CN103232977A - phiC31重组酶系统和piggyBac转座子的应用及其家蚕定点转基因系统和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种phiC31重组酶系统和piggyBac转座子的应用及其家蚕定点转基因系统和制备方法，将phiC31重组酶系统和piggyBac转座子介导家蚕转化的转基因技术相结合，先piggyBac转座载体中连入2个同向排列的attB位点或attP位点，并将此载体转化家蚕，然后筛选单拷贝转基因家蚕作为靶品系，再利用phiC31重组酶与两端由同向的attB位点或attP位点锚定目的基因表达框的载体转化靶品系，即可实现目的基因表达框定点转化至piggyBac转座载体的2个attB位点或attP位点之间，从而实现家蚕定点转基因的目的，其操作方法简单，为家蚕基因功能研究提供了有力的工具。

Description

phiC31重组酶系统和piggyBac转座子的应用及其家蚕定点转基因系统和制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种phiC31重组酶系统和piggyBac转座子在制备家蚕定点转基因中的应用，还涉及含有phiC31重组酶系统和piggyBac转座子的家蚕定点转基因系统和利用该系统的制备定点转基因家蚕的方法。 

背景技术

中国是一个蚕丝大国，也是古代丝绸之路的发源地。家蚕是目前世界上人类利用的最成功和最悠久的经济昆虫之一，家蚕的驯化、饲养已有约五千年历史。家蚕作为一种相当重要的鳞翅目模式生物，具有深入研究的重要价值和意义。随着家蚕基因组框架图、精细图和遗传突变图谱的完成，标志着家蚕基因组研究已逐步进入功能基因组时代。基因功能研究技术平台和特异位点突变材料是推动家蚕功能基因组深入研究的关键，也是推动家蚕作为鳞翅目昆虫模式化的关键。家蚕研究领域，常用piggyBac和Minos转座子系统获得的转基因家蚕，但是上述方法均是通过转座子介导外源基因随机插入家蚕基因组内。由于外源基因在染色体的插入位置或插入拷贝数不同，会导致外源基因的表达受到位置效应的影响，并且可能导致宿主自身所含基因的突变失活，即插入突变现象。而利用位点特异性重组（Site-specific recombination，SSR）技术则能够有效克服转座子介导的外源基因在基因组随机整合而不具有靶向性和易受整合的位置效应影响等缺点。 

位点特异性重组技术是目前实现基因定点插入与定点敲除最有效的手段之一，其作为一项十分有效的、高靶向性的基因功能研究和遗传改造的方法体系，已被广泛应用于拟南芥、小鼠、果蝇等多种模式生物，正逐渐成为转基因动植物研究领域进行基因操作的强有力工具。目前最常用的位点特异性重组系统包括FLP/FRT、Cre/loxP和phiC31/att系统。链霉菌噬菌体phiC31整合酶作为丝氨酸重组酶家族的成员，可催化细菌附着位点（attB位点）和噬菌体附着位点（attP位点）间发生有效的单向性重组。attB位点和attP位点的最小长度分别为34-bp和39-bp，attB位点和attP位点重组后产生attL和attR2个不同序列的重组位点。在没有辅因子的情况下，phiC31整合酶无法再介导attL和attR位点间发生重组反应。这种不可逆的重组以及较短重组位点的特点吸引了许多研究者进一步研究phiC31整合酶在高等真核生物遗传工程的潜在应用价值。目前，phiC31/att系统已经被广泛应用于拟南芥、小麦、烟草、小鼠， 果蝇，蚊子、爪蟾、斑马鱼等高等真核生物的研究中，实现了基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变、染色体大片段删除等基因工程操作。在家蚕研究中，Nakayama等人于2006年利用phiC31/att系统在体外培养的BmN4细胞系中实现了染色体上和染色体外识别位点间的重组；Yonemura等人于2012年在家蚕胚胎中实现了利用phiC31整合酶实现的质粒之间的盒式交换反应（phiC31integrase-RMCE）。以上研究证实了phiC31整合酶在家蚕细胞和胚胎中的活性。但是，基于phiC31/att系统的位点特异性整合技术体系尚未在家蚕个体水平上建立。因此，探索利用phiC31/att系统的位点特异性重组技术来实现家蚕定点转基因的方法，为有效消除插入位置效应对基因表达的影响，为家蚕的基因功能研究、不同蛋白表达研究等提供良好的基础，同时这也是推动家蚕功能基因组研究发展的需要和必然。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种phiC31重组酶系统和piggyBac转座子的在制备家蚕定点转基因中的应用；本发明的目的之二在于提供含有phiC31重组酶系统和piggyBac转座子的家蚕定点转基因系统；本发明的目的之三在于提供利用家蚕定点转基因系统制备转基因家蚕的方法。 

为实现上述发明目的，技术方案为： 

1.phiC31重组酶系统和piggyBac转座子在制备家蚕定点转基因系统中的应用。 

2.基于phiC31重组酶系统和piggyBac转座子的家蚕定点转基因系统，包括piggyBac重组载体、含目的基因表达框的重组载体和phiC31重组酶，所述piggyBac重组载体中含有2个同向排列的attB位点或attP位点，所述含目的基因表达框的重组载体的目的基因表达框两端锚定有同向的attP位点或attB位点。 

优选的，所述piggyBac重组载体的attB位点或attP位点5’端含有以眼神经组织特异启动子3×P3启动红色荧光蛋白表达的表达框。该表达框也可以表达其他标记物，只要能够实现筛选目的即能实现发明目的。 

更优选的，所述piggyBac重组载体由如下步骤制备：将2个attB位点或attP位点通过酶切位点连入pSLfa1180fa载体中，用AscI单酶切后回收含2个同向排列attB位点或attP位点的片段，然后连入pBac[3×P3-DsRedaf]载体，得piggyBac重组载体。piggyBac重组载体也可以采用其他方法构建，只要在载体中含有不影响其他功能基因表达的两个同向排列的attB位点或attP位点即可。 

更优选的，2个attB位点或attP位点其中一个通过SpeI和XhoI连入pSLfa1180fa载体中， 另一个通过SphI和BglII连入pSLfa1180fa载体中。 

优选的，所述含目的基因表达框为以眼和神经特异启动子启动绿色荧光蛋白表达的表达框。 

最优选的，所述attP位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第6-44位所示；所述attB位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.5第3-39位所示。 

3.利用所述家蚕定点转基因系统制备定点转基因家蚕的方法，包括如下步骤： 

a.将piggyBac重组载体和辅助质粒转化解除滞育的蚕卵，筛选单拷贝转基因家蚕，然后通过连续自交建立转基因靶品系； 

b.将步骤a所得转基因靶品系产生的蚕卵用含目的基因表达框的重组载体和phiC31重组酶表达体转化，即获得定点转基因家蚕。 

优选的，所述phiC31重组酶表达体为表达phiC31重组酶的载体或phiC31重组酶mRNA。 

更优选的，所述辅助质粒为pHA3PIG。 

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种家蚕定点转基因的方法，首次将phiC31/att系统与piggyBac转座子介导的家蚕转基因技术相结合，从而有效地突破了家蚕定点转基因技术的瓶颈。利用上述技术路线，可以有效地实现家蚕定点转基因，其具有以下的明显优势： 

①本发明家蚕定点转基因的方法，可实现将外源目的基因定点整合至预先确定的家蚕染色体靶位点，从而能够有效克服单纯依靠piggyBac等转座子介导的外源目的基因在家蚕基因组随机整合而不具有靶向性和易受整合的位置效应影响等缺点；②本发明首先利用piggyBac转座子在家蚕基因组插入的随机性，可建立在家蚕染色体不同位置含有靶位点插入的多个转基因靶品系，一旦筛选到外源目的基因表达水平最高的一个靶品系，该转基因靶品系含有的靶位点即可作为外源基因的接纳位点，随后利用本发明定点转基因的方法将有用蛋白基因表达框定点整合至该接纳位点，即能够实现用外源蛋白在家蚕体内的高效表达，建立高效稳定的家蚕生物反应器；③本发明通过家蚕胚胎显微注射phiC31整合酶表达载体或phiC31整合酶mRNA的方法引入phiC31整合酶的表达，利用phiC31整合酶在发育早期的家蚕胚胎中介导外源基因在靶位点的定点整合，由于phiC31整合酶表达载体和phiC31整合酶mRNA会在家蚕发育过程中逐渐降解，从而有效避免了因phiC31整合酶在家蚕体内的过量积累而产生毒性的风险；④本发明中供体质粒设计简便，外源目的基因表达框经简单的酶切连接即可成为用于定点转基因的供体质粒。 

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图： 

图1家蚕转基因重组载体pBac{3×P3-DsRed；attP/attP}和供体质粒pSL{attB-3×P3-EGFP-SV40-attB}结构示意图（A：重组载体pBac{3×P3-DsRed；attP/attP}；B：供体质粒pSL{attB-3×P3-EGFP-SV40-attB}）。 

图2为家蚕转基因重组载体pBac{3×P3-DsRed；attB/attB}和供体质粒pSL{attP-3×P3-EGFP-SV40-attP}结构示意图（A：重组载体pBac{3×P3-DsRed；attB/attB}；B：供体质粒pSL{attP-3×P3-EGFP-SV40-attP}）。 

图3为phiC31整合酶表达载体pSLA3-Int和原核表达载体pET-Int结构示意图（A：表达载体pSLA3-Int；B：原核表达载体pET-Int）。 

图4为G0代非滞育蚕卵显微注射重组载体pBac{3×P3-DsRed；attP/attP}与辅助质粒pHA3PIG混合液后的荧光显微镜观察结果图。 

图5为G1-P转基因家蚕检测结果图（A：Southern blotting检测；B：inverse PCR检测）。 

图6为转重组载体pBac{3×P3-DsRed；attP/attP}的转基因家蚕基因组结构示意图。 

图7为显微注射pSLA3-Int和供体质粒pSL{attB-3×P3-EGFP-SV40-attB}筛选到阳性转基因家蚕在白光、红色荧光和绿色荧光下的观察结果图。 

图8为阳性定点转基因家蚕检测结果图（A：Southern blotting检测；B：基因组PCR检测，WT表示非转基因家蚕，TTS1-P表示重组前转基因家蚕，TTS3-P(1，2，3）表示阳性定点转基因家蚕）。 

图9为phiC31整合酶介导供体质粒pSL{attB-3×P3-EGFP-SV40-attB}定点整合示意图。 

图10为G0代非滞育蚕卵注射重组载体pBac{3×P3-DsRed；attB/attB}与辅助质粒pHA3PIG的混合液后的荧光显微镜观察结果。 

图11为G1代阳性转基因家蚕的基因组结构示意图。 

图12为注射pSLA3-Int和供体质粒pSL{attP-3×P3-EGFP-SV40-attP}混合物后筛选到阳性转基因家蚕个体在白光、红色荧光和绿色荧光下的观察结果。 

图13为阳性定点转基因家蚕个体的检测结果图（A：Southern blotting检测；B：基因组PCR检测；WT表示非转基因家蚕；TTS1-B表示重组前转基因家蚕；TTS3-B-1,2,3表示阳性定点转基因家蚕）。 

图14为phiC31整合酶介导的供体质粒pSL{attP-3×P3-EGFP-SV40-attP}定点整合示意图。 

图15为注射phiC31整合酶mRNA和供体质粒pSL{attP-3×P3-EGFP-SV40-attP}混合物阳性转基因家蚕个体在白光、红色荧光和绿色荧光下的观察结果。 

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

本发明中使用的pCMVInt载体由美国斯坦福大学Michele P.Calos博士馈赠，并提供载体全序列。 

实施例1 

一、构建家蚕转基因重组载体pBac{3×P3-DsRed；attP/attP} 

依据目前家蚕基于piggyBac转座载体的制备转基因家蚕的要求，构建家蚕转基因重组载体pBac{3×P3-DsRed；attP/attP}（图1A）。具体步骤方法如下：合成attP1-SpeI/XhoI-F：5’-ctagtccccaactggggtaacctttgagttctctcagttgggggc-3’（SEQ ID NO.1），attP1-SpeI/XhoI-R5’-tcgagcccccaactgagagaactcaaaggttaccccagttgggga-3’（SEQ ID NO.2），attP2-SphI/BglII-F：5’-ccccaactggggtaacctttgagttctctcagttggggga-3’（SEQ ID NO.3）和attP2-SphI/BglII-R：5’-gatctcccccaactgagagaactcaaaggttaccccagttggggcatg-3’（SEQ ID NO.4）四条核苷酸序列，下划线表示酶切位点粘性末端。将合成的SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2在温度为95℃预变性5min，然后每60s降温1℃，降至25℃时保温5min，最后4℃保存，得attP位点Ⅰ，退火形成核苷酸链带SpeI/XhoI粘性末端；将SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4在温度为95℃预变性5min，然后每60s降温1℃，降至25℃时保温5min，最后4℃保存，得attP位点Ⅱ，退火形成的核苷酸链带SphI/BglII粘性末端。然后将attP位点Ⅰ和attP位点Ⅱ分别通过SpeI/XhoI和SphI/BglII连入pSLfa1180fa载体（Carsten Horn.et al2000）形成pSL{attP/attP}，再用AscI单酶切pSL{attP/attP}载体，回收384bp的包含2个同向排列attP位点的片段并连接入pBac[3×P3-DsRedaf]（Aichun Zhao.et al2010）载体，形成重组载体pBac{3×P3-DsRed；attP/attP}。 

构建的重组载体pBac{3×P3-DsRed；attP/attP}以眼神经组织特异启动子3×P3启动的红色荧光蛋白（DsRed）作为筛选标记，其后含有2个同向排列的39bp的attP位点。 

二、供体质粒pSL{attB-3×P3-EGFP-SV40-attB}的构建 

以pSLfa1180fa为基础载体，构建被2个同向排列的34bp的attB位点锚定目的基因表达框的序列，并将该表达框连接进入pSLfa1180fa载体产生供体质粒（图1B）。具体构建步骤如 下：合成attB1-SpeI/XhoI-F：5’-ctagtgtgccagggcgtgcccttgggctccccgggcgcgc-3’（SEQ ID NO.5），attB1-SpeI/XhoI-R：5’-tcgagcgcgcccggggagcccaagggcacgccctggcaca-3’（SEQ ID NO.6），attB2-SphI/BglII-F：5’-cgtgccagggcgtgcccttgggctccccgggcgcga-3’（SEQ ID NO.7）和attB2-SphI/BglII-R：5’-gatctcgcgcccggggagcccaagggcacgccctggcacgcatg-3’（SEQ ID NO.8）四条核苷酸序列，下划线表示酶切位点粘性末端。将合成的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6在95℃预变性5min，然后每60s降温1℃，至25℃时保温5min，最后于4℃保存，得attB位点Ⅰ，所得核苷酸序列两端含有SpeI和XhoI粘性末端；将SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8在95℃预变性5min，然后每60s降温1℃，至25℃时保温5min，最后于4℃保存，得attB位点Ⅱ，所得核苷酸序列两端含有SphI和BglII酶切位点的粘性末端。将获得的attB位点Ⅰ和attB位点Ⅱ分别通过SpeI与XhoI以及SphI与BglII连入pSLfa1180fa载体中，形成pSL{attB/attB}。 

将pSL{3×P3-EGFP-SV40}载体（参见Long,D.P.,Zhao,A.C.,Chen,X.J.,Zhang,Y.,Lu,W.J.,Guo,Q.,Handler,A.M.,Xiang,Z.H.,2012.FLP recombinase-mediated site-specific recombination in silkworm,Bombyx mori.PloS One7,e40150.GenBank：KC897088）利用XhoI/SphI双酶切，回收1.3kb的3×P3-EGFP-SV40表达框序列，将其连接入相同酶切的pSL{attB/attB}载体，形成供体质粒pSL{attB-3×P3-EGFP-SV40-attB}。 

三、构建家蚕转基因重组载体pBac{3×P3-DsRed；attB/attB} 

依据现有技术中基于piggyBac转座载体的获得转基因家蚕技术，构建家蚕转基因重组载体pBac{3×P3-DsRed；attB/attB}（图2A）。具体构建方法如下：用AscI单酶切上述得到的pSL{attB/attB}载体，回收375bp的包含2个attB位点同向排列的片段并连接入pBac{3×P3-DsRedaf}载体，形成重组载体pBac{3×P3-DsRed；attB/attB}。构建的重组载体pBac{3×P3-DsRed；attB/attB}以眼神经组织特异启动子3×P3启动的红色荧光蛋白（DsRed）作为筛选标记，其后含有2个同向排列的34bp的attB位点。 

四、供体质粒pSL{attP-3×P3-EGFP-SV40-attP}的构建 

以pSLfa1180fa为基础载体，构建含有被2个同向的长度为39bp的attP位点锚定目的基因表达框的序列，并将该表达框连接进入pSLfa1180fa载体产生供体质粒（图2B）。具体构建方法如下：利用XhoI/SphI双酶切pSL{3×P3-EGFP-SV40}载体，回收1.3kb的3×P3-EGFP-SV40表达框序列，将其连接入经相同酶切的pSL{attP/attP}载体，形成供体质粒pSL{attP-3×P3-EGFP-SV40-attP}。 

五、phiC31整合酶表达载体的构建 

根据phiC31整合酶基因序列（GenBank：GU564445.1）设计扩增引物，上游引物 Int-F-KpnI：5’-tataggtaccgtcgccgacatgacaca-3’（SEQ ID NO.9），下划线为KpnI酶切位点；下游引物Int-R-SphI：5’-tatagcatgcacgcgtaagcttggg-3’（SEQ ID NO.10），下划线为SphI酶切位点，然后以pCMVInt载体（参见Groth,A.C.,Olivares,E.C.,Thyagarajan,B.,Calos,M.P.,2000.A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A97,5995–6000.）为模板进行PCR扩增，PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min进行30个循环，然后72℃延伸8min，最后4℃保存，PCR扩增得到1.9kb的phiC31整合酶基因片段，经KpnI/SphI双酶切后连接进入pSLfa1180fa载体形成pSL-Int。 

根据家蚕肌动蛋白A3多聚腺苷酸信号序列（A3polyA）（GenBank：U49854.1）设计扩增引物，上游引物A3polyA-F-SphI：5’-gcatgcatgcaggaagtgcttctaagcgt-3’（SEQ ID NO.11），下划线为SphI酶切位点；下游引物A3polyA-R-BamHI：5’-gcatggatccgtgctcctagcgtaactgtc-3’（SEQ ID NO.12），下划线为BamHI酶切位点，然后以家蚕基因组为模板进行PCR扩增，PCR扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，57.5℃退火30s，72℃延伸30s进行30个循环，然后72℃延伸5min，最后4℃保存，经PCR扩增得到0.37kb的家蚕肌动蛋白A3多聚腺苷酸信号序列（A3polyA）片段，然后经SphI/BamHI双酶切连接进入pSL-Int载体形成pSL-Int-A3polyA。 

根据家蚕A3启动子序列（GenBank：U49854.1）设计扩增引物，上游引物A3-F-SacI：5’-tatcgagctcatgcgcgttaccatatatggtg-3'（SEQ ID NO.13），下划线为SacI酶切位点；下游引物A3-R-KpnI：5'-tataggtacccttgaattagtctgcaagaaaag-3'（SEQ ID NO.14），下划线为KpnI酶切位点，然后以pHA3PIG质粒为模板，进行PCR扩增，PCR扩增条件是94℃预变性5min；94℃变形30s，60℃退火30s，72℃延伸35s进行30个循环，然后72℃延伸5min，最后4℃保存，扩增得到0.65kb的家蚕A3启动子片段，然后经SacI/KpnI双酶切连接进入pSL-Int-A3polyA载体形成phiC31整合酶表达载体pSLA3-Int（图3A）。 

六、构建体外转录phiC31整合酶mRNA的原核表达载体 

根据phiC31整合酶基因序列设计扩增引物，上游引物Int-F-NcoI：5’-aatccatgggcatgacacaaggggttgtg-3’（SEQ ID NO.15），下划线为NcoI酶切位点；下游引物Int-R-XhoI5’-atactcgagctacgccgctacgtcttc-3’（SEQ ID NO.16），下划线为XhoI酶切位点，然后同样以pCMVInt载体为模板进行PCR扩增，PCR扩增条件为94℃预变性5min；94℃变形30s，60℃退火30s，72℃延伸2min进行30个循环，然后72℃延伸8min，最后4℃保存，经PCR扩增得到1.9kb的phiC31整合酶基因片段。将扩增得到的基因片段连接pMD19-T simple 载体（Takara）形成T-Int质粒，由于phiC31整合酶基因序列中含有一个NcoI酶切位点，因此用NcoI和XhoI不完全酶切T-Int质粒，然后将酶切获得1.9kb的目的片段连接入pET28a（+）载体（Novagen），形成重组原核表达载体pET-Int（图3B）。 

七、phC31整合酶mRNA的制备 

用XhoI酶切所得重组原核表达载体pET-Int使其完全线性化，随后用酚/氯仿抽提纯化酶切产物，并用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。然后参照mMESSAGE

T7Ultra Kit说明书对phiC31整合酶的体外转录产物进行加帽和加尾反应，20μL体系的加帽反应混合体系中含有1μg线性化质粒，混匀后于37℃水浴下加帽反应2小时，然后加入1μL DNaseI，并于37℃水浴条件下孵育15分钟终止反应；在完全终止加帽反应的混合体系中加入加尾反应试剂，混匀后于37℃水浴孵育1小时完成加尾反应，最后用MEGAclear^TM Kit回收加帽加尾反应后的phiC31整合酶mRNA，并用RNAse-free Water溶解并保存于-80℃待用。 

实施例2 

一、转基因靶品系的建立 

用二化滞育家蚕品系大造作为原始材料，亲代蚕卵经16℃低温催青处理以解除子代蚕卵的滞育；将10-15nL总浓度为400ng/μL的重组载体pBac{3×P3-DsRed；attP/attP}与辅助质粒pHA3PIG的混合液注射至解除滞育的294粒G0代蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25℃、相对湿度为85%的环境中催青孵化，孵化获得80头G0代蚁蚕，然后将蚁蚕用桑叶饲养至化蛾，获得74头G0代蚕蛾，将获得的蚕蛾通过回交共获得40圈G1代蚕卵，用

电动宏观荧光显微镜观察，然后筛选发红色荧光的蛾圈，结果如图4所示。经筛选获得3个发红色荧光的蛾圈，共获得27头在眼部发红色荧光的阳性转基因家蚕，其转化效率为7.5%。将获得的发红色荧光的阳性转基因家蚕利用inverse PCR和Southern blotting鉴定，并将检测转基因个体命名为G1-P，检测结果如图5所示。结果显示，在其中1个阳性蛾圈中piggyBac转座子在G1代转基因家蚕染色体中系单拷贝数插入，插入位点定位至第20号染色体，所得G1代转基因家蚕基因组的结构示意图如图6所示。将该蛾圈的G1代阳性转基因蚕蛾自交并连续传代培养七代，将获得的纯合G8代转基因家蚕系作为转基因靶品系1代（Transgenic target strain1，TTS1），即建立转基因靶品系TTS1-P。 

二、建立定点转基因家蚕系 

将浓度为1000ng/μL的供体质粒pSL{attB-3×P3-EGFP-SV40-attB}和浓度为600ng/μL的pSLA3-Int质粒混合液通过显微注射导入由转基因靶品系1代蚕蛾自交获得的241粒非滞育TTS2-P蚕卵中；随后用无毒的胶水封闭注射孔（注意注射需在蚕卵产下后6小时内完成）； 将注射完成的蚕卵在质量分数为35-37%的甲醛蒸气中消毒5min，然后置于25℃、相对湿度85%的条件下催青直到孵化，将孵化的115头TTS2-P蚁蚕饲养至化蛾，获得28头TTS2-P蚕蛾，然后将获得的蚕蛾通过回交获得22圈TTS3-P蚕卵，所得蚕卵用

电动宏观荧光显微镜观察，观察眼部同时发红色和绿色荧光的阳性定点转基因家蚕（图7）。结果表明获得1个含有定点转基因家蚕个体的阳性蛾圈，共获得5头在眼部同时发红色和绿色荧光的阳性定点转基因家蚕，重组效率为4.55%。提取阳性定点转基因家蚕的基因组DNA，用基因组PCR和Southern blotting验证，结果如图8所示。结果显示位于供体质粒上的2个attB分别和TTS2-P家蚕基因组中的2个attP位点发生了位点特异性重组反应，从而介导3×P3-EGFP-SV40表达框定点整合至靶品系家蚕基因组，其原理如图9所示。最后，将获得的阳性定点转基因个体饲养、传代，即完成阳性定点转基因家蚕系的建立。 

实施例3 

用二化滞育家蚕品系大造作为原始材料，亲代蚕卵经16℃低温催青处理以解除子代蚕卵的滞育，将10-15nL总浓度为400ng/μL的重组载体pBac{3×P3-DsRed；attB/attB}与辅助质粒pHA3PIG的混合液注射至解除滞育的108粒G0代蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25℃、相对湿度为85%的高湿度环境中催青孵化，将孵化的10头G0代蚁蚕桑叶收集饲养至化蛾，获得8头G0代蚕蛾，通过回交共获得50圈G1代蚕卵，用

电动宏观荧光显微镜观察，结果如图10所示。通过观察筛选获得1个发红色荧光的蛾圈，共获得1头在眼部发红色荧光的阳性转基因蚕，其转化效率为20%，所得阳性转基因家蚕的基因组结构示意图如图11所示。将获得的该头G1代阳性转基因蚕饲养至化蛾，并将蚕蛾回交以获得G2代阳性家蚕，然后经inverse PCR和Southern blotting鉴定，并将检测转基因个体命名为G1-B（图5）。结果显示piggyBac转座子在G1-B转基因家蚕的G1代阳性转基因家蚕染色体中系单拷贝数插入，插入位点定位至第1号染色体；筛选由该蚕蛾回交产生的G2代蛾圈，并将阳性转基因蚕蛾自交并连续传代培养六代，获得的G8代转基因家蚕系（包含纯合的雄性家蚕和半合子的雌性家蚕个体）。将获得的G8代转基因家蚕系作为转基因靶品系1代（Transgenic target strain1，TTS1），即建立转基因靶品系TTS1-B。 

通过显微注射将浓度为1000ng/μL的pSL{attP-3×P3-EGFP-SV40-attP}质粒和浓度为600ng/μL的pSLA3-Int质粒混合液共同导入到由TTS1-B代蚕蛾自交获得的480粒非滞育TTS2-B蚕卵中；随后用无毒的胶水封闭注射孔（注意注射需在蚕卵产下后6小时内完成）；将注射完成的蚕卵在质量分数为35-37%的甲醛蒸气中消毒5min，然后置于25℃、相对湿度85%的条件下催青直到孵化，将孵化的313头TTS2-B蚁蚕饲养至化蛾，获得120头TTS2-B 蚕蛾，然后通过回交共获得104圈TTS3-B蚕卵，用

电动宏观荧光显微镜观察，结果如图12所示。结果表明共获得3个定点转基因家蚕的阳性蛾圈，共获得23头在眼部同时发红色和绿色荧光的定点转基因家蚕，重组效率为2.88%。提取阳性定点转基因家蚕个体基因组DNA，经基因组PCR和Southern blotting验证，结果如图13所示。结果显示位于供体质粒上的2个attP分别和TTS2-B家蚕基因组中的2个attB位点发生了位点特异性重组反应，从而介导3×P3-EGFP-SV40表达框定点整合至靶品系家蚕基因组，其原理如图14所示。最后，将获得的阳性定点转基因个体饲养、传代，即完成阳性定点转基因家蚕系的建立。 

实施例4 

以实施例2中获得的转基因靶品系TTS1-B作为原始材料，通过显微注射将浓度为1000ng/μL的供体质粒pSL{attP-3×P3-EGFP-SV40-attP}和浓度为800ng/μL的phiC31整合酶mRNA混合液共同导入到由TTS1-B代蚕蛾自交获得的312粒非滞育TTS2-B蚕卵中；随后用无毒的胶水封闭注射孔（注意注射需在蚕卵产下后6小时内完成）；将注射完成的蚕卵在质量分数为35-37%的甲醛蒸气中消毒5min，然后置于25℃、相对湿度85%的条件下，进行催青直到孵化，然后将孵化的136头TTS2-B蚁蚕饲养至化蛾，获得43头TTS2-B蚕蛾，然后通过回交共获得38圈TTS3-B蚕卵，用电动宏观荧光显微镜观察，结果如图15所示。结果表明筛选获得2个含有定点转基因家蚕个体的阳性蛾圈，共获得16头在眼部同时发红色和绿色荧光的阳性定点转基因家蚕，重组效率为5.26%。提取阳性定点转基因家蚕个体基因组DNA，经基因组PCR和Southern blotting验证，其结果与图13相同。结果显示，位于供体质粒上的2个attP分别和TTS2-B家蚕基因组中的2个attB位点发生了位点特异性重组反应，从而介导3×P3-EGFP-SV40表达框定点整合至靶品系家蚕基因组；最后，获得的阳性定点转基因个体饲养、传代，即完成阳性定点转基因家蚕系的建立。 

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。 

Claims (10)

1.phiC31重组酶系统和piggyBac转座子在制备家蚕定点转基因系统中的应用。

2.基于phiC31重组酶系统和piggyBac转座子的家蚕定点转基因系统，其特征在于：包括piggyBac重组载体、含目的基因表达框的重组载体和phiC31重组酶，所述piggyBac重组载体中含有2个同向排列的attB位点或attP位点，所述含目的基因表达框的重组载体中目的基因表达框两端锚定有同向的attP位点或attB位点。

3.根据权利要求2所述的家蚕定点转基因系统，其特征在于：所述piggyBac重组载体的attB位点或attP位点5’端含有以眼神经组织特异启动子3×P3启动红色荧光蛋白表达的表达框。

4.根据权利要求3所述的家蚕定点转基因系统，其特征在于：所述piggyBac重组载体由如下步骤制备：将2个attB位点或attP位点通过酶切位点连入pSLfa1180fa载体中，用AscI单酶切后回收含2个同向排列attB位点或attP位点的片段，然后连入pBac[3×P3-DsRedaf]载体，得piggyBac重组载体。

5.根据权利要求4所述的家蚕定点转基因系统，其特征在于：2个attB位点或attP位点的其中一个attB位点或attP位点通过SpeI和XhoI连入pSLfa1180fa载体中，另一个attB位点或attP位点通过SphI和BglII连入pSLfa1180fa载体中。

6.根据权利要求2所述的家蚕定点转基因系统，其特征在于：所述含目的基因表达框为以眼神经组织特异启动子启动绿色荧光蛋白表达的表达框。

7.根据权利要求2-6任一项所述的家蚕定点转基因系统，其特征在于：所述attP位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第6-44位所示；所述attB位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.5第3-39位所示。

8.利用权利要求2-7任一项所述家蚕定点转基因系统制备定点转基因家蚕的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a.将piggyBac重组载体和辅助质粒转化解除滞育的蚕卵，筛选单拷贝转基因家蚕，然后通过连续自交建立转基因靶品系；

b.将步骤a所得转基因靶品系产生的蚕卵用含目的基因表达框的重组载体和phiC31重组酶表达体转化，即获得定点转基因家蚕。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述phiC31重组酶表达体为表达phiC31重组酶的载体或phiC31重组酶mRNA。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述辅助质粒为pHA3PIG。

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