CN104651409A - 一种类转录激活子效应蛋白介导的高效转基因方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种类转录激活子效应蛋白介导的高效转基因方法。采用分子生物学技术构建包含类转录激活子效应蛋白DNA序列和piggyBac转座酶DNA序列的辅助质粒，在体外转录成mRNA；采用显微注射法将该辅助质粒的mRNA与含有外源基因的piggyBac转座子质粒的DNA一起导入到动物的受精卵中，获得外源基因能够稳定遗传和表达的转基因动物；根据标志基因或基因的表达特征筛选出转基因阳性个体；本发明方法可以使piggyBac转座子在TALE-PBase融合蛋白的作用下高效的插入宿主生物的基因组中，可显著地提高piggyBac转座子介导的转基因效率，为获得转基因动物以及插入诱变等研究提供帮助。

Description

一种类转录激活子效应蛋白介导的高效转基因方法

技术领域

本发明涉及了一种转基因方法，尤其是涉及了转基因生物领域中的一种类转录激活子效应蛋白介导的高效转基因方法。

背景技术

类转录激活子效应蛋白(TALE)是从病原菌属Xanthomonas spp中分离得到的保守的细菌性效应蛋白，是一类可以特异识别DNA序列的蛋白。至今为止TALE已经广泛应用于基因打靶、内源基因的定点调控和定点的表观遗传修饰。

在过去的十多年中，piggyBac转座子介导的转基因技术已经成功应用于大量的脊椎动物和非脊椎动物，成为了强大的遗传操作工具，在制备转基因动物和插入诱变等研究上发挥重要的作用。但是，piggyBac转座子介导的转基因效率依旧较低，而且转化效率不稳定，近年来家蚕上的平均转基因效率仅为8.8％。因此，转基因效率的低下给研究人员增加了很大的工作负担，很大程度上限制了该技术的进一步的推广和应用。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种类转录激活子效应蛋白介导的高效转基因方法，大大提高了piggyBac介导的在家蚕中的转基因效率。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：

1)采用分子生物学技术构建包含类转录激活子效应蛋白(TALE)DNA序列和piggyBac转座酶(PBase)DNA序列的辅助质粒，该质粒表达有TALE-PBase融合蛋白，将该辅助质粒在体外转录成mRNA；

2)采用显微注射法将作为转座酶的辅助质粒的mRNA与含有外源基因的piggyBac转座子质粒的DNA一起导入到动物的受精卵中，获得外源基因能够稳定遗传和表达的转基因动物；

3)根据标志基因或基因的表达特征筛选出转基因阳性个体。

所述的辅助质粒中的类转录激活子效应蛋白DNA序列包括16个重复的DNA序列。

所述的辅助质粒中的类转录激活子效应蛋白DNA序列和piggyBac转座酶DNA序列之间的Linker序列长度为209bp。

所述的辅助质粒中的类转录激活子效应蛋白序列位于PBase序列的5’端，类转录激活子效应蛋白序列和PBase序列表达后为一个融合蛋白。

所述的piggyBac转座子质粒中含有至少一种外源基因的表达框。

由本发明实施例，piggyBac转座子质粒包含有绿色荧光蛋白基因(EGFP)、红色荧光蛋白基因(DsRed)和家蚕丝素轻链启动子启动人血清白蛋白(HSA)中的一种或者多种的表达框。

本发明具有的有益效果是：

本发明极大地推动了转基因技术的发展，将目前piggyBac介导的在家蚕中的转基因效率至少提高了7倍，这将是转基因技术发展中的一次重要突破。同时，其它动物的piggyBac转座子介导的转基因效率也因本技术的发明而得到显著提高。因此，在今后的研究中，获得转基因动物将会变得非常容易，这很大程度上简化了转基因实验的过程，也节省了大量的人力和物力。

附图说明

图1是本发明TALE-PBase新型辅助质粒结构图。

图2是实施例1具有3×P3-EGFP表达框的piggyBac转座子质粒结构图。

图3是实施例3具有3×P3-DsRed和FL-HSA两个表达框的piggyBac转座子质粒结构图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

以提高动物转基因效率为研究目的，构建了一个包含类转录激活效应蛋白(TALE)DNA序列和piggyBac转座酶(PBase)DNA序列(基因如SEQ ID NO.5)的新型辅助质粒(图1)。具体方法是：先组装TALE序列(如SEQ ID NO.3)；在TALE的3’端(COON端)连接一个PBase序列，与前面的TALE序列在同一个编码框内，用于表达TALE-PBase融合蛋白，TALE与PBase之间有1个209bp长度连接序列(Linker)(如SEQ ID NO.4)连接；在TALE的5’端(NH₂端)构建一个SP6原核启动子(如SEQ ID NO.1)，该启动子可以将下游基因在体外转录成mRNA；还构建了一个核定位序列(NLS)(如SEQ ID NO.2)，用于引导TALE-PBase融合蛋白进入细胞核。

同时还构建了包含3×P3-EGFP-SV40 Poly A结尾的表达框的piggyBac转座子质粒DNA(如SEQ ID NO.5)(图2)，其中ITR为piggyBac转座子的反向重复序列，绿色荧光蛋白基因EGFP(如SEQ ID NO.6)由3×P3启动子(如SEQID NO.9)启动转录，在动物的眼睛和神经组织中能够特异表达绿色荧光。

将新型辅助质粒在体外转录成mRNA，然后与3×P3-EGFP转座子质粒DNA一起溶解在没有RNA酶的pH7.6磷酸缓冲液中。磷酸缓冲液中3×P3-EGFP转座子质粒DNA的浓度为300ng/μL，新型辅助质粒的mRNA浓度为200ng/μL。

以家蚕为模式生物，采用显微注射法将混合的DNA和mRNA溶液注入家蚕P50品种产卵后4小时内的受精卵中，注射总体积为10nl左右。注射后的蚕卵在25℃温度、85％湿度、12h光照的条件下饲养至成虫(G0代)，每个G0代蛾子与野生型的蛾子交配得到G1代。得到的G1代家蚕用日本OlympusSZX12荧光显微镜，筛选出眼睛特异表达绿色荧光蛋白(EGFP)的阳性家蚕。

实验总共注射了850个家蚕受精卵，成功孵化了71条家蚕，最终得到58个G1代蛾圈。在这58个蛾圈中总共筛选得到37个阳性蛾圈，所以转基因效率为63.8％(37/58)。

实施例2：

TALE-PBase融合蛋白表达载体以及包含3×P3-EGFP表达框的转座子质粒DNA的构建方法如实施例1，实施例2的辅助质粒与包含3×P3-EGFP表达框的转座子质粒DNA均与实施例1相同。

将本发明新型辅助质粒在体外转录成mRNA，然后与3×P3-EGFP转座子质粒DNA一起溶解在没有RNA酶的pH7.6磷酸缓冲液中。磷酸缓冲液中3×P3-EGFP转座子质粒DNA的浓度为300ng/μL，新型辅助质粒mRNA的浓度为200ng/μL。

以家蚕为模式生物，采用显微注射法将混合的DNA和mRNA溶液导入P50品种家蚕产卵后4小时内的受精卵中，注射总体积为10nl左右。注射后的蚕卵在25℃温度、85％湿度、12h光照的条件下饲养至成虫(G0代)，每个G0代蛾子与野生型的蛾子交配得到G1代。得到的G1代蛾圈用日本Olympus SZX12荧光显微镜，筛选出眼睛特异表达绿色荧光蛋白(EGFP)的阳性家蚕。

实验总共注射了900个家蚕受精卵，成功孵化了75条家蚕，最终得到36个G1代蛾圈。在这36个蛾圈中总共筛选得到23个阳性蛾圈，所以转基因效率为63.9％(23/36)。

实施例3：

TALE-PBase融合蛋白表达载体的构建方法如实施例1。同时构建了包含3×P3-DsRed和FL-HSA两个表达框的piggyBac转座子质粒(图3)，SV40 PolyA(如SEQ ID NO.12)和家蚕丝素轻链(FL)Poly A(碱基如SEQ ID NO.13，肽如SEQ ID NO.1)分别为2个表达框的结尾信号；该质粒中3×P3启动子启动红色荧光蛋白(DsRed)(基因如SEQ ID NO.10，氨基酸如SEQ ID NO.11)特异的在眼中表达红色荧光；家蚕丝素轻链启动子启动人血清白蛋白(HSA)(如SEQ ID NO.15)特异的在家蚕后部丝腺中表达，丝素轻链信号肽能够促使人血清白蛋白从细胞分泌到家蚕丝腺腔内。

将新型辅助质粒在体外转录成mRNA，然后与3×P3-DsRed-FL-HSA的piggyBac转座子质粒DNA一起溶解在没有RNA酶的pH7.6磷酸缓冲液中。磷酸缓冲液中3×P3-DsRed-FL-HSA转座子质粒DNA的浓度为200ng/μL，新型辅助质粒mRNA的浓度为200ng/μL。

以家蚕为模式生物，采用显微注射法将混合的DNA和mRNA溶液导入Lan10品种家蚕产卵后4小时内的受精卵中，注射总体积为10nl左右。注射后的蚕卵在25℃温度、85％湿度、12h光照的条件下饲养至成虫(G0代)，每个G0代蛾子与野生型的蛾子交配得到G1代。得到的G1代蛾圈用日本OlympusSZX12荧光显微镜，筛选出眼睛特异表达红色荧光蛋白(DsRed)的阳性家蚕。

实验总共注射了1100个家蚕受精卵，成功孵化了234条家蚕，最终得到103个G1代蛾圈。在这103个蛾圈中总共筛选得到56个阳性蛾圈，所以转基因效率为54.4％(56/103)。采用SDS-PAGE电泳和Western blot技术分析转基因家蚕HSA蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，人血清白蛋白占蛋白溶液中总蛋白含量可达29.1％，占茧层重的2.11％。

综上所述，证明本发明的TALE-PBase融合蛋白可以显著地提高piggyBac转座子介导的转基因效率；即使增大piggyBac转座子质粒DNA的大小，如增加1个表达框FL-HAS，结果并没有导致转基因效率的显著降低(P＞0.05)；3次不同实验的结果证实了TALE-PBase融合蛋白介导的转基因效率是稳定的，这就充分说明了本发明高效转基因方法的可靠性，具有突出显著的技术效果。

实施例中的piggyBac转座子首次在鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞系TN-368中发现。之后，该转座子在地中海果蝇(Ceratitis capitata)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和家蚕(Bombyx mori L.)等昆虫中的转基因实验均取得了成功。后来研究还证明piggyBac转座子是一个广谱的转座系统，已经在酵母(Schizosaccharomyces pombe)、真涡虫(Girardiatigrina)、斑马鱼(Danio rerio)、小鼠、鸡、牛、猪、水稻和人细胞等物种中得到有效应用。从无脊椎动物到有脊椎动物等多种生物中成功实现转基因。由此可见，虽然实施例采用的物种是家蚕，但本发明也同样适用于其他物种，本发明同样可以在其它物种中实现高效的转基因。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

本发明所涉及的基因序列如下：

SEQ ID NO.1：SP6启动子序列

来源：SP6启动子

5’-ATTTAGGTGACACTATAGA-3’

SEQ ID NO.2：核定位信号(NLS)序列

来源：核定位信号(NLS)序列

5’-CCCAAGAAGAAGAGGAAGGTG-3’

SEQ ID NO.3：TALE序列

来源：TALE序列

5’-CTGACCCCAGAGCAGGTCGTGGCCATTGCCTCGAATGGAGGGGGCAAACAGGCGTTGGAAACCGTACAACGATTGCTGCCGGTGCTGTGCCAAGCGCACGGTTTAACCCCAGAGCAGGTCGTGGCAATCGCCTCCAACATTGGCGGGAAACAGGCACTCGAGACTGTCCAGCGCCTGCTTCCCGTGCTGTGCCAAGCGCACGGCCTCACCCCAGAGCAGGTCGTGGCGATCGCAAGCCACGACGGAGGAAAGCAAGCCTTGGAAACAGTACAGAGGCTGTTGCCTGTGCTGTGCCAAGCGCACGGATTAACCCCAGAGCAGGTCGTGGCCATTGCCTCGAATGGAGGGGGCAAACAGGCGTTGGAAACCGTACAACGATTGCTGCCGGTGCTTTGTCAGGCACACGGCCTCACTCCGGAACAAGTGGTCGCGATCGCAAGCCACGACGGAGGAAAGCAAGCCTTGGAAACAGTACAGAGGCTGTTGCCTGTGCTGTGCCAAGCGCACGGACTTACCCCAGAGCAGGTCGTGGCAATCGCGAGCAATAACGGCGGAAAACAGGCTTTGGAAACGGTGCAGAGGCTCCTTCCAGTGCTTTGTCAGGCACACGGCCTCACTCCGGAACAAGTGGTCGCCATTGCCTCGAATGGAGGGGGCAAACAGGCGTTTGGAAACCGTACAACGATGCTGCCGGTGCTGTGCCAAGCGCACGGCCTTACCCCAGAGCAGGTCGTGGCGATCGCAAGCCACGACGGAGGAAAGCAAGCCTTGGAAACAGTACAGAGGCTGTTGCCTGTGCTTTGTCAGGCACACGGCCTCACTCCGGAACAAGTGGTCGCAATCGCGAGCAATAACGGCGGAAAACAGGCTTTGGAAACGGTGCAGAGGCTCCTTCCAGTGCTGTGCCAAGCGCACGGACTAACCCCAGAGCAGGTCGTGGCGATCGCAAGCCACGACGGAGGAAAGCAAGCCTTGGAAACAGTACAGAGGCTGTTGCCTGTGCTTTGTCAGGCACACGGCCTCACTCCGGAACAAGTGGTCGCCATTGCCTCGAATGGAGGGGGCAAACAGGCGTTGGAAACCGTACAACGATTGCTGCCGGTGCTGTGCCAAGCGCACGGGCTCACCCCAGAGCAGGTCGTGGCAATCGCCTCCAACATTGGCGGGAAACAGGCACTCGAGACTGTCCAGCGCCTGCTTCCCGTGCTTTGTCAGGCACACGGCCTCACTCCGGAACAAGTGGTCGCGATCGCAAGCCACGACGGAGGAAAGCAAGCCTTGGAAACAGTACAGAGGCTGTTGCCTGTGCTGTGCCAAGCGCACGGGCTAACCCCAGAGCAGGTCGTGGCAATCGCCTCCAACATTGGCGGGAAACAGGCACTCGAGACTGTCCAGCGCCTGCTTCCCGTGCTTTGTCAGGCACACGGCCTCACTCCGGAACAAGTGGTCGCAATCGCGAGCAATAACGGCGGAAAACAGGCTTTGGAAACGGTGCAGAGGCTCCTTCCAGTGCTGTGCCAAGCGCACGGACTCACGCCTGAGCAGGTAGTGGCTATTGCATCCAATGGAGGGGGC-3’

SEQ ID NO.4：Linker序列

来源：Linker序列

5’-AGACCCGCACTGGAGTCAATCGTGGCCCAGCTTTCGAGGCCGGACCCCGCGCTGGCCGCACTCACTAATGATCATCTTGTACGCTGGCCTGCCTCGGCGGACGACCCGCCTTGGATGCGGTGAAGAAGGGGCTCCCGCACGCGCCTGCATTGATTAAGCGGACCAACAGAAGGATTCCCGAGAGGACATCACATCGAGTGGCAGGATCC-3’

SEQ ID NO.5：piggyBac转座酶(PBase)基因序列

来源：piggyBac转座子

5’-ATGGGATGTTCTTTAGACGATGAGCATATCCTCTCTGCTCTTCTGCAAAGCGATGACGAGCTTGTTGGTGAGGATTCTGACAGTGAAATATCAGATCACGTAAGTGAAGATGACGTCCAGAGCGATACAGAAGAAGCGTTTATAGATGAGGTACATGAAGTGCAGCCAACGTCAAGCGGTAGTGAAATATTAGACGAACAAAATGTTATTGAACAACCAGGTTCTTCATTGGCTTCTAACAGAATCTTGACCTTGCCACAGAGGACTATTAGAGGTAAGAATAAACATTGTTGGTCAACTTCAAAGTCCACGAGGCGTAGCCGAGTCTCTGCACTGAACATTGTCAGATCTCAAAGAGGTCCGACGCGTATGTGCCGCAATATATATGACCCACTTTTATGCTTCAAACTATTTTTTACTGATGAGATAATTTCGGAAATTGTAAAATGGACAAATGCTGAGATATCATTGAAACGTCGGGAATCTATGACAGGTGCTACATTTCGTGACACGAATGAAGATGAAATCTATGCTTTCTTTGGTATTCTGGTAATGACAGCAGTGAGAAAAGATAACCACATGTCCACAGATGACCTCTTTGATCGATCTTTGTCAATGGTGTACGTCTCTGTAATGAGTCGTGATCGTTTTGATTTTTTGATACGATGTCTTAGAATGGATGACAAAAGTATACGGCCCACACTTCGAGAAAACGATGTATTTACTCCTGTTAGAAAAATATGGGATCTCTTTATCCATCAGTGCATACAAAATTACACTCCAGGGGCTCATTTGACCATAGATGAACAGTTACTTGGTTTTAGAGGACGGTGTCCGTTTAGGATGTATATCCCAAACAAGCCAAGTAAGTATGGAATAAAAATCCTCATGATGTGTGACAGTGGTACGAAGTATATGATAAATGGAATGCCTTATTTGGGAAGAGGAACACAGACCAACGGAGTACCACTCGGTGAATACTACGTGAAGGAGTTATCAAAGCCTGTGCACGGTAGTTGTCGTAATATTACGTGTGACAATTGGTTCACCTCAATCCCTTTGGCAAAAAACTTACTACAAGAACCGTATAAGTTAACCATTGTGGGAACCGTGCGATCAAACAAACGCGAGATACCGGAAGTACTGAAAAACAGTCGCTCCAGGCCAGTGGGAACATCGATGTTTTGTTTTGACGGACCCCTTACTCTCGTCTCATATAAACCGAAGCCAGCTAAGATGGTATACTTATTATCATCTTGTGATGAGGATGCTTCTATCAACGAAAGTACCGGTAAACCGCAAATGGTTATGTATTATAATCAAACTAAAGGCGGAGTGGACACGCTAGACCAAATGTGTTCTGTGATGACCTGCAGTAGGAAGACGAATAGGTGGCCTATGGCATTATTGTACGGAATGATAAACATTGCCTGCATAAATTCTTTTATTATATACAGCCATAATGTCAGTAGCAAGGGAGAAAAGGTTCAAAGTCGCAAAAAATTTATGAGAAACCTTTACATGAGCCTGACGTCATCGTTTATGCGTAAGCGTTTAGAAGCTCCTACTTTGAAGAGATATTTGCGCGATAATATCTCTAATATTTTGCCAAATGAAGTGCCTGGTACATCAGATGACAGTACTGAAGAGCCAGTAATGAAAAAACGTACTTACTGTACTTACTGCCCCTCTAAAATAAGGCGAAAGGCAAATGCATCGTGCAAAAAATGCAAAAAAGTTATTTGTCGAGAGCATAATATTGATATGTGCCAAAGTTGTTTCTGA-3’

SEQ ID NO.6：EGFP基因序列

来源：EGFP基因

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA

SEQ ID NO.7：piggyBac转座子的左转座臂(PBL)碱基序列：

来源：piggyBac转座子

TTAACCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTTTGCAATTTAGGACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCGGCTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGATTATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTAATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTTATAGATATCGTGACTAATATATAATAAAATGGGATGTTCTTTAGACGATGAGCATATCCTCTCTGCTCAGC

SEQ ID NO.8：piggyBac转座子的右转座臂(PBR)碱基序列：

来源：piggyBac转座子

AAAGTTTTGTTACTTTAGAAGAAATTTTGAGTTTTTGTTTTTTTTTAATAAATAAATAAACATAAATAAATTGTTTGTTGAATTTATTATTAGTATGTAAGTGTAAATATAATAAAACTTAATATCTATTCAAATTAATAAATAAACCTCGATATACAGACCGATAAAAACACATGCGTCAATTTTACGCATGATTATCTTTAACGTACGTCACAATATGATTATCTTTCTAGGGTTAA

SEQ ID NO.9：3×P3启动子碱基序列：

来源：3×P3启动子

GCCCGGGGATCTAATTCAATTAGAGACTAATTCAATTAGAGCTAATTCAATTAGGATCCAAGCTTATCGATTTCGAACCCTCGACCGCCGGAGTATAAATAGAGGCGCTTCGTCTACGGAGCGACAATTCAATTCAAACAAGCAAAGTGAACACGTCGCTAAGCGAAAGCTAAGCAAATAAACAAGCGCAGCTGAACAAGCTAAACAATCGGGGTACCGCTAGAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCAC

SEQ ID NO.10：红色荧光蛋白(DsRed)编码基因碱基序列：

来源：DsRed红色荧光蛋白

ATGGTGCGCTCCTCCAAGAACGTCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCACCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCCACAACACCGTGAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAAGACTCCTCCCTGCAGGACGGCTGCTTCATCTACAAGGTGAAGTTCATCGGCGTGAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACAAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGTCCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCTACTACTACGTGGACTCCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAGCAGTACGAGCGCACCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGTAG

SEQ ID NO.11：红色荧光蛋白(DsRed)编码基因氨基酸序列：

来源：DsRed红色荧光蛋白

MVRSSKNVIKEFMRFKVRMEGTVNGHEFEIEGEGEGRPYEGHNTVKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKVYVKHPADIPDYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGCFIYKVKFIGVNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERLYPRDGVLKGEIHKALKLKDGGHYLVEFKSIYMAKKPVQLPGYYYVDSKLDITSHNEDYTIVEQYERTEGRHHLFL

SEQ ID NO.12：SV40 Poly A碱基序列：

来源：SV40的3’序列

AGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA

SEQ ID NO.13：家蚕丝素蛋白轻链基因(FL)启动子碱基序列：

来源：家蚕P50品种的丝素蛋白轻链基因启动子

CGCATATTGGACATCCCTTTTCTTGACATCGTATAAATTCGGTAATTCTCGGTACGGTTCGGAAAGTGCACCTGCGGCTATATTCAGACTCGCCAAGTTACGTCAGTCGTATTGTAATGAGCGATTTAGTGGGCAACTTCATTCTGTTAATTTTGTGTCACGGTGCGCGCGCATCGTAAAATTTCACTCTCATAGATTTTTCATAACGTGCCTAAAGAAGTATAACTTCAATAATTTAAATTAAAAAAAAAAACATGCATAGAATAATTATATGAATTATTTAAAATGTCATTTACCGACATTGACATAACAGACGACGTTAACACTACAAAACATTTTAATTCCACATTGTTACATATTCAACAGTTAAATTTGCGTTAATTCTCGATGCGAACAAATATAAGAACAATCGGATCAATTAGATCGCTTTGTTTCGAGCAACACTTAGTTTAACTAGAGGCGTACACCTCAAGAAATCATCTTCATTAGAAACTAAACCTTAAAATCGCAATAATAAAGCATAGTCAATTTTAACTGAAATGCAAAATCTTTTGAACGTTAGATGCTGTCAGCGTTCGTTGGTACAGTTGTTTGATATTTATTTTAATTGTCTTTTTATATATAAATAGTGGAACATTAATCACGGAATCCTGTATAGTATATACCGATTGGTCACATAACAGACCACTAAA

SEQ ID NO.14：丝素蛋白轻链基因(FL)信号肽序列

来源：家蚕P50品种的丝素蛋白轻链基因信号肽

ATGAAGCCTATATTTTTGGTATTACTCGTCGTTACAAGCGCCTACGCTGCACCA

SEQ ID NO.15：人血清白蛋白序列

来源：人血清白蛋白

GATGCTCACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCATTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCTCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGTAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCAAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCAGACCTTGCTAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTTGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCTAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCACTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAACTCGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGTCTCTAA

SEQ ID NO.16：家蚕丝素蛋白轻链基因(FL)3’末端序列

来源：家蚕P50品种的丝素蛋白轻链基因

ATAAGAACTGTAAATAATGTATATATATAATTATATAAAAGATATATATAAACCATATACAAACATATATATATCATTATAAGACAATCTACCTATATAAAAACAGACTAAAATTAATAATTATGTATACTTTAATTGTGTTTAGGACATTTTATGCAAATTGTGTTTGCGTTAGGATTTTTTTTGGAAGTTTTTTAGATTATTTATGAATATATAAATAAATATACGTTAATATAATATATATTATATAAATCAACGACACGGCTTTTCATTTTGGTGATGATCAATCTTATTGTTCTTCTAATTGATTTTTTTGTACAATAAAGATGTATCCAGTTTTCCAGATAAAGAATTTAGTTTGTTATTTCTGGCCCCATTAAAATAAGTACGGTATTCGATAATACCATATACCATACGGCATATACAATGGATTTCGGTGCTGTTGTCAATTGCTTTCCAACTGGAGAGACTGTATGCGATTTTTTTCATGTATTCGGAGATTAAGCTGCGAAACATACAAAAATGTACCTTATTTTTTCATCGCATTAGGCACAATTCACTTTAATAAAGCCCCTATAACGAGAATGTAGTCCGAAGCAGTCACAC

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  浙江大学

<120>  一种类转录激活子效应蛋白介导的高效转基因方法

<130> 

<160>  16   

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  19

<212>  DNA

<213>  SP6启动子

<400>  1

atttaggtga cactataga                                                  19

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  核定位信号(NLS)序列

<400>  2

cccaagaaga agaggaaggt g                                               21

 

 

<210>  3

<211>  1575

<212>  DNA

<213>  TALE序列

<400>  3

ctgaccccag agcaggtcgt ggccattgcc tcgaatggag ggggcaaaca ggcgttggaa     60

accgtacaac gattgctgcc ggtgctgtgc caagcgcacg gtttaacccc agagcaggtc    120

gtggcaatcg cctccaacat tggcgggaaa caggcactcg agactgtcca gcgcctgctt    180

cccgtgctgt gccaagcgca cggcctcacc ccagagcagg tcgtggcgat cgcaagccac    240

gacggaggaa agcaagcctt ggaaacagta cagaggctgt tgcctgtgct gtgccaagcg    300

cacggattaa ccccagagca ggtcgtggcc attgcctcga atggaggggg caaacaggcg    360

ttggaaaccg tacaacgatt gctgccggtg ctttgtcagg cacacggcct cactccggaa    420

caagtggtcg cgatcgcaag ccacgacgga ggaaagcaag ccttggaaac agtacagagg    480

ctgttgcctg tgctgtgcca agcgcacgga cttaccccag agcaggtcgt ggcaatcgcg    540

agcaataacg gcggaaaaca ggctttggaa acggtgcaga ggctccttcc agtgctttgt    600

caggcacacg gcctcactcc ggaacaagtg gtcgccattg cctcgaatgg agggggcaaa    660

caggcgtttg gaaaccgtac aacgatgctg ccggtgctgt gccaagcgca cggccttacc    720

ccagagcagg tcgtggcgat cgcaagccac gacggaggaa agcaagcctt ggaaacagta    780

cagaggctgt tgcctgtgct ttgtcaggca cacggcctca ctccggaaca agtggtcgca    840

atcgcgagca ataacggcgg aaaacaggct ttggaaacgg tgcagaggct ccttccagtg    900

ctgtgccaag cgcacggact aaccccagag caggtcgtgg cgatcgcaag ccacgacgga    960

ggaaagcaag ccttggaaac agtacagagg ctgttgcctg tgctttgtca ggcacacggc   1020

ctcactccgg aacaagtggt cgccattgcc tcgaatggag ggggcaaaca ggcgttggaa   1080

accgtacaac gattgctgcc ggtgctgtgc caagcgcacg ggctcacccc agagcaggtc   1140

gtggcaatcg cctccaacat tggcgggaaa caggcactcg agactgtcca gcgcctgctt   1200

cccgtgcttt gtcaggcaca cggcctcact ccggaacaag tggtcgcgat cgcaagccac   1260

gacggaggaa agcaagcctt ggaaacagta cagaggctgt tgcctgtgct gtgccaagcg   1320

cacgggctaa ccccagagca ggtcgtggca atcgcctcca acattggcgg gaaacaggca   1380

ctcgagactg tccagcgcct gcttcccgtg ctttgtcagg cacacggcct cactccggaa   1440

caagtggtcg caatcgcgag caataacggc ggaaaacagg ctttggaaac ggtgcagagg   1500

ctccttccag tgctgtgcca agcgcacgga ctcacgcctg agcaggtagt ggctattgca   1560

tccaatggag ggggc                                                    1575

 

<210>  4

<211>  209

<212>  DNA

<213>  Linker序列

<400>  4

agacccgcac tggagtcaat cgtggcccag ctttcgaggc cggaccccgc gctggccgca     60

ctcactaatg atcatcttgt acgctggcct gcctcggcgg acgacccgcc ttggatgcgg    120

tgaagaaggg gctcccgcac gcgcctgcat tgattaagcg gaccaacaga aggattcccg    180

agaggacatc acatcgagtg gcaggatcc                                      209

 

<210>  5

<211>  1785

<212>  DNA

<213>  piggyBac转座子

<400>  5

atgggatgtt ctttagacga tgagcatatc ctctctgctc ttctgcaaag cgatgacgag     60

cttgttggtg aggattctga cagtgaaata tcagatcacg taagtgaaga tgacgtccag    120

agcgatacag aagaagcgtt tatagatgag gtacatgaag tgcagccaac gtcaagcggt    180

agtgaaatat tagacgaaca aaatgttatt gaacaaccag gttcttcatt ggcttctaac    240

agaatcttga ccttgccaca gaggactatt agaggtaaga ataaacattg ttggtcaact    300

tcaaagtcca cgaggcgtag ccgagtctct gcactgaaca ttgtcagatc tcaaagaggt    360

ccgacgcgta tgtgccgcaa tatatatgac ccacttttat gcttcaaact attttttact    420

gatgagataa tttcggaaat tgtaaaatgg acaaatgctg agatatcatt gaaacgtcgg    480

gaatctatga caggtgctac atttcgtgac acgaatgaag atgaaatcta tgctttcttt    540

ggtattctgg taatgacagc agtgagaaaa gataaccaca tgtccacaga tgacctcttt    600

gatcgatctt tgtcaatggt gtacgtctct gtaatgagtc gtgatcgttt tgattttttg    660

atacgatgtc ttagaatgga tgacaaaagt atacggccca cacttcgaga aaacgatgta    720

tttactcctg ttagaaaaat atgggatctc tttatccatc agtgcataca aaattacact    780

ccaggggctc atttgaccat agatgaacag ttacttggtt ttagaggacg gtgtccgttt    840

aggatgtata tcccaaacaa gccaagtaag tatggaataa aaatcctcat gatgtgtgac    900

agtggtacga agtatatgat aaatggaatg ccttatttgg gaagaggaac acagaccaac    960

ggagtaccac tcggtgaata ctacgtgaag gagttatcaa agcctgtgca cggtagttgt   1020

cgtaatatta cgtgtgacaa ttggttcacc tcaatccctt tggcaaaaaa cttactacaa   1080

gaaccgtata agttaaccat tgtgggaacc gtgcgatcaa acaaacgcga gataccggaa   1140

gtactgaaaa acagtcgctc caggccagtg ggaacatcga tgttttgttt tgacggaccc   1200

cttactctcg tctcatataa accgaagcca gctaagatgg tatacttatt atcatcttgt   1260

gatgaggatg cttctatcaa cgaaagtacc ggtaaaccgc aaatggttat gtattataat   1320

caaactaaag gcggagtgga cacgctagac caaatgtgtt ctgtgatgac ctgcagtagg   1380

aagacgaata ggtggcctat ggcattattg tacggaatga taaacattgc ctgcataaat   1440

tcttttatta tatacagcca taatgtcagt agcaagggag aaaaggttca aagtcgcaaa   1500

aaatttatga gaaaccttta catgagcctg acgtcatcgt ttatgcgtaa gcgtttagaa   1560

gctcctactt tgaagagata tttgcgcgat aatatctcta atattttgcc aaatgaagtg   1620

cctggtacat cagatgacag tactgaagag ccagtaatga aaaaacgtac ttactgtact   1680

tactgcccct ctaaaataag gcgaaaggca aatgcatcgt gcaaaaaatg caaaaaagtt   1740

atttgtcgag agcataatat tgatatgtgc caaagttgtt tctga                   1785

 

<210>  6

<211>  720

<212>  DNA

<213>  EGFP基因

<400>  6

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac     60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac    120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc    180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag    240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc    300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg    360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac    420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac    480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc    540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac    600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc    660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa    720

 

<210>  7

<211>  379

<212>  DNA

<213>  piggyBac转座子

<400>  7

ttaaccctag aaagatagtc tgcgtaaaat tgacgcatgc attcttgaaa tattgctctc     60

tctttctaaa tagcgcgaat ccgtcgctgt ttgcaattta ggacatctca gtcgccgctt    120

ggagctcggc tgaggcgtgc ttgtcaatgc ggtaagtgtc actgattttg aactataacg    180

accgcgtgag tcaaaatgac gcatgattat cttttacgtg acttttaaga tttaactcat    240

acgataatta atattgttat ttcatgttct acttacgtga taacttatta tatatatatt    300

ttcttgttat agatatcgtg actaatatat aataaaatgg gatgttcttt agacgatgag    360

catatcctct ctgctcagc                                                 379

 

<210>  8

<211>  239

<212>  DNA

<213>  piggyBac转座子

<400>  8

aaagttttgt tactttagaa gaaattttga gtttttgttt ttttttaata aataaataaa     60

cataaataaa ttgtttgttg aatttattat tagtatgtaa gtgtaaatat aataaaactt    120

aatatctatt caaattaata aataaacctc gatatacaga ccgataaaaa cacatgcgtc    180

aattttacgc atgattatct ttaacgtacg tcacaatatg attatctttc tagggttaa     239

 

<210>  9

<211>  263

<212>  DNA

<213>  3×P3启动子

<400>  9

gcccggggat ctaattcaat tagagactaa ttcaattaga gctaattcaa ttaggatcca     60

agcttatcga tttcgaaccc tcgaccgccg gagtataaat agaggcgctt cgtctacgga    120

gcgacaattc aattcaaaca agcaaagtga acacgtcgct aagcgaaagc taagcaaata    180

aacaagcgca gctgaacaag ctaaacaatc ggggtaccgc tagagtcgac ggtaccgcgg    240

gcccgggatc caccggtcgc cac                                            263

 

<210>  10

<211>  681

<212>  DNA

<213>  DsRed红色荧光蛋白

<400>  10

atggtgcgct cctccaagaa cgtcatcaag gagttcatgc gcttcaaggt gcgcatggag     60

ggcaccgtga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag    120

ggccacaaca ccgtgaagct gaaggtgacc aagggcggcc ccctgccctt cgcctgggac    180

atcctgtccc cccagttcca gtacggctcc aaggtgtacg tgaagcaccc cgccgacatc    240

cccgactaca agaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc    300

gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccaa gactcctccc tgcaggacgg ctgcttcatc    360

tacaaggtga agttcatcgg cgtgaacttc ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag    420

accatgggct gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccc gcgacggcgt gctgaagggc    480

gagatccaca aggccctgaa gctgaaggac ggcggccact acctggtgga gttcaagtcc    540

atctacatgg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggctact actacgtgga ctccaagctg    600

gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggagc agtacgagcg caccgagggc    660

cgccaccacc tgttcctgta g                                              681

 

<210>  11

<211>  226

<212>  PRT

<213>  DsRed红色荧光蛋白

<400>  11

 

Met Val Arg Ser Ser Lys Asn Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys

1               5                   10                  15     

Val Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly

            20                  25                  30         

Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys

        35                  40                  45             

Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro

    50                  55                  60                 

Gln Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile

65                  70                  75                  80 

Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg

                85                  90                  95     

Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser

            100                 105                 110        

Ser Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val

        115                 120                 125            

Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp

    130                 135                 140                

Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly

145                 150                 155                 160

Glu Ile His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val

                165                 170                 175    

Glu Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly

            180                 185                 190        

Tyr Tyr Tyr Val Asp Ser Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp

        195                 200                 205            

Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu

    210                 215                 220                

Phe Leu

225    

 

<210>  12

<211>  229

<212>  DNA

<213>  SV40的3'序列

<400>  12

agatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac     60

acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg    120

cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt    180

tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatctta                229

 

<210>  13

<211>  692

<212>  DNA

<213>  家蚕P50品种的丝素蛋白轻链基因启动子

<400>  13

cgcatattgg acatcccttt tcttgacatc gtataaattc ggtaattctc ggtacggttc     60

ggaaagtgca cctgcggcta tattcagact cgccaagtta cgtcagtcgt attgtaatga    120

gcgatttagt gggcaacttc attctgttaa ttttgtgtca cggtgcgcgc gcatcgtaaa    180

atttcactct catagatttt tcataacgtg cctaaagaag tataacttca ataatttaaa    240

ttaaaaaaaa aaacatgcat agaataatta tatgaattat ttaaaatgtc atttaccgac    300

attgacataa cagacgacgt taacactaca aaacatttta attccacatt gttacatatt    360

caacagttaa atttgcgtta attctcgatg cgaacaaata taagaacaat cggatcaatt    420

agatcgcttt gtttcgagca acacttagtt taactagagg cgtacacctc aagaaatcat    480

cttcattaga aactaaacct taaaatcgca ataataaagc atagtcaatt ttaactgaaa    540

tgcaaaatct tttgaacgtt agatgctgtc agcgttcgtt ggtacagttg tttgatattt    600

attttaattg tctttttata tataaatagt ggaacattaa tcacggaatc ctgtatagta    660

tataccgatt ggtcacataa cagaccacta aa                                  692

 

<210>  14

<211>  54

<212>  DNA

<213>  家蚕P50品种的丝素蛋白轻链基因信号肽

<400>  14

atgaagccta tatttttggt attactcgtc gttacaagcg cctacgctgc acca           54

 

<210>  15

<211>  1758

<212>  DNA

<213>  人血清白蛋白

<400>  15

gatgctcaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa     60

gcattggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta    120

aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa    180

aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt    240

cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa    300

tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt    360

gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat    420

gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gctccggaac tccttttctt tgctaaaagg    480

tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca    540

aagctcgatg aacttcggga tgaaggtaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt    600

gcaagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc    660

cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa    720

gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcagacctt    780

gctaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa    840

aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct    900

gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct    960

gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat   1020

tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct tgagaagtgc   1080

tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gctaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt   1140

gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag   1200

tacaaattcc agaatgcact attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact   1260

ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat   1320

cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta   1380

tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc   1440

ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa   1500

gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag   1560

agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gaactcgtga aacacaagcc caaggcaaca   1620

aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag   1680

gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa   1740

gctgccttag gtctctaa                                                 1758

 

<210>  16

<211>  606

<212>  DNA

<213>  家蚕P50品种的丝素蛋白轻链基因

<400>  16

ataagaactg taaataatgt atatatataa ttatataaaa gatatatata aaccatatac     60

aaacatatat atatcattat aagacaatct acctatataa aaacagacta aaattaataa    120

ttatgtatac tttaattgtg tttaggacat tttatgcaaa ttgtgtttgc gttaggattt    180

tttttggaag ttttttagat tatttatgaa tatataaata aatatacgtt aatataatat    240

atattatata aatcaacgac acggcttttc attttggtga tgatcaatct tattgttctt    300

ctaattgatt tttttgtaca ataaagatgt atccagtttt ccagataaag aatttagttt    360

gttatttctg gccccattaa aataagtacg gtattcgata ataccatata ccatacggca    420

tatacaatgg atttcggtgc tgttgtcaat tgctttccaa ctggagagac tgtatgcgat    480

ttttttcatg tattcggaga ttaagctgcg aaacatacaa aaatgtacct tattttttca    540

tcgcattagg cacaattcac tttaataaag cccctataac gagaatgtag tccgaagcag    600

tcacac                                                               606

Claims (5)

1. 一种类转录激活子效应蛋白介导的高效转基因方法，其特征在于该方法的步骤如下：

1）采用分子生物学技术构建包含类转录激活子效应蛋白DNA序列和piggyBac转座酶DNA序列的辅助质粒，该质粒表达有TALE-PBase融合蛋白，将该辅助质粒在体外转录成mRNA；

2）采用显微注射法将作为转座酶的辅助质粒的mRNA与含有外源基因的piggyBac转座子质粒的DNA一起导入到动物的受精卵中，获得外源基因能够稳定遗传和表达的转基因动物；

3）根据标志基因或基因的表达特征筛选出转基因阳性个体。

2. 根据权利要求1所述的一种类转录激活子效应蛋白介导的高效转基因方法，其特征在于：所述的辅助质粒中的类转录激活子效应蛋白DNA序列包括16个重复的DNA序列。

3. 根据权利要求1所述的一种类转录激活子效应蛋白介导的高效转基因方法，其特征在于：所述的辅助质粒中的类转录激活子效应蛋白DNA序列和piggyBac转座酶DNA序列之间的Linker序列长度为209bp。

4. 根据权利要求1所述的一种类转录激活子效应蛋白介导的高效转基因方法，其特征在于：所述的辅助质粒中的类转录激活子效应蛋白序列位于PBase序列的5’端，两者表达后为一个融合蛋白。

5. 根据权利要求1所述的一种类转录激活子效应蛋白介导的高效转基因方法，其特征在于：所述的piggyBac转座子质粒中含有至少一个外源基因的表达框。