CN106893751A - 一种发酵生产杆菌肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种提高微生物发酵生产杆菌肽产量的方法。该方法通过1）优化有机复合氮源和发酵条件，保证了批次间发酵单位的稳定性，降低了杂质F含量；2）在杆菌肽合成期间添加超顺磁性微球，降低发酵产物对产生菌的反馈抑制。发酵结束后，杆菌肽的发酵单位可达1228U/ml，比优化前可使杆菌肽产量提高123%，提高了产能，降低了能耗及废弃物的排放。

Description

一种发酵生产杆菌肽的方法
技术领域
本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种发酵生产杆菌肽的方法。
背景技术
杆菌肽是一种由12种氨基酸组成的噻唑肽类窄谱抗生素，主要由特雷斯氏枯草杆菌和地衣芽孢杆菌发酵产生，对革兰氏阳性球菌和杆菌有效，对少数革兰氏阴性菌、螺旋体及放线菌也有一定的抑制作用。杆菌肽具有高效、低毒、残留量少等优点。因此，杆菌肽不仅是一种重要的抗生素药物，也是安全性良好的畜禽抗生素饲料添加剂。
杆菌肽是几种相似多肽组分的混合物，含有杆菌肽A、B1、B2、B3、C1、C2、C3、E、F等化学结构类似的异构体，其主要活性成分为杆菌肽A，分子式为C66H103N17O16S。杆菌肽F是杆菌肽A的降解产物，有肾毒性，需严格控制其含量。
杆菌肽是类白色至淡黄色的粉末，无嗅、味苦，有吸湿性，易被氧化剂破坏，在溶液中能被多种重金属盐类沉淀，杆菌肽在水中易溶，在乙醇中溶解，在丙酮、三氯甲烷或乙醚中不溶。
在现有技术中，杆菌肽发酵具有其自身的特点，在大规模生产中也面临着一些需要解决的难题。
1）杆菌肽最终效价、杂质F的含量受发酵过程中温度影响很大。随着发酵温度的升高，杆菌肽效价增加，但同时杂质F的比例大幅度的增加。例如常规的杆菌肽发酵过程中，当发酵温度是37℃时杂质F的比例高达10%。
2）杆菌肽为微生物发酵的次级代谢产物，存在于发酵液中。杆菌肽不仅对其他生物有杀死或抑制作用，对产生菌自身也有杀死或抑制作用。随着杆菌肽在发酵液中浓度不断增高，其产生菌受到高浓度产物的反馈调节作用，使产生菌生物细胞及酶的潜力不能充分发挥，造成杆菌肽的产率难以提高，从而成为制约提高杆菌肽发酵水平的瓶颈。选育能耐受高浓度杆菌肽的产生菌固然可以使生产指标得以提高，但并不能从根本上解决问题。添加大孔吸附树脂也可降低发酵产物对产生菌的反馈抑制，使杆菌肽产量提高11%以上，但大孔树脂的加入导致菌丝过早断裂并衰亡，存在发酵终点明显提前的弊端，加入的大孔树脂和菌丝混在一起，无法有效分离。3）杆菌肽是肽类抗生素，由一系列氨基酸通过酶催化合成，因而氮代谢对杆菌肽的合成影响明显。而目前的有机氮源大多为大宗农副产品，其质量受产地、加工方式等影响，造成大规模生成中不同发酵批次间菌种的次级代谢水平不一致，进而影响下游纯化，最终影响产品质量。
酵母粉和棉籽蛋白粉，是近年发展起来的有机氮源。其中棉籽蛋白粉是一种以特定地区的优质棉籽为原料，采用先进的技术生产的高蛋白、低酚、低纤维、微生物利用效果好的有机氮源，产品的蛋白含量在50%以上，氨基酸组成占总氮的90%以上，游离棉酚的含量控制在600ppm以下，产品质量稳定。酵母粉为标准化有机氮源，蛋白质含量高（蛋白质占干菌体总重50%以上），含有18种氨基酸，种类齐全，维生素和矿物质等含量丰富。但未见有报道将两种有机氮源配合应用于地衣芽孢杆菌生物合成杆菌肽。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中微生物发酵制备杆菌肽存在的发酵过程不稳定及发酵水平低的问题，提供一种通过优化发酵培养基配方（特别是氮源类型）、发酵条件（如发酵温度），在发酵过程的特定时间段中添加超顺磁性微球，减少反馈抑制，来提高杆菌肽产量的方法。
本发明的关键构思为：采用地衣芽孢杆菌菌株为出发菌株，在微生物发酵生产杆菌肽过程中，优化初始pH值、发酵温度及时间、接种量等条件，优化复合有机氮源，在杆菌肽合成期间添加超顺磁性微球，提高杆菌肽的产量。
本发明所提供的一种发酵生产杆菌肽的方法，包括以下步骤：
a、制备地衣芽孢杆菌菌株的种子液
将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，28-30℃、200-240 rpm，培养20-28 h获得种子液；
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉3.0-5.0克、葡萄糖10.0-20.0克、酵母粉10.0-20.0克、硫酸铵1.0-2.0克、氯化钠1.0-2.0克、七水硫酸镁1.0-1.5克，加水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min。
本发明所述杆菌肽产生菌可选用菌株ATCC 10716。
b、制备地衣芽孢杆菌菌株的发酵液
将上述种子液以体积百分比6-10%的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发酵，发酵15-25小时之间添加经过灭菌后的超顺磁性微球，继续发酵，总发酵时间72-96 h，发酵温度28 -30 ℃，得到发酵液；
其中所述发酵培养基按以下方法制得：玉米淀粉30.0-40.0克、葡萄糖10.0-20.0克、棉籽蛋白粉15.0-30.0克、酵母粉10.0-20.0克、硫酸铵2.0-3.0克、玉米浆3.0-5.0克、磷酸二氢钾1.0-1.5克、氯化钠2.0-3.0克、七水硫酸镁1.0-2.0克，加水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min。
其中步骤b中所述有机氮源中棉籽蛋白粉和酵母粉比例为3:1至1:1。
本发明的进一步改进在于：其中步骤b中有机氮源中棉籽蛋白粉和酵母粉添加比例为3:2。
本发明的进一步改进在于：发酵罐压力为0.05±0.01Mpa、搅拌速度为300-400rpm，通气比为1:0.8-1.2vvm。
本发明所述超顺磁性微球是一种内核含磁性的Fe3O4，外层包被多孔的高分子聚合物的微球。本发明中MagneStar®MP-02系列磁珠，商购于苏州纳微科技有限公司，该微球的内核具有超顺磁性，饱和磁化强度为30-40emu/g；微球的粒径为10-30μm，粒径分布为单分散；高分子聚合物层呈现多孔性质，孔径为20-30nm,该多孔聚合物表面键合了羧基基团，羧基含量为200μmol/g；所述超顺磁性微球比表面积为150-240m2/g;所述超顺磁性微球为经过盐酸处理后的酸式结构。所述超顺磁性微球由于表面具有羧基基团，能够与含有氨基等碱性基团的物质键合，因此对发酵液中带有碱性基团的物质，包括杆菌肽各组分，具有一定的吸附能力。
本发明的进一步改进在于：超顺磁性微球的添加量为1.0-2.0%（w/v），即每升发酵液添加10-20g。
本发明的有益效果:
上述优选条件，所获得杆菌肽的产量从550U/ml提高到1228U/ml，为杆菌肽的工业化生产提供了一种方法。
本发明中通过优化配方和发酵条件，选择特定的优质氮源：酵母粉、棉籽蛋白粉按一定比例的混合物，以及降低发酵温度为30 ℃，提高了杆菌肽产量，杂质F的含量控制在2%以下，也保证了批次间发酵单位的稳定性。
在发酵过程的特定时间段，通过在发酵液中添加超顺磁性微球，可以非特异性的吸附发酵液中一些成分，所述成分包括发酵液中的杆菌肽、杂质F，在一定程度上降低发酵过程中发酵液内杆菌肽含量，因此也适当降低了发酵产物杆菌肽对产生菌的反馈抑制。方法优化后可使杆菌肽产量提高36%以上；提高了产能，降低了能耗及废弃物的排放。如果应用大孔树脂法，在发酵液中加入大量的大孔树脂，我们发现大量大孔树脂的加入导致菌丝过早断裂并衰亡，发酵终点明显提前，导致最终产量提高有限。超顺磁性微球法与大孔树脂法相比，克服了上述弊端，发酵后的杆菌肽产量提高了19%。超顺磁性微球法还克服了加入到发酵液中的大孔吸附树脂无法回收，导致环境污染的缺点，超顺磁性微球用外加磁场易于回收，再生后可重复使用，工艺过程绿色环保。
附图说明
图1为菌株发酵培养15小时的菌体形态。
图2为菌株发酵培养25小时的菌体形态。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为工业级原料；所用的超顺磁性微球MagneStar®MP-02系列磁珠由苏州纳微科技有限公司提供，所用的棉籽蛋白粉购自青岛科瑞，酵母粉购自安琪酵母股份有限公司。用氨水洗脱发酵后分离的超顺磁性微球，所获得的洗脱液是含有多种成分的初级分离产物。发酵液、洗脱液中杆菌肽的效价、杂质F的含量均使用高效液相色谱方法进行测定，其具体步骤是本领域技术人员所公知的。
本发明对比实验中所用大孔吸附树脂的型号为XAD18，特征孔径150Å，粒径为0.315-1.25mm，比表面积为800m2/ g，添加量为每升发酵液添加40-80g。
大孔吸附树脂预处理方式为每克树脂加入6-10ml的2mol/L的HCl，静态浸泡2-4小时后过滤，除去盐酸，然后用去离子水洗涤至pH值5.0以上。
实施例1、 500mL摇瓶发酵制备杆菌肽（棉籽蛋白粉、酵母粉3：1）
地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备
将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，28℃、240 rpm、培养24 h获得种子液。
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉3.0克、葡萄糖20.0克、酵母粉20.0克、硫酸铵1.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.5，121℃灭菌30min。
本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
发酵培养基组成：
玉米淀粉30.0克、葡萄糖20.0克、棉籽蛋白粉30.0克、酵母粉10.0克、硫酸铵3.0克、玉米浆5.0克、磷酸二氢钾1.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.5，121℃灭菌30min。
摇瓶发酵培养：500 ml装量三角瓶6个，每瓶装50ml培养基，种子培养24小时后接种，接种量为10%，温度28 ℃、转速220 rpm，发酵培养72 h。
发酵结束后，杆菌肽的发酵单位为651U/ml，结果见表1。
实施例2、5L罐发酵制备杆菌肽（棉籽蛋白粉、酵母粉1：1）
地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备
将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，30℃、200rpm、培养20h获得种子液。
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉5.0克、葡萄糖10.0克、酵母粉10.0克、硫酸铵2.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁1.5克，加自来水定容至1000mL，pH7.0，121℃灭菌30min。
本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
发酵培养基组成：
玉米淀粉90.0克、葡萄糖60.0克、棉籽蛋白粉45.0克、酵母粉45.0克、硫酸铵6.0克、玉米浆12.0克、磷酸二氢钾4.5克、氯化钠7.5克、七水硫酸镁6.0克，加自来水定容至3L，pH6.8，121℃灭菌30min，5L自动发酵罐发酵培养。
发酵条件：装料量3L，种子培养20小时后接种，接种量为6%，罐温29 ℃、罐压0.05±0.01 Mpa、通气比1：1.2 vvm，400 rpm搅拌，发酵96 h。
发酵结束后，经检测杆菌肽的发酵单位为752U/ml，结果见表1。
实施例3、10L罐发酵制备杆菌肽（棉籽蛋白粉、酵母粉3：2）
地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备
将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，28℃、220 rpm、培养28 h获得种子液。
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉4.0克、葡萄糖15.0克、酵母粉15.0克、硫酸铵1.0克、氯化钠1.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.8，121℃灭菌30min。
本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
发酵培养基组成：
玉米淀粉200.0克、葡萄糖50.0克、棉籽蛋白粉150.0克、酵母粉100.0克、硫酸铵10.0克、玉米浆15.0克、磷酸二氢钾5.0克、氯化钠15.0克、七水硫酸镁5.0克，加自来水定容至5L，pH7.0，121℃灭菌30min，10L自动发酵罐发酵培养。
发酵条件：装料量5L，种子培养28小时后接种，接种量为8%，罐温30 ℃、罐压0.05±0.01 Mpa、通气比1：0.8 vvm，300 rpm搅拌，发酵96 h。
发酵结束后，经检测杆菌肽的发酵单位为847U/ml。结果见表1。
实施例4、 500mL摇瓶发酵制备杆菌肽（棉籽蛋白粉、酵母粉3：1，超顺磁性微球）
地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备
将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，28℃、240 rpm、培养24 h获得种子液。
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉3.0克、葡萄糖20.0克、酵母粉20.0克、硫酸铵1.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.5，121℃灭菌30min。
本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
发酵培养基组成：
玉米淀粉30.0克、葡萄糖20.0克、棉籽蛋白粉30.0克、酵母粉10.0克、硫酸铵3.0克、玉米浆5.0克、磷酸二氢钾1.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.5，121℃灭菌30min。
摇瓶发酵条件：500 ml装量三角瓶6个，每瓶装50ml培养基，种子培养24小时后接种，接种量为10%，温度28 ℃、转速220 rpm ，发酵培养25小时后，每瓶加入粒径为10μm 的超顺磁性微球0.5g，发酵周期72 h。
发酵结束后，将6瓶发酵液合并后，磁性分离发酵液中的超顺磁性微球，在超顺磁性微球中加入18ml的4%氨水洗脱获得洗脱液，分别测定洗脱液与发酵液清液中的杆菌肽含量。计算杆菌肽的发酵单位为885U/ml。结果见表1，计算方法见表2。
实施例5、5L罐发酵制备杆菌肽（棉籽蛋白粉、酵母粉1：1，超顺磁性微球）
地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备
将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基， 30℃、200 rpm、培养20 h获得种子液。
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉5.0克、葡萄糖10.0克、酵母粉10.0克、硫酸铵2.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁1.5克，加自来水定容至1000mL，pH7.0，121℃灭菌30min。
本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
发酵培养基组成：
玉米淀粉90.0克、葡萄糖60.0克、棉籽蛋白粉45.0克、酵母粉45.0克、硫酸铵6.0克、玉米浆12.0克、磷酸二氢钾4.5克、氯化钠7.5克、七水硫酸镁6.0克，加自来水定容至3L，pH6.8，121℃灭菌30min，5L自动发酵罐发酵培养。
发酵条件：装料量3L，种子培养20小时后接种，接种量为6%，罐温29 ℃、罐压0.05±0.01 Mpa、通气比1:1.2vvm，400 rpm搅拌，在培养至15小时后，加入粒径为30μm 的超顺纳米微球介质60g，培养周期96 h。
发酵结束后，磁性分离发酵液中的超顺磁性微球。在超顺磁性微球中加入360ml的4%氨水洗脱获得洗脱液，分别测定洗脱液与发酵液清液中的杆菌肽含量。计算杆菌肽的发酵单位为1068U/ml。具体结果见表1，计算方法见表2。
实施例6、10L罐发酵制备杆菌肽（棉籽蛋白粉、酵母粉3：2，超顺磁性微球）
地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备
将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，28℃、220 rpm、培养28 h获得种子液。
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉4.0克、葡萄糖15.0克、酵母粉15.0克、硫酸铵1.0克、氯化钠1.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.8，121℃灭菌30min。
本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
发酵培养基组成：
玉米淀粉200.0克、葡萄糖50.0克、棉籽蛋白粉150.0克、酵母粉100.0克、硫酸铵10.0克、玉米浆15.0克、磷酸二氢钾5.0克、氯化钠15.0克、七水硫酸镁5.0克，加自来水定容至5L，pH7.0，121℃灭菌30min，10L自动发酵罐发酵培养。
发酵条件：装料量5L，种子培养28小时后接种，接种量为8%，罐温30 ℃、罐压0.05±0.01 Mpa、通气量1:0.8vvm，300 rpm搅拌，在培养至20小时后，加入粒径为20μm 的超顺磁性微球100g，发酵周期96 h。不同发酵培养时间的菌体形态见图1和图2。
发酵结束后，磁性分离发酵液中的超顺磁性微球，在超顺磁性微球中加入600ml4%的氨水溶液洗脱吸附获得洗脱液，分别测定洗脱液与发酵液清液中的杆菌肽含量。计算杆菌肽发酵单位为1228U/ml。结果见表1，计算方法见表2。
对比例1、5L罐发酵制备杆菌肽（花生饼粉、酵母粉3：2）
地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备
将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，28℃、220 rpm、培养28 h获得种子液。
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉3.0克、葡萄糖20.0克、酵母粉20.0克、硫酸铵1.0克、氯化钠1.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.5，121℃灭菌30min。
本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
发酵培养基组成：
玉米淀粉120.0克、葡萄糖60.0克、花生饼粉90.0克、酵母粉60.0克、硫酸铵6.0克、玉米浆9.0克、磷酸二氢钾3.0克、氯化钠6.0克、七水硫酸镁3.0克，加自来水定容至3L，pH6.5，121℃灭菌30min。
发酵条件：装料量3L，种子培养28小时后接种，接种量为8%，罐温29 ℃、罐压0.05±0.01 Mpa、通气比1：1.0 vvm，300 rpm搅拌，发酵96 h，5L自动发酵罐发酵培养。
发酵结束后，经检测杆菌肽的发酵单位为550U/ml，结果见表1。
对比例2、 500mL摇瓶发酵制备杆菌肽（棉籽蛋白粉、酵母粉3：1，XAD18）
地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备
将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基， 28℃、240 rpm、培养24 h获得种子液。
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉3.0克、葡萄糖20.0克、酵母粉20.0克、硫酸铵1.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.5，121℃灭菌30min。
本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
发酵培养基组成：
玉米淀粉30.0克、葡萄糖20.0克、棉籽蛋白粉30.0克、酵母粉10.0克、硫酸铵3.0克、玉米浆5.0克、磷酸二氢钾1.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.5，121℃灭菌30min。
摇瓶发酵培养：500 ml装量三角瓶6个，每瓶装50ml培养基，种子培养24小时后接种，接种量为10%，温度28 ℃、转速220 rpm，发酵培养25小时后，每瓶加入大孔树脂XAD182g，发酵培养72 h。
发酵结束后，将6瓶发酵液合并，过滤，分离菌体与清液；菌体部分包含XAD18树脂加入80%乙醇150ml，浸泡2小时，过滤；分别测定浸泡液与清液中的杆菌肽含量。计算杆菌肽的发酵单位为723U/ml。结果见表1，计算方法见表2。
对比例3、5L罐发酵制备杆菌肽(棉籽蛋白粉、酵母粉1:1, XAD18)
地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备
将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，30℃、200rpm、培养20h获得种子液。
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉5.0克、葡萄糖10.0克、酵母粉10.0克、硫酸铵2.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁1.5克，加自来水定容至1000mL，pH7.0，121℃灭菌30min。
本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
发酵培养基组成：
玉米淀粉90.0克、葡萄糖60.0克、棉籽蛋白粉45.0克、酵母粉45.0克、硫酸铵6.0克、玉米浆12.0克、磷酸二氢钾4.5克、氯化钠7.5克、七水硫酸镁6.0克，加自来水定容至3L，pH6.8，121℃灭菌30min，5L自动发酵罐发酵培养。
发酵条件：装料量3L，种子培养20小时后接种，接种量为6%，罐温29 ℃、罐压0.05±0.01 Mpa、通气比1：1.2 vvm，400 rpm搅拌，在培养至15小时后，加入大孔树脂XAD18240g，培养周期96 h。
发酵结束后，取发酵液200ml，过滤，分离菌体与清液；菌体部分包含树脂加入80%乙醇100ml，浸泡2小时后过滤，分别测定浸泡液与清液中的杆菌肽含量。计算杆菌肽的发酵单位为895U/ml。具体结果见表1，计算方法见表2。
对比例4、5L罐发酵制备杆菌肽（花生饼粉、酵母粉3：2, 35℃）
地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备
将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，35℃、220 rpm、培养28 h获得种子液。
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉3.0克、葡萄糖20.0克、酵母粉20.0克、硫酸铵1.0克、氯化钠1.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.5，121℃灭菌30min。
本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
发酵培养基组成：
玉米淀粉120.0克、葡萄糖60.0克、花生饼粉90.0克、酵母粉60.0克、硫酸铵6.0克、玉米浆9.0克、磷酸二氢钾3.0克、氯化钠6.0克、七水硫酸镁3.0克，加自来水定容至3L，pH6.5，121℃灭菌30min。
发酵条件：装料量3L，种子培养28小时后接种，接种量为8%，罐温35 ℃、罐压0.05±0.01 Mpa、通气比1：1.0 vvm，300 rpm搅拌，发酵96 h，5L自动发酵罐发酵培养。
发酵结束后，经检测杆菌肽的发酵单位为604U/ml，结果见表1。
对比例5、5L罐发酵制备杆菌肽(棉籽蛋白粉、酵母粉1:1, 35℃)
地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备
将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，35℃、200rpm、培养20h获得种子液。
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉5.0克、葡萄糖10.0克、酵母粉10.0克、硫酸铵2.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁1.5克，加自来水定容至1000mL，pH7.0，121℃灭菌30min。
本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
发酵培养基组成：
玉米淀粉90.0克、葡萄糖60.0克、棉籽蛋白粉45.0克、酵母粉45.0克、硫酸铵6.0克、玉米浆12.0克、磷酸二氢钾4.5克、氯化钠7.5克、七水硫酸镁6.0克，加自来水定容至3L，pH6.8，121℃灭菌30min，5L自动发酵罐发酵培养。
发酵条件：装料量3L，种子培养20小时后接种，接种量为6%，罐温35 ℃、罐压0.05±0.01 Mpa、通气比1：1.2 vvm，400 rpm搅拌，发酵96 h。
发酵结束后，经检测杆菌肽的发酵单位为829U/ml，结果见表1。
将表1中结果比较计算可知：
在发酵温度低于30℃，有机氮源为棉籽蛋白粉、酵母粉时，比为花生饼粉、酵母粉时，即实施例1相比对比例1，可使发酵单位至少提高（651-550）/550=18%，且杂质F降到2%以下。
棉籽蛋白粉：酵母粉为3：2时，比其它比例最多可使发酵单位提高（847-651）/651=30%，杂质F最低（见实施例3相比实施例1）。
30℃以下条件下发酵与35℃发酵相比：对比例1相比对比例4，杂质F的量减少6.6%-2.9%=3.7%；实施例2相比对比例5，杂质F的量减少5.2%-1.8%=3.4%。
其它条件相同的情况下，添加超顺磁性微球相比不添加：实施例4相比实施例1，发酵单位提高（885-651）/651=36%；实施例5相比实施例2，发酵单位提高（1068-752）/752=42%；实施例6相比实施例3，发酵单位提高（1228-847）/847=45%。可见添加超顺磁性微球使发酵单位提高均在36%以上。
其它条件相同的情况下，添加大孔吸附树脂XAD18相比不添加：对比例2相比实施例1，发酵单位提高（723-651）/651=11%；对比例3相比实施例2，发酵单位提高（895-752）/752=19%；可见添加大孔树脂使发酵单位提高均在11%以上。
其它条件相同的情况下，添加超顺磁性微球相比添加大孔吸附树脂XAD18：实施例4相比对比例2，发酵单位提高（885-723）/723=22%；实施例5相比对比例3，发酵单位提高（1068-895）/895=19%；可见添加超顺磁性微球比添加大孔树脂使发酵单位提高在19%以上。
实施例6相比对比例1，即综合优化后可使发酵单位提高（1228-550）/550=123%。
E=（A*B+C*D）/B

Claims (6)

1.一种发酵生产杆菌肽的方法，包括以下步骤：
a、制备地衣芽孢杆菌菌株的种子液
将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，28-30℃、200-240 rpm，培养20-28 h获得种子液；
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉3.0-5.0克、葡萄糖10.0-20.0克、酵母粉10.0-20.0克、硫酸铵1.0-2.0克、氯化钠1.0-2.0克、七水硫酸镁1.0-1.5克，加水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min；
b、制备地衣芽孢杆菌菌株的发酵液
将上述种子液以体积百分比6-10%的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发酵，发酵时间72-96 h，发酵温度28 -30 ℃，得到发酵液；
其中所述发酵培养基按以下方法制得：玉米淀粉30.0-40.0克、葡萄糖10.0-20.0克、棉籽蛋白粉15.0-30.0克、酵母粉10.0-20.0克、硫酸铵2.0-3.0克、玉米浆3.0-5.0克、磷酸二氢钾1.0-1.5克、氯化钠2.0-3.0克、七水硫酸镁1.0-2.0克，加水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b中所述棉籽蛋白粉和酵母粉比例为3:1至1:1。
3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤b中所述棉籽蛋白粉和酵母粉比例为3：2。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其中步骤b发酵15-25小时之间添加经过灭菌后的超顺磁性微球，所述超顺磁性微球的粒径为10-30μm，粒径分布为单分散，孔径为20-30nm，表面的功能基团为羧基基团，羧基含量为200μmol/g。
5.根据权利要求1所述的方法，步骤b中所述发酵压力为0.05±0.01Mpa、搅拌速度为300-400rpm，通气比为1:0.8-1.2vvm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每升发酵液添加10-20g所述超顺磁性微球。
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