CN106434750A - 靶向打靶载体及靶向整合外源基因至MYH9 Intron2位点构建小鼠胚胎干细胞株的方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了靶向打靶载体及靶向整合外源基因至MYH9Intron2位点构建小鼠胚胎干细胞株的方法和应用。所述靶向打靶载体序列如SEQ ID NO.7所示，命名为mpNTKV‑LoxP MAI2L‑MAI2R载体。本发明提供了一个新的能实现高效、安全、靶向整合的位点序列，基于该位点构建的靶向插入外源基因的打靶载体，不仅可实现高效打靶，而且能够保证外源基因在小鼠胚胎干细胞中稳定表达而内源基因表达不受影响，从而为构建转基因细胞系以及小鼠搭建了一个好的平台。

Description

靶向打靶载体及靶向整合外源基因至MYH9 Intron2位点构建 小鼠胚胎干细胞株的方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及靶向打靶载体及靶向整合外源基因至MYH9Intron2位点构建小鼠胚胎干细胞株的方法和应用。
背景技术
转基因、基因敲除/敲入技术已成为现代生命科学基础研究和应用开发领域所倚重的关键技术，其中，将人工分离和修饰过的基因导入生物体基因组中，通过导入基因的表达引起生物体性状的可遗传改变，这一技术称之为转基因技术(Transgenic technology)；通过同源重组将外源基因定点整合至靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的，这种基于基因打靶(Gene Targeting)的技术称之为基因敲除/敲入(Gene knock-out/knock-in)技术。转基因和基因敲除/敲入技术最主要的区别在于前者是随机插入而具有盲目性和偶然性，而后者是定点整合而具有确定性和可预测性，从而成为一种更理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。尽管基因敲除和敲入技术都是基于同源重组，但是也存在方法上的些许差异，基因敲除仅把需要被破坏的基因的几个重要外显子或者功能区域用筛选标志基因如Neomycin替换掉，而基因敲入除了筛选标志基因外还需将预先设计的目的DNA片段一并整合至相应的基因组位点。这些经典技术在推动人类对于基因功能与调控的认识、疾病发生机制以及药物研发等方面发挥了重要作用，并且还将结合最新的基因编辑工具如锌指核酸酶(ZFN)、转录因子样效应物核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复及其关联蛋白系统(CRISPR/Cas9)等在理论研究和应用开发中继续发挥不可或缺的作用。
将外源基因靶向整合至特定的染色体位点在基因疗法、细胞工程、遗传动物模型、基因功能研究及药物开发等中具有重要应用价值，而所有这些应用一方面依赖于转入基因功能的可靠性和可预测性，另一方面要求转入基因不影响内源基因和或其他调控因子的功能。因此，一个适合外源基因良性插入并表达的基因组位点非常重要，而这种适合插入外源基因的所谓安全/友好位点(safe harbor)需要具备如此一些特性：1)该位点处于一个开放的染色体状态而消除任何可能的位置效应，保证转入基因能被正常转录及表达而不会出现基因沉默现象；2)该位点插入外源目的DNA片段对细胞/机体无已知的副作用，如不破坏内源编码基因和高度保守区以及激活癌基因或microRNAs(Sadelain M 2011 NatureReviews Cancer 12,51-58)；3)在该位点靶向插入外源基因时有可以接受的同源重组效率，否则难以获得所需细胞株，随着基因编辑工具的出现，这一要求开始降低。目前研究确定可以用作safe harbor的基因组位点为数很少，如人类基因组中的ROSA26，AAVS1，CCR5以及小鼠基因组中的ROSA26等位点(Sadelain M 2011 Nature Reviews Cancer 12,51-58)，并且仍可能存在潜在的未知问题。因此，探寻和鉴定其它safe harbor位点仍是十分需要的。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种靶向打靶载体及靶向整合外源基因至MYH9Intron2位点构建小鼠胚胎干细胞株的方法和应用。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述靶向打靶载体序列如SEQ ID NO.7所示，命名为mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R载体；该载体仅将抗性基因Neomycin靶向整合。
上述靶向打靶载体的制备方法包括如下步骤：
(1)构建空载体mpNTKV-LoxP，所述空载体mpNTKV-LoxP序列如SEQ ID NO.17所示；
(2)以bMQ-369E5BAC DNA为模板，利用序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.1所示的左侧同源臂；以bMQ-369E5BAC DNA为模板，利用序列如SEQ ID NO.5所示的正向引和序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.2所示的右侧同源臂；
(3)将左侧同源臂和右侧同源臂插入空载体mpNTKV-LoxP中，即得靶向打靶载体mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R载体。
上述靶向打靶载体可用于靶向整合外源基因至MYH9Intron2位点构建小鼠胚胎干细胞株，即，将上述的靶向打靶载体将外源基因靶向整合至MYH9Intron2位点。
本发明还提供了整合外源基因的打靶载体，所述整合外源基因的打靶载体是将构建的外源基因表达盒插入mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R载体中左侧同源臂和抗性基因Neomycin之间而构建成的。
优选地，所述整合外源基因的打靶载体序列如SEQ ID NO.8所示，命名为mpNTKV-LoxP MAI2L-EF1α-GFP-pA-MAI2R(Knock-in EF1α-GFP-pA)载体；或者，所述整合外源基因的打靶载体序列如SEQ ID NO.9所示，命名为mpNTKV-LoxP MAI2L-pA-GFP-EF1α-MAI2R(Knock-in pA-GFP-EF1α)载体；或者，所述整合外源基因的打靶载体序列如SEQ ID NO.10所示，命名为mpNTKV-LoxP MAI2L-αMHC-Puro-IRES-GFP-pA-MAI2R(Knock-inαMHC-Puro-IRES-GFP-pA)载体。
本发明利用MYH9基因第二号内含子上游4.5kb和下游2.0kb DNA序列构建靶向打靶载体左、右侧同源臂，经电转导入细胞、正负标记药物筛选、long-range PCR筛选与鉴定，所获得的胚胎干细胞单克隆阳性率≥70％。在上述基础上，将EF1α启动子控制的GFP表达盒正向或反向，或者αMHC启动子控制的Puro-T2A-GFP表达盒置于上述左、右同源臂之间，可以实现高效靶向整合。结果表明EF1α控制的GFP表达正常且与插入方向无关；同样αMHC控制的Puro和GFP表达准确。3)内源MYH9基因表达水平不受外源基因插入的影响。由此表明MYH9基因内含子2区域具有类似于小鼠Rosa26位点特性，是小鼠基因组内另一个可供外源基因高效、安全、靶向整合以及正确表达的位点。
本发明的有益效果为：
本发明建立了一种高效、安全靶向整合外源DNA序列至小鼠胚胎干细胞基因组MYH9位点的方法并提供了应用实例。
本发明针对目前小鼠基因组中可供外源基因靶向整合的染色体位点很少的现状而提供了一个可供基因定点插入的小鼠基因组位点。
本发明首先构建靶向小鼠MYH9内含子2位点的打靶载体，确定在胚胎干细胞中能否实现高效同源重组从而容易获得所需细胞株。
本发明提供了靶向小鼠MYH9Intron2位点的打靶载体左、右同源臂DNA序列信息及构建方法。
本发明提供了筛选与鉴定阳性细胞株/克隆的方法。
本发明提供了构建外源基因靶向整合至小鼠MYH9Intron2位点的打靶载体的方法，并证实敲入的外源基因表达正常。
本发明确认了内源MYH9表达不受外源基因整合的影响，从而可以成为小鼠基因组中一个新的safe harbor。
如背景技术中所提到的，目前小鼠基因组中可供靶向整合的位点很少，本发明提供了一个新的能实现靶向整合的位点序列，利用该位点可构建靶向插入外源基因的打靶载体，并且能够保证外源基因在小鼠胚胎干细胞中稳定表达而内源基因表达不受影响，从而为构建转基因细胞系以及小鼠搭建了一个好的平台。
附图说明
图1：靶向MYH9基因Intron2位点打靶载体的构建，及同源重组后进行PCR筛选与鉴定的引物示意图；
图2：PCR筛选与鉴定靶向MYH9Intron2位点的小鼠胚胎干细胞单克隆，正确靶向的单克隆细胞出现约2.2kb条带；
图3：外源基因靶向插入MYH9Intron2位点打靶载体的构建；
图4：靶向整合至MYH9内含子2位点的外源GFP表达仅受EF1α启动子控制而不受插入方向的影响(objective 20X)；
图5：靶向插入MYH9内含子2位点的外源GFP和Puromycin表达仅受αMHC启动子控制，从而相应的胚胎干细胞在药物嘌呤毒素处理下定向分化成心肌细胞，GFP荧光强度随着分化时间延长而增强(objective 20X)；
图6：Western blot检测表明MYH9基因表达不受外源基因插入的影响，该蛋白与正常细胞中的水平一致。
具体实施方式
实施例1：构建靶向小鼠MYH9基因内含子2位点的打靶载体
我们早先的研究表明，在小鼠MYH9基因第一个ATG所处的外显子2进行基因替代，其同源重组效率高达90％以上，但是这也同时破坏内源MYH9基因，不利于除基因替代外的其它外源基因的插入。我们考虑是否可以将外源基因靶向整合至MYH9基因内含子2位点，这样不仅可以利用该位点具有的高效同源重组效率，而且可以保持内源基因的完整性。为此，从genome.ucsc.edu网站检索并下载获得小鼠MYH9基因组序列，结合小鼠MYH9mRNA(Genbank No:NM_022410)序列，确定各外显子和内含子位置及序列，特别是第二号内含子。根据MYH9第二号内含子上、下游各6kb基因组序列，利用Primer3软件设计4kb左右长臂和2kb左右短臂PCR引物，选取最佳序列。参照David J.Adams 2005文献报道，获得包含整个MYH9基因的BAC Clone No:bMQ-369E5，并从Chieldren’hospotal Oakland ResearchInstitute购买获得，BAC DNA利用QIAGEN Plasmid Midi Kit(Qiagen)制备备用。以bMQ-369E5BAC DNA为模板利用正向引物MAI2R-F(Pme I)5’-AGCTTTGTTTAAACGAAGATCAAGCTCCCACCTGC(SEQ ID NO.5)和反向引物MAI2R-R(BamH I)5’-CGGGATCCGGAGGCTGAAGCCCTGCCCAG(SEQ ID NO.6)及Platinum Taq DNA Polymerase HighFidelity(Invitrogen)作PCR扩增约2.0kb右侧同源臂(94℃2min,94℃30s,60℃30s,68℃2min,30cycles,68℃10min)，下划线序列为酶切位点。PCR产物经PCR clean-up kit纯化后利用Pme I和BamH I(Fermantas)进行双酶切，而空载体mpNTKV-LoxP(该载体为本实验室构建并正在申报专利)利用Pme I和Bgl II(Fermantas)进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并回收，然后利用T4DNA ligase(Fermantas)将载体与目的片段连接，接着转化至大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测序结果显示右侧同源臂插入成功并命名为mpNTKV-LoxP MAI2R，右侧同源臂序列如SEQ ID NO.2所示。接着，以bMQ-369E5BAC DNA为模板利用正向引物MAI2L-F(Sal I)5’-ACGCGTCGACGAAGTGAAGCTCCTGGCTTTG(SEQ ID NO.3)和反向引物MAI2L-R(Sac II)5’-TCCCCGCGGCTGCATGCAGGGAACAGAGGG(SEQ ID NO.4)及Platinum Taq DNA Polymerase HighFidelity作PCR扩增约4.5kb左侧同源臂(94℃2min,94℃30s,60℃30s,68℃4.5min,30cycles,68℃10min)，下划线序列为酶切位点。PCR产物经PCR clean-up kit纯化后与质粒mpNTKV-LoxP MAI2R一道利用Sal I和Sac II进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并回收，然后将载体与目的片段连接，接着转化至大肠杆菌DH5α,挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测序结果显示左侧同源臂插入成功并命名为mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R(knock-in Neo)，左侧同源臂序列如SEQ IDNO.1和图1所示。此外，用于确定靶向是否成功的PCR引物位置如图1所示，其序列如SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12。
实施例2：靶向整合外源基因的打靶载体的构建
为使外源基因能够靶向整合至MYH9基因内含子2位点，必须将外源基因表达盒插入上述靶向载体中mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R，其过程包括如下：
EF1α-GFP-rGlobin polyA表达盒的构建：以pEF-GFP质粒质粒(Addgene)为模板利用正向引物EF1a-F(Pac I)5’-CCTTAATTAACGTGAGGCTCCGGTGCCCGTC(SEQ ID NO.13)和反向引物rGlobin pA-R(Pac I)5’-CCTTAATTAA CTGCAGGTCGAGGGATCTTCAT及Platinum Taq DNAPolymerase High Fidelity作PCR扩增约2.5kb包括human EF1α启动子、GFP表达序列以及rabbit Globin polyA终止序列的DNA片段(94℃2min,94℃30s,60℃30s,68℃2.5min,30cycles,68℃10min)，下划线序列为酶切位点。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、切出目的条带并利用DNAGel extraction kit(Qiagen)回收DNA片段，接着将该片段连接至T-easy载体(Promega)中，转化至大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序，测序证实无误后进行下一步。
EF1α-GFP-rGlobin polyA表达盒插入靶向载体mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R：利用Pac I(Fermantas)将hEF1α-GFP-rGlobin polyA片段从T-easy载体切出；同时利用Pac I对mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R质粒(以上构建)进行酶切，酶切后利用Shrimp AlkalinePhosphatase(Fermantas)对线性化载体进行去磷酸化处理。经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的和载体条带并回收，然后将载体与目的片段连接，接着转化至大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序以确定插入方向。根据测序结果确定，与MYH9基因转录方向一致的为正向插入称为mpNTKV-LoxP MAI2L-EF1α-GFP-pA-MAI2R(Knock-in EF1α-GFP-pA)，反之则为反向插入称为mpNTKV-LoxP MAI2L-pA-GFP-EF1α-MAI2R(Knock-in pA-GFP-EF1α)，这些载体及序列如图3所示和SEQ ID NO.8、SEQID NO.9所示。这些外源基因定点整合产生的相应突变等位基因分别称为AKI EF1α-GFP-pA，AKI pA-GFP-EF1α。
αMHC-Puro-IRES-GFP-hgh polyA表达盒的构建：以pMSCV Puro-IRES-GFP质粒(Addgene)为模板利用正向引物PIG-F(SalI)5’-ACGCGTCGACATGACCGAGTACAAGCCCACGGTG(SEQ ID NO.15)和反向引物PIG-R(SalI)5’-ACGCGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC(SEQID NO.16)及Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity作PCR扩增约2.0kb包括Puro-IRES-GFP表达序列的DNA片段(94℃2min,94℃30s,60℃30s,68℃2min,30cycles,68℃10min)，下划线序列为酶切位点。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、切出目的条带并利用DNAGel extraction kit回收DNA片段，接着将该片段连接至T-easy载体中，转化至大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序，测序证实无误后进行下一步。利用Sal I(Fermantas)将Puro-IRES-GFP片段从T-easy载体切出；同时利用Sal I对pJG/αMHC质粒(Addgene)进行酶切，酶切后利用Shrimp Alkaline Phosphatase(Fermantas)对线性化载体进行去磷酸化处理。经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的和载体条带并回收，然后将载体与目的片段连接，接着转化至大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序以确定插入方向。根据测序结果确定，与αMHC启动子方向一致的为正向插入称为αMHC-Puro-IRES-GFP-hgh polyA质粒。
αMHC-Puro-IRES-GFP-hgh polyA表达盒插入靶向载体mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R：利用Not I(Fermantas)将αMHC-Puro-IRES-GFP-hgh polyA片段从上述αMHC-Puro-IRES-GFP-hgh polyA质粒中切出，然后利用T4DNA polymease将粘性末端补平；同时利用Swa I对mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R载体(以上构建)进行酶切，酶切后利用ShrimpAlkaline Phosphatase(Fermantas)对线性化载体进行去磷酸化处理。经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的和载体条带并回收，然后将载体与目的片段连接，接着转化至大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序以确定插入方向。根据测序结果确定，与MYH9基因转录方向一致的为正向插入称为mpNTKV-LoxPMAI2L-αMHC-Puro-IRES-GFP-pA-MAI2R(Knock-inαMHC-Puro-IRES-GFP-pA)载体，如图3所示，其序列如SEQ ID NO.10所示。该外源基因定点整合产生的相应突变等位基因称为AKI αMHC-Puro-IRES-GFP-pA。
至此，本发明中拟进行应用的三个靶向整合外源基因的打靶载体构建完毕，如图3所示。
接下来，利用Not I将上述构建的一个靶向打靶载体和三个靶向整合外源基因的打靶载体(100μg)进行线性化处理，然后应用UltraPure Phenol:Chloroform:IsoamylAlcohol(25:24:1,v/v)(Invitrogen)抽提DNA线性化酶切体系两次，高速离心10min后将上清转移至另一新的1.5ml EP管，加入2.5倍上清体积的100％乙醇，充分混融后高速离心10min获得白色DNA沉淀，然后用70％乙醇洗涤DNA沉淀一次，在超净台中去除上清并风干DNA沉淀约10min，待乙醇溶液完全风干后，加入适量TE溶液溶解DNA约2小时以上，测定线性化DNA浓度并调节DNA浓度约为1μg/μl，同时利用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，DNA溶液4℃保存备用。
到此为止，导入细胞的靶向整合外源基因的打靶载体DNA制备完成。
实施例3：靶向整合外源基因的打靶载体导入小鼠胚胎干(ES)细胞
本发明中所使用的滋养层细胞是经γ-射线处理的具有Neomycin抗性的(Neomycin-resistant)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)；小鼠胚胎干细胞系是V6.5具有C57BL/6和129S6vEv杂合遗传背景，均来自美国国立心肺血液研究所转基因中心。所使用的MEF和ES细胞培养液DMEM及所需添加物LIF、NEAA、L-glutamine、HEPES、β-mercaptoethanol、PEN/STREP、Puromycin等，均购自Millipore公司。
用于培养胚胎干细胞的培养皿制备，按如下程序和比例进行：10cm细胞培养皿用3ml 0.1％Gelatin于37℃包被2小时或者4℃包被过夜备用，然后37℃水浴快速解冻MEF细胞、1000rpm离心5min后去上清、重悬，加入2X106 Neomycin-resistant MEFs培养过夜，其它大小培养皿按比例放大和缩小使用量。
ES细胞培养与传代过程是：37℃水浴快速解冻ES细胞、1000rpm离心5min后去上清，重悬后将适量ES细胞接种至上述制备好的培养皿中。ES细胞长至70％丰度以1：3比例传代。
准备用于电转的ES细胞过程是：37℃0.25％胰酶消化细胞4min，反复吹打至单个细胞，并计数，1000rpm离心收集，PBS洗涤一次，按0.5X107个细胞/ml浓度重悬于电转缓冲液中(Millipore)。
ES细胞电转过程是：将0.6ml上述细胞加入含50μg线性化打靶载体DNA的1.5ml EP管中混匀，并转移至Eppendorf电转仪配套电转杯中，室温静置5min。用Eppendorfmultiporator电转仪320V 500μF电转，取出电转杯室温放置5min。转移至含30ml培养液的50ml离心管中混匀，再均匀分配至事先准备好含滋养层细胞的3个10cm培养皿中，37℃5％CO2培养箱中培养。
ES细胞药物处理过程是：电转后的ES细胞在24小时后，换成含800μg/ml G418和200μM ganciclovir培养液，此后每天更换含药物的培养液
ES细胞单克隆挑选、培养与冻存过程是：连续药物处理7天后，在尼康SMZ1500显微镜下用特制吸管挑取胚胎干细胞单克隆并转移至事先准备好的含滋养层细胞及培养液的48孔培养板中，每种打靶载体各挑取30个左右单克隆，于37℃5％CO2培养箱中培养。24小时后，用胰酶消化挑取的单克隆细胞并吹打6次，再转移至新的事先准备好的含滋养层细胞及培养液的48孔培养板中，于37℃5％CO2培养箱中培养3-4天，每天换液。待单克隆细胞长至80％丰度，细胞经胰酶消化、吹打、培养基中和后，将1/3细胞悬液转移至事先准备好的含滋养层细胞及培养液的24孔培养板中，并于37℃5％CO2培养箱中培养至细胞丰度达90％，用于制备基因组DNA；向剩余在48孔培养板的细胞悬液中加入等体积的2X胚胎干细胞冻存液(Millipore)，用Parafilm封好培养板四周再包裹两层以上吸水纸，储存在-80℃冰箱备后续利用。
实施例4:外源基因靶向整合至MYH9内含子2位点的阳性ES细胞单克隆的筛选与鉴定
基因组DNA制备：移去培养在上述24孔板中的经药物筛选的ES单克隆细胞的培养液，PBS洗涤一次，加入600μl含RNaseA的Nuclei lysis solution(Promega)，反复吹打并转移至一干净EP管中，加入200μl Protein precipitation solution，有力地振荡30s后，冰上放置5min，接着高速离心10min，然后转移上清至一新EP管；加入等体积的Isopropanol并充分混匀，接着室温高速离心10min，然后去除上清；用1ml 70％乙醇洗涤DNA沉淀一次，再高速离心5min，然后用真空泵吸去上清，室温风干10-15min，最后加入100μl DNARehydration solution，于37℃溶解DNA 2小时或者4℃溶解过夜并保存备用。
PCR筛选与鉴定：我们以前的研究表明，利用Southern Blot和PCR方法筛选与鉴定获得一致的结果，因此本发明中主要利用PCR方法对同源重组事件进行分析和确定。以提取的小鼠ES细胞基因组DNA为模板利用P1 5’-ATGAGGAAATTGCATCGCATTGTC(SEQ ID NO.11)和P2 5’-GGAACCTCGATGCGCATACATAG(SEQ ID NO.12)及Platinum Taq High Fidelity DNAPolymerase进行PCR反应，其中P1位于Neomycin 3’末端，P2位于右侧同源臂下游。PCR反应条件是94℃3min,94℃30s,60℃30s,68℃140s,30cycles,68℃10min。PCR扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，若为野生型等位基因A+则无条带，若为突变型等位基因AKI Neo、AKI EF1α-GFP-pA、AKI pA-GFP-EF1α、AKI αMHC-Puro-IRES-GFP-pA皆可产生约2.2kb条带。
PCR反应特异性确认：为确认该2.2kb DNA条带的特异性，随机从每一种打靶载体产生的阳性细胞单克隆中挑取一个，进行二次证实，并将该2.2kb DNA条带从琼脂糖凝胶中切出，经DNA extraction kit回收后，连接至T-easy载体中，经转化、细菌单克隆随机挑取和培养、质粒DNA制备、酶切初步鉴定等过程，最后送商业公司测序。测序结果表明，完全符合预期序列，从而证实该2.2kb条带是由于MYH9基因内含子2位点发生特异性突变所产生的。各靶向整合外源基因的打靶载体在小鼠ES细胞中发生同源重组的效率如表1所示。
表1：基因打靶同源重组效率
实施例5：定点敲入基因的表达分析
如上述所示，在本发明中每种靶向整合外源基因的打靶载体皆获得多个阳性细胞单克隆，为此随机从上述48孔培养板中挑取一个单克隆细胞进行定点敲入基因的表达分析，并与对照的野生型ES细胞进行比较。本发明中使用无组织特异性启动子EF1α和组织特异性启动子αMHC调控插入基因的表达，接下来将分别进行分析。
无组织特异性启动子EF1α调控下的基因表达分析：在37℃解冻冻存于48孔培养板中的ES细胞，随机挑取一个A+/AKI EF1α-GFP-pA,A+/AKI pA-GFP-EF1α和A+/A+(对照)基因型ES单克隆细胞，转移至1.5ml EP管中，1000rpm离心5min，去除上清，重悬细胞，然后接种至事先准备好的含滋养层细胞及培养基的6孔细胞培养板内，ES细胞培养、传代和冻存按例行方法进行。接种约1000个ES细胞至一35x10mm Tissue Culture Dish(Thermo Fisher)中，正常条件下培养3天后，在荧光显微镜下观察并摄取活细胞图像，结果显示EF1α启动子调控下的GFP蛋白发出强烈荧光信号，而野生型ES细胞则无荧光，并且正向、反向插入表达盒的两种细胞之间荧光信号强度无明显差异，由此充分说明定点插入MYH9基因内含子2位点的外源基因表达正常且与插入反向无关，如图4所示。
组织特异性启动子αMHC调控下的基因表达分析：在37℃解冻冻存于48孔培养板中的ES细胞，随机挑取一个A+/AKI αMHC-Puro-IRES-GFP-pA和A+/A+(对照)基因型ES单克隆细胞，于一个10cm tissue culture dish中扩增培养，待长至70％以上丰度，利用胰酶消化细胞，吹打成单个细胞，1000rpm离心5min去除上清，再使用不含胚胎干细胞分化抑制剂LIF但含20％FCS的DMEM培养基重悬并配制成2X105cells/ml细胞悬液。将30μL/滴的单细胞悬液点至直径10cm的培养皿盖内面上，获得多个彼此分开的小滴；在培养皿中加入15mL无菌D-Hank’s缓冲液，然后小心盖上培养皿盖，放置在37℃5％CO2培养箱中倒悬培养2天。用无菌吸管收集单个悬滴形成的拟胚体，转入含100ng/ml重组人类Activin A蛋白(R&D Systems)的分化培养基的6孔细胞培养板中于37℃5％CO2培养箱培养24小时，然后换成含10ng/ml重组人类BMP4蛋白(R&D Systems)的分化培养基继续培养96小时。在分化培养液中共计培养5天后，换成含10μg/ml Puromycin的正常培养基处理拟胚体状细胞7天。换液过程中，将细胞用吸管转入15ml无菌管中并使用200rpm低速离心5min方法去除上清。从分化培养基中培养开始至药物处理整个过程中，用荧光显微镜摄取拟胚体实时图像，并观察心肌细胞(群)的自主节律性收缩。结果表明自分化两天后，A+/AKI αMHC-Puro-IRES-GFP-pA拟胚体可见微弱GFP荧光信号，而A+/A+拟胚体无荧光；药物处理7天后，A+/AKI αMHC-Puro-IRES-GFP-pA拟胚体可见强烈荧光，并伴随自主节律性收缩，而A+/A+拟胚体不仅无荧光，还因药物处理逐步凋亡，如图5所示。
实施例6：定点插入的外源基因对内源MYH9基因表达的影响分析
采用蛋白质印记实验分析定点插入的外源基因对内源MYH9基因的表达进行分析。如实施例5在6孔板中培养A+/AKI EF1α-GFP-pA,A+/A KI pA-GFP-EF1α和A+/A+(对照)基因型ES单克隆细胞直到长至80％以上丰度，移去培养基，PBS洗涤细胞一次，然后直接加入0.3ml 2X SDS Sample Buffer(Thermo Fisher)裂解细胞。从上述细胞中提取的蛋白经10％SDS-PAGE Gel电泳分离，转移至PVDF膜，1小时5％milk封闭；根据分子量大小将膜分成两半，一部分与Anti-NMHC IIA antibody和另一部分与Anti-βactin antibody(Abcam)4℃孵育过夜，洗膜，与Anti-mouse HRP(Abcam)室温孵育2小时，再洗膜，最后经辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法(Pierce)获得结果，扫描胶片，利用Image J进行图片灰度分析。以NMHCIIA/β-actin比值衡量和比较NMHC IIA在不同细胞中的表达量变化。结果显示，与A+/A+(对照)细胞比较，A+/AKI EF1α-GFP-pA和A+/A KI pA-GFP-EF1α细胞中NMHC IIA的表达量几乎一致，表明定点插入MYH9基因内含子2位点的外源基因对内源MYH9基因不产生任何影响，从而确定MYH9基因内含子2位点完全可以作为一个新的外源基因插入的safe harbor。

Claims (6)

1.一种靶向打靶载体，其特征在于，所述靶向打靶载体序列如SEQ ID NO.7所示，命名为mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R载体。
2.如权利要求1所述靶向打靶载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)构建空载体mpNTKV-LoxP，所述空载体mpNTKV-LoxP序列如SEQ ID NO.17所示；
(2)以bMQ-369E5 BAC DNA为模板，利用序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.1所示的左侧同源臂；以bMQ-369E5 BAC DNA为模板，利用序列如SEQ ID NO.5所示的正向引和序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.2所示的右侧同源臂；
(3)将左侧同源臂和右侧同源臂插入空载体mpNTKV-LoxP中，即得靶向打靶载体mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R载体。
3.如权利要求1所述靶向打靶载体在靶向整合外源基因至MYH9 Intron2位点构建小鼠胚胎干细胞株中的应用。
4.一种靶向整合外源基因至MYH9 Intron2位点构建小鼠胚胎干细胞株的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1所述的靶向打靶载体将外源基因靶向整合至MYH9 Intron2位点。
5.整合外源基因的打靶载体，其特征在于，所述整合外源基因的打靶载体是将构建的外源基因表达盒插入权利要求1所述的靶向打靶载体中左侧同源臂和抗性基因Neomycin之间而构建成的。
6.如权利要求5所述的整合外源基因的打靶载体，其特征在于，所述整合外源基因的打靶载体序列如SEQ ID NO.8所示，命名为mpNTKV-LoxP MAI2L-EF1α-GFP-pA-MAI2R载体；或者，所述整合外源基因的打靶载体序列如SEQ ID NO.9所示，命名为mpNTKV-LoxP MAI2L-pA-GFP-EF1α-MAI2R载体；或者，所述整合外源基因的打靶载体序列如SEQ ID NO.10所示，命名为mpNTKV-LoxP MAI2L-αMHC-Puro-IRES-GFP-pA-MAI2R载体。
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