炎症应答，以达到选择性抑制前炎症应答作用，抑制脂多糖与血清脂多糖结合蛋白因子结合，预防内毒素血症的发生。抗菌肽在适应性免疫中的作用：先天免疫中的介质因子对淋巴细胞适应性免疫的触发能够起到指导性作用，当生物体受到病原菌入侵时，先天免疫细胞大量聚集到感染部位诱导产生的免疫介质抗菌肽，可以直接活化多种先天免疫细胞，随后即激活特异性免疫增强因子以及T、B淋巴细胞，从而激发抗原特异性的适应性免疫反应。
在食品防腐领域，我国与国际上一些发达国家相比技术上和普及方面还有不小的差距。传统的食品保鲜方法主要采用化学防腐剂或腌渍(糖、醋、盐等)、熏制、干燥等物理手段，但是这些会导致食品安全、品质及风味改变等问题。而天然防腐剂具有毒副作用小、可降解、使用安全等优点，渐渐有取代传统化学防腐剂的趋势。天然防腐剂的开发已经得到国内很多研究者的重视。在天然防腐剂中，抗菌肽类防腐剂由于其安全无毒害，甚至对人体有保健作用而受到人们的广泛关注，正在成为食品防腐保鲜领域的新宠。
作为饲料添加剂，随着经济的发展，人们的生活水平日益提高，对食品安全越来越重视。抗生素作为传统的抗菌促生长剂添加到饲料中由来已久，随着其大量、广泛地用于饲料中，人们对其使用所产生的副作用——药物残留、耐药性和环境污染等问题日益关注，抗生素在饲料业中已面临着被淘汰或禁用的局面，欧盟在2006年已经全面禁止将抗生素作为饲料添加剂用于饲料中。因此研制具有广谱、无毒、无公害、无残留的新型抗菌剂代替抗生素作饲料添加剂已成为当前国内外饲料科学研究的一项重要的内容。我国是畜禽产品生产的大国，但是，由于各方面的原因，我国目前尚未全面禁止饲用抗生素，而且目前我国生产的多数抗生索饲料添加剂为国外已淘汰或将被禁用的产品，如喹乙醇、阿散酸、杆菌肽锌、泰乐菌素、维吉尼亚霉素等，这严重影响了我国畜禽产品对外出口。据有关部门统计，我国每年因此损失达到上百亿美元，造成了巨大的经济损失，严重影响了我国畜牧业的发展，更为严重的是还损害了我国畜产品在国际上的声誉，面对全球研发环保型高效饲料添加剂的大潮，加快相关方面的研究已势在必行。
由于微生物生产抗菌肽有成本低、无毒害、周期短等明显优点，近年微生物生产抗菌肽的研究开始兴起，但当前研究主要集中在乳酸菌，而乳酸菌产生的抗菌肽存在着耐热性差、抗菌谱窄等问题，如何解决这些问题，还有待进一步研究，孢杆菌和类芽孢杆菌产生的抗菌肽普遍抑菌谱广、稳定性高，开始引起国内外研究人员的注意，而对芽孢杆菌和类芽孢杆菌产生的抗菌肽报道不多。
发明内容
本发明所解决的技术问题是克服现有技术的不足，以产生广谱高效抗菌肽的枯草芽孢杆菌为生产菌株，通过液体种子制备、发酵液制备、发酵液预处理、抗菌肽提取与精制、抗菌肽干粉制备等工艺方法制备高纯抗菌肽成品，提供一种产量高，提取工艺简单，环境污染少的抗菌肽制备工艺方法。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案：
所述产生广谱高效抗菌肽的菌株具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRT39，该菌株已于2012年1月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCCNO.5702。
所述抗菌肽制备工艺方法，包括如下步骤：
1)菌株活化
将保藏完好的斜面菌种CGMCC NO.5702接种于斜面培养基，35-37℃培养16-20h，进行菌种活化。
2)液体种子培养
将活化好的枯草芽孢杆菌斜面菌种单菌落接入灭菌后的种子培养基中，于旋转摇床180-200r/min、35-37℃恒温振荡培养16-20h，种子发酵液的含菌量为107-108cfu/mL；
所述种子培养基组成为：葡萄糖2g，蛋白胨1g，NaH2PO4·2H2O0.2g，Na2HPO4·2H2O0.4g，MgSO4·7H2O0.05g，dH2O100mL，pH值7.5，121℃灭菌20min。
3)摇瓶发酵培养
将步骤2)得到的种子液以4-10％的接种量接入三角瓶，1000mL三角瓶装摇瓶发酵培养基为100-200mL，三角瓶塞采用乳胶塞，发酵温度32-37℃，转速160-200r/min摇床培养60-62h；
所述摇瓶发酵培养基组成为：豆粕粉1-2g，麦芽糖0.5g，葡萄糖0.7-1g，硫酸铵0.3g，硝酸铵0.2g，蛋白胨0.4-1g，牛肉膏0.5g，NaCl0.5g，KH2PO40.1g，MgSO4·7H2O0.04g，dH2O100mL，pH8.0，121℃，灭菌20min。
4)15升气式自动发酵罐发酵培养
采用分批补料发酵方式进行气升式液体深层发酵：15L发酵罐装发酵培养基10L，发酵罐灭菌冷却后，将步骤3)中的摇瓶发酵液按照4-6％接种量接种，发酵控制条件为：温度35-37℃，时间60-62h，发酵培养基pH值7.5-8.0，无菌空气通风比1∶1(v/v)，罐压0.02MPa，发酵15-20h后，每隔6-8h向发酵液中补加葡萄糖溶液100mL；
所述发酵罐发酵培养基组成为：豆粕粉1-2g，玉米粉0.5-1g，麦芽糖0.5g，可溶性淀粉0.5-0.7g，葡萄糖0.7-1g，硫酸铵0.3g，硝酸铵0.2g，蛋白胨0.4-1g，牛肉膏0.5g，NaCl0.5g，KH2PO40.1g，MgSO4·7H2O0.04g，dH2O100mL，pH8.0，121℃，灭菌20min。
所述葡萄糖溶液浓度为150g/L。
5)发酵液预处理
将步骤4)发酵液10000-12000r/min离心8-10min去菌体，得到发酵液上清。取上清液首先通过截留分子量为20kDa的超滤膜超滤，收集的滤液再经过截留分子量为1000Da的超滤膜超滤，弃去滤过液，抗菌肽溶液浓缩10倍。将超滤得到的浓缩抗菌肽溶液加热升温至82-85℃，保温12-15min后将温度降至32-35℃，继续降温至4℃静置4-6h，10000-12000r/min离心8-10min去掉加热变性的絮状悬浮沉淀蛋白。室温下向以上离心过后的发酵清液中慢慢加入固体硫酸铵至20％饱和度，冰箱中静置4-6h后，1000-12000rmp离心8-10min，收集上清液，再向收集的上清液中加入固体硫酸铵至饱和度80％，4℃静置4-6h，1000-12000r/min离心8-10min，收集沉淀并溶解于0.02M，pH7.0的Tris-HCl缓冲液中，进一步采用透析袋透析，其间每隔3～4h，更换一次纯水，得透析完全的抗菌肽样品。
6)抗菌肽阴离子交换层析
将步骤5)透析完全的抗菌肽样品上样DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱。采用0.02mol/LpH值8.0的Tris-HCl缓冲溶液将未结合的杂质洗脱掉，一直洗脱至紫外检测线不发生变化，再用含有0-1mol/L的NaCl的0.02mol/LpH值8.0的Tris-HCl的缓冲溶液进行线性梯度洗脱，洗脱速度1.5mL/min，按每管3mL收集，抗菌肽洗脱出的NaCl浓度为0.50-0.55mol/L。合并有抗菌活性的收集管，采用截留分子量为1000Da的纤维素膜超滤浓缩后得阴离子交换层析活性浓缩液。
7)抗菌肽分子筛凝胶柱过滤层析
将步骤6)阴离子交换层析活性浓缩液上样Sephadex G-15分子筛凝胶柱，洗脱缓冲溶液为0.02M、pH值8.0的Tris-HCl，洗脱速度1mL/min，按每管2mL收集，合并有活性的收集管得分子筛凝胶柱过滤层析抗菌肽活性溶液。
8)高纯度抗菌肽干粉制备
将步骤7)分子筛凝胶柱过滤层析抗菌肽活性溶液采用截留分子量1000Da的超滤膜过滤，使抗菌肽溶液浓缩15倍。然后采用旋转蒸发仪真空浓缩，温度为65-75℃，当浓缩至抗菌肽溶液较为粘稠时，取出抗菌肽浓缩液于-20℃冷冻8-10h，然后将结冰的抗菌肽置于真空冷冻干燥机中，控制真空度为30-50Pa，温度为-35℃，干燥时间15-18h，即得抗菌肽成品。
有益效果
1.本发明以产生广谱高效抗菌肽的枯草芽孢杆菌为生产菌株，通过液体种子制备、发酵液制备、发酵液预处理、抗菌肽提取与精制、抗菌肽干粉制备等工艺方法制备高纯抗菌肽成品，由于本发明抗菌肽耐热性好，对发酵液预处理时采用加热方法，使不耐热的杂蛋白热比安性去除，大大提高了纯化效率。同时将超滤、硫酸铵盐析、离子交换层析和分子筛凝胶过滤层析相结合，能得到电泳纯的抗菌肽，活力回收率达到43.5％以上。另外，将抗菌肽加工成干粉时，利用了抗菌肽的耐热性，通过旋转真空蒸发技术，快速使抗菌肽深度浓缩，提高了抗菌肽制备效率。本发明分离纯化抗菌肽纯化效率高，成本低廉。
2.本发明所制的抗菌肽干粉不仅可以抑制革兰氏阳性细菌，同时对多种革兰氏阴性细菌及真菌均具有较强的抑制作用，并且酸碱稳定性强、热稳定性较好、光稳定性强、耐有机溶剂强。本发明所制的抗菌肽干粉属于天然抗菌剂，无毒副作用，可以用作食品防腐剂、饲料添加剂、农用生物防治剂和动物防病剂，具有无毒、无残留、不产生耐药性、安全性高的优点。
附图说明：
图1抗菌肽DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析洗脱曲线
图2DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析收集管抗菌肽活性检测
图3Sephadex G-15柱层析洗脱曲线
图4抗菌肽C18RP-HPLC分离色谱图
图5经过C18HPLC分离得到的d峰抑菌活性检测
图6抗菌肽C18RP-HPLC分离后峰d Tricnine-SDS-PAGE凝胶电泳
图7抗菌肽成品牛奶防腐试验效果图
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
本发明的一种利用枯草芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法生产菌株具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRT39，该菌株已于2012年2月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.5702。
所述种子培养基组成为：葡萄糖2g，蛋白胨1g，NaH2PO4·2H2O0.2g，Na2HPO4·2H2O0.4g，MgSO4·7H2O0.05g，dH2O100mL，pH值7.5，121℃灭菌20min。
所述摇瓶发酵培养基组成为：豆粕粉1-2g，麦芽糖0.5g，葡萄糖0.7-1g，硫酸铵0.3g，硝酸铵0.2g，蛋白胨0.4-1g，牛肉膏0.5g，NaCl0.5g，KH2PO40.1g，MgSO4·7H2O0.04g，dH2O100mL，pH8.0，121℃，灭菌20min。
所述发酵罐发酵培养基组成为：豆粕粉1-2g，玉米粉0.5-1g，麦芽糖0.5g，可溶性淀粉0.5-0.7g，葡萄糖0.7-1g，硫酸铵0.3g，硝酸铵0.2g，蛋白胨0.4-1g，牛肉膏0.5g，NaCl0.5g，KH2PO40.1g，MgSO4·7H2O0.04g，dH2O100mL，pH8.0，121℃，灭菌20min。
实施例2
一种抗菌肽制备工艺方法，包括如下步骤：
1)菌株活化
将保藏完好的斜面菌种CGMCC NO.5702接种于斜面培养基，35℃培养16h，进行菌种活化。
2)液体种子培养
将活化好的枯草芽孢杆菌单菌落接入灭菌后的种子培养基中，于旋转摇床180r/min、35℃恒温振荡培养16h，种子发酵液的含菌量为107cfu/mL；
3)摇瓶发酵培养
将步骤2)得到的种子液以5％的接种量接入三角瓶，1000mL三角瓶装发酵液体培养基为200mL，三角瓶塞采用乳胶塞，发酵温度32℃，转速160r/min摇床培养60h；
4)15升气升式自动发酵罐发酵培养
采用分批补料发酵方式进行气升式液体深层发酵：15L发酵罐装发酵培养基10L，发酵罐灭菌冷却后，将步骤3)中的摇瓶发酵液按照4％接种量接种，发酵控制条件为：温度35℃，时间60h，发酵培养基pH值8.0，无菌空气通风比1∶1(v/v)，罐压0.02MPa，发酵15h后，分5次向发酵液中补加浓度为150g/L的葡萄糖溶液，每次100mL；
5)发酵液预处理
将步骤4)发酵液10000r/min离心8min去菌体，得到发酵液上清。取上清液首先通过截留分子量为20kDa的超滤膜超滤，收集的滤液再经过截留分子量为1000Da的超滤膜超滤，弃去滤过液，抗菌肽溶液浓缩10倍。抗菌肽回收率高达80％。将超滤得到的浓缩抗菌肽溶液加热升温至82℃，保温12min后将温度降至32℃，将该发酵液继续降温至4℃静置4h，10000r/min离心8min去掉加热变性的絮状悬浮沉淀蛋白。室温下向以上离心过后的发酵清液中慢慢加入固体硫酸铵至20％饱和度，冰箱中静置4h后，10000r/min离心8min，收集上清液，再向收集的上清液中加入固体硫酸铵至饱和度80％，4℃静置4h，，10000r/min离心8min，收集沉淀并溶解于0.02mol/L，pH7.0的Tris-HCl缓冲液中，进一步采用透析袋透析，其间每隔3h，更换一次纯水，得透析完全的抗菌肽样品。
6)抗菌肽阴离子交换层析
将步骤5)透析完全的抗菌肽样品上样DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱。采用0.02mol/LpH值8.0的Tris-HCl缓冲溶液将未结合的杂质洗脱掉，一直洗脱至紫外检测线不发生变化，再用含有1mol/L的NaCl的0.02mol/L pH值8.0的Tris-HCl的缓冲溶液进行线性梯度洗脱，洗脱速度1.5mL/min，按每管3mL收集。洗脱曲线见图1，洗脱出四个大的蛋白峰。以蜡样芽胞杆菌作为指示菌，平板扩散法检测每个峰样品的抑菌活性。结果显示峰III有抗菌活性。抗菌肽洗脱出的NaCl浓度约为0.50mol/L。抗菌活性收集管的抑菌活性检测如图2。合并有抗菌活性的收集管，采用截留分子量为1000Da的纤维素膜超滤浓缩后得阴离子交换层析活性浓缩液。
7)抗菌肽分子筛凝胶柱过滤层析
将步骤6)阴离子交换层析活性浓缩液上样Sephadex G-15分子筛凝胶柱，洗脱缓冲溶液为0.02mol/L、pH值8.0的Tris-HCl，洗脱速度1mL/min，按每管2mL收集。洗脱曲线见图3，合并有活性的收集管得分子筛凝胶柱过滤层析抗菌肽活性溶液，检测抗菌活力，计算回收率为43.5％。
8)高纯度抗菌肽干粉制备
将步骤7)分子筛凝胶柱过滤层析抗菌肽活性溶液采用截留分子量1000Da的超滤膜过滤，使抗菌肽溶液浓缩15倍。然后采用旋转蒸发仪真空浓缩，温度控制为65℃，当浓缩至抗菌肽溶液较为粘稠时，取出抗菌肽浓缩液。-20℃冷冻8h，然后将结冰的抗菌肽置于真空冷冻干燥机中，控制真空度为：30Pa，温度为-35℃，干燥时间15h。即得抗菌肽成品。
实施例3
一种抗菌肽制备工艺方法，包括如下步骤：
1)菌株活化
将保藏完好的斜面菌种CGMCC NO.5702接种于斜面培养基，36℃培养18h，进行菌种活化。
2)液体种子培养
将活化好的枯草芽孢杆菌单菌落接入灭菌后的种子培养基中，于旋转摇床190r/min、36℃恒温振荡培养18h，种子发酵液的含菌量为107cfu/mL；
3)摇瓶发酵培养
将步骤2)得到的种子液以8％的接种量接入三角瓶，1000mL三角瓶装发酵液体培养基为200mL，三角瓶塞采用乳胶塞，发酵温度35℃，转速180r/min摇床培养61h；
4)15升气升式自动发酵罐发酵培养
采用分批补料发酵方式进行气升式液体深层发酵：15L发酵罐装发酵培养基10L，发酵罐灭菌冷却后，将步骤3)中的摇瓶发酵液按照5％接种量接种，发酵控制条件为：温度36℃，时间61h，发酵培养基pH值8.0，无菌空气通风比1∶1(v/v)，罐压0.02MPa，发酵18h后，分5次向发酵液中补加浓度为150g/L的葡萄糖溶液，每次100mL；
5)发酵液预处理
将步骤4)发酵液11000r/min离心9min去菌体，得到发酵液上清。取上清液首先通过截留分子量为20kDa的超滤膜超滤，收集的滤液再经过截留分子量为1000Da的超滤膜超滤，弃去滤过液，抗菌肽溶液浓缩10倍。抗菌肽回收率高达81％。将超滤得到的浓缩抗菌肽溶液加热升温至83℃，保温13min后将温度降至33℃，将该发酵液继续降温至4℃静置5h，11000r/min离心9min去掉加热变性的絮状悬浮沉淀蛋白。室温下向以上离心过后的发酵清液中慢慢加入固体硫酸铵至20％饱和度，冰箱中静置5h后，11000rmp离心9min，收集上清液，再向收集的上清液中加入固体硫酸铵至饱和度80％，4℃静置5h，11000r/min离心9min，收集沉淀并溶解于0.02mol/L，pH7.0的Tris-HCl缓冲液中，进一步采用透析袋透析，其间每隔4h，更换一次纯水，得透析完全的抗菌肽样品。
6)抗菌肽阴离子交换层析
将步骤5)透析完全的抗菌肽样品上样DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱。采用0.02mol/LpH值8.0的Tris-HCl缓冲溶液将未结合的杂质洗脱掉，一直洗脱至紫外检测线不发生变化，再用含有1mol/L NaCl的0.02mol/L pH值8.0的Tris-HCl的缓冲溶液进行线性梯度洗脱，洗脱速度1.5mL/min，按每管3mL收集。抗菌肽洗脱出的NaCl浓度为0.52mol/L。合并有抗菌活性的收集管，采用截留分子量为1000Da的纤维素膜超滤浓缩后得阴离子交换层析活性浓缩液。
7)抗菌肽分子筛凝胶柱过滤层析
将步骤6)阴离子交换层析活性浓缩液上样Sephadex G-15分子筛凝胶柱，洗脱缓冲溶液为0.02M、pH值8.0的Tris-HCl，洗脱速度1mL/min，按每管2mL收集，合并有活性的收集管得分子筛凝胶柱过滤层析抗菌肽活性溶液，检测抗菌活力，计算回收率为44.0％。
8)高纯度抗菌肽干粉制备
将步骤7)分子筛凝胶柱过滤层析抗菌肽活性溶液采用截留分子量1000Da的超滤膜过滤，使抗菌肽溶液浓缩15倍。然后采用旋转蒸发仪真空浓缩，温度控制为70℃，当浓缩至抗菌肽溶液较为粘稠时，取出抗菌肽浓缩液。-20℃冷冻9h，然后将结冰的抗菌肽置于真空冷冻干燥机中，控制真空度为：40Pa，温度为-35℃，干燥时间16h。即得抗菌肽成品。
实施例4
一种抗菌肽制备工艺方法，包括如下步骤：
1)菌株活化
将保藏完好的斜面菌种CGMCC NO.5702接种于斜面培养基，37℃培养20h，进行菌种活化。
2)液体种子培养
将活化好的枯草芽孢杆菌单菌落接入灭菌后的种子培养基中，于旋转摇床200r/min、37℃恒温振荡培养20h，种子发酵液的含菌量为108cfu/mL；
3)摇瓶发酵培养
将步骤2)得到的种子液以10％的接种量接入三角瓶，1000mL三角瓶装发酵液体培养基为200mL，三角瓶塞采用乳胶塞，发酵温度37℃，转速200r/min摇床培养62h；
4)15升气升式自动发酵罐发酵培养
采用分批补料发酵方式进行气升式液体深层发酵：15L发酵罐装发酵培养基10L，发酵罐灭菌冷却后，将步骤3)中的摇瓶发酵液按照6％接种量接种，发酵控制条件为：温度37℃，时间62h，发酵培养基pH值8.0，无菌空气通风比1∶1(v/v)，罐压0.02MPa，发酵20h后，分5次向发酵液中补加浓度为150g/L的葡萄糖溶液，每次100mL；
5)发酵液预处理
将步骤4)发酵液12000r/min离心10min去菌体，得到发酵液上清。取上清液首先通过截留分子量为20kDa的超滤膜超滤，收集的滤液再经过截留分子量为1000Da的超滤膜超滤，弃去滤过液，抗菌肽溶液浓缩10倍。抗菌肽回收率高达82％。将超滤得到的浓缩抗菌肽溶液加热升温至85℃，保温15min后将温度降至35℃，继续降温至4℃静置6h，12000r/min离心10min去掉加热变性的絮状悬浮沉淀蛋白。室温下向以上离心过后的发酵清液中慢慢加入固体硫酸铵至20％饱和度，冰箱中静置6h后，12000rmp离心10min，收集上清液，再向收集的上清液中加入固体硫酸铵至饱和度80％，4℃静置6h，12000r/min离心10min，收集沉淀并溶解于0.02mol/L，pH7.0的Tris-HCl缓冲液中，进一步采用透析袋透析，其间每隔4h，更换一次纯水，得透析完全的抗菌肽样品。
6)抗菌肽阴离子交换层析
将步骤5)透析完全的抗菌肽样品上样DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱。采用0.02mol/LpH值8.0的Tris-HCl缓冲溶液将未结合的杂质洗脱掉，一直洗脱至紫外检测线不发生变化，再用含有1mol/L NaCl的0.02mol/L pH值8.0的Tris-HCl的缓冲溶液进行线性梯度洗脱，洗脱速度1.5mL/min，按每管3mL收集。抗菌肽洗脱出的NaCl浓度为0.55mol/L。合并有抗菌活性的收集管，采用截留分子量为1000Da的纤维素膜超滤浓缩后得阴离子交换层析活性浓缩液。
7)抗菌肽分子筛凝胶柱过滤层析
将步骤6)阴离子交换层析活性浓缩液上样Sephadex G-15分子筛凝胶柱，洗脱缓冲溶液为0.02mol/L、pH值8.0的Tris-HCl，洗脱速度1mL/min，按每管2mL收集，合并有活性的收集管得分子筛凝胶柱过滤层析抗菌肽活性溶液，检测抗菌活力，计算回收率为44.5％。
8)高纯度抗菌肽干粉制备
将步骤7)分子筛凝胶柱过滤层析抗菌肽活性溶液采用截留分子量1000Da的超滤膜过滤，使抗菌肽溶液浓缩15倍。然后采用旋转蒸发仪真空浓缩，温度控制为75℃，当浓缩至抗菌肽溶液较为粘稠时，取出抗菌肽浓缩液。-20℃冷冻10h，然后将结冰的抗菌肽置于真空冷冻干燥机中，控制真空度为：50Pa，温度为-35℃，干燥时间18h。即得抗菌肽成品。
实施例5抗菌肽的纯化程度检测
将实施例2步骤7)中分子筛凝胶柱过滤层析抗菌肽活性溶液上样于0.1％TFA双蒸水平衡的C18柱进行RP-HPLC分离，用8％～100％乙腈(0.1％TFA)进行0.6mL/min线性梯度洗脱，得到五个完全分开的洗脱峰如图4，分别收集各个峰样品并冷冻干燥，以蜡样芽胞杆菌作为指示菌，进行平板扩散法检测每个峰样品的抑菌活性。结果洗脱曲线中的洗脱峰d(23.5min处)样品有抑菌活性，抑菌结果如图5所示，分离效果理想。
将经RP-HPLC反相色谱柱分离纯化所得的样品进行Tricnine-SDS-PAGE凝胶电泳，分离胶浓度为16.5％，浓缩胶浓度为5％，用考马斯亮蓝染色脱色后，在凝胶上只出现一条谱带(如图6)，说明该样品已经达到电泳纯，根据谱带位置，初步确定该条带分子量为3500Da左右。
将经过RP-HPLC分离的峰d样品，用6mol/L的HCl于110℃水解24h，然后将水解液蒸干，加5mL0.02mol/L的HCl溶解后，上日立L-8800全自动氨基酸分析仪进行氨基酸组成分析。氨基酸分析结果表明，抗菌肽主要含有12种氨基酸。其中极性氨基酸(Leu、Pro、Val、Ile、Met)相对含量为49.01％，非极性氨基酸(Gly、Ser、Tyr、Glu、Asp、Cys、His)相对含量为50.99％。极性不带电荷的氨基酸(Glu、Ser、Cys、Tyr)相对含量为27.96％，极性带电荷的氨基酸(His、Glu、Asp)相对含量为13.99％。
表1抗菌肽氨基酸组成分析
Figure BDA00003313811800101
实施例6：抗菌肽食品防腐实验
将实施例2获得的抗菌肽固体粉末，水分＜5％，用于食品防腐试验。
1、牛奶防腐实验
将超市购买的超高温瞬时灭菌牛奶，加入到清洗干净但未灭菌的试管中，每管15mL，试管编1～7号，在实验组1～7号中按照每100mL牛奶加入抗菌肽固体粉末0.2g、0.4g、0.8g、1.2g、1.6g、2.0g、2.4g的质量浓度加入到以上试管中，混合均匀。空白对照不添加抗菌肽。然后置于室温下30d，记录牛奶腐败变质情况。结果如图7所示，30d后，空白组试管内的牛奶已经明显变质，色洋暗黄，水乳分层，产生絮状沉淀，打开试管塞，也闻到一股异味。1、2号试管也出现一定程度的腐败现象，而后面的试管随着抗菌肽添加量的增加，腐败现象越来越不明显，其中7号试管牛奶颜色洁白，无异味，感官良好，几乎无变质现象。故该抗菌肽可以用于牛奶的防腐中。
2、草莓汁防腐实验
按照每100mL新鲜草莓汁加入抗菌肽固体粉末0.2g、0.4g、0.8g、1.2g、1.6g、2.0g、2.4g的质量浓度加入到新鲜草莓汁中，混合均匀。空白对照不添加抗菌肽。然后置于室温下10d，观察草莓汁感官及微生物数目情况。结果如表4所示，随着抗菌肽的添加量增加，草莓汁出现浑浊和絮状沉淀的腐败现象越来越轻，在添加质量浓度为1.2g/100mL以上室温10d，草莓汁外观无腐败现象，可以接受。从微生物含量来看，添加抗菌肽可以显著抑制杂菌的繁殖增长，随着抗菌肽的添加，微生物数量越来越少。当抗菌肽添加质量浓度在1.6g/100mL以上时，培养平板中检测不到微生物，故添加质量浓度在1.6g/100mL以上时可以达到完全抑制微生物生长的抑菌效果。
表4枯草芽孢杆菌BRT39产抗菌肽对草莓汁的防腐效果
Figure BDA00003313811800111

Claims (7)

1.一种利用枯草芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)菌株活化
将保藏完好的斜面菌种CGMCC NO.5702接种于斜面培养基，35-37℃培养16-20h，进行菌种活化；
2)液体种子培养
将活化好的枯草芽孢杆菌斜面菌种接入灭菌后的种子培养基中，于旋转摇床180-200r/min、35-37℃恒温振荡培养16-20h，种子发酵液的含菌量为107-108cfu/mL；
3)摇瓶发酵培养
将步骤2)得到的种子液以4-10％的接种量接入三角瓶，1000mL三角瓶装摇瓶发酵培养基为100-200mL，三角瓶塞采用乳胶塞，发酵温度32-37℃，转速160-200r/min摇床培养60-62h；
4)15升气式自动发酵罐发酵培养
采用分批补料发酵方式进行气升式液体深层发酵：15L发酵罐装发酵培养基10L，发酵罐灭菌冷却后，将步骤3)中的摇瓶发酵液按照4-6％接种量接种，发酵控制条件为：温度35-37℃，时间60-62h，发酵培养基pH值7.5-8.0，无菌空气通风比1∶1(v/v)，罐压0.02MPa，发酵15-20h后，每隔6-8h向发酵液中补加葡萄糖溶液100mL；
5)发酵液预处理
将步骤4)发酵液10000-12000r/min离心8-10min去菌体，得到发酵液上清。取上清液首先通过截留分子量为20kDa的超滤膜超滤，收集的滤液再经过截留分子量为1000Da的超滤膜超滤，弃去滤过液，抗菌肽溶液浓缩10倍。将超滤得到的浓缩抗菌肽溶液加热升温至82-85℃，保温12-15min后将温度降至32-35℃，继续降温至4℃静置4-6h，10000-12000r/min离心8-10min去掉加热变性的絮状悬浮沉淀蛋白。室温下向以上离心过后的发酵清液中慢慢加入固体硫酸铵至20％饱和度，冰箱中静置4-6h后，1000-12000rmp离心8-10min，收集上清液，再向收集的上清液中加入固体硫酸铵至饱和度80％，4℃静置4-6h，1000-12000r/min离心8-10min，收集沉淀并溶解于0.02mol/L，pH7.0的Tris-HCl缓冲液中，进一步采用透析袋透析，其间每隔3～4h，更换一次纯水，得透析完全的抗菌肽样品；
6)抗菌肽阴离子交换层析
将步骤5)透析完全的抗菌肽样品上样DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱。采用0.02mol/LpH值8.0的Tris-HCl缓冲溶液将未结合的杂质洗脱掉，一直洗脱至紫外检测线不发生变化，再用含有0-1mol/L的NaCl的0.02mol/L pH值8.0的Tris-HCl的缓冲溶液进行线性梯度洗脱，洗脱速度1.5ml/min，按每管3ml收集，抗菌肽洗脱出的NaCl浓度为0.50-0.55mol/L。合并有抗菌活性的收集管，采用截留分子量为1000Da的纤维素膜超滤浓缩后得阴离子交换层析活性浓缩液；
7)抗菌肽分子筛凝胶柱过滤层析
将步骤6)阴离子交换层析活性浓缩液上样Sephadex G-15分子筛凝胶柱，洗脱缓冲溶液为0.02mol/L、pH值8.0的Tris-HCl，洗脱速度1mL/min，按每管2mL收集，合并有活性的收集管得分子筛凝胶柱过滤层析抗菌肽活性溶液；
8)高纯度抗菌肽干粉制备
将步骤7)分子筛凝胶柱过滤层析抗菌肽活性溶液采用截留分子量1000Da的超滤膜过滤，使抗菌肽溶液浓缩15倍。然后采用旋转蒸发仪真空浓缩，温度为65-75℃，当浓缩至抗菌肽溶液较为粘稠时，取出抗菌肽浓缩液于-20℃冷冻8-10h，然后将结冰的抗菌肽置于真空冷冻干燥机中，控制真空度为30-50Pa，温度为-35℃，干燥时间15-18h，即得抗菌肽成品。
2.如权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，其特征在于，所述种子培养基组成为：葡萄糖2g，蛋白胨1g，NaH2PO4·2H2O0.2g，Na2HPO4·2H2O0.4g，MgSO4·7H2O0.05g，dH2O100mL，pH值7.5，121℃灭菌20min。
3.如权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，其特征在于，所述摇瓶发酵培养基组成为：豆粕粉1-2g，麦芽糖0.5g，葡萄糖0.7-1g，硫酸铵0.3g，硝酸铵0.2g，蛋白胨0.4-1g，牛肉膏0.5g，NaCl0.5g，KH2PO40.1g，MgSO4·7H2O0.04g，dH2O100mL，pH8.0，121℃，灭菌20min。
4.如权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，其特征在于，所述发酵罐发酵培养基组成为：豆粕粉1-2g，玉米粉0.5-1g，麦芽糖0.5g，可溶性淀粉0.5-0.7g，葡萄糖0.7-1g，硫酸铵0.3g，硝酸铵0.2g，蛋白胨0.4-1g，牛肉膏0.5g，NaCl0.5g，KH2PO40.1g，MgSO4·7H2O0.04g，dH2O100mL，pH8.0，121℃，灭菌20min。
5.如权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，其特征在于，所述补加葡萄糖溶液浓度为150g/L。
6.如权利要求1-5所述的任一一种利用枯草芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)菌株活化
将保藏完好的斜面菌种CGMCC NO.5702接种于斜面培养基，35℃培养16h，进行菌种活化；
2)液体种子培养
将活化好的枯草芽孢杆菌单菌落接入灭菌后的种子培养基中，于旋转摇床180r/min、35℃恒温振荡培养16h，种子发酵液的含菌量为107cfu/mL；
3)摇瓶发酵培养
将步骤2)得到的种子液以5％的接种量接入三角瓶，1000mL三角瓶装发酵液体培养基为200mL，三角瓶塞采用乳胶塞，发酵温度32℃，转速160r/min摇床培养60h；
4)15升气升式自动发酵罐发酵培养
采用分批补料发酵方式进行气升式液体深层发酵：15L发酵罐装发酵培养基10L，发酵罐灭菌冷却后，将步骤3)中的摇瓶发酵液按照4％接种量接种，发酵控制条件为：温度35℃，时间60h，发酵培养基pH值8.0，无菌空气通风比1∶1(v/v)，罐压0.02MPa，发酵15h后，分5次向发酵液中补加浓度为150g/L的葡萄糖溶液，每次100mL；
5)发酵液预处理
将步骤4)发酵液10000r/min离心8min去菌体，得到发酵液上清，取上清液首先通过截留分子量为20kDa的超滤膜超滤，收集的滤液再经过截留分子量为1000Da的超滤膜超滤，弃去滤过液，抗菌肽溶液浓缩10倍。抗菌肽回收率高达80％，将超滤得到的浓缩抗菌肽溶液加热升温至82℃，保温12min后将温度降至32℃，将该发酵液继续降温至4℃静置4h，10000r/min离心8min去掉加热变性的絮状悬浮沉淀蛋白，室温下向以上离心过后的发酵清液中慢慢加入固体硫酸铵至20％饱和度，冰箱中静置4h后，10000rmp离心8min，收集上清液，再向收集的上清液中加入固体硫酸铵至饱和度80％，4℃静置4h，，10000r/min离心8min，收集沉淀并溶解于0.02mol/L，pH7.0的Tris-HCl缓冲液中，进一步采用透析袋透析，其间每隔3h，更换一次纯水，得透析完全的抗菌肽样品；
6)抗菌肽阴离子交换层析
将步骤5)透析完全的抗菌肽样品上样DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱。采用0.02mol/LpH值8.0的Tris-HCl缓冲溶液将未结合的杂质洗脱掉，一直洗脱至紫外检测线不发生变化，再用含有1mol/L的NaCl的0.02mol/L pH值8.0的Tris-HCl的缓冲溶液进行线性梯度洗脱，洗脱速度1.5ml/min，按每管3ml收集。洗脱曲线见图1，洗脱出四个大的蛋白峰，以蜡样芽胞杆菌作为指示菌，平板扩散法检测每个峰样品的抑菌活性。结果显示峰III有抗菌活性，抗菌肽洗脱出的NaCl浓度约为0.50mol/L，抗菌活性收集管的抑菌活性检测如图2，合并有抗菌活性的收集管，采用截留分子量为1000Da的纤维素膜超滤浓缩后得阴离子交换层析活性浓缩液；
7)抗菌肽分子筛凝胶柱过滤层析
将步骤6)阴离子交换层析活性浓缩液上样Sephadex G-15分子筛凝胶柱，洗脱缓冲溶液为0.02mol/L、pH值8.0的Tris-HCl，洗脱速度1ml/min，按每管2ml收集，洗脱曲线见图3，合并有活性的收集管得分子筛凝胶柱过滤层析抗菌肽活性溶液，检测抗菌活力，计算回收率为43.5％；
8)高纯度抗菌肽干粉制备
将步骤7)分子筛凝胶柱过滤层析抗菌肽活性溶液采用截留分子量1000Da的超滤膜过滤，使抗菌肽溶液浓缩15倍，然后采用旋转蒸发仪真空浓缩，温度控制为65℃，当浓缩至抗菌肽溶液较为粘稠时，取出抗菌肽浓缩液，-20℃冷冻8h，然后将结冰的抗菌肽置于真空冷冻干燥机中，控制真空度为：30Pa，温度为-35℃，干燥时间15h，即得抗菌肽成品。
7.如权利要求1-6所述的任一一种利用枯草芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法所制得的抗菌肽在食品防腐中的应用。
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