CN103261231A - 嵌合蜘蛛丝及其用途 - Google Patents
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Abstract
披露了被工程化为拥有并表达一种嵌合蜘蛛丝蛋白质基因的转基因蚕，该嵌合蜘蛛丝蛋白质基因对于一种具有蜘蛛丝结构域的嵌合蜘蛛丝蛋白质进行编码，该蜘蛛丝结构域对于一种蜘蛛丝弹性基序序列和/或一种蜘蛛丝强度基序序列是特定的。还提供了改进的蚕丝纤维，该改进的蚕丝纤维具有相对于天然蚕丝纤维而言的改进的强度（张力）以及弹性特征。还提供了一种用于采用在此披露的转基因蚕来制备嵌合丝纤维的改进的方法，该方法采用一种基于piggyBac的载体系统以及一种辅助质粒。提供了基因表达盒，并且这些基因表达盒用于创造多种合成的蜘蛛丝编码序列（蜘蛛2、蜘蛛4、蜘蛛6、蜘蛛8）。在一种辅助质粒的存在下，使用一种piggyBac载体系统以转化突变的蚕，从而将该嵌合蜘蛛丝基因合并入该蚕中以提供一种稳定的转化体。因而这些转基因蚕提供了适用于丝纤维的商业生产的一种有效的蜘蛛丝生产有机体。
Description
由于工作受来自国家生物医学成像和生物工程研究所，美国国立卫生研究院（DLJ）的批准号R21 EB007247的支持，美国政府可以拥有对本申请中的技术的权利。共同研究协议是在圣母大学研究部（MJF）内签订，以及与Kraig BioCraft实验室公司（MJF）签订了一个研究协议。
发明领域
本发明因为提供了具有改进的强度和柔性特征的嵌合蜘蛛丝纤维，故涉及丝纤维的领域。此外，本发明因为提供了用于采用一种具有特定蜘蛛丝基因序列（蜘蛛丝强度和/或蜘蛛丝柔性和/或弹性基序序列）的工程化的转基因蚕来生产一种改进的丝纤维（具体而言为一种蚕/蜘蛛丝嵌合纤维）的方法，故涉及生产嵌合的丝纤维的方法的领域。由于描述了被工程化为包括一种嵌合的蚕序列的转基因蚕（该嵌合的蚕序列包括对于蜘蛛丝柔性和/或弹性基序以及蜘蛛丝强度基序的特定的蜘蛛丝基因序列）以及用于采用一种特定设计的piggyBac载体来创造这些转基因蚕的方法，故本发明还涉及转基因有机体。还提供了采用所述的转基因蚕针对嵌合的丝纤维的商业生产方法。
发明背景
丝纤维已经作为用于多种多样的重要外科手术的缝合线而被使用多年。需要更精细的纤维作为用于眼睛、神经、以及整容手术的缝合线。丝纤维还有作为用于以下项的材料的很大希望：人工韧带、人工腱、用于烧伤患者中皮肤移植的弹性绷带、以及可以在骨、牙周、以及结缔组织的再生期间提供支持并且在一些例子中提供临时功能的支架。由于在老龄化人口中需要外科修复的前交叉韧带（ACL）以及其他的关节损伤的发生增加，丝纤维作为用于韧带和腱的材料的发展有望变得日益重要。当前用作缝合线的小比例的纤维是从天然的蚕丝衍生，而大多数是作为合成的聚合物而被化学企业生产。此方法的主要限制是它仅能提供具有窄范围的物理特性（例如直径、强度以及弹性）的丝纤维。
多种多样的的重组系统已经用于生产不同的丝蛋白质，这些重组系统包括：细菌（路易斯（Lewis）等人1996）、酵母（凡恩斯托克（Fahnestock）和别济克（Bedzyk），1997）、杆状病毒感染的昆虫细胞（许梅里希（Huemmerich）等人2004）、哺乳动物细胞（拉扎里斯（Lazaris）等人2002）以及转基因植物（舍勒（Scheller）等人2001）。然而，所有这些系统没有被天然地设计为纺造丝（spin silk），并且因此还没有一种已经确实生产出有用的丝纤维。为了使丝纤维从商业角度来说被认为是有用的，该纤维必须拥有足够的张力（强度）以及柔性和/或弹性特征，并且适用于创造在所希望的商业应用中的纤维。因此，继续存在一种对于可用于此目标的系统的需要。
蜘蛛丝蛋白质已经在一些异源蛋白生产系统中得以生产。在各个情况中，生产的蛋白质的量远低于实际商业水平。可以将转基因植物和动物表达系统按比例扩大，但是即使在这些系统中，重组蛋白质生产水平也会不得不被实质性地增加至呈有成效的。甚至更困难的问题是先前的生产努力已经产生了蛋白质，但不是纤维。因而，这些蛋白质必须使用一种后期生产（post-production）方法而被纺造成纤维。由于这些生产和纺造问题，依然没有能生产足够长以致具有商业利益的蜘蛛丝纤维（即“有用的”纤维）的重组蛋白质生产系统的实例。
先前报道的生产纤维的尝试使用了一种哺乳动物细胞系统以表达对来自蜘蛛十字园蛛（A.diadematus）的MaSp1、MaSp2、以及相关的丝蛋白质进行编码的基因（拉扎里斯（Lazaris）等人2002）。这个工作导致60Kd蜘蛛丝蛋白质—ADF-3的生产，该ADF-3被纯化并且用于使用后期生产纺造（post-production spinning）方法来生产纤维。然而，此系统并非一致地生产有用的纤维。此外，由于溶解这些蛋白质、开发成功的纺造条件、以及进行后期纺造牵拉以得到具有有用特性的纤维的需要，此方法是有问题的。
本领域仍然缺乏用于一致地提供这样一种丝纤维产物的商业方法：该丝纤维产物具有制造用途中所需要的必要张力和柔性特征。
发明概述
本发明解决了本领域中描述的以上的以及其他的困难。具体而言，提供了一种可适配为商业等级的转基因蚕生产系统，由于它被天然地装备为纺造丝纤维而绕开了与蛋白质纯化、溶解、以及人工后期生长纺造相关联的问题。
在广义上以及整体意义上，本发明提供了一种用于生产嵌合蜘蛛丝纤维的生物技术方法，该途径使用转基因蚕作为具有优越的张力和柔性特征的商业上有用的嵌合丝纤维的异源丝蛋白生产的平台。嵌合的丝纤维可以按用户需要被设计为提供具有特定范围的所希望物理特性的、或具有预定特性的纤维，被优化用于所希望的生物医药应用。
蜘蛛/蚕丝蛋白质以及嵌合蜘蛛丝纤维：
在一方面，本发明提供了一种重组嵌合蜘蛛丝/蚕丝蛋白质，该蛋白质由一种序列进行编码，该序列包括一个或多个蜘蛛丝柔性和/或弹性基序/结构域序列和/或一个或多个蜘蛛丝强度结构域序列。在一些实施例中，该嵌合的蜘蛛/蚕丝蛋白质被进一步描述为编码一种蜘蛛2、蜘蛛4、蜘蛛6或蜘蛛8嵌合的蜘蛛/蚕丝蛋白质。
此外，本发明提供了从嵌合的蚕/蜘蛛丝蛋白质制备的嵌合蜘蛛丝纤维。在具体实施例中，嵌合蜘蛛丝纤维被描述为具有与天然蚕丝纤维相比而言较大的拉伸强度，并且在一些实施例中，具有与天然蚕纤维相比而言大于高达2倍的拉伸强度。
转基因蚕：
在另一方面，本发明提供了转基因有机体，具体地是重组的昆虫和转基因动物。在一些实施例中，该转基因有机体是一种转基因蚕，例如转基因家蚕（Bombyx mori）。在具体实施例中，有待被转化以提供转基因蚕的宿主蚕将是一种缺乏生产天然丝纤维的能力的突变的蚕。在一些实施例中，该蚕突变体是pnd-w1。
在一些实施例中，突变的蚕（家蚕）将使用piggyBac系统而被转化，其中piggyBac载体是使用一种表达盒来制备，该表达盒包括在侧翼有家蚕fhc蛋白质的N-和C-末端片段的合成蜘蛛丝蛋白质序列。通常，蚕转化涉及通过显微注射蚕卵而将piggyBac载体与对piggyBac转座酶进行编码的辅助质粒的混合物引入前胚盘胚胎中。使用经校准以刺破绒毛膜的eppendorf机器针操纵器来创造微插入开口，通过该微插入开口将一个玻璃毛细管插入，通过该玻璃毛细管将DNA溶液注入蚕卵中。然后允许被注入的卵成熟，并且进展为孵化成幼虫。允许幼虫成熟为成熟的蚕，并且根据蚕的常规的生命周期吐丝成茧。
这些转基因昆虫与彼此或者与非转基因昆虫/蚕的交叉培育也被提供作为本发明的部分。
蜘蛛丝基因表达盒：
在另一方面，提供了嵌合的蚕/蜘蛛丝表达盒，该盒包括相应于一个或多个如在此披露的多个具体蜘蛛丝柔性和/或弹性基序序列和/或蜘蛛丝强度基序序列的一个或多个蜘蛛丝蛋白质序列基序。在另一方面，提供了用于生产嵌合蜘蛛丝/蚕蛋白质以及纤维的方法。已经提供了如在图5中所描绘的表达盒的至少八（8）种不同的形式，这些形式对四种不同的合成蜘蛛丝蛋白质（带有或不带有插入在NTD与(abd)蜘蛛丝序列之间的框架中的EGFP）进行编码。这些序列在此表示为“蜘蛛2”、“蜘蛛4”、“蜘蛛6”以及“蜘蛛8”。
转基因蚕：
在又另一个方面，提供了转基因蚕以及用于制备转基因蚕的方法。在一些实施例中，制备转基因蚕的方法包括：制备具有一种序列的表达盒，该序列包括蚕序列、嵌合蜘蛛丝序列（对一个或多个蜘蛛丝强度基序序列以及一个或多个蜘蛛丝柔性和/或弹性基序序列进行编码）；将所述盒序列亚克隆进piggyBac载体（例如piggyBac载体pBac[3xP3-DsRedaf]，参见图6，母质粒（parent plasmid）参见图10-11，从母质粒亚克隆的质粒参见图12A-12E）中；将piggyBac载体与对piggyBac转座酶进行编码的辅助质粒的混合物引入前胚盘蚕胚胎中（例如通过显微注射蚕卵）；将被注入的蚕胚胎维持在标准培养条件（大约28°C和70%湿度）下直到幼虫孵出；并且获得转基因蚕。
可以将这些转基因蚕进一步配对以产生F1代胚胎，用于基于S-红眼标记的表达而对推定的转化体的后续鉴别。然后将通过这种方法鉴别的推定的雄性和雌性转化体进行配对，从而生产纯合子系（homozygouslineage）用于更详细的基因分析。确切地，蚕转化涉及将piggyBac载体与辅助质粒DNA的混合物注入清晰表皮（clear cuticle）蚕突变体pnd-w1的蚕卵中。蚕突变体pnd-w1描述于田村（Tamura）等人2000中，该参考文献确切地以其全文结合在此。该突变体具有黑化作用缺陷，该缺陷使得使用荧光基因的筛选更加容易。一旦为红眼，则鉴别出推定的F1转化体，使用丝腺蛋白质以及收获的茧丝的蛋白质印迹法来确认纯合子系。
制造嵌合蜘蛛丝/蚕丝纤维的方法：
在又另一方面，本发明提供了用于在转基因蚕中生产嵌合蜘蛛丝/蚕纤维的商业生产方法。在一个实施例中，该方法包括制备在此所述的转基因蚕，并且在允许它们生长并形成茧的条件下培养转基因蚕，收获茧，并且从茧获得嵌合蜘蛛丝纤维。可以使用用于从丝茧解开和/或以其他方式收获丝纤维的标准技术。
制造的物品以及使用这些物品的方法：
仍在另一方面，提供了制造的多种物品，这些物品从本发明的嵌合蜘蛛丝纤维制得。例如，除了其他项之外，该重组嵌合的蜘蛛/蚕纤维可以用于医学缝合线材料、伤口敷件以及组织/关节替换和重建材料与装置、药物递送贴剂和/或其他递送物件、防护衣（防弹背心以及其他物品）、娱乐物品（帐篷、降落伞、露营用具等）。
在另一方面，提供了在不同的医学程序中使用重组嵌合蜘蛛丝/蚕纤维的方法。例如，这些纤维可以用于协助组织修复（在生长或再生中，作为用重组纤维制备的在组织中被工程化为生物相容构建体的支架），或提供已经被工程化为纤维的蛋白质或治疗剂的递送。
除非另外限定，在此所用的所有技术术语和科学术语均与本领域普通技术人员普遍理解的具有相同的含义。虽然类似或等同于在此所述的那些的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但以下描述了优选的方法和材料。所有出版物、专利申请、专利以及其他在此提及的参考文献均通过引用结合在此。此外，材料、方法和实例仅是示例性的而非旨在是限制性的。在矛盾的情况下，本发明说明书（包括定义）占据主导。
附图简要说明
在结合附图阅读了以下优选实施例的详细说明后，本发明的其他目的和优势对于本领域的普通技术人员将变得清楚，其中已经使用相同的参考号来指代相同的元件，并且其中：
图1呈现来自分歧的圆网蜘蛛或衍生的圆网蜘蛛的两种大壶状腺丝蛋白质的氨基酸序列（加特希（Gatesy）等人2001）。对比揭示了高水平序列保守性，具体地是在以上所述的序列基序内，该保守性从这些物种彼此分歧开始已经保持长达1亿2500万年。在不同圆网品种中的大壶状腺丝蛋白质的一致重复氨基酸序列，（-）指示当与其他序列比较时不存在的氨基酸。蜘蛛是：棒络新妇蛛（Nephila clavipes）；褐寡妇蜘蛛（Lactrodectusgeometricus）；三带金蛛（Argiope trifasciata）。
图2–呈现来自圆网蜘蛛的小壶状腺丝蛋白质的一致氨基酸序列。在最初的大壶状腺丝蛋白质序列公开后不久，表示来自棒络新妇蛛的小壶状腺丝（Mi）蛋白质转录物的cDNA被分离并被测序（Colgin和Lewis，1998）。在此图中提供的MiSp序列具有相对于MaSp蛋白质而言相似以及显著不同的序列两者。MiSp包括GGX和短的聚Ala序列，但在MaSp中的较长的聚Ala基序是被(GA)n重复替换。一致重复具有相似的组织，但是GGX和GA重复的数目有很大不同。
图3–呈现鞭状丝蛋白质cDNA一致序列。这些丝蛋白质cDNA对来自棒络新妇蛛鞭状腺的捕捉螺旋丝蛋白质进行编码（图3；林淳（Hayashi）和路易斯（Lewis），2000）。这些cDNA包含对5’非翻译区和分泌信号肽、五氨基酸基序的众多重复以及C-末端进行编码的序列。RNA印迹法分析指示大约15kb的mRNA大小，对一种接大约500Kd的蛋白质进行编码。从基因序列预测的氨基酸序列表明了一种蛋白质结构模型，该模型有助于解释蜘蛛丝弹性的物理基础，该弹性也与MaSp2的特性一致（在此进一步被描述）。
图4–呈现一个具有β螺旋的计算机模型。这是一种能量最小化的(GPGGQGPGGY)2序列的模型，在每个五聚物序列处具有II型β-转角的起始构型。
图5–呈现被构建的、在基础的家蚕丝丝心蛋白重链表达盒上的若干变体。该设计涉及被设计为表达丝心蛋白重链（fhc）-蜘蛛丝嵌合体的构建体的装配，在该嵌合体中合成的蜘蛛丝蛋白质序列侧翼带有家蚕fhc蛋白质的N-和C-末端片段。在每个表达盒中的功能相关的基因元件从左到右，包括：来自家蚕fhc基因的主启动子，上游增强子元件（UEE），基础启动子、以及N-末端结构域（NTD）；随后为定位在框架内的不同的合成蜘蛛丝蛋白质序列，该框架具有位于NTD上游的翻译起始位点；随后为C-末端结构域（CTD），该C-末端结构域包括翻译终止位点以及RNA多聚腺苷酸化位点。
图6–呈现用于将盒（cassette）亚克隆进piggyBac中的方案。八种不同形式的所画出的表达盒中的每一个是使用AscI和FseI从母质粒切下，并且被亚克隆进pBAC[3xP3-DSRedaf]的相应位点。显示了该piggyBac载体的图谱。
图7–呈现转基因蚕丝的蛋白质印迹。通过使用蜘蛛丝特异性抗体对来自转基因蚕茧的蚕丝腺蛋白质成分和丝纤维两者进行的蛋白质印迹，针对蜘蛛丝嵌合蛋白质的存在将这些丝进行分析。在两种情况中，转基因蚕被核实为生产嵌合蛋白质，并且微分萃取（differential extraction）研究显示这些蛋白质是它们的茧的转基因丝纤维的整合组分。并且，通过使用荧光解剖显微镜对丝腺或丝纤维的直接检验，在丝腺以及纤维两者中每一个嵌合绿色荧光蛋白融合体的表达是明显的。在大多数情况中，荧光蛋白在纤维中的量是足够高的，以致于通过使茧着绿色而在正常照明下被可视化。
图8–呈现母质粒pSL-蜘蛛4号，17,388bp大小。该母质粒携带嵌合蜘蛛丝蛋白质4号盒，蜘蛛丝(A4S8)x42。
图9–呈现母质粒pSL-蜘蛛4号+GFP。GFP是绿色荧光蛋白。该载体具有18,102bp的大小。该母质粒携带具有标记蛋白GFP的嵌合蜘蛛丝蛋白质4号盒，蜘蛛丝(A4S8)x42。
图10–呈现母质粒pSL-蜘蛛6号。该母质粒具有12,516bp的大小。该母质粒携带嵌合蜘蛛丝蛋白质6号盒，蜘蛛丝(A2S8)x14)x42。
图11–呈现母质粒pSL-蜘蛛6号+GFP。GFP是绿色荧光蛋白。该母质粒具有13,230bp的大小。该母质粒携带具有标记蛋白GFP的嵌合蜘蛛丝蛋白质6号盒，蜘蛛丝(A2S8)x14。
图12A-B–呈现piggyBac质粒。图12A描绘了具有10,458bp大小的pXLBacII-ECFP NTD CTD maspX16构建体。图12B描绘了pXLBacII-ECFP NTD CTD maspX24构建体，并且具有11,250bp大小。
图13–呈现pSL-蜘蛛4号的序列。
图14–呈现pSL-蜘蛛4号+GFP的序列。
图15呈现pSL-蜘蛛6号的序列。
图16–呈现pSL-蜘蛛6号+GFP的序列。
图17–呈现piggyBac载体设计。图17A，A2S814合成蜘蛛丝基因；图17B，蜘蛛6嵌合蚕/蜘蛛丝基因；图17C，蜘蛛丝6-GFP嵌合蚕/蜘蛛丝基因；图17D，piggyBac载体；图17E，对于以下项的符号：鞭状弹性基序（A2；120bp）；大壶状腺蜘蛛丝蛋白-2；蜘蛛基序（S8；55bp）Fhc主启动子（1,157bp）、Fhc增强子（70bp）；Fhc基本启动子，Hhc5’翻译区（外显子1/内含子/外显子2；Fhc N-末端cds）=1,744bp；EGF（720bp）；A2SB14.蜘蛛丝序列（2,462bp），Fhc C-末端cds（180bp），Fhc多聚腺苷酸化信号（300bp）。
图18–呈现在来自蜘蛛6-GFP蚕的茧（18A）、丝腺（18B，18C）、以及丝纤维（18D）中嵌合蚕/蜘蛛丝/EGFP蛋白质的表达。在蚕丝腺中嵌合的蚕/蜘蛛丝蛋白质的表达和定位。将丝腺切下，用蜘蛛6或蜘蛛6-GFPpiggyBac载体进行轰击，并且在荧光显微镜下进行检验，如在方法中所描述的。
图19–丝纤维的循序提取。将由pnd-w1（泳道3-6）、蜘蛛6（泳道8-11）、或蜘蛛6-GFP（泳道13-16）蚕生产的茧进行脱胶并且经受循序提取方案，如在此所述的。将在每个提取步骤中溶解的蛋白质通过SDSPAGE以及考马斯亮蓝染色（19A）或与蜘蛛丝蛋白质特异性的抗血清进行的免疫印迹（19B）进行分析。M：分子量标记物。+:在大肠杆菌（E.coli）中表达并纯化的A2S814蜘蛛丝蛋白质。泳道3、8、以及13：盐水提取物。泳道4、9、以及14：SDS提取物。泳道5、10、以及15：8M LiSCN/2%巯基乙醇提取物。泳道6、11、以及16：16M LiSCN/5%巯基乙醇提取物。箭头标记嵌合蜘蛛丝蛋白质。对于来自大肠杆菌的A2S814，表观分子量是大约75kDa，对于蜘蛛6而言是大约106kDa，并且对于蜘蛛6-GFP而言是大约130kDa以及大约110kDa。
图20–显示了对于来自转基因蚕的复合纤维、来自亲本蚕的天然纤维、以及代表性的天然（牵丝）蜘蛛丝纤维观察到的最佳力学性能的比较。纤维韧性是由在应力/应变曲线下的面积所限定。经脱胶的天然的和复合的丝纤维的力学特性。将对于天然蚕（pnd-w1）和代表性蜘蛛（棒络新妇蛛牵丝）丝纤维所测量的最佳力学性能，与使用由转基因蚕生产的复合丝纤维获得的那些进行比较。将所有的纤维在相同的条件下进行测试。当与天然蚕pnd-w1（43.9MJ/m3）相比时，最坚韧的值是：蜘蛛6系7（86.3MJ/m3）；蜘蛛6-GFP系1（98.2MJ/m3），蜘蛛6-GFP系4（167.2MJ/m3）；以及棒络新妇蛛牵丝（138.7MJ/m3）。这些数据显示：与来自非转基因蚕的天然纤维相比，所有的来自转基因蚕的复合丝纤维更坚韧。
图21–描绘了构建体pXLBacII-ECFP NTD CTD masp1X16的核酸序列（10,458bp(pb)）。
图22–描绘了构建体pXLBacII-ECFP NTD CTD maspX24的核酸序列（11,250bp）。
优选实施方案的详细说明
在本发明中用于将基因插入蚕染色体中的方法应该能使基因稳定地合并在染色体中并且在染色体中表达，并且使基因也通过配对而被稳定地繁殖到子代。虽然使用显微注射进蚕卵中的方法或使用基因枪的方法可以被使用，优选使用的方法包括将包含靶基因的载体（用于将外源基因插入蚕染色体中）以及包含转座子基因的辅助质粒同时显微注射进蚕卵中（自然生物技术（Nature Biotechnology 18,81-84,2000））。
将靶基因插入重组蚕中的生殖细胞中，该重组蚕已经从显微注射的蚕卵孵出并且生长。以此方式获得的重组蚕的子代能够在它们的染色体中稳定地保持靶基因。可以按与普通蚕相同的方式来维持在本发明中获得的在重组蚕中的基因。即，可以通过在标准条件下孵育这些卵、收集孵出的幼虫到人工喂养并且然后在与普通蚕相同的条件下饲养它们来饲养高达五龄的蚕。
在本发明中获得的重组的蚕可以按与普通蚕相同的方式来饲养，并且能通过在普通条件下的饲养来生产外源蛋白，从而使蚕发育和生长最大化。
在本发明中获得的基因重组的蚕能够以与普通蚕相同的方式化蛹并且生产茧。将雄性和雌性在蛹期进行区分，并且在转化为蛾后，雄性和雌性配对并且在次日收集卵。可以按与普通蚕卵相同的方式来储存这些卵。可以通过如上所述的培育而将本发明的基因重组蚕维持在后续代上，并且可以使其增加至大的数目。
虽然对这里使用的启动子没有具体限制，并且可以使用起源自任何有机体的任何启动子（其条件是它在蚕细胞内有效地作用），已经被设计为确切诱导蚕丝腺中的蛋白质的启动子是优选的。蚕丝腺蛋白质启动子的实例包括丝心蛋白H链启动子、丝心蛋白L链启动子、p25启动子以及丝胶蛋白启动子。
在本发明中，“用于表达嵌合蜘蛛丝蛋白质的基因盒”是指在插入昆虫细胞中的情况中用于嵌合蛋白质合成的必需的一组DNA。这种用于表达嵌合蜘蛛丝蛋白质的基因盒包含启动基因（该基因对嵌合蜘蛛丝蛋白质进行编码）的表达的启动子。正常地，它还包含终止子以及poly A附加区，并且优选地包含启动子、外源蛋白质结构基因、终止子以及poly A附加区。并且，它还可以包含连接在启动子与外源蛋白质结构基因之间的分泌信号基因。还可以将任意基因序列连接在poly A附加序列与外源蛋白质结构基因之间。此外，还可以连接人工设计的以及合成的基因序列。
此外，“用于插入嵌合蜘蛛丝/蚕基因的基因盒”是指用于表达嵌合蜘蛛丝/蚕基因的基因盒，该基因盒在两边具有一对piggyBac转座子的反向重复序列并且包括通过piggyBac转座子的作用而插入昆虫细胞染色体的一组DNA。
在本发明中的载体是指具有环状或线性DNA结构的那种。特别优选的是能够在大肠杆菌中复制并且具有环状DNA结构的载体。出于协助转化体的选择的目标，此载体还可以合并一种标记基因，例如抗生素抗性基因或水母绿色荧光蛋白基因。
虽然对本发明中使用的昆虫细胞没有具体限制，它们优选是鳞翅目昆虫，更优选家蚕细胞，并且甚至更优选蚕丝腺细胞或包含在家蚕卵中的细胞。在丝腺细胞的情况中，五龄蚕幼虫的后部丝腺细胞是优选的，这是因为那里存在丝心蛋白的活性合成并且它们易于处理。
对用于合并一种基因盒的方法不存在具体限制，该基因盒用于由昆虫细胞对嵌合蜘蛛丝蛋白质的表达。在合并入蚕丝腺细胞中的情况中，使用基因枪的方法以及使用显微注射的方法可以用于到培养的昆虫细胞中的合并，例如一种基因可以使用基因枪而容易地被合并入从五龄蚕幼虫体移除的后部丝腺组织中。
使用基因枪来将基因合并入后部丝腺中可以通过以下方法来进行：例如，使用粒子枪（particle gun）（Bio-Rad，型号PDS-1000/He），在1,100至1,800psi的氦（He）气压下，将用含有表达外源蛋白质的基因盒的载体涂覆的金颗粒轰击进入固定在琼脂板上的后部丝腺等等。
在将基因合并入包含在家蚕卵中的细胞中的情况中，使用显微注射的方法是优选的。在此，在执行显微注射进卵内的情况中，不必要的是直接地显微注射进卵的细胞中，而是基因可以通过简单地显微注射进卵中来被合并。
在其染色体中包含本发明的“用于表达嵌合蜘蛛丝蛋白质的基因盒”的重组蚕可以通过将具有“用于插入嵌合蜘蛛丝基因的盒”的载体显微注射进家蚕卵中来获得。例如，第一代（G1）蚕是通过将一种具有“用于插入嵌合蜘蛛丝基因的基因盒”的载体以及一种其中piggyBac转座酶基因是在蚕肌动蛋白启动子的控制下被安排的质粒同时地显微注射进家蚕卵中（根据塔玛拉（Tamara）等人的方法，《自然生物技术》（NatureBiotechnology）18,81-84,2000）、随后培育孵化的幼虫、并且使得到的同一组内的成年昆虫（G0）杂交来获得。正常地，重组的蚕以在该G1代中1%至2%的频率出现。
重组蚕的选择可以通过在从G1代蚕组织分离DNA后使用设计引物（该设计引物基于外源蛋白质基因序列）的PCR来进行。可替代地，可以通过以下方法容易地选择重组蚕：预先将一种连接在启动子下游的、能够在蚕细胞中表达的、对绿色荧光蛋白进行编码的基因插入“用于插入基因的基因盒”中、并且然后在紫外灯下在一龄期的G1代蚕中选择那些发射绿色荧光的个体。
此外，出于获得在它们的染色体中包含“用于表达外源蛋白的基因盒”的重组蚕的目标，在将具有“用于插入基因的基因盒”的载体显微注射进家蚕卵中的情况中，重组蚕可以按如上所述的方式通过同时显微注射piggyBac转座酶蛋白质来获得。
piggyBac转座子是指一种DNA转移因子，它在两端具有13个碱基对的反向序列以及约2.1k碱基对的ORF内部。虽然对本发明中使用的piggyBac转座子没有具体限制，可以使用的那些的实例包括起源自粉纹夜蛾细胞系TN-368、苜蓿银纹夜蛾NPV（AcNPV）以及Galleria mellonea NPV（GmMNPV）的那些。优选地可以使用具有起源自粉纹夜蛾细胞系TN-368的部分的质粒pHA3PIG和pPIGA3GFP来制备具有基因和DNA转移活性的piggyBac转座子（《自然生物技术》（Nature Biotechnology）18,81-84,2000）。起源自piggyBac的DNA序列的结构需要具有一对包含TTAA序列的反向末端序列，并且具有一种外源基因（例如插入于那些DNA序列之间的细胞因子基因）。更优选的是使用转座酶，以便使用起源自转座子的DNA序列而将外源基因插入蚕染色体中。例如，基因插入蚕染色体中的频率可以通过以下方法而得以显著改进：同时插入能够表达piggyBac转座酶的DNA以使转座酶在蚕细胞中被转录并被翻译，从而识别那两对反向末端序列、切下它们之间的基因片段、并且将该基因片段转移至蚕染色体。
可以通过以下说明甚至更完全地理解本发明。
在生物医学领域中嵌合丝蛋白质：
提供嵌合蜘蛛丝纤维作为用于一程序子集（例如眼睛手术、神经修复、以及整形外科，这些程序需要极其细的纤维）的广泛使用材料的部分。另外的用途包括用于骨、韧带以及腱的再生的支架材料连同用于药物递送的材料。
通过本发明的方法生产的重组蜘蛛丝纤维可以用于多种医学应用（例如伤口闭合系统，包括血管伤口修复装置、止血敷件、贴剂以及胶、缝合线、药物递送）以及组织工程应用（例如，如支架、韧带假体装置）以及用于长期的或生物可降解的植入人体内的产品中。优选的工程化支架是用在此所述的重组蜘蛛丝/蚕纤维制备的纤维的非纺织网状物。
此外，本发明的重组嵌合的丝纤维可以用于器官修复、替换或再生策略，这些策略可以从这些独特的支架获益，包括但不局限于：脊椎盘、颅骨组织、硬膜、神经组织、肝脏、胰脏、肾脏、膀胱、脾脏、心肌、骨骼肌、腱、韧带以及乳房组织。
在本发明的另一个实施例中，重组体蜘蛛丝纤维材料可以包括治疗剂。为了形成这些材料，可以将治疗剂在形成材料之前工程化为纤维或者在形成材料后装载到材料中。可以与本发明的重组嵌合丝纤维结合使用的多种不同治疗剂。总体上，可以经由本发明的药用组合物而被给予的治疗剂包括不局限于：抗-感染药剂，例如抗生素以及抗病毒药剂；化疗药剂（即抗癌药剂）；抗排斥药剂；镇痛剂以及镇痛剂组合；抗炎药剂；激素，例如类固醇；生长因子（骨形态发生蛋白（即BMP′s 1-7）、骨形态发生样蛋白（即GFD-5、GFD-7和GFD-8）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（即FGF1-9）、血小板衍生生长因子（PDGF）、胰岛素样生长因子（IGF-I和IGF-II）、转化生长因子（即TGF-βI-III）、血管内皮生长因子（VEGF））；以及其他天然衍生的或遗传改造的蛋白质、多糖、糖蛋白、或脂蛋白。这些生长因子描述于维姬·罗森（Vicki Rosen）和斯科特·蒂斯（R.Scott Thies）的《骨形成和修复的细胞和分子基础》（The Cellularand Molecular Basis of Bone Formation and Repair）（由R.G.Landes公司出版）中，由此通过引用结合在此。
包含重组蜘蛛丝/蚕纤维的生物活性材料可以通过将一种或多种治疗剂与用来制得该材料的纤维混合来进行配制。可替代地，可以将治疗剂（优选与药学上可接受的载体一起）涂覆在纤维上。可以使用任何不溶解纤维的药用载体。治疗剂可以作为液体、磨碎的固体、或任何其他适当的物理形式存在。
治疗剂的量将取决于正采用的具体药物以及正治疗的医学病症。典型地，药物的量表示按重量计为该材料的约0.001%至约70%，更典型地约0.001%至约50%，最典型地约0.001%至约20%。在与体液或组织接触时，例如，药物将被释放。
可以将用重组的蜘蛛丝/蚕纤维制得的组织工程支架在制作之后进行进一步修饰。例如，可以用生物活性物质来涂覆支架，这些生物活性物质发挥对于所希望细胞群体而言的受体或化学吸引子（chemoattractor）功能。可以通过吸附或化学键合来涂覆该包衣。
适用于与本发明一起使用的添加剂包括生物学或药学上的活性化合物。生物活性化合物的实例包括细胞附着介质（例如已知影响细胞附着的、包含“RGD”整合素结合序列的变体的肽）、生物活性配体、以及增强或排斥具体种类的细胞或组织向内生长的物质。此类物质包括例如，骨诱导物质，例如骨形态发生蛋白（BMP）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子（IGF-I和II）、TGF-、YIGSR肽、葡糖氨基葡聚糖（GAG）、透明质酸（HA）、整合素、选择素以及钙粘素。
支架被定型为用于组织工程以及组织引导再生应用（包括重建手术）的物品。支架的结构允许大量的细胞的向内生长，消除细胞的预播种（preseeding）的需要。支架还可以被模制为形成外部支架，该外部支架用于细胞体外培养的支持物，用于外部支撑器官的创造。
支架发挥模仿身体的细胞外基质（ECM）的功能。支架充当用于体外培养期间分离的细胞以及后续植入的物理支持物以及粘附基底两者。移植的细胞群体生长并且细胞正常地发挥功能时，它们开始分泌它们自己的ECM支持物。
在像软骨和骨的结构组织的重建中，组织形状是整合的以发挥功能，需要将支架模制成变化的厚度和形状的物品。在三维结构中所希望的任何裂缝、孔或精制结构可以通过用剪刀、解剖刀、激光束或任何其他切割仪器去除基底部分来创造。支架应用包括组织（例如神经的、肌骨的、软骨的、腱的(tendenous)、肝脏的、胰脏的、眼睛的、外皮的(integumenary)、动静脉的、泌尿的或任何其他形成固体或中空器官的组织）的再生。
支架还可以用于移植作为用于解离的细胞（例如，软骨细胞或肝细胞）的基底，从而创造一种三维组织或器官。可以将任何类型的细胞添加至支架用于培养和可能的移植，这些细胞包括从供体、从已建立的细胞系亦或甚至在基因工程之前或之后所获得的肌肉和骨骼系统的细胞（例如软骨细胞、成纤维细胞、肌肉细胞以及骨细胞）、实质细胞（例如肝细胞、胰脏细胞（包括胰岛细胞）、肠源性细胞、以及其他细胞（例如神经细胞、骨髓细胞、皮肤细胞、多能细胞以及干细胞））、以及它们的组合。还可以使用组织片，能以相同的结构提供多个不同的细胞类型。
将细胞从适合的供体或有待植入这些细胞的患者获得，使用标准技术将其进行解离并且接种在支架上和内。体外培养可任选地可以在植入之前进行。可替代地，将支架植入，允许其血管化，然后将细胞注入支架中。用于体外培养细胞的方法和试剂以及组织支架的植入对于本领域普通技术人员来说是已知的。
可以使用常规的灭菌方法（例如基于辐射的灭菌（即γ-射线）、基于化学品的灭菌（环氧乙烷）或其他适当的程序）来对本发明的重组蜘蛛丝/蚕纤维进行灭菌。优选灭菌方法将是用环氧乙烷、在52°C-55°C之间的温度持续8小时或更短的时间。在灭菌之后，可以将生物材料封装在适当的灭菌抗湿的包装内用于装运以及医院和其他保健设施中的用途。
本发明(the resent invention)的嵌合丝纤维还可以用于不同形式的运动型和保护型外套的制造中，例如，在运动服和防弹背心的制造/制作中。在此披露的嵌合蜘蛛丝纤维还可以用于汽车工业中，例如改进的气袋制作中。采用披露的嵌合丝纤维的气袋在汽车碰撞中提供更大的冲击能量，非常像蜘蛛网吸收落入网的捕食的飞虫的能量。
定义
如在此使用的，生物相容意为丝纤维或从其制备的材料是无毒的、非诱变的、并且引出最小到中等程度的炎性反应。用于在本发明中使用的优选的生物相容聚合物可以包括例如，聚氧化乙烯（PEO）、聚乙二醇（PEG）、胶原、纤连蛋白、角蛋白、聚天冬氨酸、聚赖氨酸、藻酸盐、壳聚糖、几丁质、透明质酸、果胶、聚己酸内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚羟基脂肪酸酯、葡聚糖、以及聚酐。依据本发明，可以将两种或更多种生物相容聚合物添加至水性溶液中。
如在此使用的，柔性和/或弹性基序和/或结构域序列被定义为基因或蛋白质片段的可鉴别的基因序列，该基因序列编码与对材料的弹性和/或柔性特征的赋予相关联的蜘蛛丝（例如丝纤维）。作为举例，柔性和/或弹性基序和/或结构域是GPGGA。
如在此使用的，强度基序被定义为基因或蛋白质片段的经鉴别的基因序列，该基因序列编码与对材料的强度特征的赋予（例如增加和/或增强丝纤维的拉伸强度）相关联的蜘蛛丝。作为举例，这些蜘蛛强度基序的一些是：GGPSGPGS(A)8（此时A是多聚丙氨酸序列）。
通过以下旨在示例本发明的实例，本发明将进一步被特征化。
实例1-材料和方法
提供本实例以描述在转基因蚕的创造中采用的材料和方法/技术、在采用的基因构建体的创造中所采用的大体程序、连同在转基因蜘蛛丝纤维的拉伸强度的评估中使用的参考表。
1.使用的基因序列使用的基因序列提供于在此所提供的图13-16中。这些变体也被认为是本发明的部分，这是因为考虑到可以采用这些序列的具有保守性置换的较短和/或较长形式，例如，伴随基本上相同的嵌合蜘蛛丝蛋白质特性。
2.嵌合蜘蛛丝蛋白质以及用这些嵌合丝蛋白质获得的纤维将被评估拉伸强度。表1提供了针对嵌合蜘蛛丝纤维将被评估的大体参考。发现本发明的嵌合蜘蛛丝纤维拥有与天然蜘蛛丝的那些类似的张力以及其他机械强度特征。
表1：蜘蛛丝的力学特性的比较a
a数据来自（高斯兰（Gosline）等人1984）。
实例2-个别的经转化的蚕丝的拉伸强度特性分析：
通过使用蜘蛛丝特异性抗体对来自转基因蚕茧的蚕丝腺蛋白质成分和丝纤维两者进行的蛋白质印迹，针对蜘蛛丝嵌合蛋白质的存在将这些转基因蚕丝进行分析。在两种情况中，转基因蚕被核实为生产嵌合蛋白质，并且微分萃取研究显示这些蛋白质是它们的茧的转基因丝纤维的整合组分。并且，通过使用荧光解剖显微镜对丝腺或丝纤维的直接检验，在丝腺以及纤维两者中每一个嵌合绿色荧光蛋白融合体的表达是明显的。在大多数情况中，荧光蛋白在纤维中的量是足够高的，以致于通过使茧着绿色而在正常照明下被可视化。
表2显示从个别的转基因蚕生产的转基因丝的分析。这些分析明确显示与来自未转化的蚕的丝纤维相比，用蜘蛛-4或蜘蛛-6构建体转化的转基因系生产具有改进强度的嵌合蜘蛛丝/蚕纤维。显然，在相同情况中，这些纤维强度是天然丝的两倍。蚕/蜘蛛丝嵌合纤维的强度上的两倍改进接近于这样一种改进，该改进被认为是将蚕丝制得如蜘蛛丝一样强和有柔性必需的。因此，这些结果证明蚕可以通过使用piggyBac载体（对蜘蛛丝的特异性强度和/或柔性结构域进行编码）以构建家蚕/蜘蛛丝嵌合蛋白质而在遗传上被改造为生产可以有利地与天然蜘蛛丝相竞争的嵌合蜘蛛丝/蚕纤维。
表2：与未转化的pnd-w1和商业蚕品系相比的转基因蚕纤维的拉伸强度分析
实例3-用于在转基因蚕中表达嵌合蜘蛛丝/蚕蛋白质的蚕嵌合基因表达盒
以及piggyBac载体
提供本实例以证实本发明在提供多种多样的蚕嵌合蜘蛛丝基因表达盒中的效用和范围。本实例还证实piggyBac载体的完备，这些载体被显示为成功地转化蚕、并且导致在制造中商业上有用的嵌合蜘蛛丝蛋白质的成功生产，其中这些嵌合蜘蛛丝蛋白质适用于商业上有用长度的纤维的生产。
表达盒
以下显示的基础表达盒的若干变体被构建。这些构建体反映了被设计为表达丝心蛋白重链（fhc）-蜘蛛丝嵌合体的构建体的装配，在该嵌合体中合成的蜘蛛丝蛋白质序列侧翼带有家蚕fhc蛋白质的N-和C-末端片段。在此方面，显示在图5中的家蚕丝丝心蛋白重链基础表达盒的若干变体被构建。该设计涉及被设计为表达丝心蛋白重链（fhc）-蜘蛛丝嵌合体的构建体的装配，在该嵌合体中合成的蜘蛛丝蛋白质序列侧翼带有家蚕fhc蛋白质的N-和C-末端片段。在每个表达盒中的功能相关的基因元件从左到右，包括：来自家蚕fhc基因的主启动子，上游增强子元件（UEE），基础启动子、以及N-末端结构域（NTD）；随后为定位在框架内的不同的合成蜘蛛丝蛋白质序列（参见下文），该框架具有位于NTD上游的翻译起始位点；随后为C-末端结构域（CTD），该C-末端结构域包括翻译终止位点以及RNA多聚腺苷酸化位点。
存在图5中所画出的表达盒的八种不同的形式，这些形式对四种不同的合成蜘蛛丝/蚕蛋白质（带有或不带有插入到NTD与蜘蛛丝序列之间的框架中的EGFP）进行编码。这些序列已经被特指为“蜘蛛2”、“蜘蛛4”、“蜘蛛6”、以及“蜘蛛8”，并且它们如下被定义为：
a)蜘蛛2：7,104bp，由(A4S8)24组成。A1指示推定的鞭状丝弹性基序（GPGGA）的4个拷贝；因此A4指示该相同序列的16个拷贝。S8指示推定的牵丝强度基序[GGPSGPGS(A)8]，也被描述为“接头-多聚丙氨酸”序列。GFP（绿色荧光蛋白）融合蛋白的近似大小是161.9+50.4=212.3Kd。
b)蜘蛛4：7,386bp，由(A4S8)42组成。A2指示推定的鞭状丝弹性基序（GPGGA）的8个拷贝。S8指示如上的推定的牵丝强度基序[GGPSGPGS(A)8]。GFP融合蛋白的近似大小是169.4+50.4=219.8Kd。
c)蜘蛛6：2,462bp，由(A4S8)14组成。如上，A2指示弹性基序（GPGGA）的8个拷贝，并且S8指示强度基序[GGPSGPGS(A)8]。GFP融合蛋白的近似大小是56.4+50.4=106.8Kd。
d)蜘蛛84,924bp，由(A4S8)28组成。如上，A2指示弹性基序（GPGGA）的8个拷贝，并且S8指示强度基序[GGPSGPGS(A)8]。GFP融合蛋白的近似大小是112.8+50.4=163.2Kd。
NTD外显子I和II的大小（1625+15161）；eGFP（27135）；CTD（6470）=50,391Kd。
实例4-将表达盒亚克隆进piggyBac中
八种不同形式的在图5中所画出（并且在实例3中所描述）的表达盒中的每一个是使用AscI和FseI从母质粒切下，并且被亚克隆进pBAC[3xP3-DSRedaf]的相应位点。在图6中显示了该piggyBac载体的图谱。
将具有或不具有EGFP的所有的如上所述的piggyBac载体通过PCR来测试单独的组分，并且展示所期望大小的产物。
将对融合到EGFP上的蜘蛛丝蛋白质进行编码的每一个piggyBac载体通过测定它们诱导EGFP在家蚕丝腺中表达的能力来进行功能评估。简单地，将丝腺从蚕移除，并且使用粒子枪，用涂覆有piggyBac DNA（或对照）的钨粒来轰击腺体。然后将被轰击的组织在培养盘中的格拉斯氏（Grace’s）培养基中进行培养，并且在两天和三天后使用在同事实验室可获得的、配备用于EGFP荧光的解剖显微镜来检验表达EGFP的丝腺。显示每个载体诱导EGFP荧光。
使用对蜘蛛4和6进行编码的带有或不带有EGFP插入的四个piggyBac载体的组来生产转基因蚕。
实例5-转基因蚕的分离
通常，蚕转化涉及通过显微注射蚕卵而将对piggyBac转座酶进行编码的piggyBac载体与辅助质粒的混合物引入前胚盘胚胎中。在产卵后，胚盘形成在长达4h中不发生。因此，胚胎的收集和注入可以在室温下经历相对长的时期进行。显微注射的技术障碍是突破卵绒毛膜的需要，该卵绒毛膜造成一个坚硬的屏障。田村（Tamura）和同事通过用尖锐的钨针刺破绒毛膜、并且然后精确地将一个玻璃毛细管注射针引入所生成的洞中，从而使得用于蚕的显微注射技术变得完美。现在这是一个相对常规的程序，通过以下方法来完成：使用经校准的eppendorf机器针操纵器以刺破绒毛膜，移除钨针，插入玻璃毛细管，并且注入DNA溶液。然后将卵使用一小滴Krazy胶来重密封，并且维持在28°C和70%湿度的标准培养条件下，直至幼虫孵出。然后将存活的注入的昆虫进行配对以产生F1代胚胎，用于基于DS-红眼标记的表达而对推定的转化体的后续鉴别。然后将通过这种方法鉴别的推定的雄性和雌性转化体进行配对，从而生产纯合子系（homozygous lineage）用于更详细的基因分析。
确切地，用于当前项目的蚕转化涉及将piggyBac载体与辅助质粒DNA的混合物注入清晰表皮（clear cuticle）蚕突变体家蚕pnd-w1的蚕卵中。该突变的蚕描述于田村（Tamura）等人2000中，该参考文献确切地通过引用结合在此。该突变体具有黑化作用缺陷，该缺陷使得使用荧光基因的筛选更加容易。一旦为红眼，则鉴别出推定的F1转化体，建立纯合子系，并且使用丝腺蛋白质以及收获的茧丝的蛋白质印迹法来确认真正的转化体。
实例6-通过转基因蚕生产的嵌合蜘蛛丝/蚕的分析
通过使用蜘蛛丝特异性抗体对来自转基因蚕茧的蚕丝腺蛋白质成分和丝纤维两者进行的蛋白质印迹，针对蜘蛛丝嵌合蛋白质的存在将这些转基因蚕丝进行分析。在两种情况中，转基因蚕被核实为生产嵌合蛋白质，并且微分萃取实验显示这些蛋白质是它们的茧的转基因丝纤维的整合组分。
并且，通过使用荧光解剖显微镜对丝腺或丝纤维的直接检验，在丝腺以及纤维两者中每一个嵌合绿色荧光蛋白融合体的表达是明显的。（图7）。在大多数情况中，荧光蛋白在纤维中的量是足够高的，以致于通过使茧着绿色而在正常照明下被可视化。
实例7-piggyBac载体设计
piggyBac是用于此项目的选择的载体，因为它能用于高效地转化蚕4,11,43。在此项目中使用的特定的piggyBac载体被设计为携带具有一些关键特征的基因。如在图17中突出显示的，这些包括家蚕丝心蛋白重链（fhc）启动子以及fhc增强子，该启动子可将异种蜘蛛丝蛋白质的表达靶向至后部丝腺91,92，该增强子可提高表达水平并且协助将异种丝蛋白质装配进纤维中93。piggyBac载体还对具有弹性(GPGGA)8和强度（接头-丙氨酸8）基序两者的A2S814—相对大的合成蜘蛛丝蛋白质进行编码（图17A）。合成的蜘蛛丝蛋白质序列是嵌入在对家蚕fhc蛋白质的N-和C-末端结构域进行编码的序列内（图17B-17C）。先前已经使用此嵌合的蚕/蜘蛛丝设计来指导将异种蛋白合并入家蚕丝腺中的初生内源丝纤维中，并且生产复合的丝纤维91,92。
在本研究中构建的piggyBac载体的其中之一仅对嵌合的蚕/蜘蛛丝蛋白质进行编码（图17B），而其他对具有N-末端增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标签的相同蛋白质进行编码（图17C）。后者构建体协助由转化的子代生产的丝纤维的分析，并且还被用于预备性的离体丝腺轰击试验从而检验在丝腺中嵌合蜘蛛丝蛋白质表达，如在此所述的。
方法：
将一些基因片段通过用分离自家蚕品系P50/Daizo丝腺的基因组DNA以及基因特异性引物的聚合酶链式反应（PCR）来进行分离，这些基因片段显示于图17中。这些片段包括fhc主启动子和上游增强子（MP-UEE）、具有不同5’-和3’-侧翼限制酶切位点的两种形式的fhc基础启动子（BP）和N-末端结构域（NTD；外显子1/内含子1/外显子2）、fhcC-末端结构域（CTD；3’编码序列以及poly A信号）、以及EGFP。在每种情况中，将扩增产物进行凝胶纯化，并且将期望大小的DNA片段切下并且移除。随后，将fhc MP-UEE、fhc CTD、以及EGFP克隆进pSLfa1180fa（pSL）（Y.Miao（苗））中，将两种不同的NTD片段克隆进pCR4-TOPO（Invitrogen公司，卡尔斯巴德（Carlsbad），加利福尼亚州（CA））中，并且将包含正确扩增产物的大肠杆菌转化体通过限制酶切图谱进行鉴别并且通过测序进行核实。
然后如下的使用这些片段来装配在本研究中使用的piggyBac载体。将合成的A2S814蜘蛛丝序列用BamHI和BspEI而从pBluescript SKII+质粒前体（F.Teulé和R.V.Lewis（路易斯））切下，进行凝胶纯化，进行回收，并且将其亚克隆进以上所述的pSL中间质粒中的CTD上游的相应位点中。此步骤产生特指为pSL-蜘蛛6-CTD的质粒。然后将NotI/BamHI片段从如上所述的pCR4-TOPO-NTD中间质粒的一个中切下，进行凝胶纯化，进行回收，并且将其亚克隆进pSL蜘蛛6-CTD中的蜘蛛6-CTD序列上游的相应位点中，从而生产pSL-NTD-蜘蛛6-CTD。平行地，将NotI/XbaI片段从如上所述的另一个pCR4-TOPO-NTD中间质粒中切下，进行凝胶纯化，进行回收，并且将其亚克隆进以上所述的pSL-EGFP中间质粒中的EGFP扩增引物上游的相应位点中。这生产出包含NTD-EGFP片段的质粒，该片段是用NotI和BamHI切下并且被亚克隆进pSL-蜘蛛6-CTD中的蜘蛛6-CTD序列上游的相应位点中。然后将MP-UEE片段用SfiI和NotI从以上所述的pSL中间质粒切下，进行凝胶纯化，进行回收，并且将其亚克隆进以上所述的两个不同中间pSL质粒中的NTD-蜘蛛6-CTD和NTD-EGFP-蜘蛛6-CTD序列上游的相应位点中。最后，将完全装配的MP-UEE-NTD-A2S814-CTD或MP-UEE-NTD-EGFP-A2S814-CTD盒用AscI和FseI从对应的最终pSL质粒切下，并且将其亚克隆进pBAC[3XP3-DsRedaf]98的相应位点。这个最终的亚克隆步骤产生了两种单独的piggyBac载体，这两种载体特指蜘蛛6和蜘蛛6-EGFP以指代EGFP标记的不存在或存在。将这些载体用于离体丝腺轰击试验以及蚕转基因，如下所述。
结果：
离体试验结果显示对GFP-标签嵌合蚕/蜘蛛丝蛋白质进行编码的piggyBac载体在后部丝腺区诱导绿色荧光。用GFP-特异性抗体的免疫印迹测定进一步证实被轰击的丝腺包含具有大约116kDa的表观分子量（Mr）的免疫反应性蛋白质。只是稍微大于所期望的（106kDa），这些结果确认该piggyBac载体的基础设计，并且提示使用这些构建体的转基因蚕的分离。
实例8-转基因蚕分离
将每个piggyBac载体与对piggyBac转座酶进行编码的质粒混合在一起，并且独立地将混合物显微注射进分离自家蚕pnd-w1的卵中43。使用该蚕品系，是因为它具有导致清晰外皮表型的黑化作用缺陷，这有助于在转化体中的EGFP-标签的嵌合蚕-蜘蛛丝蛋白质的检测。，将推定的F1转化体最初通过红眼表型来鉴别，该红眼表型源自在包含在每个piggyBac载体中的神经特异性3XP3启动子27（图17D）的控制下DS-红色（DS-Red）的表达。使用这些动物来建立一些纯合转基因蚕系，如在方法中所描述的，这些蚕系特指蜘蛛6和蜘蛛6-GFP，蜘蛛6和蜘蛛6-GFP指代出它们的转化所使用的piggyBac载体。
方法：
离体丝腺轰击试验
将进入五龄的第三天的活的家蚕品系pnd-w1蚕通过浸入70%乙醇中持续几秒进行灭菌，并且将其放置在0.7%w/v NaCl(NaCI)中。然后将整个丝腺从每个动物无菌地解剖并且转移至包含格拉斯氏（Grace’s）培养基（补充有抗生素）的培养皿，在DNA轰击过程之前将它们保持在那里。平行地，将钨微粒（1.7μm M-25微载体；Bio-Rad实验室，Hercules，CA）使用用于轰击的DNA进行涂覆，如下。根据制造商的说明书将微粒进行预处理，并且将其以3mg/50μl等分部分保持在-20°C、50%甘油中。就在每个轰击实验之前，根据制造商的说明书，在5μl的最大体积中，将3mg微粒等分部分用5μg的相关piggyBac DNA进行涂覆。将一些微粒等分部分用蒸馏水进行涂覆，用于作为DNA-阴性对照。每个轰击实验包括六个重复，并且每个单独的轰击包括一对完整的丝腺。为了轰击，将这些腺体从在格拉斯氏培养基中的保持状态转移至包含1%w/v灭菌琼脂的90mm培养皿上，并且将培养皿放置在Bio-Rad Biolistic
PDS-1000/He颗粒递送系统室中。将该室抽空至以Hg计的20-22，并且使用1,100psi的氦压力、在从颗粒源到靶组织的6cm的距离处，将丝腺用预涂覆的钨微粒进行轰击，如前所述26。在轰击后，将丝腺放置在包含格拉斯氏培养基（补充有2X抗生素）的新鲜培养平板中，并且在28°C进行孵育。在轰击后48和72小时，在蜘蛛6-GFP piggyBac载体中的EGFP的瞬时表达是通过荧光显微镜来评估。用奥林巴斯FSX100显微镜在4.2X放大倍数、1/120秒的相位、以及1/110秒的绿色荧光下获得图像（抓拍）。此外，EGFP标签的以及无标签的嵌合蚕/蜘蛛丝蛋白质的瞬时表达是通过将经轰击的丝腺提取物用EGFP-或蜘蛛丝特异性抗血清进行免疫印迹来进行评估，如下所述。
蚕转化
在由pnd-w1蛾产卵1小时后将卵收集，并且将其安排在显微镜载玻片上。将载体和辅助质粒以各自0.2μg/ul的终浓度重悬浮在注射缓冲液（0.1mM磷酸钠，5mM KCl，pH6.8）中，并且使用由世界精密仪器（WorldPrecision Instruments）PV820压力调节器（美国）、骏河精机（Suruga Seiki）M331微操纵器（日本）、以及Narishige HD-21双移液管架（double pipetteholder）（日本）组成的注射系统将1-5nl注入每个前胚盘蚕胚胎中。将刺破的卵用帮手超级粘合胶（Helping Hand Super Glue gel）（The FaucetQueens公司，美国）进行密封，并且然后将其放置在用于胚胎发育的25°C和70%湿度的生长室中。在孵出后，将幼虫在人工饲料（Nihon Nosan公司，日本）上进行培养，并且通过在相同系内的同科进行配对来获得后代。使用具有550和700nm之间滤光器的奥林巴斯SXZ12显微镜（东京，日本），将转基因后代暂时通过Ds红色（DsRed）荧光眼睛标记的存在来进行鉴别。
结果：
即使在没有特异性EGFP激发的情况下通过在白光下的目测，也在由蜘蛛6-GFP转化体生产的茧中观察到了EGFP表达（图18A）。当来自这些动物的丝腺（图18B-18C）以及茧（图18D）在荧光显微镜下被检查到时，还观察到了强的EGFP表达。茧表现为：包括带有整合的EGFP信号的至少一些丝纤维。EGFP-标签的嵌合蚕/蜘蛛丝蛋白质在蜘蛛6-GFP丝腺和茧中的表达是通过将丝腺和茧提取物用EGFP-和蜘蛛丝蛋白质特异性抗血清进行免疫印迹来进行确认（图19）。对于蜘蛛6丝腺和茧提取物的相似的结果是通过用蜘蛛丝蛋白质特异性抗血清进行免疫印迹来获得（图19）。这些结果指示我们已经成功地将对EGFP-标签的或无标签形式的嵌合蚕/蜘蛛丝蛋白质进行编码的转基因蚕分离，并且这些蛋白质与由那些转基因动物生产的丝纤维相关联。
实例9-复合丝纤维的分析
使用循序蛋白质提取方法以分析由转基因蚕生产的嵌合蚕/蜘蛛丝蛋白质与复合丝纤维的关联。在去除宽松关联的丝胶蛋白层后，使脱胶的丝纤维经受一系列日益严格的提取，如在方法中所述。
方法：
蚕茧蛋白质的循序提取
将由亲本的和转基因的蚕生产的茧收获，并且将丝胶蛋白层通过在85°C在0.05%（w/v）Na2CO3中轻轻地搅拌茧持续15分钟来去除，其中材料:溶剂比率为1:50（w/v）40。将脱胶的丝从温浴移除，并且用热（50°C-60°C）水洗涤两次，伴随小心的搅拌以及相同的材料:溶剂比率。然后将脱胶的丝纤维冻干，并且称重，从而估计丝胶蛋白层去除的效率。将脱胶的纤维用于循序蛋白质提取方案，伴随在混合轮上的旋转以确保恒定的搅拌，如下。将三十mg的脱胶的丝纤维用1ml的磷酸盐缓冲盐水（PBS；137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2PO4，1.8mM KH2PO4）在4°C处理16小时。将材料通过离心而分离为不可溶的和可溶的部分，将上清液去除并且保持在-20°C作为PBS可溶的部分，并且将沉淀经受下个提取。将该沉淀重悬浮在1ml的2%(w/v)SDS中，并且在室温下进行孵育持续16小时。再次，将材料通过离心而分离为不可溶的和可溶的部分，将上清液去除并且保持在-20°C作为SDS-可溶的部分，并且将沉淀经受下个提取。将该沉淀重悬浮在1ml的包含2%（v/v）β-巯基乙醇的9MLiSCN中，并且在室温下进行孵育持续16-48小时。在离心后，将上清液保持在-20°C作为9M LiSCN/BME-可溶的部分。将在此步骤中获得的最终沉淀重悬浮在1ml的包含5%（v/v）BME的16M LiSCN中，并且在室温下进行孵育持续大约一小时。这导致完全的溶解并且生产出最终提取物，将该最终提取物在-20°C保持作为16M LiSCN/BME-可溶的部分直至进行免疫印迹测定。
丝蛋白质的分析
将来自离体轰击试验以及还来自未处理的亲本及转基因蚕的丝腺在冰上在包含1%（w/v）SDS和5M尿素的磷酸钠缓冲液（30mM Na2PO4，pH 7.4）中进行匀浆化，然后在4°C在微量离心机的13,500rpm下澄清5分钟。将上清液收获作为丝腺提取物，并且这些提取物连同以上所述的相继的茧提取物用10mM Tris-HCl/2% SDS/5% BME缓冲液稀释4X，并且将包含大约90μg的总蛋白的样品与SDS-PAGE上样缓冲液以1:1进行混合，在95°C煮沸5分钟，并且装载到4%-20%梯度凝胶上（皮尔斯蛋白质产品（Pierce Protein Products）；罗克福德，伊利诺伊州）。在分离后，根据制造商的说明书，使用Bio-Rad转移池（transfer cell）将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜（ImmobilonTM；密理博公司（Millipore），比尔里卡，马萨诸塞州）上。使用针对棒络新妇蛛鞭状丝样A2肽而生产的蜘蛛丝蛋白质特异性多克隆兔抗血清（GenScript公司，皮斯卡塔韦，新泽西州）或商业EGFP特异性小鼠单克隆抗体（Living ColorsGFP，ClontechLaboratories公司，山景城，加利福尼亚州）作为初级抗体进行免疫检测。二级抗体分别是山羊抗兔IgG-HRP（Promega公司，麦迪逊，威斯康星州）或山羊抗小鼠IgG H+L HRP结合物（EMD Chemicals公司，吉布斯敦，新泽西州）。所有的抗体是以1:10,000稀释在标准封闭缓冲液（1xPBST/0.05%脱脂奶粉）中来使用，并且抗体-抗原反应是使用商业试剂盒（ECLTM蛋白质印迹检测试剂；GE保健公司）通过化学发光法来可视化。
结果：
在此程序的每个步骤后，将可溶的和不可溶的部分通过离心进行分离，将可溶的部分保持用于免疫印迹，并且将不可溶的部分用于下个提取中。最终的提取溶剂完全溶解剩余的丝纤维。免疫印迹对照核实了蜘蛛丝蛋白质-特异性抗血清没有鉴别pnd-w1丝纤维中的任何蛋白质（图19B，泳道3-6），但是鉴别出在大肠杆菌中生产的嵌合蚕/A2S814蜘蛛丝蛋白质（图19B，泳道2）。使用盐水（图19B，泳道8和13）、SDS（图19B，泳道9和14）、以及8M LiSCN/2% β-巯基乙醇（图19B，泳道10和15）进行的来自转基因动物的脱胶茧的循序提取均未释放任何可检测的免疫反应性蛋白质。然而，用16M LiSCN/5% β-巯基乙醇对残余丝纤维的后续提取释放出来自残余蜘蛛6的、具有大约106kDa的Mr的免疫反应性蛋白质（图19，泳道11）以及两种来自残余蜘蛛-6-GFP纤维的、具有大约130kDa和大约110kDa的Mr的免疫反应性蛋白质（图19，泳道16)。所有这些蛋白质大于所期望的（对于蜘蛛6和蜘蛛6-GFP分别为78kDa和106kDa）。对于这些区别的可能解释包括转录/翻译‘打滑’（‘stuttering’），该转录/翻译‘打滑’是由于蜘蛛丝序列高度重复性质、在SDS-PAGE上的蛋白质产物的不规则迁移、和/或嵌合蚕/蜘蛛丝蛋白质的翻译后修饰。在大肠杆菌中生产的嵌合蚕/A2S814蜘蛛丝蛋白质（是用于免疫印迹的阳性对照）也具有与所期望的（60kDa）相比较大的Mr（大约75kDa）。来自两种转基因蚕系的脱胶茧的、16M LiSCN/5% β-巯基乙醇提取物还包括具有从大约40kDa至大约75kDa的Mr的免疫反应性拖影（smear），可能反映嵌合蚕/蜘蛛丝蛋白质的降解和/或过早的翻译终止。不考虑转基因产物的大小或它们出现的原因，这些循序提取结果清晰地证实转基因蚕提供了如在此描述的、表达的嵌合蚕/蜘蛛丝蛋白质，这些蛋白质极其稳定地被合并入复合丝纤维中。
实例10-复合丝纤维的力学特性
经脱胶的天然丝纤维以及由转基因蚕生产的复合丝纤维的复合丝纤维的力学特性在此被描述。
复合丝纤维被制备用于测试的方法以及以及测试如何进行呈现于下文方法中。
方法：
用于力学测试的脱胶蚕丝纤维具有19mm的初始长度（L0）。单个纤维测试是使用安装有标准50N池和定做的10g装载池（TransducerTechniques公司，蒂梅丘拉，加利福尼亚州）的MTS Synergie 100系统（MTSSystems公司，伊登普雷里，明尼苏达州），在周围条件（20℃-22℃以及19%-22%湿度）下进行。在允许用于应力和应变值计算的5mm/min的应变率以及250MHz的频率下，将来自两个装载池的力学数据（装载以及伸长）用TestWorks
4.05软件（MTS Systems公司，伊登普雷里，明尼苏达州）来记录。使用MATLAB（7.1版本）来绘制来自为每个纤维收集的数据组的应力/应变曲线，从而确定韧性（或断裂能量）、杨氏模量（初始刚度）、最大应力、以及最大延伸（=最大值%应变）。
结果：
结果证实与来自pnd-w1蚕的天然纤维相比，包含EGFP-标签亦或无标签的嵌合蚕/蜘蛛丝蛋白质的脱胶复合纤维具有显著大的可延展性以及稍微改进的强度和刚度（表3和图20）。表3：将由亲本和转基因蚕生产的12-15个丝纤维的力学特性在温度、湿度、以及测试速度精确匹配的条件下进行测量，并且平均值和标准偏差呈现于表中。将在完全相同的条件下平行确定的蜘蛛（棒络新妇蛛）牵丝纤维的平均力学特性包括在内用于比较。
表3：经脱胶的天然的和复合的丝纤维的力学特性
测量由亲本和转基因蚕生产的12-15个丝纤维的力学特性，并且平均值和标准偏差呈现于表中。将在相同的条件下确定的蜘蛛（棒络新妇蛛）牵丝纤维的最佳力学特性包括在内用于比较。
因此，这些复合纤维比天然蚕丝纤维更坚韧。由转基因动物生产的复合纤维的力学特性与由亲本品系生产的天然纤维的那些相比是更加可变的。此外，由两种不同的蜘蛛6-GFP系生产的复合纤维具有相似的可延展性，但是不同的拉伸强度。在单独的转基因系内复合丝纤维的力学特性中观察到的变化以及系与系间的变化可以反映复合纤维中的非均匀性，该非均匀性可能是由于嵌合蚕/蜘蛛丝蛋白质比率和/或这些蛋白质沿着纤维的位置的差异。可以参考图18D中的复合纤维中的非均匀性的证据。图20中显示了对于来自转基因蚕的复合纤维、来自亲本蚕的天然纤维、以及代表性的蜘蛛牵丝纤维观察到的最佳力学性能的比较。这些结果显示：与来自pnd-w1蚕的天然纤维相比，所有的复合纤维更坚韧。并且，与在相同条件下测试的天然蜘蛛牵丝纤维相比，来自转基因蜘蛛6-GFP系4蚕的复合纤维甚至更坚韧。这些结果证实：通过使用转基因蚕平台，嵌合蚕/蜘蛛丝蛋白质的合并可以显著改进所生产的复合丝纤维的力学特性。
将对于天然蚕（pnd-w1）和蜘蛛（棒络新妇蛛牵丝）纤维所测量的最佳力学性能，与使用由转基因蚕生产的复合丝纤维获得的那些进行比较。将所有的纤维在相同的条件下进行测试。最坚韧的值是：蚕pnd-w1（蓝线，43.9MJ/m3）；蜘蛛6系7（橘色线，86.3MJ/m3）；蜘蛛6-GFP系1（暗绿色线，98.2MJ/m3），蜘蛛6-GFP系4（浅绿色线，167.2MJ/m3）；以及棒络新妇蛛牵丝（红线，138.7MJ/m3）。（见表3）。
实例11-包含稳定合并的嵌合蚕/蜘蛛丝蛋白质的复合纤维
蜘蛛丝具有作为用于许多不同应用的生物材料的巨大应用。先前，蜘蛛养殖的严重障碍削弱了例如天然制造的努力。发展用于丝纤维生产的有效生物技术方法的需要存在于本披露提供的平台中。尽管其他的平台已经被披露用于重组蜘蛛丝蛋白质的生产中，但高效地将这些蛋白质加工成有用的纤维已经变得困难。制造纤维（不仅是蛋白质）的要求将蚕定位为用于这种具体生物技术应用的有资格的平台。
工程化为生产蜘蛛丝蛋白质的转基因蚕是使用piggyBac载体进行分离的，该载体是在家蚕丝胶蛋白（Ser1）启动子的转录控制下、对天然棒络新妇蛛的大壶状腺蜘蛛丝蛋白-1丝蛋白质进行编码。蜘蛛丝蛋白序列被融合到对C-末端fhc肽进行编码的下游序列。使用piggyBac构建体分离的转基因蚕生产包含嵌合蚕/蜘蛛丝蛋白质的茧，但是此蛋白质仅发现于宽松关联的丝胶蛋白层中。相比之下，由本披露的转基因蚕生产的嵌合的蚕/蜘蛛丝蛋白质是复合纤维的整合组分。除其他事项之外，由其他人设计的嵌合蚕/蜘蛛丝蛋白质的相对宽松的关联可能反映N-末端蚕fhc结构域的不存在。可替代地，除其他事项之外，在piggyBac载体中Ser1启动子的使用可以与适当的纤维装配不一致，这是因为此启动子在中间丝腺中具有转录活性，而分别控制fhc、丝心蛋白轻链、以及昆虫储存蛋白质（hexamerin）的表达的fhc、flc、以及fhx启动子则是在后部丝腺中有活性。蚕丝蛋白质到纤维的装配部分地受到丝基因表达的紧密的空间和时序调节的控制。因此，本披露的载体被用fhc启动子工程化为驱动在与天然丝蛋白质相同的空间中和相同的时间处嵌合蚕/蜘蛛丝蛋白质的累积，以便协助嵌合蛋白质稳定地整合为新装配的复合丝纤维。其他人已经描述了来自由一些转基因蚕生产的茧的纤维的弹性和拉伸强度中的较小增加。然而，在力学测试之前丝胶蛋白层未被去除，并且这个脱胶步骤在用于商业丝纤维生产的茧的加工中是必不可少的。因此，如果茧已经按常规的方式被加工，重组的蜘蛛丝/蚕蛋白质将被去除，并且生成的丝纤维将不被期望具有改进的力学特性。
生产蜘蛛丝蛋白质的转基因蚕被报道作为其他研究的相对较小的部分，他们关注来自溶解于六氟溶剂中的丝蛋白质的纤维的重建。然而，此研究描述了两种用piggyBac载体生产的转基因蚕，这些载体对来自棒络新妇蛛的大壶状腺蜘蛛丝蛋白-1或鞭状丝蛋白质的极其短的合成的“丝样”序列进行编码。两种丝样的肽被嵌入N-和C-末端fhc结构域之内。力学测试显示由这些转基因动物生产的丝纤维具有略微较大的拉伸强度（41-73MPa）以及没有变化的弹性。这些工作者还报道：在它们的复合纤维的力学特性中观察到的相对小的变化反映重组蛋白质合并的低水平。还有可能的是在那些构建体中使用的特定蜘蛛丝样肽序列和/或它们的小尺寸可以至少部分地解释由这些转基因蚕生产的复合纤维的力学特性的相对小的变化。
在此的转基因蚕以及复合纤维是生产这样一些转基因蚕系的首例：产生包含稳定整合的嵌合蚕/蜘蛛丝蛋白质的复合丝纤维，这些嵌合蚕/蜘蛛丝蛋白质显著改进它们的力学特性。与天然蜘蛛牵丝纤维相比，由本转基因蚕系生产的复合蜘蛛丝/蚕纤维甚至更加坚韧。除其他因素外，这可以至少部分地归因于2.4kbp A2S814合成蜘蛛丝序列的使用，该序列对重复鞭状样(GPGGA)4弹性基序和大壶状腺蜘蛛丝蛋白-2[接头-丙氨酸8]结晶基序进行编码。这种相对大的合成蜘蛛丝蛋白质可以通过在大肠杆菌生产后的挤出而被纺造成纤维，指示它保持了装配成纤维的天然能力。然而，此蛋白质将被同步表达，并且将不得不与内源的蚕fhc、flc、以及fhx蛋白质相互作用以便合并入丝纤维中。因此，A2S814蜘蛛丝序列被嵌入在N-和C-末端fhc结构域以指导装配过程。连同fhc启动子驱动它们在接近于内源蚕丝蛋白质的空间和时序下进行表达的能力一起，这些特征可以至少部分地解释嵌合蚕/蜘蛛丝蛋白质参与复合丝纤维装配以及显著贡献于它们的力学特性的能力。
实例12-piggyBac载体构建体以及piggyBac载体组分的PCR扩增
将一些基因片段通过用在表4中所显示的分离自家蚕品系P50/Daizo丝腺的基因组DNA以及基因特异性引物的聚合酶链式反应来进行分离。这些片段包括fhc主启动子和上游增强子（MP-UEE）、具有不同5’-和3’-侧翼限制酶切位点的两种形式的fhc基础启动子（BP）和N-末端结构域（NTD；外显子1/内含子1/外显子2）、fhc C-末端结构域（CTD；3’编码序列以及poly A信号）、以及EGFP。在每种情况中，将扩增产物进行凝胶纯化，并且将期望大小的DNA片段切下并且移除。随后，将fhcMP-UEE、fhc CTD、以及EGFP克隆进pSLfa1180fa中，将两种不同的NTD片段克隆进pCR4-TOPO（Invitrogen公司，Carlsbad，CA）中，并且将包含正确扩增产物的大肠杆菌转化体通过限制酶切图谱进行鉴别并且通过测序进行核实。然后(than)如下的使用这些片段来装配在本研究中使用的piggyBac载体。将合成的A2S814蜘蛛丝序列用BamHI和BspEL而从pBluescript SKII+质粒前体切下，进行凝胶纯化，进行回收，并且将其亚克隆进以上所述的pSL中间质粒中的CTD上游的相应位点中。此步骤产生特指为pSL-蜘蛛6-CTD的质粒。然后将Notl/BamHI片段从如上所述的pCR4-TOPO-NTD中间质粒的一个中切下，进行凝胶纯化，进行回收，并且将其亚克隆进pSL-蜘蛛6-CTD中的蜘蛛6-CTD序列上游的相应位点中，从而生产pSL-NTD-蜘蛛6-CTD。平行地，将Notl/Xbal片段从如上所述的另一个pCR4-TOPO-NTD中间质粒中切下，进行凝胶纯化，进行回收，并且将其亚克隆进以上所述的pSL-EGFP中间质粒中的EGFP扩增引物上游的相应位点中。这生产出包含NTD-EGFP片段的质粒，该片段是用Notl和BamHI切下并且被亚克隆进pSL-蜘蛛6-CTD中的蜘蛛6-CTD序列上游的相应位点中。然后将MP-UEE片段用Sfil和Notl从以上所述的pSL中间质粒切下，进行凝胶纯化，进行回收，并且将其亚克隆进以上所述的两个不同中间pSL质粒中的NTD-蜘蛛6-CTD和NTD-EGFP-蜘蛛6-CTD序列上游的相应位点中。最后，将完全装配的MP-UEE-NTD-A2S814-CTD或MP-UEE-NTD-EGFP-A2S814-CTD盒用AScl和Fsel从对应的最终pSL质粒切下，并且将其亚克隆进pBAC[3XP3-DsRedaf]的相应位点中(霍恩（Horn）等人（2002），《昆虫生物化学与分子生物学》（Insect Biochem.Mol.Biol.,32:1221-1235）。这个最终的亚克隆步骤产生了两种单独的piggyBac载体，这两种载体特指蜘蛛6和蜘蛛6-EGFP以指代EGFP标记的不存在或存在。以下表格提供了所使用的piggyBac载体的一些关键组分的一个列表。
实例13-masp克隆
本实例通过提供包含质粒（并且具体而言是pXLBacII ECFP质粒）内的NTD区的基因构建体证实了本发明的效用。
包含pXLBacII ECFP质粒内的NTD区的潜在阳性克隆是通过用PCR的菌落筛选显示。
创造用于pXLBacII-ECFP NTD CTD maspX16（10,458bp）（图12A）和pXLBacII-ECFP NTD CTD maspX24（11,250bp）（图12B）的基因构建体masp。
对于本领域普通技术人员应该清楚的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本发明可以做出不同的修改和变化。因此，预期的是本发明覆盖了本发明的修改和变化，其条件是它们在所附权利要求及它们的等效物范围之内。
文献目录
在此的参考文献通过引用特此确切地结合在此。
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100.美国专利5,728,810 Lewis（路易斯）。
Claims (23)
1.一种重组蜘蛛丝蛋白质，该蛋白质由一种嵌合序列进行编码，该嵌合序列包括一个蚕序列、一个或多个蜘蛛丝弹性基序序列、一个或多个蜘蛛丝强度基序序列、或它们的一种组合。
2.如权利要求1所述的重组丝蛋白质，其中该蜘蛛丝弹性基序序列是一种MaSp样的基序序列或一种MiSp样的基序序列。
3.如权利要求2所述的重组蜘蛛丝蛋白质，其中该MaSp样的基序是MaSp1、MaSp2、或它们的一种组合。
4.如权利要求1所述的重组蜘蛛丝蛋白质，进一步包括一种生长促进肽。
5.包括如权利要求1所述的重组丝蛋白质的一种嵌合蜘蛛丝/蚕纤维，其中所述丝纤维具有大于天然蚕丝纤维的一个拉伸强度。
6.一种转基因蚕，该转基因蚕具有一个重组嵌合基因，该重组嵌合基因具有一种序列，该序列包括一个或多个蜘蛛丝弹性基序序列、一个或多个蜘蛛丝强度基序序列、或它们的一种组合。
7.如权利要求6所述的转基因蚕，其中该蚕能够生产一种嵌合的蚕/蜘蛛丝蛋白质，该嵌合的蚕/蜘蛛丝蛋白质适用于具有大于天然蚕纤维两倍的一个拉伸强度的一种嵌合蜘蛛丝/蚕纤维的生产。
8.如权利要求5所述的转基因蚕，其中该转基因蚕是一种转基因家蚕。
9.如权利要求6所述的转基因蚕，包括8个蜘蛛丝弹性基序序列。
10.如权利要求8所述的转基因蚕，其中该蜘蛛丝弹性基序序列是一种MaSp样的基序序列或一种MiSp样的基序序列。
11.一种基因构建体，包括能够表达一种丝心蛋白重链（fhc）-蜘蛛丝嵌合体的一种家蚕丝心蛋白重链表达盒，所述构建体包括对一种蜘蛛丝弹性基序序列、一种蜘蛛丝强度基序序列、或两者进行编码的一种蜘蛛丝蛋白质序列，所述构建体在侧翼分布有一种家蚕fhc丝蛋白质序列的N-和C-末端片段。
12.如权利要求11所述的基因构建体，其中该蜘蛛丝蛋白质序列包括一种推定的鞭状丝弹性基序序列的4至8个拷贝以及一种推定的牵丝强度基序序列的1至4个拷贝。
13.如权利要求11所述的基因构建体，其中该弹性基序序列是GPGGA并且该强度基序序列是GGPSGPGS(A)8。
14.一种如在图5中所限定的基因构建体。
15.一种如在图12A中所限定的piggyBac载体。
16.如在图12B中所限定的piggyBac载体。
17.一种用于嵌合蜘蛛丝复合纤维的生产的制造方法，该方法包括：
a.)使用一种piggyBac载体系统来制备一种转基因蚕，该载体系统具有对一种嵌合蜘蛛丝强度基序序列、一种蜘蛛丝柔性基序序列或它们的一种组合进行编码的一种基因；
b.)允许该转基因蚕在对于该蚕是天然的适合生理条件下生产一种茧；
c.)收集这些茧，并且提取嵌合蜘蛛丝纤维。
18.如权利要求17所述的方法，其中该转基因蚕是一种转基因家蚕。
19.制备一种转基因家蚕的方法，该转基因家蚕能够稳定地表达一种适用于装配为一种蜘蛛丝复合纤维的、稳定的嵌合蜘蛛丝蛋白质，所述嵌合蜘蛛丝蛋白质由包括一种蜘蛛丝柔性基序序列以及一种蜘蛛丝强度基序序列、或它们的一种组合的一种序列进行编码，所述方法包括：
a.)将一种piggyBac载体插入一种突变的家蚕卵中以提供注入的家蚕卵，该载体包括一种重组基因盒，该重组基因盒具有一个蜘蛛丝柔性基序序列、一个蜘蛛丝强度基序序列、或它们的一种组合；
b.)允许这些卵在适合的孵育条件下孵出，从而提供幼虫；
c.)允许该幼虫在适合的孵育条件下成熟；并且
d(c).)选择转基因家蚕。
20.如权利要求19所述的方法，其中重组的基因盒包括一个绿色荧光蛋白（GFP），用于转基因家蚕的选择。
21.如权利要求19所述的方法，其中该piggyBac载体是pXLBacII-ECFP NTD CTD masp1X16（10,458bp）或pXLBacII-ECFP NTDCTD maspX24（11,250bp）。
22.包含稳定整合的蜘蛛丝蛋白质的一种合成复合丝纤维，与一种天然蚕丝纤维并且与一种天然蜘蛛丝纤维相比，所述合成复合丝纤维具有一个较大的拉伸强度。
23.如权利要求22所述的合成复合丝纤维，进一步包括一种稳定整合的治疗分子。
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