CN111118091A - 一种抗菌肽的生产方法 - Google Patents

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孙维国
陈龙
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
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    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis

Abstract

本发明公开了一种抗菌肽的生产方法，本发明对融合蛋白形式表达的细菌经过发酵产生的发酵醪液，采用低温静置与板框过滤结合法使得发酵醪液中抗菌肽和其他培养基残留物、菌体等能够得到有效分离，从而抗菌体得以纯化，所得到的产品效价大于等于100000U/g，得率大于等于85％，成本小于等于35/kg，本发明制得的抗菌肽同比市面上其他方法生产的抗菌肽效价大大提高，得率也得到提高，成本大幅度降低，打通了该法规模化生产饲用抗菌肽的工艺瓶颈，实用性更好。

Description

一种抗菌肽的生产方法
技术领域
本发明涉及一种抗菌肽生产领域，具体是一种抗菌肽的生产方法。
背景技术
抗菌肽是一类具有抗菌活性的碱性小分子肽类物质，分子量在2000-7000左右，这类活性小分子多肽多数具有广谱抗菌等特点，是饲料养殖行业禁用抗生素的最佳替代品。
由于欧美饲料禁抗较早，饲用抗菌肽的研究开发与应用远远领先于中国，由于受到知识产权保护等问题，有关抗菌肽技术方面的交流无论是国际还是国内几乎没有举办过。目前国内市场上用于饲料添加剂的抗菌肽全部为进口产品，且价格昂贵。
由于抗菌肽在生物体内含量极微，从生物体内提取抗菌肽产量低、时间长、工艺复杂、成本高，无法实现规模生产，这成为制约抗菌肽进入实际应用的最大障碍。所以采用分子生物学的手段对细菌进行改造是必然的选择。由于抗菌肽对细菌的杀伤作用，不能用原核表达系统直接表达具有生物活性的抗菌肽，而如果采用融合蛋白的形式表达，表达产物与残留培养基、菌体等几乎无法分离纯化(无论采用何种分离设备)，得率低(约为25％)，产品效价低(约30000u/g)，成本高(约100元/kg)。本发明针对此问题进行了深入研究，即对融合蛋白形式表达的细菌经过发酵所表达的抗菌肽的分离纯化进行了研究，结果表明：发酵料液采用低温静置与板框过滤结合法使得发酵醪液中抗菌肽和其他培养基残留物、菌体等能够得到有效分离，从而抗菌体得以纯化，得率得以提高，成本大幅度降低，打通了该法规模化生产饲用抗菌肽的工艺瓶颈。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗菌肽的生产方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种抗菌肽的生产方法，其具体生产步骤如下：
S1、将抗菌肽制备时以融合蛋白形式表达的细菌放入种子罐中进行种子培养，菌种达到后续培养接种条件后将其转入发酵罐里面进行发酵，菌种后续培养接种条件为种龄6.小时，PH5.6，OD6.0；菌种发酵培养结束条件为：周期18小时，pH5.9，OD12.7；发酵好后将发酵醪液提取出来，转到中转罐中，待醪液在中转罐中的温度降到20-25℃时，使醪液保持这个温度在中转罐中静置16-24h，静置结束后，向中转罐中添加硅藻土，之后对硅藻土和醪液进行搅拌，搅拌均匀之后将它们转入过滤机中进行分离，得到的清液为抗菌肽溶液，且该溶液湿重检测为零；
S2、采用截留1000分子量的膜对得到的抗菌肽溶液进行纯化浓缩，浓缩倍数为2-3倍，然后向浓缩液里面添加载体，一般为辅美粉，之后对载体和浓缩液进行搅拌，搅拌均匀形成混合溶液，之后对混合溶液进行干燥，得到抗菌肽高效价粉状产品。
作为本发明进一步的方案：所述步骤S1中添加的硅藻土的量按照醪液体积的3％-5％添加。
作为本发明进一步的方案：所述步骤S1中过滤机为普通鼓膜式聚丙烯板框过滤机。
作为本发明进一步的方案：所述步骤S2中所添加的载体的体积为所得浓缩液体积量的15％。
作为本发明进一步的方案：所述步骤S2中干燥方式为喷雾干燥。
作为本发明进一步的方案：所述步骤S2中干燥的控制条件为混合溶液进入干燥箱时的温度为135-145℃，排出干燥箱时的温度为70-75℃。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤S2中所得到的产品效价大于等于100000U/g，得率大于等于85％，成本小于等于35/kg。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明对融合蛋白形式表达的细菌经过发酵产生的发酵醪液，采用低温静置与板框过滤结合法使得发酵醪液中抗菌肽和其他培养基残留物、菌体等能够得到有效分离，从而抗菌体得以纯化，所得到的产品效价大于等于100000U/g，得率大于等于85％，成本小于等于35/kg，本发明制得的抗菌肽同比市面上其他方法生产的抗菌肽效价大大提高，得率也得到提高，成本大幅度降低，打通了该法规模化生产饲用抗菌肽的工艺瓶颈，实用性更好。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种抗菌肽的生产方法，其具体生产步骤如下：
S1、将抗菌肽制备时以融合蛋白形式表达的细菌放入300L的种子罐中进行种子培养，菌种达到后续培养接种条件后将其转入3m3的发酵罐里面进行发酵，菌种后续培养接种条件为种龄6.小时，PH5.6，OD6.0；菌种发酵培养结束条件为：周期18小时，pH5.9，OD12.7；然后将发酵醪液转到中转罐中，待醪液在中转罐中的温度降到20-25℃时，使醪液保持这个温度在中转罐中静置16h，静置结束后，向中转罐中添加硅藻土，添加的硅藻土的量按照醪液体积的4％添加，之后对硅藻土和醪液进行搅拌，搅拌均匀之后将它们转入过滤机中进行分离，过滤机为20㎡鼓膜式聚丙烯板框过滤机，得到的清液为抗菌肽溶液，且该溶液湿重检测为零，所述溶液湿重检测为零表明液体清亮，无残渣或水不溶物；
S2、清液经过1000分子量膜的纯化，所得浓缩液约1m3，然后向浓缩液里面添加载体，一般为辅美粉，所添加的载体的体积为所得浓缩液体积量的15％，之后对载体和浓缩液进行搅拌，搅拌均匀形成混合溶液，之后对混合溶液进行干燥，干燥方式为喷雾干燥，干燥的控制条件为混合溶液进入干燥箱时的温度为135-145℃，排出干燥箱时的温度为70-75℃，得到抗菌肽高效价粉状产品，所得产品151公斤，产品效价113869u/g，同比提高了3.79倍，得率86.5％，同比提高了3.46倍，成本32.5元/kg，同比降低了67.5％。
实施例2
一种抗菌肽的生产方法，其具体生产步骤如下：
S1、将抗菌肽制备时以融合蛋白形式表达的细菌放入3000L的种子罐中进行种子培养，菌种达到后续培养接种条件后将其转入20m3的发酵罐里面进行发酵，菌种后续培养接种条件为种龄6.小时，PH5.6，OD6.0；菌种发酵培养结束条件为：周期18小时，pH5.8，OD12.1；然后将发酵醪液转到中转罐中，待醪液在中转罐中的温度降到20-25℃时，使醪液保持这个温度在中转罐中静置20h，静置结束后，向中转罐中添加硅藻土，添加的硅藻土的量按照醪液体积的3％添加，之后对硅藻土和醪液进行搅拌，搅拌均匀之后将它们转入过滤机中进行分离，过滤机为100㎡的鼓膜式聚丙烯板框过滤机，得到的清液为抗菌肽溶液，且该溶液湿重检测为零，所述溶液湿重检测为零表明液体清亮，无残渣或水不溶物；
S2、清液经过1000分子量膜的纯化，所得浓缩液约6.5m3，然后向浓缩液里面添加载体，一般为辅美粉，所添加的载体的体积为所得浓缩液体积量的15％，之后对载体和浓缩液进行搅拌，搅拌均匀形成混合溶液，之后对混合溶液进行干燥，干燥方式为喷雾干燥，干燥的控制条件为混合溶液进入干燥箱时的温度为135-145℃，排出干燥箱时的温度为70-75℃，得到抗菌肽高效价粉状产品，所得产品990公斤，产品效价116750u/g，同比提高了3.89倍，得率87％，同比提高了3.48倍，成本31元/kg，同比降低了69％。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (7)

1.一种抗菌肽的生产方法，其特征在于，其具体生产步骤如下：
S1、将抗菌肽制备时以融合蛋白形式表达的细菌放入种子罐中进行种子培养，菌种达到后续培养接种条件后将其转入发酵罐里面进行发酵，菌种后续培养接种条件为种龄6.小时，PH5.6，OD6.0；菌种发酵培养结束条件为：周期18小时，pH5.9，OD12.7；发酵好后将发酵醪液提取出来，转到中转罐中，待醪液在中转罐中的温度降到20-25℃时，使醪液保持这个温度在中转罐中静置16-24h，静置结束后，向中转罐中添加硅藻土，之后对硅藻土和醪液进行搅拌，搅拌均匀之后将它们转入过滤机中进行分离，得到的清液为抗菌肽溶液，且该溶液湿重检测为零；
S2、采用截留1000分子量的膜对得到的抗菌肽溶液进行纯化浓缩，浓缩倍数为2-3倍，然后向浓缩液里面添加载体，一般为辅美粉，之后对载体和浓缩液进行搅拌，搅拌均匀形成混合溶液，之后对混合溶液进行干燥，得到抗菌肽高效价粉状产品。
2.根据权利要求1所述的一种抗菌肽的生产方法，其特征在于，所述步骤S1中添加的硅藻土的量按照醪液体积的3％-5％添加。
3.根据权利要求1所述的一种抗菌肽的生产方法，其特征在于，所述步骤S1中过滤机为普通鼓膜式聚丙烯板框过滤机。
4.根据权利要求1所述的一种抗菌肽的生产方法，其特征在于，所述步骤S2中所添加的载体的体积为所得浓缩液体积量的15％。
5.根据权利要求1所述的一种抗菌肽的生产方法，其特征在于，所述步骤S2中干燥方式为喷雾干燥。
6.根据权利要求1所述的一种抗菌肽的生产方法，其特征在于，所述步骤S2中干燥的控制条件为混合溶液进入干燥箱时的温度为135-145℃，排出干燥箱时的温度为70-75℃。
7.根据权利要求1所述的一种抗菌肽的生产方法，其特征在于，所述步骤S2中所得到的产品效价大于等于100000U/g，得率大于等于85％，成本小于等于35/kg。
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