CN105200078A - 一种黑曲霉基因敲除方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黑曲霉基因敲除方法，属于生物技术领域。本发明将剪切元件和基因敲除表达框同时整合到黑曲霉基因组中，后续利用诱导型启动子诱导抗性基因的消除，从而只需要对黑曲霉进行一次转化，就能消除抗性。本发明方法可以用于连续敲除多个基因。本发明为代谢改造黑曲霉提供了有效的方法和新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及一种黑曲霉基因敲除方法，属于生物技术领域。
背景技术
黑曲霉是一种在自然界广泛存在且表型多样的丝状真菌，在生物技术工业领域中是最重要的工业生产菌之一，作为生物反应器主要用于生产降解多糖的酶(淀粉酶类、果胶酶和木聚糖酶)和有机酸(如柠檬酸)。同时，作为基因工程宿主菌生产蛋白和多肽类产品，黑曲霉和大肠杆菌以及酵母相比，具有糖基化位点更类似于哺乳动物，蛋白分泌系统强大，培养基更廉价的优势。通过分子改造对黑曲霉的代谢进行调控来实现目的产物的积累已经有成功的报道。
目前，对黑曲霉进行基因敲除时，使用的抗性筛选标记包括两类：营养缺陷型互补基因(尿嘧啶营养缺陷型基因pyrG)和抗性基因，抗性药物包括潮霉素(Hygromycin)和博来霉素(Bleomycin)等。其中，对于野生型菌株而言，仅潮霉素对其抑制作用较明显。潮霉素可以与肽链延长因子EF-2作用，从而抑制肽链的合成。有限的抗性标记限制了对黑曲霉进行多步遗传操作的可能性。利用营养缺陷型互补基因筛选阳性克隆时，需对营养缺陷型菌株利用pyrG进行正反双向筛选来进行多轮遗传操作，但对于野生型菌株而言，5-氟乳清酸的抑菌效果并不明显，而且需要首先敲除pyrG基因才能得到营养缺陷型菌株。目前，利用潮霉素抗性基因筛选阳性克隆时，是通过瞬时表达CRE蛋白以及转化商品化的CRE酶，以将loxP位点之间的潮霉素抗性敲除，其缺陷是基因敲除和消除抗性分别需要对黑曲霉进行转化，每次消除抗性都需要转化黑曲霉，而黑曲霉的转化费时费力。
本发明只需要对黑曲霉进行一次转化，将剪切元件和基因敲除表达框同时整合到黑曲霉基因组中，后续利用诱导型启动子诱导抗性的消除，每次消除抗性都不再涉及黑曲霉的转化，为代谢改造黑曲霉提供了有效的方法和新的思路。
发明内容
本发明的目的是提供一种黑曲霉基因敲除方法，主要包括剪切元件和基因敲除表达框的构建，以及抗性消除；所述剪切原件用于诱导表达CRE酶以消除基因敲除表达框中的抗性基因。
所述方法包括以下步骤：
1)构建剪切元件和基因敲除表达框，所述剪切元件主要包括以下核心元件：来源于黑曲霉的Xln启动子、CRE重组酶基因和trp终止子；所述基因敲除表达框主要包括以下核心元件：靶基因上游同源臂、loxP位点、gpdA启动子、潮霉素抗性基因hph、trp终止子、loxP位点、靶基因下游同源臂；
2)将剪切元件和基因敲除表达框转化黑曲霉，得到靶基因敲除的阳性克隆；
3)将阳性克隆在含有木糖的培养基上继代培养，诱导CRE重组酶基因表达，以消除潮霉素抗性标记。
在本发明的一种实施方式中，所述Xln启动子的序列如SEQIDNO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述CRE重组酶基因的序列如SEQIDNO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述trp终止子的序列如SEQIDNO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述loxP位点的序列如SEQIDNO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述gpdA启动子的序列如SEQIDNO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述潮霉素抗性基因hph的序列如SEQIDNO.1所示。
本发明的一种实施方式，还包括将消除了潮霉素抗性标记的阳性克隆进行生孢培养，对孢子进行潮霉素抗性验证。
在本发明的一种实施方式中，所述靶基因是oah基因，编码草酰乙酸水解酶基因。
在本发明的一种实施方式中，步骤1)中，将CRE重组酶基因和trp终止子通过融合PCR扩增得到Cre-Ttrp片段，将片段反向连接到pMD19上，得到pMD-Cre-Ttrp载体，扩增启动子Xln使启动子两端含有EcoRI和KpnI位点，利用EcoRI和KpnI双酶切Xln启动子和pMD-Cre-Ttrp，回收片段后连接，得到pXCT载体，再用EcoRI和HindIII双酶切pXCT得到剪切元件。
在本发明的一种实施方式中，步骤2)将剪切元件和基因敲除表达框经PEG介导法转入黑曲霉原生质体中，在潮霉素抗性的高渗软琼脂ME平板上培养得到阳性克隆，再将经培养4-7天的阳性克隆转移至含200mg/L潮霉素的平板上进一步培养得到阳性克隆。
在本发明的一种实施方式中，木糖培养基：1％木糖，0.5％KCl，0.5％MgSO4，1.5％KH2PO4，1mg/LFeSO4，1mg/LZnCl2，1mg/LCuSO4，70mMNaNO3，pH8.0。
本发明提供了一种对黑曲霉进行基因敲除的方法，将剪切元件和基因敲除表达框同时整合到黑曲霉基因组中，后续利用诱导型启动子诱导抗性基因的消除，从而只需要对黑曲霉进行一次转化，就能消除抗性。本发明方法可以用于连续敲除多个基因。应用本发明方法，我们成功敲除了黑曲霉基因中的oah基因，并实现了潮霉素抗性的消除，抗性消除后的转化子遗传稳定，形态正常，柠檬酸产量不受影响。
附图说明
图1所示为剪切元件和基因敲除表达框的结构以及作用方式。
图2所示为黑曲霉的oah基因敲除的PCR验证。泳道M为分子量标记，ck为野生型黑曲霉对照，A图为trp和同源臂的扩增，基因敲除菌株可以扩增出2656bp片段，基因未敲除的菌株扩增不出相应片段。B图为oah基因的扩增，基因敲除菌株扩增不出相应片段，而基因未敲除的菌株可以扩增出1658bp片段。图中泳道1、2、3、6、7、8、9、11、13、14、15、17和20为oah基因敲除菌株，而泳道4、5、10、12、16、18和19为oah基因没有敲除的菌株。
图3所示为黑曲霉产酸能力的验证。
具体实施方式
实施例1黑曲霉基因组DNA的提取
将黑曲霉孢子接种到ME液体培养基(3％麦芽提取物，0.5％胰蛋白胨)中，35℃250r/min培养48h，用mirocloth收集菌球，用无菌超纯水洗涤3遍，滤干水分，迅速液氮冷冻。用液氮研磨的方法将组织充分磨碎，采用QIAGEN公司DNeasyPlantMiniKit提取丝状真菌基因组。
实施例2剪切元件和基因敲除表达框的构建
1)基因敲除表达框的构建：
利用引物oahB5-F(GAGCTCGTTTAAACTACCAAGGCCAGGCCGCAA)和oahB5-R(GCGGCCGCCCGCCAGCAACCAATATTCAT)从黑曲霉基因组中扩增oah基因上游2200bp的片段oahB5，片段的5’端含有SacI和PmeI位点，片段的3’端含有NotI位点；利用引物oahB3-F(ACTAGTACAGAACACCCTGATCGACAGT)和oahB3-R(AAGCTTCCTGCTACAAATACATTGACCTC)从黑曲霉基因组中扩增oah基因下游2200bp的片段oahB3，片段两端含有SpeI和HindIII位点。
利用引物PgpdB-F
(GCGGCCGCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCCTTGTATCTCTACACACAGGCTCA)和hphB-R(ACTAGTCCGCGGTCGGCATCTACT)从pAN7-1载体上扩增完整的gpdA启动子和hph半部分片段，命名为hphB，hphB片段两端含有NotI位点和SpeI位点，片段内部含有EcoRI位点，在gpdA启动子5’端带有loxP位点，loxP位点通过PgpdB-F引物来引入；利用引物hphB-F(TCGTTGCGTCAGTCCAACATTT)和TtrpB-R(ACTAGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTGCAGGTCGAGTGGAGATGTG)从pAN7-1上扩增hph后半部分和trp终止子片段，称为trpB片段，片段3’端含有SpeI位点，内部含有EcoRI位点，在trp终止子3’端带有loxP位点，loxP位点通过TtrpB-R引物来引入。hphB和trpB分别连接到pMD19上。
hphB片段经EcoRI和SpeI酶切，去掉800bp的片段，回收5200bp的大片段(带有pMD19载体)，与trpB片段经EcoRI和SpeI酶切回收的1600bp的片段进行连接，得到pMD-hph-lox载体，载体上含有loxP-PgpdA-hph-Ttrp-loxP，两端为NotI和SpeI位点。
oahB3片段经SpeI和HindIII酶切，oahB5片段经SacI和NotI酶切，pMD-hph-lox载体经NotI和SpeI酶切，依次连接到pBluescriptIISK(+)载体上，得到pSK-oah-lox载体。利用PmeI和HindIII双酶切pSK-oah-lox得到含有loxP位点的oah敲除框。
2)剪切元件的构建：
利用引物Cre-F(ATGTCCAATTTACTGACCGTACA)和Cre-R-Ttrp(ATGATTTCAGTAACGTTAAGTGGATCCTAATCGCCATCTTCCAGCAGGC)，以pSH47为模板扩增得到CRE重组酶基因；利用引物Cre-F-Ttrp(GCCTGCTGGAAGATGGCGATTAGGATCCACTTAACGTTACTGAAATCAT)和Ttrp-R(TCGAGTGGAGATGTGGAGTGGG)，以pAN7-1为模板扩增得到Trp终止子。通过融合PCR扩增得到Cre-Ttrp片段，将片段反向连接到pMD19上，得到pMD-Cre-Ttrp载体。利用引物Xln-F(GAATTCAGCTTTATATGATGAGATGGATTTGC)和Xln-R(GGTACCGATTGTTGATTGATGATATAGCTTGG)从黑曲霉基因组中扩增得到Xln启动子，启动子两端含有EcoRI和KpnI位点。用EcoRI和KpnI双酶切Xln启动子和pMD-Cre-Ttrp，回收片段后连接，得到pXCT载体。用EcoRI和HindIII双酶切pXCT得到作用于loxP位点的Cre表达框。
实施例3黑曲霉原生质体的制备和转化
按3×105/ml的浓度接种孢子至ME液体培养基，30℃200r/min培养过夜。用mirocloth收集菌球，并用无菌水清洗菌球。称取一定量的溶壁酶，并用渗透压稳定剂KMC溶解，用无菌滤膜过滤除菌。称取一定量菌球，加入到酶解液中，37℃100r/min震荡培养约3h直至菌丝完全消化为原生质体，4℃1000rpm离心10min，弃上清，加入相同体积预冷的STC，4℃1000rpm离心10min，弃上清，洗涤2次，加入100μLSTC，混匀。100μL黑曲霉原生质体中加入10μL线性化核酸片段和330μLPEG缓冲液，冰上放置20min，加入2mLPEG，室温放置10min，依次加入4mLSTC和4mL于48℃预热的上层培养基，铺板于含有150mg/L潮霉素的下层培养基上。平板在35℃倒置培养4-7天，直至出现菌落，挑取单菌落继代。每个菌落进行3次单孢子继代。
实施例4黑曲霉基因敲除菌株的鉴定
利用引物P1(TGTCAACTGAAATCTAACACCCA)、P2(CTCAAACAAGCCTCTTTCTCTCC)鉴定oah基因的敲除，片段大小为1658bp，利用引物P3(CACAGGTACACTTGTTTAGAGGTAAT)和P4(TCCACCCGAAGGTCACTGATT)鉴定抗性片段插入的位置，片段大小为2656bp。
实施例5黑曲霉抗性基因的消除
阳性克隆在木糖固体培养基上进行继代，35℃培养四天，挑取菌落边缘菌丝体至新的木糖固体培养基，转接3次。
刮取菌丝体至ME培养基上生孢，35℃培养5-7天，用0.05％Tween刮取孢子并稀释，按照每个平板100个孢子的量涂布于ME平板，35℃培养5-7天至单菌落长出孢子。将孢子同时点板于含潮霉素和不含潮霉素的ME平板，筛选潮霉素消除的转化子。消除抗性的转化子进行产量的验证。
实施例6黑曲霉转化子产量的验证
黑曲霉接种于ME培养基上35℃生孢培养5-7天，刮取孢子，以3×105/mL的接种量接种于种子培养基，35℃250r/min培养24h，以1/10接种量转接发酵培养基，35℃250r/min发酵110h。发酵液离心去除菌体，稀释10倍，用滤膜过滤后用HPLC检测柠檬酸含量。
柠檬酸的含量用高效液相色谱(HPLC)进行检测。仪器：Agilent1200高效液相色谱仪(配紫外可见检测器检测器和工作站)；色谱条件：AmethystC18-H色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相为0.01％磷酸溶液，流量为0.8mL/min，进样量为10μL，柱温为30℃，210nm波长紫外光检测。
结果表明成功敲除了黑曲霉基因中的oah基因，并实现了潮霉素抗性的消除，抗性消除后的转化子遗传稳定，形态正常，柠檬酸产量不受影响。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (6)
1.一种黑曲霉基因敲除方法，其特征在于，主要包括剪切元件和基因敲除表达框的构建，以及抗性消除；所述剪切原件用于诱导表达CRE酶以消除基因敲除表达框中的抗性基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)构建剪切元件和基因敲除表达框，所述剪切元件主要包括以下核心元件：来源于黑曲霉的Xln启动子、CRE重组酶基因和trp终止子；所述基因敲除表达框主要包括以下核心元件：靶基因上游同源臂、loxP位点、gpdA启动子、潮霉素抗性基因hph、trp终止子、loxP位点、靶基因下游同源臂；
2)将剪切元件和基因敲除表达框转化黑曲霉，得到靶基因敲除的阳性克隆；
3)将阳性克隆在木糖培养基上继代培养，诱导CRE重组酶基因表达，以消除潮霉素抗性标记。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述靶基因是oah基因，编码草酰乙酸水解酶基因。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中，将CRE重组酶基因和trp终止子通过融合PCR扩增得到Cre-Ttrp片段，将片段反向连接到pMD19上，得到pMD-Cre-Ttrp载体，扩增启动子Xln使启动子两端含有EcoRI和KpnI位点，利用EcoRI和KpnI双酶切Xln启动子和pMD-Cre-Ttrp，回收片段后连接，得到pXCT载体，再用EcoRI和HindIII双酶切pXCT得到剪切元件。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)将剪切元件和基因敲除表达框经PEG介导法转入黑曲霉原生质体中，在潮霉素抗性的高渗软琼脂ME平板上培养得到阳性克隆，再将经培养4-7天的阳性克隆转移至含200mg/L潮霉素的平板上进一步培养得到阳性克隆。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，木糖培养基：1％木糖，0.5％KCl，0.5％MgSO4，1.5％KH2PO4，1mg/LFeSO4，1mg/LZnCl2，1mg/LCuSO4，70mMNaNO3，pH8.0。
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