CN110305899A - 外源基因定点整合至gapdh基因下游的打靶载体构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种将外源基因定点整合至猪GAPDH基因下游的打靶载体，所述打靶载体是以GAPDH基因终止密码子上下游序列作为左、右同源臂，将左同源臂、2A序列、外源基因序列和右同源臂依次连接起来，反向插入到真核表达载体的多克隆位点上。将该打靶载体与含特异性靶向猪GAPDH基因下游的sgRNA的CRISPR/Cas9切割载体共转染猪真核细胞中，可以将外源基因定点整合至GAPDH基因下游。本发明提供的这一打靶位点，可以拓宽外源基因在猪基因组中整合位点的范围，为制备外源基因在猪基因组中高效稳定的表达奠定基础。

Description

外源基因定点整合至GAPDH基因下游的打靶载体构建方法及 其应用

技术领域

本发明属于动物基因工程领域，具体地说，涉及一种将外源基因定点整合至GAPDH基因下游的打靶载体及其构建方法和应用。

背景技术

在构建转基因动物及基因获得(gain-of-function)功能研究的过程中，外源基因能否正确且高效稳定的在动物基因组中进行表达，是转基因技术是否成功的关键。外源基因在动物基因组中随机整合会因为基因的位置效应和剂量效应引起表达不稳定或受到表观修饰而沉默表达。而将外源基因定点整合至特定位点则会避免上述情况的发生，可使外源基因在基因组中持续稳定的表达。近年来，随着ZFN、TALEN技术，尤其是CRISPR/cas9技术的出现，为外源基因定点整合提供了新的工具，大大提高了基因定点整合的效率，并且在多个物种中获得了成功。然而，基因定点整合的一个关键因素是位点的选择，一个好的位点应该使得不同来源不同类型的外源基因可以在目标基因组中不同时间不同组织中都能保持高效稳定的表达，且对内源基因在基因组内的表达没有不利的影响。目前在猪中这样的位点报道的还比较少，因此提供新的安全的友好定点是非常重要和有益的。

GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因是甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是糖酵解反应中的一个酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量约为146kDa。该酶在几乎所有组织中都高水平和稳定表达，并且在同种细胞和组织中表达量是恒定的，不受其他因素的影响，因此也称为管家基因(house keeping)。基于这些特点，GAPDH基因适合作为一个新的安全的友好位点被开发利用。

CRISPR/Cas(CRISPR-associated)系统是发现于细菌与古细菌中的一种针对入侵的外源基因的免疫系统，通过特异的sgRNA序列的介导，可以切割和降解外源性的DNA。这种系统可以广泛应用于原核和真核动植物基因组中进行基因编辑，自2013年该系统首次在真核细胞中成功应用以来，迅速在生命科学研究的各个领域大显身手。CRISPR系统最大的特点在于简单易用，成本低廉且效率较高。目前这种系统在包括大鼠、小鼠、斑马鱼、猪、拟南芥等各物种中都有成功的应用。CRISPR系统可以在目标序列产生双链断裂，随后机体可以利用非同源末端链接修复机制自我修复，但这种修复往往不精确且会导致基因功能的缺失。此外，该系统可以与同源重组载体共同作用，使目的基因发生精确修饰，从而定点整合外源基因。目前为止，科研工作者在小鼠、猴、羊、马及牛等模式动物中实现了精确的基因定点整合。因此，CRISPR系统凭借其巨大的优势成为目前基因编辑领域最为普遍的研究工具。

目前在猪中报道的可用于定点整合外源基因的位点相对较少，且可以借助内源基因启动子直接驱动外源基因的表达更是鲜有报道。

发明内容

本发明的目的是提供了一种将外源基因定点整合至猪GAPDH基因下游的打靶载体，借助CRISPR/Cas9系统，该打靶载体可将外源基因序列高效稳定定点整合至猪GAPDH基因下游，使外源基因可在内源GAPDH基因启动子的驱动下稳定表达。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种将外源基因定点整合至猪GAPDH基因下游的打靶载体，其构建方法是：

以GAPDH基因终止密码子上下游序列作为左、右同源臂，将左同源臂、2A序列、外源基因序列和右同源臂依次连接起来，反向插入到真核表达载体的多克隆位点上；所述的左同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，右同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，上述真核表达载体为pCDNA3.1(+)，插入的多克隆位点位于HindIII与Kpn1位点之间。

特异性靶向猪GAPDH基因下游的sgRNA序列，作为优先，所述sgRNA的序列如SEQ IDNO.5所示。

利用CRISPR/Cas9系统将外源基因定点整合至猪GAPDH基因下游的方法，包括以下步骤：

(1)构建打靶载体：以GAPDH基因终止密码子上下游序列作为左、右同源臂，将左同源臂、2A序列、外源基因序列和右同源臂依次连接起来，反向插入到真核表达载体的多克隆位点上；所述的左同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，右同源臂的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；

(2)构建CRISPR/Cas9切割载体：所述的切割载体含特异性靶向猪GAPDH基因下游的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(3)将打靶载体和CRISPR/cas9切割载体共同转染猪真核细胞。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种将外源基因定点整合至猪GAPDH基因下游的打靶载体及其应用，借助CRISPR/cas9系统，该打靶载体可将外源基因序列定点整合至猪GAPDH基因下游并稳定表达。与传统打靶载体相比，本发明设计的打靶载体仅需包含外源基因表达序列，启动子及终止调控序列完全借助内源基因相关元件，从而简化了载体构建流程。此外，本发明打靶载体可借助载体骨架上药物筛选标记进行富集可进一步提高筛选效率。利用该打靶载体，可以高效构建稳转外源基因的细胞系及转基因猪模型，可为基因功能研究及制备转基因猪提供有用的工具。

附图说明

图1是本发明实施例的同源重组定点打靶载体关键序列组成结构；

图2是本发明实施例GFP基因定点敲入GAPDH基因下游的打靶载体的质粒图谱；

图3是本发明实施例GFP基因敲入后流式分析图；

图4是本发明实施例GFP基因敲入后荧光图；

图5是本发明实施例GFP基因敲入后sanger测序鉴定敲入序列的测序峰图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修饰和替换。

实施例1 GFP基因定点敲入打靶载体构建

参阅图1，一种将外源基因定点整合至猪GAPDH基因下游的打靶载体，以NCBI中GAPDH基因参考序列(Gene ID:396823)的64129887-64130787区域为左同源臂、64128983-64129883区域为右侧同源臂，为防止GFP基因发生定点整合后被CRISPR切割载体再次切割，将左同源臂上64129890-64129892位置上的AAG密码子同义突变为AAA，然后将左同源臂序列(SEQ ID NO.1所示)、P2A序列(SEQ ID NO.2所示)、GFP序列(SEQ ID NO.3所示)及右同源臂序列(SEQ ID NO.4所示)依次进行连接，从而构成同源重组定点插入片段的关键序列。

参阅图2，在优选的实施例中，基于常规的真核表达载体Pcdna3.1(+)载体，将上述图1所示的关键片段反向插入至Pcdna3.1(+)多克隆位点的酶切位点HindIII及Kpn1位点之间，从而构建完成GFP基因定点敲入至猪GAPDH基因下游的打靶载体，命名为pCDNA3.1-GAPDH-GFP-KI-donor。

实施例2 CRISPR/cas9切割载体构建

选取猪GAPDH基因终止密码子上游的一个sgRNA序列：CATGGTCCACATGGCCTCCA(SEQID NO.5所示)，命名为GAPDH-sgR1，其反向互补序列为：TGGAGGCCATGTGGACCATG(SEQ IDNO.6所示)。需合成的寡核苷酸链如下表所示，划线部分为酶切位点：

将合成的一对寡核苷酸序列稀释至10μM，然后各取5μL混合均匀，在PCR仪上进行退火处理，程序为：95℃，10分钟；65℃，30分钟。将退火后的PCR产物与BbsI酶切过后的PX330骨架连接，挑取单克隆菌落测序，将构建成功的载体命名为px330-GAPDH-sgR。

实施例3构建GFP基因定点敲入细胞系

将上述GFP基因定点敲入打靶载体pCDNA3.1-GAPDH-GFP-KI-donor及CRISPR/cas9切割载体采用脂质体转染方法共同转染PK15细胞，构建稳转GFP基因的PK15细胞系，具体操作流程如下：

转染前一天，将PK15细胞接种至6孔板培养皿。待第二天细胞汇合至80％左右时进行转染。按照1:1的比例，将打靶载体pCDNA3.1-GAPDH-GFP-KI-donor及CRISPR/cas9切割载体共同转染至PK15细胞中，按照lipo2000(Invitrogen)操作说明书进行操作。转染48小时后，观察荧光，并更换含有800μg/mL G418的细胞培养基，在含有G418的培养基中连续培养三天，进行流式细胞术分选含有GFP荧光的细胞。

参阅图3，将GFP基因定点敲入GAPDH基因下游后对发绿色荧光的PK15细胞进行分选。从流式分选的统计数据中看出，GFP阳性细胞的比例可达到2％以上。

实施例4 PCR-sanger测序检测敲入GFP基因的基因型

参阅图4，在流式细胞术分选出GFP基因发光的PK15细胞后，在荧光显微镜下进行观察，结果表明，流式细胞术分选出的PK15细胞均能产生绿色荧光。

收取部分分选出的PK15细胞，提取细胞基因组。跨同源臂设计引物对用于检测GFP基因是否成功敲入，引物设计策略参阅图5。引物对F1：5′-CAGGACATCAGAGGAGGGGTA-3′，R1：5′-CTGAACTTGTGGCCGTTTAC-3′，引物对F2：5′-CTGAGCAAAGACCCCAACGA-3′，R2：5′-ATGGGGAGACGTGACTGAGG-3′。

分别用两对检测引物PCR扩增目的序列，将扩增出来的PCR产物进行sanger测序，得到的测序结果与参考目的序列进行比对。参阅图5，比对结果显示，GFP基因成功定点敲入至GAPDH基因下游。

以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所做的进一步的详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施例作出若干替代或变形，而这些替代或变形方式都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 外源基因定点整合至GAPDH基因下游的打靶载体

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggcgtcacaa gcgctaggca gggccttcac tccccctcct tgtctccaga ccacggtcca 60

tgccatcact gccacccaga agactgtgga tggcccgtct gggaagctgt ggcgtgatgg 120

ccgaggggct gcccagaaca tcatccctgc ttctaccggc gctgccaagg ctgtgggcaa 180

ggtcatccct gagctcaacg ggtgaggctc tttgctgctc tcctgccctg ggtgtctggg 240

gcaccagcag gggtggtgct gactctgctt gcttcctcgt gtccccagga agctcactgg 300

catggccttc cgtgtcccca cccccaacgt gtcggttgtg gatctgacct gccgcctgga 360

gaaacctgta ggtttgggtt ggaacagctt tggggggctg aggggttgta ggattggtac 420

ttgaataacc atcggttttt acctcatcag gcaaaatatg atgacatcaa gaaggtggtg 480

aagcaggcgt ccgagggccc cctcaagggc atcctgggct acactgagga ccaggtactg 540

ataggtcagg gaacttggtg tccacacgac cccactgacc aagactgggt tccgtaattg 600

gccctcttcc ttccccaggt tgtgtcctgt gacttcaaca gtgacactca ctcttccact 660

tttgatgctg gggctggcat tgccctcaac gaccacttcg tcaagctcat ttcctggtag 720

ggtgctgggg gatgtggcgg gtggggaggg atgatgcttc agaatgtgat caagtctggt 780

gccccctggt ggctgctcgg gaaaaccaca cttaactctt gctctccttt caggtacgac 840

aatgaatttg gctacagcaa cagggtggtg gacctcatgg tccacatggc ctccaaagag 900

<210> 2

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaagcggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggccg gcgacgtgga ggagaacccc 60

ggcccc 66

<210> 3

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 4

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagcccctgg accaccaacc ccagcaagag cacgcgagga ggagagaggc cctcagctgc 60

tggggagtca cagccccaac tcgatccccc aacacaccga gcatctcctg acttccagtt 120

tccatcccag acccccggaa gaaggggagg ggcttaggga gacctgcctc gtcatgtacc 180

atcaataaag tacactgtac ccagcctcct gtcgttctca ctctagagcc tgggataaag 240

aggagggaag ccgggctggg gccaaggaga actagagctt gctgaggaaa ctccaccctg 300

ggctcctctg aagagccacc tgtcctcgtg ttgccttagt gaggcctctg ggtgctacag 360

ctccagactg ccgtggctga acccaggaat ggcctggctg cttgcaccca agacaccatt 420

ctgtctgcag ctccctggag gggggcactg gcacaggaag tccatttggc tacggcctga 480

ctgccaggag tggattccag ctctgccctg tcacagctgt gagcctcagt gcccaagaga 540

ttgccatctg tggtacagct gtgccagtgc cagctcagag attgttcaga gaagttacag 600

taggttagcc caagggaaag gttggggtgg ttttatttcc atgtcttctg tcacctgcga 660

atgcgcacag gcttagtggg aagaagcaga gacagcactg acaacctgga tggaggccct 720

ggttctgcta cttgaggtgc cattactttg ggcaagttgc ttgtaaccct gtgtgtctgt 780

gcaatgatca ccagtgcaca ccacacaaca gggaccagag ccaccaccga aaagttgctg 840

gaaacagtga caccaaagcg ttcaataaat actcgccagt ttcattagga ttagattcca 900

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catggtccac atggcctcca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggaggccat gtggaccatg 20

Claims (5)

1.一种将外源基因定点整合至猪GAPDH基因下游的打靶载体，其特征在于，以GAPDH基因终止密码子上下游序列作为左、右同源臂，将左同源臂、2A序列、外源基因序列和右同源臂依次连接起来，反向插入到真核表达载体的多克隆位点上；所述的左同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，右同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的打靶载体，其特征在于，所述的真核表达载体为pCDNA3.1(+)，插入的多克隆位点位于HindIII与Kpn1位点之间。

3.权利要求1或2所述的打靶载体在将外源基因定点整合至猪GAPDH基因下游中的应用。

4.特异性靶向猪GAPDH基因下游的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA的序列如SEQ IDNO.5所示。

5.利用CRISPR/Cas9系统将外源基因定点整合至猪GAPDH基因下游的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建打靶载体：以GAPDH基因终止密码子上下游序列作为左、右同源臂，将左同源臂、2A序列、外源基因序列和右同源臂依次连接起来，反向插入到真核表达载体的多克隆位点上；所述的左同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，右同源臂的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；

(2)构建CRISPR/Cas9切割载体：所述的切割载体含特异性靶向猪GAPDH基因下游的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(3)将打靶载体和CRISPR/cas9切割载体共同转染猪真核细胞。