CN108546708A

CN108546708A - 一种丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法

Info

Publication number: CN108546708A
Application number: CN201810351803.XA
Authority: CN
Inventors: 谢鑫; 王勇; 蒋君梅
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2018-04-19
Filing date: 2018-04-19
Publication date: 2018-09-18

Abstract

本发明公开了一种丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法，包括以下步骤：(1)构建HPH‑GFP融合表达载体，并克隆出HPH‑GFP片段；(2)分别用带有接头序列的引物克隆待敲除基因的上、下游片段；(3)克隆待敲除基因上、下游片段与HPH‑GFP组成嵌合体片段；(4)用嵌合体片段转化真菌原生质体，得转化子备用；(5)将转化子置于含有潮霉素的培养基中进行培养，对正常生长出来的菌丝，用荧光显微镜观察并选择有GFP荧光的转化子，即为敲除突变体；本发明用以解决现有技术存在的基因敲除筛选成功率低，假阳性率高等技术问题。

Description

一种丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法

技术领域

本发明涉及一种丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法，属于基因工程领域。

背景技术

真菌在自然界广泛分布，与人类生活的各个方面都有这密不可分的联系。因此对真菌的研究变得尤为重要，其中对真菌的基因功能进行研究是研究的热点之一。通过对真菌DNA进行遗传改造是基因功能研究的重要技术，目前，对丝状真菌进行遗传改造的方法主要有：(1)PEG介导的原生质体转化；(2)农杆菌介导的转化(A.tumeafeiensmediatedtransformation,ATMT)；(3)电击转化；(4)基因枪转化；等方法。

基因敲除是研究基因功能的手段之一，利用同源重组原理对感兴趣的基因进行敲除，通过观察敲除突变体的表型变化从而明确该基因的功能，最终实现改良或防治真菌的目的。目前，常用的基因敲除的方法有：(1)同源重组基因敲除，即利用基因两侧的同源臂在位点特异性DNA重组酶的作用下进行基因敲除是最流行的方法；(2)基因沉默(RNAsilence)诱导的基因敲除，通过构建小的双链RNA片段干扰基因的表达，并且这种干扰效应会持续“传递”到子代细胞，从而造成基因敲除；(3)转座子和逆转录转座子标签法，转座子在基因组中会发生“跳跃”，从而能造成染色体的畸变或基因的缺失。

以上的基因敲除方法最终都需要筛选标记对敲除突变体进行筛选，丝状真菌基因敲除时常用的筛选标记有潮霉素、新霉素和G418等，筛选成功率不到30％，存在着筛选效率低，假阳性率高等缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法，以解决现有技术存在的基因敲除筛选成功率低，假阳性率高等技术问题。

本发明的技术方案是：一种丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法，包括以下步骤：

(1)构建HPH-GFP融合表达载体，并克隆出HPH-GFP片段；

(2)分别用带有接头序列的引物克隆待敲除基因的上、下游片段；

(3)克隆待敲除基因上、下游片段与HPH-GFP组成嵌合体片段；

(4)用嵌合体片段转化真菌原生质体，得转化子备用；

(5)将转化子置于含有潮霉素的培养基中进行培养，对正常生长出来的菌丝，用荧光显微镜观察并选择有GFP荧光的转化子，即为敲除突变体。

前述构建HPH-GFP融合表达载体的方法是：分别克隆潮霉素基因HPH和GFP基因，获得潮霉素HPH片段和GFP片段，再用PCR将HPH和GFP基因融合到表达载体，克隆得到HPH-GFP片段，即HPH-GFP融合表达载体。

在步骤(3)中，以步骤(1)得到的HPH-GFP片段和步骤(2)得到的待敲除基因上下游片段为模板，扩增得到两个上下游片段-HPH-GFP的片段，1：1混合两个片段，得嵌合体片段备用。

本发明的有益效果是：本发明利用同源重组的原理，采用两步法PCR进行基因敲除，并利用潮霉素和绿色荧光蛋白(GFP)同时进行转化子的筛选，大大提高了筛选效率。据申请人试验，经过潮霉素和GFP双重筛选，可将真菌转化子筛选效率从现有的20％提高到50％以上，这极大的减少了工作量，同时在其他真菌中也可借鉴此方法进行基因敲除。

附图说明

图1是MoNACα转化子在潮霉素培养基上的生长情况；

图2是有GFP荧光的MoNACα阳性转化子；

图3是PCR检验MoNACα转化子的图。

具体实施方式

下面结合附图及具体的实施例对发明进行进一步介绍：

以稻瘟菌NACα基因的敲除及筛选为例：

从稻瘟菌数据库(http://fungidb.org/fungidb/)中搜索NAC基因，发现一个NACα基因(MGG_02660)，命名为MoNACα，下载其CDS以及基因组序列，其中稻瘟菌MoNACαCDS的核苷酸系列如SEQ ID NO：1所示，稻瘟菌MoNACα基因组核苷酸系列如SEQ ID NO：2所示。

1、构建HPH-GFP融合表达载体，并克隆出HPH-GFP片段

分别用TRP-F/HYG-GFP-R和HYG-GFP-F/GFP-T引物对从pBHt2载体和PYBA1132载体扩增带有启动子TrpC的潮霉素HPH片段(1352bp，其核苷酸系列如SEQ ID NO：19所示)和GFP片段(720bp，其核苷酸系列如SEQ ID NO：20所示)。

其中，TRP-F引物核苷酸系列如SEQ ID NO：3所示，即：GCTGGAGCTA GTGGAGGTCAA。HYG-GFP-R引物核苷酸系列如SEQ ID NO：4所示，即：CTCGCCCTTGCTCACCATTTCCTTTGCCCTCGGACGAGT。HYG-GFP-F引物核苷酸系列如SEQ ID NO：5所示，即：ACTCGTCCGAGGGCAAAGGAAAT GGTGAGCAAGGGCGAG。GFP-T引物核苷酸系列如SEQ IDNO：6所示，即：TCACTTGTACAGCTCGTCCAT。

以前述产物HPH和GFP片段为模板，用TRP-F/GFP-T引物扩增，获得融合的HPH-GFP片段，并将该片段插入全式金pEASY-Blunt克隆载体，DNA测序鉴定是否存在突变，若有，则用M13-F/M13-R引物从克隆载体上克隆出HPH-GFP片段，备用。其中，M13-F引物核苷酸系列如SEQ ID NO：7所示，即：TGTAAAACGACGGCCAGT。M13-R引物核苷酸系列如SEQ ID NO：8所示，即：CAGGAAACAGCTATGACC。

2、分别用带有接头序列的引物克隆待敲除基因的上、下游片段

进行第一轮PCR分别扩增MoNACα基因上下游片段。用常规方法根据待敲除基因上下游片段的特性设计得到扩增引物AF/AR和BF/BR。

在AR引物和BF引物5’端分别加入ACTGGCCGTCGTTTTACA和GGTCATAGCTGTTTCCTG接头序列。在稻瘟菌NACα基因的敲除中，分别用引物MGG_02660_AF/MGG_02660_AR和MGG_02660_BF/MGG_02660_BR从稻瘟菌基因组中扩增基因上游片段(595bp)和下游片段(550bp)。其中，MGG_02660_AF引物核苷酸系列如SEQ ID NO：9所示，即：TATCCAATCGGCATTAGGG。MGG_02660_AR引物核苷酸系列如SEQ ID NO：10所示，即：ACTGGCCGTCGTTTTACATTTCGCGGGTGGTCAA。MGG_02660_BF引物核苷酸系列如SEQ ID NO：11所示，即：GGTCATAGCT GTTTCCTGACACTCGGTCTTGGTTTATTG。MGG_02660_BR引物核苷酸系列如SEQ ID NO：12所示，即：TGAGGACGGAGCGGTAG。

3、克隆待敲除基因上、下游片段与HPH-GFP组成嵌合体片段

进行第二轮PCR扩增形成MoNACα基因上下游片段与HPH-GFP的嵌合体。以引物AF/GFP-R和HY-F/BR扩增模板，得到两个上下游片段-HPH-GFP的片段，1：1混合两个片段，备用。其中，GFP-R引物核苷酸系列如SEQ ID NO：13所示，即：TCGCCGGACACGCTGAA。HY-F引物核苷酸系列如SEQ ID NO：14所示，即：GCCGTGGTTGGCTTGTAT。

4、用嵌合体片段转化真菌原生质体，得转化子备用

1)原生质体制备：将新鲜的固体培养基上的菌丝切成小块(用手术刀背面轻轻刮)，置于液体完全培养基中(加入链霉素)，28℃120rpm培养3天左右；用无菌漏斗及滤纸过滤收集菌丝，用无菌水及0.7MNaCL溶液洗涤菌丝数次以除去残余的培养基；将干燥好的菌丝转移至溶壁酶溶液中，并小心将菌丝搅碎，加入适量的链霉素和氨苄，30℃、90rpm裂解3-4小时，期间每小时用血球计数板镜检原生质体的裂解情况；裂解液用miraocloth过滤到无菌预冷的50mL的离心管中，STC溶液洗涤一次；室温下5000rpm离心10min；小心去上清液，用30mL(用量根据原生质体沉淀的量而定)1×STC充分重悬沉淀；室温下5000rpm离心10min；小心去上清液，再次用1mL1×STC重悬沉淀；用血球计数板在显微镜中观察原生质体的浓度，用1×STC调整其浓度为5×10^7-8个/mL。

2)原生质体转化：配制40％PTC10mL；用剪过尖端的枪头将200ul原生质体加入无菌的50mL离心管中，再加入100微升从第二轮PCR扩增中得到的产物，轻轻混匀，置于冰上放置20min；分两次加入总量1.5mL4％PTC溶液，轻轻混匀，冰上静置20min；加入5mL液体TB₃培养基，轻轻混匀，封口；倾斜固定在摇床上，28℃，90rpm复苏过夜。

5、对丝状真菌基因敲除突变体进行筛选

溶解下层已加入终浓度为200ug/mL潮霉素的TB₃培养基，将复苏液倒入此TB₃中，混匀，倒板后开盖于超净台上吹直至培养基凝固；溶解上层已加入终浓度为300ug/mL潮霉素的TB₃培养基，于28℃倒置培养；7天左右，可观察到稻瘟菌落长到上层培养基，挑取这些正常生长出来的菌落于PDA培养基上于28℃培养，用荧光显微镜观察并选择有GFP荧光的转化子，即为敲除突变体。

6、突变体的验证

1)用含有潮霉素的培养基验证转化子

把筛选到的转化子转到含有350ug/mL潮霉素的PDA培养基上再次观察是否能够生长，检验潮霉素基因是否真正替换待敲除的基因MoNACα。结果显示阳性转化子在潮霉素培养基上可以正常生长(附图1)。

2)用荧光显微镜观察转化子是否有GFP荧光

用牙签挑取少许菌丝在荧光显微镜下观察转化子是否有GFP信号,结果显示阳性转化子在荧光显微镜下有GFP信号(附图2)。

3)提取转化子的DNA用于PCR验证

分别用MGG_02660_UA/GFP-R、HY-F/MGG_02660_DB和MGG_02660_NF/MGG_02660_NR这3对引物扩增提取的转化子DNA来验证是否为阳性转化子。结果显示阳性转化子用MGG_02660_UA/GFP-R、HY-F/MGG_02660_DB引物可以扩增出条带，而用引物MGG_02660_NF/MGG_02660_NR则不能扩增出条带，说明MGG_02660基因被敲除(附图3)。

MGG_02660_UA引物核苷酸系列如SEQ ID NO：15所示，即：AGGAATCTTTGGGACT。MGG_02660_DB引物核苷酸系列如SEQ ID NO：16所示，即：CCTGGCAGTCTCAAT。MGG_02660_NF引物核苷酸系列如SEQ ID NO：17所示，即：GACCGCCGTCATCCACT。MGG_02660_NR引物核苷酸系列如SEQ ID NO：18所示，即：TCACCGAAGACGCTGTAATG。

核苷酸系列表：

SEQUENCE LISTING

序列表

<110> 贵州大学

<120> 一种丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法

<160> 18

<210> 1

<211> 606

<212> DNA

<213> 稻瘟菌MoNACαCDS序列

<400> 1

ATGGCCAACC CTAGAGTCGA AGAGCTTCCC GACGAGGAGG TCAAGAAGAC TGTCGTCGAC 60

GACCACGATG ACGACAGCAG CTCCGACTCC GATGGCGAAG AGGAGACCAA CCTCCCTGCC 120

GGCTCGACCG CCGTCATCCA CTCCCGCAAC GAGAAGAAGG CTCGCAAGGC CATCGAGAAA 180

CTGCATCTGA TCCGCGTCGA CGGCATCACC CGCGTCACCC TCCGCCGCCC TAAGAACATT 240

CTCTTTGTCA TCAACAACCC CGAAGTCTAC AAGTCGCCCA ACAGCGGCAC ATACATCGTC 300

TTCGGTGAGG CGAAGATTGA AGACCTGAAC GCCTCAGCCC AGGCTGCCGC TGCCCAGCAG 360

CTTGCTTCCT CGGCCGGCCA CGACCACGAC CACGCTGGCC ACAGCCACGG TGAGGCCAAG 420

GCCAGCGAGG GTGACGCCAA GAAGGAGGAG GAGGACGACG ACGAGGAGGT CGACGCCGAC 480

GGTATCGAGG ACAAGGACAT TGAGCTTGTC ATGACCCAGG CCGGCGTCTC GCGCACAAAG 540

GCCATCAAGG CTTTGAAGGA GAACGACAAT GATATAGTCA ACTCCATCAT GGCTTTAAGC 600

GTCTAA 606

<210> 2

<211> 3502

<212> DNA

<213> 稻瘟菌MoNACα基因组

<400> 2

CCGCCAGGTC AGGAGGGGTG CCCTCACCGA CTTCGACCGC TTCAAGGTCA TGCGCCTCAA 60

GAAGCGCGCC CGCTTCGAGG AGCGCAAGGC TCTGGCCAAG GTCAAGGCCT CGGCATAGAC 120

GACAACGACT TTGACGGAAG CATAAAAAGG AATCTTTGGG ACTGTTTCGG CGTGGCTTGC 180

ATCGAGGGGA CGGGCGTCAA ATTAGAGCAG ACTTGGAAGG AAAGGGGCTT TTTCGACGCG 240

GTTTCGGTTT GCGGAAAACG GTTTTCACCT TTGGAATGGA TTGCATGATC ATATCCAATC 300

GGCATTAGGG CTATTGCGAT TCTTTGCACT TTTTTCGGGA CGACCCTGTA CAGTCACGAT 360

CATCTTACGA GATGGCGTGT CGCGGCGTAA AATGAGGAAA TCTTTTGAGC CAAACGACCG 420

TCGGCGCTTG ATATTGTGAC AATCGGGGCG GTCGGGTGAT ACTGAAGGGA GCCGGGCAGA 480

CTGATATACT CCGAAGCTAC CATTCGTTTC GTTTGTGGGG ATGCCTCGTC CTTCGAAAGC 540

TCACAAACAA AACAAAGCAT TCTTACCTAA TGATATCAAG AACACCACGG CACTGCATAT 600

AAACGCGTCT GAATTGTAAG AATGAAAACT GCTATTGCCA TTTGCCTTTG ATATCCCGAA 660

AGTAGTGCAG CAGACCTTCA CACAATCTTG AGCCATTCAT AGCGAATTTC CCCGTAGTTT 720

TTCAATAGAC GTTCAAACCG CCACACGGCG TCTTCATTGG CTTTAATGTG CGATGGGTAG 780

TCAGTACCTT ACCTCTGCCA ACATGCCCGT CACCTGAGGT GGGTAGTGC GACGCTGCGG 840

GTTGGTCGGT GGGTGAAGTT TTTGTGTGCA TTGACCACCC GCGAAATTCT AGGGTTGTGA 900

ATTCTTCTGT CTCTGAGCAC TTTGCGTCCC ACATCTCAGA GTGCGCTTTG GAGTAACGAC 960

GAGACCAGTA AAAGCAGGGC GGTATTAATC AAAACAGAG TAAGTGGGAA TTTGCTGCAG 1020

AAATTGTCCC GATCAAATCG GATTCTTGAG AACGGCTTCA ACATTTGAAC AATTGATTTG 1080

TGGCCCAAAA GCTGTTAAAT CGCAAGTGCT CTCAAGCAAT CAACCTACCT ACCTACCTTA 1140

CCTACCTACC TTACCTACCT ACCTTACCTA CCTACCTTAC CTACCCACTT TCGAAATTTC 1200

GCCCTCTTTG TTCATTCTGT GAAAGTGGGC AAAGTTCAGG CTTGCTTGAC CCTCCAAATT 1260

CTACACTGAG CACCAAATTG TACATTCATT TCCACTAACC ACCCGAACCA CCCCGCAATA 1320

GTTCCTCAAA ATGGCCAACC CTAGAGTCGA AGAGCTTCCC GACGAGGAGG TCAAGAAGAC 1380

TGTCGTCGAC GACCACGATG ACGACAGCAG CTCCGACTCC GATGGCGAAG AGGAGACCAA 1440

CCTCCCTGCC GGCTCGACCG CCGTCATCCA CTCCCGCAAC GAGAAGAAGG CTCGCAAGGC 1500

CATCGAGAAA CTGCATCTGA TCCGCGTCGA CGGCATCACC CGCGTCACCC TCCGCCGCCC 1560

TAAGAACGTA AGTCGATTAC ATGGGAAGCC ATAGTGGGAT GTGCGCGTGG CAAGAGGTGG 1620

GCACAATGGG TAGCAGAGGG CCTCGAAGCT CTAGACAACA TGCGGGAGAG CTCCAGGCTT 1680

GGTGCAATAG CTTTTTTGGA TATGCGCTCT ACATTTTCTT ATTGGTTCAA AGTCTGACTT 1740

ATGACTTAGA TTCTCTTTGT CATCAACAAC CCCGAAGTCT ACAAGTCGCC CAACAGCGGC 1800

ACATACATGT GAGTAGCCCC TTCTGCTAAG CTACATCGCG AGTCGCGAGC TCCATTTCTG 1860

ACTCGCGCCT ATCATTACAG CGTCTTCGGT GAGGCGAAGA TTGAAGACCT GAACGCCTCA 1920

GCCCAGGCTG CCGCTGCCCA GCAGCTTGCT TCCTCGGCCG GCCACGACCA GACCACGCT 1980

GGCCACAGCC ACGGTGAGGC CAAGGCCAGC GAGGGTGACG CCAAGAAGGA GGAGGAGGAC 2040

GACGACGAGG AGGTCGACGC CGACGGTATC GAGGACAAGG ACATTGAGCT TGTCATGACC 2100

CAGGCCGGCG TCTCGCGCAC AAAGGCCATC AAGGCTTTGA AGGAGAACGA CAATGATATA 2160

GTCAACTCCA TCATGGCTTT AAGCGTCTAA TGGGGGGATG GTTTGATTGC TAGTGTATCT 2220

TTGGGCTGAG GTTTTTTCGG CCATGGACGA GCGTTTTCGT ACGCCTCCCA GGCATGATTT 2280

GATAGGAGGT CCGGGTATTA TGTGGCTCAT GACCAGAACG ACCATGAAAC AGCAATGAAA 2340

AAAGCATAGC TGAATCTTTG TGACAATTTC GATCGTTCTG ATGGTGACGA TAACAAGCCT 2400

TGCATGTAGT GCCTCTTGCT ACGGTTATTG TGCGCCTGCA CTGTACCTCT TTTCACATAC 2460

AATCTGCTAT TTTGCGATGT CTCTTAAATG GTACTTGCGA GCTTCGATTT CTTATGTTGG 2520

ATGCATTTAT CGATCCGATC TATCGTTTAA GGTGAGACAC TCGGTCTTGG TTTATTGTTG 2580

ACAGCTTGAA TGACTAAACA TACAGATGGC ATGGACTCTG GTCGATCGGT CACGTGACAA 2640

GTGGATCACT CTGGCTGGCT TGTCCGAGTT TGCTGTAGGA ACTTCGGCAA GCATCATCGC 2700

GACAACGACG ACTTCGTTTT CAATCTCCAC TCCTCCAAAC ACGCACATCA ACCGCAAAAA 2760

TGGCCGCAGT AAGTTTTTTC CGTACCAATT GACGTTCTGG AGCCAGTCTC TGGTGCTTTT 2820

AGACCATCGC CGTCACACAA TCGCTGCCCC AAGTTCCCGT CCGTCAATCG CCAGCAACCA 2880

CTCCGAGAAC GCCCGAGCTA ATTTTGCCGA ACCTCCCCAA AAAAACAGCG AAGCGCAGCT 2940

CTCAAGATCG ACTGGGCCCA GGTCACCACC TCGCTGGGCC TCCGTGGCCA GACGGCCGCC 3000

TCGCTCCAGG CTTTCAAGAA GCGTAACGAC GACGTCAGGC GCAAGGTCCA GCAGCTGTCC 3060

CAGCAGTCTA CCCAGGTCGA CTTTGCCCAC TACCGCTCCG TCCTCAAGAA CCAGGCCATC 3120

GTCGACGAGA TCGAGAAGCG CTTCGCCGCC TTCAAGCCCG CCACCTACGA T GTCTCGCGC 3180

CAGCTCAAGG CCATCGACGC CTTCGAGGTC GGGCCGTCA AGAACGCCGA AGCCACCAAG 3240

AACCAGGTCG ACATGACCCT CAAGGACCTC CAGAAGACCC TCGAGAACAT TGAGACTGCC 3300

AGGCCGTTCG AGGACCTCAC TGTTGTATGT GGTGGAATTA GCGGGTTGAT AATAACACGC 3360

GTGTCTGTGT TGATACTAAT GTGGCACTTT TATTACAGGA TGAGGTTGCC GCTGCCGAGC 3420

CCTCGATTGA CGAGAAGACC GCCAAGTTGG TCTCCAAGGG CCGCTGGCAG GTGCCTGGAT 3480

ACAAGGCAAG TTTTCAGTTC CT 3502

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工系列

<400> 3

GCTGGAGCTA GTGGAGGTCA A 21

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工系列

<400>3

CTCGCCCTTG CTCACCATTT CCTTTGCCCT CGGACGAGT 39

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工系列

<400>5

ACTCGTCCGA GGGCAAAGGA AATGGTGAGC AAGGGCGAG 39

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工系列

<400> 6

TCACTTGTAC AGCTCGTCCA T 21

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工系列

<400> 7

TGTAAAACGA CGGCCAGT 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工系列

<400> 8

CAGGAAACAG CTATGACC 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工系列

<400> 9

TATCCAATCG GCATTAGGG 19

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工系列

<400> 10

ACTGGCCGTC GTTTTACATT TCGCGGGTGG TCAA 34

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工系列

<400> 11

GGTCATAGCT GTTTCCTGAC ACTCGGTCTT GGTTTATTG 39

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工系列

<400> 12

TGAGGACGGA GCGGTAG 17

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工系列

<400> 13

TCGCCGGACA CGCTGAA 17

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工系列

<400>14

GCCGTGGTTG GCTTGTAT 18

<210> 15

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工系列

<400> 15

AGGAATCTTT GGGACT 16

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工系列

<400> 16

CCTGGCAGTC TCAAT 15

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工系列

<400> 17

GACCGCCGTC ATCCACT 17

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工系列

<400> 18

TCACCGAAGA CGCTGTAATG 20

<210> 19

<211> 1352

<212> DNA

<213> 潮霉素HPH

<400> 19

GCTGGAGCTA GTGGAGGTCA ACAATGAATG CCTATTTTGG TTTAGTCGTC CAGGCGGTGA 60

GCACAAAATT TGTGTCGTTT GACAAGATGG TTCATTTAGG CAACTGGTCA GATCAGCCCC 120

ACTTGTAGCA GTAGCGGCGG CGCTCGAAGT GTGACTCTTA TTAGCAGACA GGAACGAGGA 180

CATTATTATC ATCTGCTGCT TGGTGCACGA TAACTTGGTG CGTTTGTCAA GCAAGGTAAG 240

TGGACGACCC GGTCATACCT TCTTAAGTTC GCCCTTCCTC CCTTTATTTC AGATTCAATC 300

TGACTTACCT ATTCTACCCA AGCATCCAAA TGAAAAAGCC TGAACTCACC GCGACGTCTG 360

TCGAGAAGTT TCTGATCGAA AAGTTCGACA GCGTCTCCGA CCTGATGCAG CTCTCGGAGG 420

GCGAAGAATC TCGTGCTTTC AGCTTCGATG TAGGAGGGCG TGGATATGTC CTGCGGGTAA 480

ATAGCTGCGC CGATGGTTTC TACAAAGATC GTTATGTTTA TCGGCACTTT GCATCGGCCG 540

CGCTCCCGAT TCCGGAAGTG CTTGACATTG GGGAATTCAG CGAGAGCCTG ACCTATTGCA 600

TCTCCCGCCG TGCACAGGGT GTCACGTTGC AAGACCTGCC TGAAACCGAA CTGCCCGCTG 660

TTCTGCAGCC GGTCGCGGAG GCCATGGATG CGATCGCTGC GGCCGATCTT AGCCAGACGA 720

GCGGGTTCGG CCCATTCGGA CCGCAAGGAA TCGGTCAATA CACTACATGG CGTGATTTCA 780

TATGCGCGAT TGCTGATCCC CATGTGTATC ACTGGCAAAC TGTGATGGAC GACACCGTCA 840

GTGCGTCCGT CGCGCAGGCT CTCGATGAGC TGATGCTTTG GGCCGAGGAC TGCCCCGAAG 900

TCCGGCACCT CGTGCACGCG GATTTCGGCT CCAACAATGT CCTGACGGAC AATGGCCGCA 960

TAACAGCGGT CATTGACTGG AGCGAGGCGA TGTTCGGGGA TTCCCAATAC GAGGTCGCCA 1020

ACATCTTCTT CTGGAGGCCG TGGTTGGCTT GTATGGAGCA GCAGACGCGC TACTTCGAGC 1080

GGAGGCATCC GGAGCTTGCA GGATCGCCGC GGCTCCGGGC GTATATGCTC CGCATTGGTC 1140

TTGACCAACT CTATCAGAGC TTGGTTGACG GCAATTTCGA TGATGCAGCT TGGGCGCAGG 1200

GTCGATGCGA CGCAATCGTC CGATCCGGAG CCGGGACTGT CGGGCGTACA CAAATCGCCC 1260

GCAGAAGCGC GGCCGTCTGG ACCGATGGCT GTGTAGAAGT ACTCGCCGAT AGTGGAAACC 1320

GACGCCCCAG CACTCGTCCG AGGGCAAAGG AA 1352

<210> 20

<211> 720

<212> DNA

<213> 绿色荧光蛋白GFP

<400> 20

ATGGTGAGCA AGGGCGAGGA GCTGTTCACC GGGGTGGTGC CCATCCTGGT CGAGCTGGAC 60

GGCGACGTAA ACGGCCACAA GTTCAGCGTG TCCGGCGAGG GCGAGGGCGA TGCCACCTAC 120

GGCAAGCTGA CCCTGAAGTT CATCTGCACC ACCGGCAAGC TGCCCGTGCC CTGGCCCACC 180

CTCGTGACCA CCCTGACCTA CGGCGTGCAG TGCTTCAGCC GCTACCCCGA CCACATGAAG 240

CAGCACGACT TCTTCAAGTC CGCCATGCCC GAAGGCTACG TCCAGGAGCG CACCATCTTC 300

TTCAAGGACG ACGGCAACTA CAAGACCCGC GCCGAGGTGA AGTTCGAGGG CGACACCCTG 360

GTGAACCGCA TCGAGCTGAA GGGCATCGAC TTCAAGGAGG ACGGCAACAT CCTGGGGCAC 420

AAGCTGGAGT ACAACTACAA CAGCCACAAC GTCTATATCA TGGCCGACAA GCAGAAGAAC 480

GGCATCAAGG TGAACTTCAA GATCCGCCAC AACATCGAGG ACGGCAGCGT GCAGCTCGCC 540

GACCACTACC AGCAGAACAC CCCCATCGGC GACGGCCCCG TGCTGCTGCC CGACAACCAC 600

TACCTGAGCA CCCAGTCCGC CCTGAGCAAA GACCCCAACG AGAAGCGCGA TCACATGGTC 660

CTGCTGGAGT TCGTGACCGC CGCCGGGATC ACTCTCGGCA TGGACGAGCT GTACAAGTGA 720

Claims

1.一种丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建HPH-GFP融合表达载体，并克隆出HPH-GFP片段；

(3)克隆待敲除基因上、下游片段与HPH-GFP组成嵌合体片段；

(4)用嵌合体片段转化真菌原生质体，得转化子备用；

2.根据权利要求1所述的丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法，其特征在于：构建HPH-GFP融合表达载体的方法是：分别克隆潮霉素基因HPH和GFP基因，获得潮霉素HPH片段和GFP片段，再用PCR将HPH和GFP基因融合到表达载体，克隆得到HPH-GFP片段，即HPH-GFP融合表达载体。

3.根据权利要求1所述的丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法，其特征在于：在步骤(3)中，以步骤(1)得到的HPH-GFP片段和步骤(2)得到的待敲除基因上下游片段为模板，扩增得到两个上下游片段-HPH-GFP的片段，1：1混合两个片段，得嵌合体片段备用。