CN111518831A - 蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法。蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因为黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝或者园蛛葡萄状腺丝1倍碱基重复单元以1‑8倍连续重复构成的基因序列，具有改良家蚕丝性能等应用；先构建家蚕合成分泌葡萄状腺丝蛋白的载体pBac‑ACSP质粒，将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，用转座子使荧光蛋白基因和葡萄状腺丝蛋白基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，育成分泌蜘蛛葡萄状腺丝蛋白的转基因家蚕。本发明发现了一种蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因的用途，并开发了一种新型家蚕蜘蛛仿生丝的改良家蚕丝性能的生产方法，降低生产成本，显著提高了蚕丝的机械性能。
Description
技术领域
本发明涉及了一种基因的应用及其作用方法，尤其是涉及了一种利用蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因(ACSP)改良家蚕丝性能的方法。
背景技术
具有庞大家族的蜘蛛属于节肢动物门(Arthropoda)，蛛形纲(Arachnida)，蜘蛛目，目前已知含有112个科，3095个属，大概共有4万4千多种。大多数蜘蛛都能产生蜘蛛丝，例如雌性的织网蜘蛛(orb-weavers)可以产生七种不同类型的蜘蛛丝，包括大囊状腺丝(Major Ampullate Silk)，小囊状腺丝(Minor Ampullate Silk)，鞭毛状腺丝(Flagelliform Silk)，管状腺丝(Tubuliform silk)，梨状腺丝(Pyriform gland)，葡萄状腺丝(Aciniform Silk)等，每种丝都由不同的丝腺分泌，不同类型的蜘蛛丝具有各自的功能，共同搭建蜘蛛赖以生存和繁殖的蜘蛛网。蜘蛛丝纤维因出色的机械性能而闻名,它兼具稳定性、柔韧性、高强度和高延展性。
蜘蛛的葡萄状腺丝(Aciniform Silk，AcSp)具有多种功能，如在蜘蛛卵壳内形成柔软的衬里，是包裹猎物的坚实外壳和梨状腺丝的附着物。葡萄状腺丝蛋白约300kDa，包含(GGX)n结构域。黑寡妇蜘蛛(Latrodectus hesperus)完整的葡萄状腺丝(AcSp1)基因序列长39269bp，外显子为18999bp，被收录于基因库JX978171.1。与其他蜘蛛丝蛋白一样，黑寡妇蜘蛛的葡萄状腺丝AcSp1由非重复的N末端、C末端和16倍重复单元构成的核心序列组成，且重复单元以丝氨酸(S)、甘氨酸(G)和丙氨酸(A)为主。园蛛完整的AcSp基因序列长为10387bp，由非重复的N末端、C末端和15倍重复单元构成的核心序列组成，且前14个重复单元的长度均为203个氨基酸，而最后一个重复单元的长度为197个氨基酸，被收录于基因库MG021196.1。AcSp1蛋白重复区域约占整个蛋白质的88％，而且在重复区域中最丰富的三个氨基酸(甘氨酸，丙氨酸和丝氨酸)占总数的45％。
蜘蛛丝具有生物相容性、生物可降解性以及卓越的机械性能，其卓越性能是合成纤维和家蚕丝等无法超越的。但是，令人遗憾的是，由于蜘蛛的领土意识和自相残杀的本能，它们吐的丝就不可能大规模地生产。因此，蜘蛛丝蛋白的实际的应用市场就无法实现。越来越多的科学家就尝试利用分子生物学技术去制造转基因蜘蛛丝，已经在酵母菌，细菌,哺乳动物细胞,转基因植物和昆虫细胞等不同宿主中表达了蜘蛛丝蛋白。在这些生物中虽然都表达了蛋白，但是没有一个具备自然纺丝的能力，即异源蛋白生产系统无法将蜘蛛丝蛋白组装成丝纤维。另外，在这些宿主生物中还存在转基因表达产率低和溶解度低等问题。由于家蚕具有生长周期短、繁殖率高、个体中等、易被大批量驯养等优点，更重要的是它本身就可以大量生产蚕丝。因此，研究者便尝试用家蚕作为大量生产蜘蛛丝的生物反应器。
家蚕和蜘蛛都是能够生产丝蛋白的动物，而蜘蛛丝的弹性与韧性更好，但是蜘蛛丝本身不仅产丝量低而且具有侵略性，难以大批量驯养，因此利用家蚕作为生物反应器来表达蜘蛛丝，可以获得超天然的复合纤维丝。但已有的研究主要是针对大壶状腺丝蛋白方面。2010年，Wen等基于piggyBac转座系统使得Ser1启动子驱动的蜘蛛大壶状腺丝(MaSp1)在家蚕的中部丝腺成功表达，而且重组蜘蛛丝的机械性能提升了15.3％。2012年，Teulé等利用piggyBac介导的转基因技术在家蚕后部丝腺成功表达了重链Fib-H启动子启动的蜘蛛丝蛋白A2S814，Western blot证实它的确存在蚕茧中，蚕丝的机械性能也得到了很大改善。2014年，Kuwana等利用piggyBac转座系统插入了蜘蛛(Araneus ventricosus)MaSp1基因，获得的转基因家蚕表达了重链蛋白和蜘蛛牵引丝蛋白(MaSp1)的融合蛋白，尽管MaSp1的含量仅为天然重链蛋白的0.37-0.61％(w/w)，但是复合纤维丝的韧性相对于野生型家蚕提高了53％左右，而且他们的转基因蚕丝从蚕茧加工成了纺织品。
现有技术中缺少了针对其他蜘蛛丝蛋白基因提高蚕丝性能的有效的转基因处理方法和有效作用基因的发现，而本发明发现了葡萄状腺丝蛋白基因具有显著提高蚕丝性能的作用。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于利用转基因家蚕技术将葡萄状腺丝基因(AcSp)导入家蚕基因组内，并在家蚕后部丝腺细胞中特异性表达，提供一种利用家蚕后部丝腺细胞合成分泌葡萄状腺丝蛋白的方法，开发出能合成分泌葡萄状腺丝蛋白的家蚕，通过家蚕丝腺细胞分泌的葡萄状腺丝蛋白可以在茧层中检测到，且很大程度上提高了蚕丝的机械性能，为开发具有更优异机械性能的蚕丝奠定基础。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：
一、一种蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因序列的应用：
所述蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因在改良家蚕丝性能、家蚕转基因培养、利用家蚕合成分泌生产蜘蛛丝-蚕丝新型复合材料的应用；所述的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因的碱基为黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝(ACSP)基因1倍碱基重复单元以1-8倍连续重复构成的基因序列或者园蛛葡萄状腺丝(ACSP)基因1倍碱基重复单元以1-8倍连续重复构成的基因序列。
黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝1倍碱基重复单元如SEQ ID NO.1，黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝1倍碱基重复单元是从完整的黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝(ACSP)基因碱基序列中局部人工提取获得。园蛛葡萄状腺丝1倍碱基重复单元如SEQ ID NO.2，园蛛葡萄状腺丝1倍碱基重复单元是从完整的园蛛葡萄状腺丝(ACSP)基因碱基序列中局部人工提取获得。
所述改良家蚕丝性能是提高蚕丝机械性能。
二、一种利用蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法：
该方法是构建改良家蚕丝力学性能的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白(ACSP)基因的表达框，表达框组成包含家蚕丝蛋白信号肽、蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因和丝蛋白polyA；然后构建带有表达框的质粒，然后将质粒导入到家蚕基因组中经多次培养续代培育成荧光基因和蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌葡萄状腺丝蛋白的转基因家蚕，获得能够高效率大规模生产蜘蛛葡萄状腺丝蛋白的家蚕品种，进而提高蚕丝的机械性能，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系；所述的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白(ACSP)基因采用权利要求1所述的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白(ACSP)基因。
所述的方法具体如下：
(1)采用分子生物学方法构建家蚕合成分泌葡萄状腺丝蛋白的质粒pBac-ACSP，质粒pBac-ACSP包含有作为外源基因的葡萄状腺丝蛋白(ACSP)和标记基因荧光蛋白的基因；
(2)采用显微注射转基因家蚕的方法将pBac-ACSP质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1-2：1的比例导入家蚕产卵后2-8小时内的受精卵中，利用piggyBac转座子将葡萄状腺丝蛋白插入到家蚕基因组内；
(3)蚕卵孵化后再经多次培养续代育成荧光基因和葡萄状腺丝蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌葡萄状腺丝蛋白的转基因家蚕；
(4)通过家蚕丝腺细胞合成分泌葡萄状腺丝蛋白，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。
由此获得能够高效率大规模生产蜘蛛葡萄状腺丝蛋白的家蚕品种，进而提高蚕丝的机械性能，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系。
所述的质粒pBac-ACSP是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，质粒pBac-ACSP包括piggyBac转座子的两个转座臂pBL和pBR以及两个转座臂PBL和PBR之间的两个功能表达框；一个功能表达框是IE1启动子启动的荧光蛋白基因表达框，另一个功能表达框是包含家蚕丝蛋白基因启动子、家蚕丝蛋白基因信号肽、蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因和家蚕丝蛋白基因polyA的表达框。
所述的辅助质粒pHA3PIG包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的一个转座臂pBR、A3启动子启动的piggyBac转座酶的表达框，即A3 Promoter-transposase-SV40。
所述的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因在家蚕丝腺细胞特异表达，在家蚕丝蛋白信号肽的作用下分泌到丝腺腺腔，并经前部丝腺直到蚕茧。
所述的荧光蛋白基因包括绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因。
所述的家蚕丝蛋白基因包括丝素蛋白重链、丝素蛋白轻链、丝素蛋白P25基因和和丝胶蛋白1基因。
本发明先构建家蚕合成分泌葡萄状腺丝蛋白的载体pBac-ACSP质粒，再利用显微注射将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，用piggyBac转座子使荧光蛋白基因和葡萄状腺丝蛋白基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，育成分泌蜘蛛葡萄状腺丝蛋白的转基因家蚕。
本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，利用该家蚕丝腺细胞特异地合成分泌蜘蛛葡萄状腺丝蛋白，开发了一种新型蚕丝-蜘蛛丝生产系统，降低生产成本，同时保证了重组蚕丝具有比家蚕丝更高的机械性能。
本发明具有的有益效果是：
本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，这种转基因家蚕能够在家蚕丝腺细胞特异地合成分泌葡萄状腺丝蛋白，改良蚕丝性能，简化提纯方法，降低生产成本，提高企业的生产效率和经济效益，提高蚕农的经济效益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
采用已报道的黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝蛋白(ACSP)基因序列的重复序列，构建8倍的重复序列为目的序列，按照家蚕重链密码子偏好性进行优化，人工合成基因并克隆到载体pUC57上，用限制性内切酶AgeI和NheI双酶切质粒，将该目的片段连接到包含piggyBac转座子的左右臂、IE1启动子启动的绿色荧光基因表达框和丝素蛋白重链基因启动子启动的表达框的质粒上，构建成最终转基因质粒pBac-ACSP8H-EGFP。
将pBac-ACSP8H-EGFP质粒与能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒helper按2：1比率混合，2种质粒的总浓度为1.4μg/μl，然后采用显微注射方法导入野生型家蚕品种Lan10的家蚕刚产下的卵。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，为G1代。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达EGFP标志基因的转基因蚁蚕，将转基因蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代，为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使葡萄状腺蛋白基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G3代时，取5龄第3天家蚕后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增检测目的基因AcSp是否插入家蚕基因组中，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点是在第2号染色体上，证明转座子已经成功插入到家蚕基因组内。
从G4代开始选择EGFP表型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，经连续3代选择、交配，育成EGFP基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌葡萄状腺蛋白的转基因家蚕新品种。
提取转基因家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和Western blot技术分析转基因家蚕AcSp蛋白的表达情况，SDS-PAGE电泳条带结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。Western blot研究结果检测到了75kDa分子量的目的蛋白。
对转基因家蚕丝的机械性能测定结果显示(下表)，与用于对照的未导入任何质粒和辅助质粒的野生型家蚕品种Lan10相比，机械性能得到显著提高。
实施例1转基因家蚕茧丝机械性能测定结果
综上结果证明葡萄状腺蛋白基因已插入到转基因家蚕基因组的染色体内，并能够在家蚕丝腺细胞合成分泌葡萄状腺蛋白，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达，转基因家蚕丝的机械性能得到显著改善。
实施例2：
采用园蛛葡萄状腺丝2倍碱基重复单元构成的2个重复片段为目的序列，按照家蚕丝素蛋白密码子偏好性进行优化，人工合成基因并克隆到载体pUC57上，用限制性内切酶AgeI和NheI双酶切质粒，将目的片段连接到包含piggyBac转座子的左右臂、IE1启动子启动的红色荧光基因(DsRed)表达框和丝素蛋白轻链基因启动子启动的表达框质粒上，获得最终转基因质粒pBac-ACSP2L-DsRed。
将pBac-ACSP2L-DsRed质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒helper按1,5：1比率混合，2种质粒的总浓度为1.4μg/μl，然后采用显微注射方法导入野生型家蚕品种Lan10的家蚕产下8h以内的卵。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，为G1代。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达DsRed标志基因的转基因蚁蚕，将转基因蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代，为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达DsRed标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使葡萄状腺蛋白基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G3代时，取5龄第3天家蚕后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增检测目的基因AcSp是否插入家蚕基因组中，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点是第25号染色体上，证明转座子已经成功插入到家蚕基因组内。
从G4代开始选择红眼表型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，经连续3代选择、交配，育成红眼基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌葡萄状腺蛋白的转基因家蚕新品种。
提取转基因家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和Western blot技术分析转基因家蚕AcSp蛋白的表达情况，SDS-PAGE电泳条带结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。
对转基因家蚕丝的机械性能测定结果显示(见下表)，与用于对照的未导入任何质粒和辅助质粒的野生型家蚕品种Lan10相比，机械性能得到很大提高
实施例2转基因家蚕茧丝机械性能测定结果
综上结果证明葡萄状腺蛋白基因已插入到转基因家蚕基因组的染色体内，并能够在家蚕丝腺细胞合成分泌葡萄状腺蛋白，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达，转基因家蚕丝的机械性能得到显著改善。
实施例3：
采用已报道全长的黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝蛋白(ACSP)基因的4倍重复序列为目的序列，按照家蚕丝素密码子偏好性进行优化，人工合成基因并克隆到载体pUC57上，用限制性内切酶AgeI和NheI双酶切质粒，将该目的片段连接到包含piggyBac转座子的左右臂、IE1启动子启动的绿色荧光基因表达框和丝素P25蛋白基因启动子启动的表达框的质粒，构建成最终转基因质粒pBac-ACSP4P-EGFP。
将pBCABP4P-EGFP质粒及能够提供piggyBac转座酶的pHA3PIG质粒按浓度比2：1比例混合，溶解在0.5mM的磷酸缓冲液(pH＝7)中,总浓度为400ng/μl，然后采用显微注射方法导入野生型家蚕品种Lan10的家蚕产卵后2小时内的受精卵中，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，得到G1代。待转基因实验的G1代蚁蚕孵化后，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达EGFP标志基因的转基因阳性蚕1区，将其饲养至成虫，转基因家蚕自交传代，是为G2代。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选EGFP标志基因表达量高的的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使葡萄状腺丝蛋白1基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G2代时，以5龄第3天转基因家蚕后部丝腺基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增ACSP基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点在第4条染色体上，证明转座子已经插入到家蚕基因组内。
从G4代开始选择绿色荧光表型纯一的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成绿色荧光蛋白基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌葡萄状腺丝蛋白的转基因家蚕新品种。
提取转基因家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和Western blot技术分析转基因家蚕葡萄状腺丝蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。
对转基因蚕丝的机械性能测定结果显示(见下表)，与用于对照的未导入任何质粒和辅助质粒的野生型家蚕品种Lan10相比，转基因蚕丝的机械性能较对照有显著提升。
实施例3转基因家蚕茧丝机械性能测定结果
研究结果证明葡萄状腺丝蛋白基因已插入到转基因家蚕新品种基因组的第4号染色体，并能够在后部丝腺细胞合成分泌葡萄状腺丝蛋白，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达，能有效提高重组蚕丝机械性能。
从上述实施例可以看出，利用本发明方法，可以在家蚕后部丝腺细胞高效合成黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝蛋白，葡萄状腺丝蛋白可以像丝素蛋白一样由后部丝腺分泌进入中部丝腺，并进一步经过前部丝腺而分泌到蚕茧中，且性状已能够稳定表达并遗传。采用本方法能够通过家蚕正常的吐丝结茧大量生产蜘蛛葡萄状腺丝蛋白-蚕丝复合材料，降低生产成本，改良蚕丝性能，提高蚕桑经济效益，提高蚕农收入。
实施例4：
采用园蛛葡萄状腺丝1倍碱基重复单元构成的4个重复片段为目的序列，按照家蚕丝胶蛋白密码子偏好性进行优化，人工合成基因并克隆到载体pUC57上，用限制性内切酶AgeI和NheI双酶切质粒，将目的片段连接到包含piggyBac转座子的左右臂、IE1启动子启动的绿色荧光基因表达框和丝胶蛋白1基因启动子启动的表达框的质粒。构建成最终转基因质粒pBac-ACSP4S-EGFP。
将pBac-ACSP4S-EGFP质粒与能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒helper按1：1比率混合，2种质粒的总浓度为1.4μg/μl，然后采用显微注射方法导入野生型家蚕品种Lan10的家蚕产下2h的卵。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，为G1代。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达EGFP标志基因的转基因蚁蚕，将转基因蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代，为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使葡萄状腺蛋白基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G3代时，取5龄第3天家蚕中部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增检测目的基因AcSp是否插入家蚕基因组中，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点是在第5号染色体上，证明转座子已经成功插入到家蚕基因组内。
从G4代开始选择EGFP表型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，经连续3代选择、交配，育成EGFP基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌葡萄状腺蛋白的转基因家蚕新品种。
提取转基因家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和Western blot技术分析转基因家蚕AcSp蛋白的表达情况，SDS-PAGE电泳条带结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带，检测到了45kDa分子量的目的蛋白。
对转基因家蚕丝的机械性能测定结果显示(下表)，与用于对照的未导入任何质粒和辅助质粒的野生型家蚕品种Lan10相比，机械性能显著提高。
实施例4转基因家蚕茧丝机械性能测定结果
本发明涉及的序列如下：
SEQ ID NO.1：黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝1倍碱基重复单元
来源：人工合成
CTGGCTTCATCAGGTGTATTTAGAGCTGCCTTTAATTCAAGAGTCTCAACACCAGTAGCTGTTCAACTCACCGACGCCTTGGTTCAAAAGATCGCTTCAAACTTGGGGTTGGATTACGCTACTGCCTCGAAACTGAGAAAGGCTAGTCAGGCCGTATCAAAAGTCCGCATGGGATCAGACACGAATGCATACGCTCTAGCTATTTCAAGCGCTCTCGCCGAAGTACTATCATCAAGCGGAAAAGTTGCTGATGCTAACATAAATCAGATCGCTCCACAACTTGCTTCAGGAATCGTACTAGGTGTGTCAACCACCGCTCCGCAATTCGGAGTTGACTTGTCAAGCATCAACGTTAACCTGGACATCTCAAATGTTGCTAGGAATATGCAAGCTTCAATCCAAGGTGGTCCAGCTCCAATTACTGCAGAAGGTCCGGACTTTGGTGCTGGATACCCCGGTGGCGCTCCTGCAGATTTGTCTGGTCTGGATATGGGTGCTCCATCTGACGGATCACGTGGAGGTGACGCTACAGCGAAACTTCTGCAGGCTCTCGTTCCGGCTCTGCTCAAGTCAGATGTTTTCAGGGCTATATACAAGCGGGGTACTCGTAAACAGGTCGTTCAGTATGTTACAAACTCAGCTCTGCAACAAGCTGCTTCAAGCTTAGGATTAGATGCTTCAACGATCTCACAATTGCAAACAAAAGCAACTCAGGCTTTGTCATCAGTATCAGCTGACTCTGACTCAACTGCTTACGCAAAAGCATTTGGTTTGGCTATTGCTCAAGTTTTAGGTACCAGCGGACAAGTGAATGACGCAAACGTTAACCAAATCGGAGCTAAACTTGCAACTGGTATTCTGAGAGGATCATCTGCTGTTGCTCCTCGCCTGGGAATCGATCTGTCTGGTATTAATGTGGACTCTGACATAGGTAGCGTCACATCATTAATCTTATCAGGATCCACTCTCCAGATGACAATCCCCGCTGGAGGAGATGATTTATCAGGTGGCTATCCAGGTGGATTTCCTGCTGGTGCTCAACCCAGCGGTGGTGCCCCAGTTGACTTCGGAGGTCCATCTGCTGGTGGTGACGTTGCAGCAAAACTCGCAAGATCACTCGCTTCAACA
SEQ ID NO.2：园蛛葡萄状腺丝1倍碱基重复单元
来源：人工合成
AATAACTTATCCAGAATTGCTTTACAAGCTATCTCACAAGTCCCAGCTGGTTCTGACACTTCAGCTTATGCTCAAGCATTTTCTACTGCCTTGGTCACCGGTGGAGTTCTGAACGCAAACAATGTTGACACTTTGGGATCCCAAGTTCTCTCAGCAGTTCTGAACGGAGTATCATCAGCTGCTCAAGGACTTGGAATCAATGTAGATACTGGAAGCGTACAGTCAGACATTCGTTCCAGCAGTTCATCCCTGTCAACATCATCTTCATCTGCTTCATTTTCTCAGACCAGCGGTGCAGCTTCGACAACTGGTTTCACAGGGGCTGGTGGTTATCCAGGTGGAGCTGGTCCTTTAGGTGGTGGAGTTGGTTCATTGACAGGACAAACGTCTTTTGGTCAAACATCAGGTTTTACTTCAACTGCTGGAGCCCAAGGAGGTTTCGGTCCAACAACTGGTGCTCAATCAGCCCTAATCTCCAGGATAGCTAACGCACTGGCTAATACATCAACACTGAGATCAGTGCTCAGAACCGGTGTTTCCCAACAGACTGCTTCAAGCGTGGTTCAGCGCACCATCCAGACGTTGGCTAGCAATCTCGGCATCGATGGA
上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1128
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctggcttcat caggtgtatt tagagctgcc tttaattcaa gagtctcaac accagtagct 60
gttcaactca ccgacgcctt ggttcaaaag atcgcttcaa acttggggtt ggattacgct 120
actgcctcga aactgagaaa ggctagtcag gccgtatcaa aagtccgcat gggatcagac 180
acgaatgcat acgctctagc tatttcaagc gctctcgccg aagtactatc atcaagcgga 240
aaagttgctg atgctaacat aaatcagatc gctccacaac ttgcttcagg aatcgtacta 300
ggtgtgtcaa ccaccgctcc gcaattcgga gttgacttgt caagcatcaa cgttaacctg 360
gacatctcaa atgttgctag gaatatgcaa gcttcaatcc aaggtggtcc agctccaatt 420
actgcagaag gtccggactt tggtgctgga taccccggtg gcgctcctgc agatttgtct 480
ggtctggata tgggtgctcc atctgacgga tcacgtggag gtgacgctac agcgaaactt 540
ctgcaggctc tcgttccggc tctgctcaag tcagatgttt tcagggctat atacaagcgg 600
ggtactcgta aacaggtcgt tcagtatgtt acaaactcag ctctgcaaca agctgcttca 660
agcttaggat tagatgcttc aacgatctca caattgcaaa caaaagcaac tcaggctttg 720
tcatcagtat cagctgactc tgactcaact gcttacgcaa aagcatttgg tttggctatt 780
gctcaagttt taggtaccag cggacaagtg aatgacgcaa acgttaacca aatcggagct 840
aaacttgcaa ctggtattct gagaggatca tctgctgttg ctcctcgcct gggaatcgat 900
ctgtctggta ttaatgtgga ctctgacata ggtagcgtca catcattaat cttatcagga 960
tccactctcc agatgacaat ccccgctgga ggagatgatt tatcaggtgg ctatccaggt 1020
ggatttcctg ctggtgctca acccagcggt ggtgccccag ttgacttcgg aggtccatct 1080
gctggtggtg acgttgcagc aaaactcgca agatcactcg cttcaaca 1128
<210> 2
<211> 609
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aataacttat ccagaattgc tttacaagct atctcacaag tcccagctgg ttctgacact 60
tcagcttatg ctcaagcatt ttctactgcc ttggtcaccg gtggagttct gaacgcaaac 120
aatgttgaca ctttgggatc ccaagttctc tcagcagttc tgaacggagt atcatcagct 180
gctcaaggac ttggaatcaa tgtagatact ggaagcgtac agtcagacat tcgttccagc 240
agttcatccc tgtcaacatc atcttcatct gcttcatttt ctcagaccag cggtgcagct 300
tcgacaactg gtttcacagg ggctggtggt tatccaggtg gagctggtcc tttaggtggt 360
ggagttggtt cattgacagg acaaacgtct tttggtcaaa catcaggttt tacttcaact 420
gctggagccc aaggaggttt cggtccaaca actggtgctc aatcagccct aatctccagg 480
atagctaacg cactggctaa tacatcaaca ctgagatcag tgctcagaac cggtgtttcc 540
caacagactg cttcaagcgt ggttcagcgc accatccaga cgttggctag caatctcggc 600
atcgatgga 609
Claims (9)
1.一种蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因序列的应用，其特征在于：
所述蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因在改良家蚕丝性能、家蚕转基因培养、利用家蚕合成分泌生产蜘蛛丝-蚕丝新型复合材料的应用；所述的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因的碱基为黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝(ACSP)基因1倍碱基重复单元以1-8倍连续重复构成的基因序列或者园蛛葡萄状腺丝(ACSP)基因1倍碱基重复单元以1-8倍连续重复构成的基因序列。
2.根据权利要求1所述的一种蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因序列的应用，其特征在于：所述改良家蚕丝性能是提高蚕丝机械性能。
3.一种利用蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：
该方法是构建改良家蚕丝力学性能的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白(ACSP)基因的表达框，表达框组成包含家蚕丝蛋白信号肽、蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因和丝蛋白polyA；然后构建带有表达框的质粒，然后将质粒导入到家蚕基因组中经多次培养续代培育成荧光基因和蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌葡萄状腺丝蛋白的转基因家蚕，获得能够生产蜘蛛葡萄状腺丝蛋白的家蚕品种，进而提高蚕丝的机械性能，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系；所述的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白(ACSP)基因采用权利要求1所述的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白(ACSP)基因。
4.根据权利要求3所述的一种利用蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述的方法具体如下：
(1)采用分子生物学方法构建家蚕合成分泌葡萄状腺丝蛋白的质粒pBac-ACSP，质粒pBac-ACSP包含有作为外源基因的葡萄状腺丝蛋白(ACSP)和标记基因荧光蛋白的基因；
(2)采用显微注射转基因家蚕的方法将pBac-ACSP质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1-2：1的比例导入家蚕产卵后2-8小时内的受精卵中，利用piggyBac转座子将葡萄状腺丝蛋白插入到家蚕基因组内；
(3)蚕卵孵化后再经多次培养续代育成荧光基因和葡萄状腺丝蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌葡萄状腺丝蛋白的转基因家蚕；
(4)通过家蚕丝腺细胞合成分泌葡萄状腺丝蛋白，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。
5.根据权利要求4所述的一种利用蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述的质粒pBac-ACSP是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，质粒pBac-ACSP包括piggyBac转座子的两个转座臂pBL和pBR以及两个转座臂PBL和PBR之间的两个功能表达框；一个功能表达框是IE1启动子启动的荧光蛋白基因表达框，另一个功能表达框是包含家蚕丝蛋白基因启动子、家蚕丝蛋白基因信号肽、蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因和家蚕丝蛋白基因polyA的表达框。
6.根据权利要求3所述的一种利用蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述的辅助质粒pHA3PIG包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的一个转座臂pBR、A3启动子启动的piggyBac转座酶的表达框，即A3Promoter-transposase-SV40。
7.根据权利要求3所述的一种利用蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因在家蚕丝腺细胞特异表达，在家蚕丝蛋白信号肽的作用下分泌到丝腺腺腔，并经前部丝腺直到蚕茧。
8.根据权利要求4所述的一种利用蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述的荧光蛋白基因包括绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因。
9.根据权利要求3所述的一种利用蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述的家蚕丝蛋白基因包括丝素蛋白重链、丝素蛋白轻链、丝素蛋白P25基因和和丝胶蛋白1基因。
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|---|---|---|---|---|
| CN113173983A (zh) * | 2021-04-20 | 2021-07-27 | 西南大学 | 一种利用家蚕丝腺大规模生产荧光蛋白的方法 |
| WO2023213009A1 (zh) * | 2022-05-05 | 2023-11-09 | 苏州大学 | 一种含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法 |
| WO2023213008A1 (zh) * | 2022-05-05 | 2023-11-09 | 苏州大学 | 一种含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝及其制备方法 |
Citations (2)
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| CN103261231A (zh) * | 2010-09-28 | 2013-08-21 | 圣母大学 | 嵌合蜘蛛丝及其用途 |
| CN105400815A (zh) * | 2015-10-23 | 2016-03-16 | 浙江大学 | 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的方法 |
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2020
- 2020-05-11 CN CN202010392618.2A patent/CN111518831B/zh active Active
Patent Citations (2)
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