CN105331632A - 利用家蚕后部丝腺合成分泌钙离子结合蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用家蚕后部丝腺合成分泌钙离子结合蛋白的方法。先构建家蚕合成分泌钙离子结合蛋白的载体pBCABP-EGFP质粒，再利用显微注射将质粒与能够提供piggyBac转座酶的TALE-PBase融合蛋白mRNA导入到家蚕受精卵内，用piggyBac转座子使绿色荧光蛋白基因和钙离子结合蛋白基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，制成转基因家蚕。本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，利用家蚕后部丝腺细胞特异的合成分泌钙离子结合蛋白，开发了一种新型的生产具有钙离子结合活性蚕丝的生产工艺，降低生产成本，并保证钙离子结合蛋白的活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种家蚕合成分泌外源蛋白的方法，尤其是涉及利用转基因技术的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌钙离子结合蛋白的方法。
背景技术
家蚕生活周期短，饲养方便，丝蛋白产量大，个体小容易饲养，特别是基于piggyBac的转基因家蚕品系发展越来越成熟，这些优点使其非常有利于作为生物反应器生产外源蛋白。蚕丝是一种天然的蛋白纤维，主要包括两种成分，丝素和丝胶。丝素在后部丝腺中合成经过中部丝腺时被丝胶包被，最后经前部丝腺分泌到茧子里。丝素蛋白由350kDa的重链，26kDa的轻链和25kDa的P25(fibrohexamerin)这三种多肽构成。
骨再生相关的医学材料需求越来越大，这些材料具有一些非常重要的特征包括生物相容性，多孔性以及适当的机械性能。家蚕丝蛋白具有优越的机械性能，如可裁剪性，降解慢，具有足够的时间来重建或者产生生物相容性，是一种非常理想的医学生物材料。例如，基于丝素蛋白的医学缝合线，用于软骨细胞的分布和软骨再生、用于药物递送的载体的丝纤蛋白海绵。研究表明当哺乳动物细胞表面覆盖上一层有丝素蛋白融合的胶原蛋白或者来自家蚕丝蛋白的纤连蛋白衍生肽时细胞的粘附性会增加。
本发明开发了利用家蚕丝腺生物反应器表达合浦珠母贝珍珠层基质蛋白钙结合序列EYDYDDDSDDDDEWD和家蚕丝蛋白重复序列(AGSGAG)n构成的、具有钙离子结合能力结构域的融合多肽[(AGSGAG)6ASEYDYDDDSDDDDEWD]2(缩写为CABP)，实验证明含有这种多肽的新型混合蚕丝具有钙结合活性和矿化作用，该转基因家蚕已经能够稳定遗传和表达，这种新型混合蚕丝能够通过饲养家蚕而大量生产。
发明内容
本发明的目的在于利用家蚕转基因技术将钙离子结合蛋白基因导入家蚕基因组内，并在家蚕后部丝腺细胞中特异表达，提供一种利用家蚕后部丝腺合成分泌钙离子结合蛋白的方法，开发出能合成分泌钙离子结合蛋白的家蚕，通过家蚕后部丝腺细胞分泌的钙离子结合蛋白直接分泌到丝中，使蚕丝具有钙离子结合活性，可以直接作为医学材料应用。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：
1)采用分子生物学方法构建家蚕合成分泌钙离子结合蛋白的质粒pBCABP-EGFP，质粒pBCABP-EGFP包含有作为外源基因的钙离子结合蛋白基因和绿色荧光蛋白EGFP标记基因；
2)采用显微注射转基因家蚕的方法将pBCABP-EGFP质粒及能够提供piggyBac转座酶的TALE-PBase融合蛋白mRNA按浓度比1:1导入家蚕产卵后2～4小时以内的受精卵内，采用piggyBac转座子将钙离子结合蛋白插入到家蚕基因组内；
3)蚕卵孵化后再经多次培养续代育成绿色荧光基因和钙离子结合蛋白基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌钙离子结合蛋白的转基因家蚕；
4)通过家蚕后部丝腺细胞合成分泌钙离子结合蛋白，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。
所述的步骤3)具体为：
3.1)蚕卵孵化后饲养至成虫，自交续代，此代为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体示显微镜观察筛选出表达EGFP绿色荧光标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫自交续代，成为G2代；
3.2)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达绿色荧光EGFP标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；
3.3)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达绿色荧光EGFP标记基因的蚕蛾互相交配，制成G4代，育成绿色荧光基因和钙离子结合蛋白基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌钙离子结合蛋白的转基因家蚕。
所述的质粒pBCABP-EGFP以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因。
所述的质粒pBCABP-EGFP包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以及两个转座臂之间的两个功能表达框，一个功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框，即A3-EGFP-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白轻链基因启动子、丝素蛋白轻链基因信号肽，钙离子结合蛋白序列和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端的表达框，即FLPromoter-FLSP-CABP-FibroinLchain3’-PolyA。
所述的TALE-PBase融合蛋白mRNA是由包含类转录激活子效应蛋白(TALE)和转座酶(PBase)序列的质粒转录获得。
所述的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌钙离子结合蛋白的方法，其特征在于：所述的钙离子结合蛋白基因在家蚕后部丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白轻链信号肽的作用下分泌到后部丝腺腔，并依次进入中部丝腺、前部丝腺直到蚕茧，使蚕丝具有钙离子结合活性。
本发明是先构建家蚕合成分泌钙离子结合蛋白的载体pBCABP-EGFP质粒，再利用显微注射转基因家蚕技术将这种质粒与能够提供piggyBac转座酶的TALE-PBase融合蛋白mRNA一起导入到家蚕受精卵内，依靠piggyBac转座子的转座特性，使绿色荧光蛋白基因和钙离子结合蛋白基因转入到家蚕基因组内并得到稳定遗传和表达，从而创制出一种能够在家蚕后部丝腺细胞特异性合成分泌钙离子结合蛋白的转基因家蚕，自交使钙离子结合蛋白基因纯合，育成能分泌钙离子结合蛋白的转基因家蚕，然后利用该种家蚕合成分泌具有钙结合蛋白活性的蚕丝。
常规的利用piggyBac转座子的转基因家蚕实验都是采用piggyBac转座酶辅助质粒实现的，而本发明采用能够提供piggyBac转座酶的TALE-PBase融合蛋白mRNA代替辅助质粒将外源基因导入家蚕基因组，通过TALE-PBase融合蛋白mRNA代替辅助质粒，相比之下外源基因导入家蚕基因组的比例更高，更容易筛选获得转基因家蚕。
本发明所具有的有益效果是：
本发明借助绿色荧光标志基因筛选转基因家蚕，这种转基因家蚕能够在家蚕后部丝腺细胞特异的合成分泌钙离子结合蛋白，开发了一种新型的钙离子结合蛋白的生产工艺，降低生产成本，为大量生产具有钙离子结合活性的蚕丝奠定了基础，保证具有钙离子结合蛋白蚕丝的生物活性。
附图说明
图1是本发明pBCABP-EGFP质粒结构图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明的实施例如下：
本发明的三个实施例中的pBCABP-EGFP采用以下方式制备合成：
合成钙离子结合蛋白序列CABP(如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2)。在合成时5’端加上丝素轻链蛋白的信号肽(FLSP)(如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4)，在3’端加上丝素轻链蛋白polyA序列(如SEQIDNO.5)。并在5’和3’端分别加上酶切位点ApaI和BamHI，完整的碱基序列如SEQIDNO.6。
具有EGFP报告基因和piggyBac转座臂的转基因载体-piggy-6212被用作质粒构建。该质粒包括一个A3启动子启动的EGFP基因的表达框和piggyBac转座子的左右臂。一个依次由限制性内切酶SalI,ApaI和BamHI连接组成的接头序列与转基因载体被SalI和BamHI消化后的片段连接。得到的质粒通过ApaI和BamHI双酶切与CABP序列连接，获得质粒P1(如SEQIDNO.7)。设计上游引物5’-actgtcgacGAAAATGCTCCACGTGAGTTTA-3’和下游引物5’-agtgggcccTTTAGTGGTCTGTTATGTGACC-3’，PCR扩增P50家蚕丝素轻链蛋白启动子。丝素轻链蛋白启动子PCR反应体系如表1所示。
表1丝素轻链蛋白启动子PCR反应体系
| 名称 | 成分 |
| PrimeSTAR HS Polymerase | 0.25ul |
| 5×PrimeSTAR Buffer | 2.5ul |
| dNTP Mixture | 2ul |
| 上游引物PA-F | 1ul |
| 下游引物PA-R | 1ul |
| Lan10基因组 | 0.5ul |
| ddH2O | up to 25ul |
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收后，与质粒P1经过SalI和ApaI酶切后的含CABP序列片段连接，构成质粒pBCABP-EGFP(如SEQIDNO.8)(图1)。
实施例1：
将pBCABP-EGFP质粒(图1)及能够提供piggyBac转座酶的TALE-PBase融合蛋白mRNA(其是由分别如SEQIDNO.9、SEQIDNO.10和SEQIDNO.11的TALE序列、Linker序列和piggyBac转座酶基因序列相连后的质粒转录得到)按浓度比1:1比率混合，总浓度为0.4μg/μl，质粒和mRNA溶解在pH＝7、0.5mM的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后2～4小时以内的受精卵内，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，转基因家蚕自交传代，是为G1代。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达EGFP标志基因的转基因阳性蚕，将蚕饲养至成虫，转基因家蚕自交传代，是为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使钙离子结合蛋白基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G3代时，取5龄第3天家蚕后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用InversePCR扩增CABP基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点是在Bm_scaf2、第18号染色体4272100处，插入位点的左侧序列为：AAAAGGAAAATTTCAATTAATTTTGTTAATTAACTATAGCAAGTCCATGTTTCTGAAGGAATACCGTGAAATGAGTTTATCCAGAACGCTTTGAGATAAACTTAA-piggyBac，证明转座子已经插入到家蚕基因组内。
从G4代开始选择绿色荧光表型纯一的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成绿色荧光蛋白基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌钙离子结合蛋白的转基因家蚕新品种，定名为SCa3。
提取SCa3家蚕的茧丝蛋白和后部丝腺细胞蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和Westernblot技术分析转基因家蚕钙离子结合蛋白的表达情况，并进一步用MS/MS质谱检测验证，证明了钙离子结合蛋白确实在家蚕后部丝腺细胞表达，并分泌到茧丝中去。
研究结果证明钙离子结合蛋白基因已插入到转基因家蚕新品种SCa3基因组的第18染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌钙离子结合蛋白，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达。
进一步对获得的转基因蚕丝的生物矿化功能进行了分析，证明SCa3转基因蚕丝素能够促进碳酸钙矿化物的生成，而对照品种蚕丝素钙离子结合效应不明显，表明转基因蚕丝丝素溶液具有钙离子结合功能。
实施例2：
将pBCABP-EGFP质粒(图1)及能够提供piggyBac转座酶的TALE-PBase融合蛋白mRNA(其是由分别如SEQIDNO.9、SEQIDNO.10和SEQIDNO.11的TALE序列、Linker序列和piggyBac转座酶基因序列相连后的质粒转录得到)按浓度比1:1比率混合，总浓度为0.4μg/μl，质粒和mRNA溶解在pH＝7、0.5mM的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后2～4小时以内的受精卵内，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，转基因家蚕自交传代，是为G1代。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达EGFP标志基因的转基因阳性蚕，将蚕饲养至成虫，转基因家蚕自交传代，是为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使钙离子结合蛋白基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G3代时，取5龄第3天家蚕后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用InversePCR扩增CABP基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点也是在Bm_scaf25、第26号染色体2886046处，插入位点的左侧序列为：
TAAAAAGTGTCGTGACAACTTTTCGTAAGAATTTTTTCCGTCTAGCCCCCTTTCATTGCGCGCGATAAGGAACTTCGTTCCAAAACTTCGTTCCAACAAAAGCCTAAAGTGATTACGTTCAAACATTTCGATCAAAAGGAAAATTTCAATTAATTTTGTTAATTAACTATAGCAAGTCCATGTTTCTGAAGGAATACCGTGAAATGAGTTTATCCAGAACGCATTGAGATAAATTAA-piggyBac，证明转座子已经插入到家蚕基因组内。
从G4代开始选择绿色荧光蛋白表型纯一的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成绿色荧光蛋白基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌钙离子结合蛋白的转基因家蚕新品种，定名为Sca4。
提取Sca4家蚕的茧丝蛋白和后部丝腺细胞蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和Westernblot技术分析转基因家蚕钙离子结合蛋白蛋白的表达情况，进一步用MS/MS质谱检测，证明了钙离子结合蛋白确实在家蚕后部丝腺细胞表达，并分泌到茧丝中去。
研究结果证明钙离子结合蛋白基因已插入到转基因家蚕新品种Sca4基因组的第26染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌钙离子结合蛋白，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达。
进一步对获得的转基因蚕丝的生物矿化功能进行了分析，证明Sca4转基因蚕丝素能够促进碳酸钙矿化物的生成，而对照品种蚕丝素钙离子结合效应不明显，表明转基因蚕丝丝素溶液具有钙离子结合功能。
实施例3：
将pBCABP-EGFP质粒(图1)及能够提供piggyBac转座酶的TALE-PBase融合蛋白mRNA(其是由分别如SEQIDNO.9、SEQIDNO.10和SEQIDNO.11的TALE序列、Linker序列和piggyBac转座酶基因序列相连后的质粒转录得到)按浓度比1:1比率混合，总浓度为0.4μg/μl，质粒和mRNA溶解在pH＝7、0.5mM的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后2～4小时以内的受精卵内，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，转基因家蚕自交传代，是为G1代。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达EGFP标志基因的转基因阳性蚕，将蚕饲养至成虫，转基因家蚕自交传代，是为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使钙离子结合蛋白基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G3代时，取5龄第3天家蚕后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用InversePCR扩增CABP基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点是在Bm_scaf4、第16号染色体1155464处，插入位点的左侧序列为：
TTGGTATCCACCAAAACTTGTACGCCAGGTATCCGGCTGCTGCTAGGCTCAGGATTATGTACAGAGACACTGATGACCAGCTTGGATTGTTGGTTATTATTGTCCTGATATTTTCAGTATTTTCCTGGATTTTTTCAGCGCGTTGCAGGGCGTCTTTAAGTTTATCCAGTTTAATGTCTTGTAACTTGATGTTTATTGGAGCTGCTTCGGGTGTAGCATGTGCACGGGGTAAAGGTATTATTTCTTCAATGTTTATGAATTTTCAGTGTGTTTGAAGGGTTTTTCCAGCGACTTGTACCTTACAATTATTGTCTATTGTAATTAGGGAAATGCCTTTGCTACGCTGGTACTGCACTTCATTGTTGCAGGTTGACTTGATAACTTCTTCTTGTTTAA--piggyBac，证明转座子已经插入到家蚕基因组内。
从G4代开始选择绿色荧光蛋白表型纯一的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，经连续3代选择、交配，育成绿色荧光蛋白基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌钙离子结合蛋白的转基因家蚕新品种，定名为SCa10。
提取SCa10家蚕的茧丝蛋白和后部丝腺细胞蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和Westernblot技术分析转基因家蚕钙离子结合蛋白蛋白的表达情况，进一步用MS/MS质谱检测，证明了钙离子结合蛋白确实在家蚕后部丝腺细胞表达，并分泌到茧丝中去。
研究结果证明钙离子结合蛋白基因已插入到转基因家蚕新品种SCa10基因组的第16染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌钙离子结合蛋白，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达。
进一步对获得的转基因蚕丝的生物矿化功能进行了分析，证明Sca4转基因蚕丝素能够促进碳酸钙矿化物的生成，而对照品种蚕丝素钙离子结合效应不明显，表明转基因蚕丝丝素溶液具有钙离子结合功能。
从上述三个实施例可以看出，利用本发明方法，可以在家蚕后部丝腺细胞高效合成钙离子结合蛋白，钙离子结合蛋白可以像蚕丝一样由后部丝腺分泌进入中部丝腺，并进一步经过前部丝腺而吐出蚕体。该性状已能够稳定表达并遗传。采用本方法能够通过家蚕正常的吐丝结茧大量生产钙离子结合蛋白，降低生产成本，保证钙离子结合蛋白制品的生物活性。能够提高蚕桑经济效益，提高蚕农收入。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种利用家蚕后部丝腺合成分泌钙离子结合蛋白的方法，其特征在于该方法的步骤如下：
1)采用分子生物学方法构建家蚕合成分泌钙离子结合蛋白的质粒pBCABP-EGFP，质粒pBCABP-EGFP包含有作为外源外源基因的钙离子结合蛋白基因和绿色荧光蛋白EGFP标记基因；
2)采用显微注射转基因家蚕的方法将pBCABP-EGFP质粒及能够提供piggyBac转座酶的TALE-PBase融合蛋白mRNA按浓度比1:1导入家蚕产卵后2～4小时以内的受精卵内，采用piggyBac转座子将钙离子结合蛋白插入到家蚕基因组内；
3)蚕卵孵化后再经多次培养续代育成绿色荧光基因和钙离子结合蛋白基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌钙离子结合蛋白的转基因家蚕；
4)通过家蚕后部丝腺细胞合成分泌钙离子结合蛋白，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。
2.根据权利要求1所述的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌钙离子结合蛋白的方法，其特征在于：所述的步骤3)具体为：
3.1)蚕卵孵化后饲养至成虫，自交续代，此代为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体示显微镜观察筛选出表达EGFP绿色荧光标记基因外源基因的转基因家蚕，饲养至成虫自交续代，成为G2代；
3.2)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达绿色荧光EGFP标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；
3.3)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达绿色荧光EGFP标记基因的蚕蛾互相交配，制成G4代，育成绿色荧光基因和钙离子结合蛋白基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌钙离子结合蛋白的转基因家蚕。
3.根据权利要求1所述的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌钙离子结合蛋白的方法，其特征在于：所述的质粒pBCABP-EGFP以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因。
4.根据权利要求3所述的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌钙离子结合蛋白的方法，其特征在于：所述的质粒pBCABP-EGFP包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以及两个转座臂之间的两个功能表达框，一个功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框，即A3-EGFP-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白轻链基因启动子、丝素蛋白轻链基因信号肽，钙离子结合蛋白序列和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端的表达框，即FLPromoter-FLSP-CABP-FibroinLchain3’-PolyA。
5.根据权利要求1所述的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌钙离子结合蛋白的方法，其特征在于：所述的TALE-PBase融合蛋白mRNA是由包含类转录激活子效应蛋白(TALE)和转座酶(PBase)序列的质粒转录获得。
6.根据权利要求1～5任一所述的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌钙离子结合蛋白的方法，其特征在于：所述的钙离子结合蛋白基因在家蚕后部丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白轻链信号肽的作用下分泌到后部丝腺腔，并依次进入中部丝腺、前部丝腺直到蚕茧，使蚕丝具有钙离子结合活性。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |