CN107904198A - 一种高产杆菌肽a的地衣芽孢杆菌基因改组菌株及应用 - Google Patents

一种高产杆菌肽a的地衣芽孢杆菌基因改组菌株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株及应用。本发明采取了育种新技术中的等离子体诱变技术，与传统物理、化学诱变方法相结合，并采用基因组改组技术，效果明显，产量提高显著。本发明提供的用于杆菌肽A高效发酵生产的基因改组菌株F2‑X1，降低了以地衣芽孢杆菌为发酵菌株，生产杆菌肽的成本。而且产量提高明显，经所述条件发酵后，杆菌肽A产量可达到1.7g/L,适用于大规模发酵生产杆菌肽A。本发明提供的以HPLC检测方法简单准确，是用于快速准确检测杆菌肽A产量。

Description

一种高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株及应用
技术领域
本发明涉及一种高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株及应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
杆菌肽是由是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌产生的一种对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌有广泛抑制作用的环肽。根据氨基酸组成和位置的不同，现已发现15种同系物，其中杆菌肽A，分子式为C66H103N17O16S，是其中主要的活性物质，生物活性也最强。由于杆菌肽高效、无残留及无毒副作用、并产生耐药性及交叉耐药性、排泄快等优点，广泛应用于饲料农业等。
由于自然筛选到的野生菌活力低，营养条件苛刻，产能较低，通过诱变及基因改组后，能有效提高微生物产能。
目前，除了传统的理化诱变技术外，近几年发展起来一种新的生物诱变育种技术：常压室温等离子体(ARTP)技术，由裸露金属电极结构的，大气压射频辉光放电等离子体发生器产生的活性粒子，如电子、离子、光子、处于激发态的中性粒子及一些自由基能作用于细胞的核酸或蛋白质，从而引起细胞基因突变或结构及通透性改变。与传统诱变技术相比，该技术操作简便，条件温和，适应范围广，而且诱变效果与其他诱变方法相结合能大大提高突变效果。ARTP技术虽然证明能有效引起基因突变，但是引起基因突变的机制还不清楚，产生的各种激发离子比例无法控制。
发明内容
技术问题
本发明为解决上述现有技术中所存在的技术缺陷，提供了一种高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株，目的在于，提高菌株发酵水平的同时降低发酵能耗和生产成本。
技术方案
为实现上述发明目的，采取的技术方案为：
一种高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株，该菌株F2-X1保藏号为CGMCC No.14830。
所述高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株的培养基为LB培养基。
所述高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株可以在生产杆菌肽A方面得到应用。包括以下步骤：
(1)斜面培养
地衣芽孢杆菌F2-X1在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，37℃培养48h,其中所述的固体斜面培养基为LB培养基；
(2)种子培养
将步骤(1)所培养的地衣芽孢杆菌在无菌条件下接种于液体种子培养基，37℃，180rpm，培养12h；其中所述的种子培养基为液体LB培养基；
(3)发酵培养
将步骤(2)所述种子液在无菌条件下接种于培养基中，37℃，180rpm，培养48h；其中所述发酵培养基为LB液体培养基。
其中杆菌肽A含量检测包括:将步骤(3)所得发酵液离心除菌体，加入两倍体积无水乙醇，离心过膜后以HPLC检测杆菌肽A产量。
杆菌肽A的HPLC检测方法为,以A：水+0.1％三氟乙酸；B：乙腈+0.1％三氟乙酸，为流动相进行梯度洗脱，其中，A相有30％线性增长为40％，时间为20min,检测波长为220nm，柱温35℃。
有益效果
本发明提供的LB培养基及其与之相适应用于杆菌肽A高效发酵生产的基因改组菌株F2-X1，大大降低了以地衣芽孢杆菌为发酵菌株，生产杆菌肽的成本。而且产量提高明显，经所述条件发酵后，杆菌肽A产量可达到1.7g/L,适用于大规模发酵生产杆菌肽A。本发明提供的以HPLC检测方法简单准确，是用于快速准确检测杆菌肽A产量。
附图说明
图1杆菌肽A标准曲线
图2杆菌肽A液相检测图
图3杆菌肽A检测结果
生物保藏
菌株F2-X1，分类命名为：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),于2017年10月 20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏号为:CGMCC No.14830。
具体实施方式：
下面结合菌体实施例对本发明做具体说明，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
1.杆菌肽A高效液相检测方法
HPLC条件：以A：水+0.1％三氟乙酸；B：乙腈+0.1％三氟乙酸，为流动相进行梯度洗脱，洗脱条件：A相由30％线性增长为40％，时间为20min。进样量20μL，检测波长为 220nm，柱温35℃。
精密配制浓度为0.20、0.40、0.60、0.80、0.40、0.20g/L杆菌肽标(购自德国Dr.Ehrenstorfer 公司)准溶液(杆菌肽A含量47.1％，)，HPLC检测并计算峰面积，每个浓度检测3次。以杆菌肽A峰面积平均值为纵坐标，杆菌肽A浓度为横坐标绘制标准曲线。得到线性回归方程为y＝23.45x-1.04，线性范围为0.094-0.94g/L，相关性系数为0.9992。标准曲线及检测结果见图1和图2。
2.地衣芽孢杆菌菌株的诱变，以实验室保藏地衣芽孢杆菌为初始菌株。
(1)紫外诱变：地衣芽孢杆菌菌株的诱变，实验原始菌种为地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis)，于实验室筛选保藏。原始地衣芽孢杆菌菌株接种于LB培养基，培养8h至对数中期，离心得菌体，无菌蒸馏水重悬，调节菌体浓度至OD600值为1.5，取5ml 重悬菌液于直径5cm灭菌玻璃平皿中，放入灭菌的磁力搅拌棒，紫外灯下30cm照射180s，时间到关闭搅拌器，取1ml处理后菌液梯度稀释至10-1和10-2，涂布于LB固体平板上，37℃培养24h。挑取较大单菌落，接种于液体LB培养基中，37℃发酵48h，琼脂扩散法初筛，具体操作为：选择藤黄微球菌为指示菌，将藤黄微球菌液体种子液按10％的接种量接人已经融化好的LB固体培养基中，迅速摇匀，倒入水平平板上面，待其凝固，用灭菌后的5mm 打孔器打孔，取50μL离心发酵上清液加入孔内，于37℃培养24h后观察、比较抑菌圈直径大小，取20株抑菌圈直径大者为初筛菌株。HPLC法检测杆菌肽A产量复筛，检测结果见图3。选取产量最高的两株.
(2)亚硝酸胍诱变：菌株UV-2接种于LB培养基，培养8h至对数中期，离心得菌体，无菌蒸馏水重悬，调节菌体浓度至OD600值为1.5。重悬菌液加入亚硝酸胍母液，使终浓度调节为150mg/ml，室温处理10min，5000rpm离心10min终止反应，以无菌蒸馏水梯度稀释至10-1和10-2，涂布于LB培养基，37℃培养24h。挑取较大单菌落，接种于液体LB培养基中，37℃发酵48h，琼脂扩散法初筛，HPLC法检测杆菌肽A产量复筛，具体操作见紫外诱变。选取产量最高的两株得M-1和M-2.(3)ARTP诱变：菌株M-2接种于LB培养基，培养8h至对数中期，离心得菌体，无菌蒸馏水重悬，调节菌体浓度至OD600值为1.5 取10ul涂于铁片上，不致重叠效应影响诱变处理的均匀性。处理参数为：高纯氦气(99.999％) 流量10SLM，射频功率200W，处理时间210s，距放射源距离5mm。处理后，以无菌生理盐水洗下铁片上菌体，梯度稀释至10-1和10-2，涂布于固体LB培养基，37℃培养24h。挑取较大单菌落，接种于液体LB培养基中，37℃发酵48h，琼脂扩散法初筛，HPLC法检测杆菌肽A产量复筛，具体操作见紫外诱变。选取产量最高的两株。
3.菌株诱变后的原生质体制备：A-2菌株接种于液体LB培养基中，37℃培养8h，取5ml发酵液，8000rpm，10min离心得菌体，无菌蒸馏水洗涤两次，最终悬浮于5ml原生质体稳定液中，加入溶菌酶，使终浓度为5mg/ml，37℃处理5min。结束后，500rpm，5min 收集原生质体，原生质体稳定液洗涤两次，最终重悬于1ml原生质体稳定液中，得原生质体悬液。
4 原生质体灭活：将制得原生质体悬液平均分为两份，一份80℃水浴80min，进行热灭活；另一份放入到灭菌的磁力搅拌器中，紫外灯25cm下磁力搅拌照射20min，进行紫外灭活。
5 原生质体融合：取热灭活与紫外灭活的原生质体等体积混合均匀，加入9倍体积40％PEG6000，室温保存10min进行融合，融合结束后，迅速放入离心机中，5000rpm，5min 收集原生质体，并用稳定液洗涤两次，重悬后得融合子，适当稀释，涂布于原生质体再生培养基上，37℃培养48h得融合子单菌落。
6 基因改组菌株的筛选：挑取融合后较大单菌落，接种于液体LB培养基中，37℃发酵48h，琼脂扩散法初筛，HPLC法检测杆菌肽A产量复筛，具体操作见紫外诱变。选取高产菌株。
7 遗传稳定性菌株筛选：取多轮改组后菌株传代10次，验证遗传稳定性，获得遗传稳定的多轮融合高产菌株F2-X1。
8 发酵验证产量：
(1)斜面培养
地衣芽孢杆菌X-1在无菌条件下接种于斜面培养基上，37℃培养48h。
其中所述的固体斜面培养基为LB培养基。
(2)种子培养
将步骤(1)所培养的地衣芽孢杆菌在无菌条件下接种于液体种子培养基，37℃，180rpm，培养12h。
其中所述的种子培养基为液体LB培养基。
(3)发酵培养
将步骤2所述种子液在无菌条件下接种于培养基中，37℃，180rpm，培养48h。
其中所述发酵培养基为LB液体培养基。
(4)杆菌肽A含量检测
将步骤3所得发酵液离心除菌体，加入两倍体积无水乙醇，离心过膜后以HPLC检测杆菌肽A产量。经所述条件发酵后，杆菌肽A产量可达到1.7g/L。现有文献报道杆菌肽A 产量在1g/L左右。

Claims (6)

1.一种高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株，该菌株F2-X1保藏号为CGMCCNo.14830。
2.权利要求1所述高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株的培养基为LB培养基。
3.权利要求1所述高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株F2-X1的应用。
4.权利要求1所述高产杆菌肽A的地衣芽孢杆菌基因改组菌株F2-X1在生产杆菌肽A方面的应用。
5.根据权利要求3或4所述的应用，包括以下步骤：
(1)斜面培养
地衣芽孢杆菌F2-X1在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，37℃培养48h,其中所述的固体斜面培养基为LB培养基；
(2)种子培养
将步骤(1)所培养的地衣芽孢杆菌在无菌条件下接种于液体种子培养基，37℃，180rpm，培养12h；其中所述的种子培养基为液体LB培养基；
(3)发酵培养
将步骤(2)所述种子液在无菌条件下接种于培养基中，37℃，180rpm，培养48h；其中所述发酵培养基为LB液体培养基。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于,杆菌肽A含量检测包括:
将步骤(3)所得发酵液离心除菌体，加入两倍体积无水乙醇，离心过膜后以HPLC检测杆菌肽A产量,杆菌肽A的HPLC检测方法为：
以A：水+0.1％三氟乙酸；B：乙腈+0.1％三氟乙酸，为流动相进行梯度洗脱，其中，A相由30％线性增长为40％，时间为20min,检测波长为220nm，柱温35℃。
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