CN1910196A - 含有蜘蛛丝蛋白质的丝线以及产生该丝线的蚕 - Google Patents
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Abstract
使用通过利用转座子功能等方法，在不破坏蚕丝心蛋白H链基因的情况下导入了编码具有高强度、高伸长度等期望性质的蜘蛛丝蛋白质的基因的转基因蚕，使转基因蚕产生丝线的强度以及伸长度不下降且具有期望性质的蜘蛛丝蛋白质，从而生产具有期望性质的蜘蛛丝与丝线的复合丝。
Description
技术领域
本发明涉及通过转基因蚕制备的含有蜘蛛丝蛋白质的丝线、该转基因蚕、以及通过该转基因蚕的丝线的制备方法。
背景技术
在不影响强度和耐久性的同时，对于兼具重量轻以及柔软的材料或布的需求经常增加，而蜘蛛丝显示出具备很多期望的特性。已知织网蜘蛛能够通过6种不同类型的腺组织产生丝，这6种纤维各自具备不同的机械特性。由大囊状腺(Major amullate gland)和小囊状腺(Minor amullategland)形成的蜘蛛丝被称作牵引丝、drag line。因牵引丝显示出的高抗拉强度和高伸长度(非专利文献1)，期待其有广泛的工业用途(非专利文献2)。另外，由鞭毛状腺(Flagelliform gland)和聚状腺(Aggregate gland)形成的蜘蛛丝一般为横丝，显示粘着性和高伸长度(非专利文献3)。
由此蜘蛛丝显示出比钢铁的抗拉强度还强以及具有比羊毛的抗屈曲性还强的特性，进一步地，已知其特征在于比KEVLAR(注册商标)具有更大的断裂能界限。特别地，牵引丝具有超过200ksi的抗拉强度，同时具有约35％的抗屈曲性。由于被赋予上述特征，蜘蛛丝能够作为重量轻的高强度纤维适用于多种织物。
另外，由于蜘蛛丝在最高达100℃时仍稳定，使用该纤维能够加固热注入化塑料。该蛋白质即使呈膜或包衣的形态，也可能具有价值。进一步地，蜘蛛丝是以氨基酸为组成成分的蛋白质，兼具在自然界中可以被分解的优点。
作为天然的蜘蛛丝蛋白质，已知有spidroin1(MaSpI)、spidroin2(MaSpII)(非专利文献4)、ADF-3、ADF4等。作为这些蜘蛛丝蛋白质具有的特征序列可例举如下，由丙氨酸、丝氨酸以及甘氨酸等占多数的氨基酸组成，同时，还含有相当多的谷氨酰胺、酪氨酸、亮氨酸以及缬氨酸等其他氨基酸。spidroin1含有重复序列，重复单位最大为34个氨基酸长度，而且不是严格保守。该重复单位由两个不同区段组成，即(i)由5-7个残基的多聚丙氨酸序列占多数的10个氨基酸区段，(ii)在序列内是保守的，但在许多重复单位中具有多次3个氨基酸缺失的24个氨基酸区段。后者的序列主要由Gly-Xaa-Gly基序组成，Xaa是丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸或谷氨酰胺。Spidroin2也具有重复序列，重复单位最大为51个氨基酸长度，而且也不是严格保守。该重复单位由两个不同区段组成，即(i)由6-9个残基的多聚丙氨酸序列占多数的区段，(ii)包含GlyGlyTyrGlyProGly或GlyProGlyGlnGln氨基酸序列的区段。
已发现作为天然蜘蛛丝蛋白质特别是牵引丝的主要组成蛋白spidroin1是包含甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、精氨酸、异亮氨酸和缬氨酸作为组成成分的多肽。作为次要组成成分的spidroin2的序列中，已发现较spidroin1含有更多的脯氨酸，脯氨酸有助于转角构型和螺旋构型。
已知作为保持上述特征的经人工合成、设计的基因包括DP-1B、DP-2A(非专利文献4)。
但是，蜘蛛的集团饲养存在困难，直接从蜘蛛制备大量的丝存在困难。另外，天然蜘蛛丝的溶解和纯化也尚存困难，蜘蛛丝除了在例如LiSCN、LiClO4或88％(体积/体积)甲酸那样的非常苛刻试剂之外呈不溶性。即使一旦溶解，但是，进行透析时或者使用典型的缓冲液进行稀释时，构成蜘蛛丝的蜘蛛丝蛋白质还是沉淀。进一步地，通过蜘蛛制备的蜘蛛丝因蜘蛛丝的种类不同其性质有差异，分离得到具有期望性质的蜘蛛丝蛋白质更加困难。正因如此，以适当的花费利用天然来源获得商业有用量蜘蛛丝蛋白质是不可能的。
因此近年来利用基因重组技术，尝试对多种生物进行改造以制备蜘蛛丝蛋白质。例如，尝试通过大肠杆菌或酵母等微生物制备蜘蛛丝蛋白质(非专利文献4)(专利文献1)、尝试利用烟草或马铃薯等植物(非专利文献5)、利用哺乳类细胞的方法、利用转基因山羊自乳汁或尿液生产的方法(专利文献2)等。但是，通过上述基因重组体产生蜘蛛丝蛋白质时，需要对产生的蜘蛛丝蛋白质进行提取、纯化、人工纺丝(非专利文献1)，人工纺丝需要耗费工时和费用，而且使用多种溶剂引发了环境负荷的问题。
上述中、纯化和/或人工纺丝步骤并非必要，作为用于直接生产含有蜘蛛丝组成蛋白纤维的方法，公开了利用转基因蚕生产含有绿色荧光蛋白与蜘蛛丝蛋白质的重组蛋白的丝线(非专利文献3)。该方法通过电穿孔方法向蚕卵导入编码模拟绿色荧光蛋白与蜘蛛丝蛋白质的融合蛋白的基因，通过同源重组获得重组体。但是该方法中，与非转基因蚕所产的丝线相比，该方法只能生产出强度和伸长度低的丝线。
作为该原因，考虑有以下可能性，1.由于通过同源重组导入基因，蚕本身持有的一对丝心蛋白H链基因中至少之一遭到破坏；2.为了挑选重组体，必须使绿色荧光蛋白作为融合蛋白表达，蜘蛛丝蛋白质的性质可能受损；3.所设计的蜘蛛丝蛋白质为不具有高强度、高伸长度特性的序列。
[专利文献1]特表平8-511426号公报
[专利文献2]特表2002-506642号公报
[专利文献3]国际公开第02/40528号公报
[非专利文献1]Science，2002年，第295卷，p472-476
[非专利文献2]Nature，2001年，第410卷，p541-548
[非专利文献3]大崎茂芳，蜘蛛丝的化学，有机合成化学，(日本)，1985年，第4卷，第9号，p828-835
[非专利文献4]Reviews in Molecular Biotechnology，2000年，第74号，p105-119
[非专利文献2]Nature，2001年，第19卷，p573-577
发明公开
发明欲解决的课题
本发明的课题是通过不使用多种溶剂并且不必进行人工纺丝步骤的方法而提供具有预期的高强度、高伸长度特性的蜘蛛丝的丝线。
解决课题的手段
本发明者们通过深入研究得到解决上述课题的方法，发现通过利用转座子的功能，使导入编码蜘蛛丝蛋白质基因的转基因蚕生产出具有预期高强度、高伸长度性质的含有蜘蛛丝蛋白质的丝线，从而完成了本发明。
即本发明提供以下(1)至(26)项发明。
(1)含有蜘蛛丝蛋白质的丝线，其是通过具有一对丝心蛋白H链基因的转基因蚕制备的。
(2)含有蜘蛛丝蛋白质的丝线，其特征在于：通过具有一对丝心蛋白H链基因的转基因蚕制备，基本保持丝线丝心蛋白H链蛋白的基本结构。
(3)上述发明(1)或(2)所述的丝线，其特征在于：蜘蛛丝蛋白质在丝心蛋白蛋白质中分散存在。
(4)上述发明(1)至(3)中任意一项所述的丝线，其特征在于：蜘蛛丝蛋白质与包含于丝心蛋白H链蛋白质中的多肽融合。
(5)上述发明(4)所述的丝线，其特征在于：蜘蛛丝蛋白质插入至丝心蛋白H链蛋白质的N末端部分与C末端部分之间，通过包含于C末端部分的半胱氨酸与丝心蛋白L链蛋白质形成二硫键。
(6)上述发明(1)至(5)中任意一项所述的丝线，其特征在于：蜘蛛丝蛋白质的含量为0.1％至25％重量百分比。
(7)上述发明(6)所述的丝线，其特征在于：蜘蛛丝蛋白质的含量为1％至15％重量百分比。
(8)上述发明(7)所述的丝线，其特征在于：蜘蛛丝蛋白质的含量为1％至10％重量百分比。
(9)上述发明(1)至(8)中任意一项所述的丝线，其特征在于：蜘蛛丝蛋白质包含序列编号1的肽或者包含在序列编号1中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加并具有蜘蛛丝蛋白质特性的肽。
(10)上述发明(9)所述的丝线，其特征在于：包含上述发明(9)所述的肽重复3至30次的蜘蛛丝蛋白质。
(11)上述发明(10)所述的丝线，其特征在于：包含上述发明(9)所述的肽重复4至16次的蜘蛛丝蛋白质。
(12)上述发明(1)至(8)中任意一项所述的丝线，其特征在于：蜘蛛丝蛋白质包含序列编号2的肽或者包含在序列编号2中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加并具有蜘蛛丝蛋白质特性的肽。
(13)上述发明(12)所述的丝线，其特征在于：包含上述发明(12)所述的肽重复3至30次的蜘蛛丝蛋白质。
(14)上述发明(13)所述的丝线，其特征在于：包含上述发明(12)所述的肽重复4至16次的蜘蛛丝蛋白质。
(15)上述发明(1)至(8)中任意一项所述的丝线，其特征在于：蜘蛛丝蛋白质含有上述发明(9)所述的肽以及上述发明(12)所述的肽这两者。
(16)上述发明(5)至(15)中任意一项所述的丝线，其特征在于：与蜘蛛丝蛋白质融合的丝心蛋白H链蛋白的C末端部分为序列编号3的肽或者为在序列编号3中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加并具有2或3个半胱氨酸的肽。
(17)上述发明(5)至(16)中任意一项所述的丝线，其特征在于：与蜘蛛丝蛋白质融合的丝心蛋白H链蛋白质的N末端部分为序列编号4的肽或者为在序列编号4中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的肽，编码所述肽的基因具有通过启动子增强外源蛋白质表达功能的肽。
(18)上述发明(1)至(17)中任意一项所述的丝线，其特征在于：蜘蛛丝蛋白质不与成为选择性标记的蛋白质融合。
(19)制备上述发明(1)至(18)中任意一项所述丝线的转基因蚕，其具有一对丝心蛋白H链基因，且编码蜘蛛丝蛋白质的基因导入一对丝心蛋白H链基因之外的区域。
(20)上述发明(19)所述的转基因蚕，其特征在于：具有用于使转基因蚕表达蜘蛛丝蛋白质的丝心蛋白H链基因启动子。
(21)上述发明(19)所述的转基因蚕，其特征在于：具有用于使转基因蚕表达蜘蛛丝蛋白质的丝心蛋白H链基因启动子及其上游区域。
(22)上述发明(20)或(21)所述的转基因蚕，其特征在于：丝心蛋白H链基因第一外显子·第一内含子全部或部分·第二外显子区域的部分连接在丝心蛋白H链启动子下游。
(23)利用转座子制备上述发明(19)至(22)中任意一项所述的转基因蚕的方法。
(24)上述发明(23)所述的转基因蚕的制备方法，其特征在于：转座子为piggyBac转座子。
(25)丝线的制备方法，其特征在于：通过上述发明(19)至(22)中任意一项所述的转基因蚕制备。
(26)使用上述发明(1)至(18)中任意一项所述的丝线的织物。
发明效果
通过本发明获得了含有强度、伸长度和/或韧性均有提高的具有优良特性的蜘蛛丝蛋白质的丝线。另外，由于利用该丝线的织物具有以上优良特性，因此可用于以下产业用途，例如航空、宇宙用途、被服制造、绳索、外科手术缝线等高强度材料、以及还可作为移植术(例如，人工韧带或大动脉用绷带)用的生物材料。
附图简述
图1显示HP·DP16·HC、HP·DP12·HC、HP·DP8·HC、HP·DP4·HC以及HP·AEX·HC基因结构的制备方法。
图2显示HUP·DP8·HC以及HUP·DP4·HC基因结构的制备方法。
图3显示如下结果的图片，随机选取含有HP·DP8·HC(泳道1至5)、HP·DP4·HC(泳道6至10)基因结构的转基因蚕，用EcoRI限制性酶处理其基因组，标记蜘蛛丝蛋白质基因DP，进行Southern杂交。
图4显示导入HP·DP16·HC、HP·DP8·HC、HP·DP4·HC、HP·AEX·HC、HUP·DP8·HC、HUP·DP4·HC基因结构的蚕所结的茧经溶解、银染色以及利用抗体进行Western分析后的结果图片。
图5显示非重组蚕与导入HP·DP8·HC基因的重组蚕所产丝线在精制前、后用扫描电子显微镜(15000倍)拍摄的图片。
图6显示以非重组蚕所产丝线为样品，沿纤维轴方向进行切片，使用针对蜘蛛丝蛋白质DP的抗体进行免疫电子显微镜(倍率15000倍)观察结果的图片。
图7显示以导入HP·DP8·HC基因的重组蚕所产丝线为样品，沿纤维轴方向进行切片，使用针对蜘蛛丝蛋白质DP的抗体进行免疫电子显微镜(倍率15000倍)观察结果的图片。
符号说明
1：丝胶蛋白层
2：丝心蛋白层
3：蜘蛛丝蛋白质
实施发明的最佳方式
本发明使用的其它用语、定义在发明实施方式的说明和实施例中均有详细规定。另外，用于实施发明的多种技术，特别地除了标明出处的技术之外的其他技术是基于公开的文献并且本领域技术人员能够容易并且确实地实施。例如Sambrook和Maniatis，Molecular Cloning-A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989，Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，N.Y，1995等著述的基因工程以及分子生物学技术。
本发明中的丝线是指以构成家蚕(Bombyx mori)吐丝所结茧的蛋白为主要成分的纤维。优选地是指从茧制备的生丝，进一步优选地是指生丝经精制后得到的丝线，更为优选地是指从两个以上的多个茧进行复丝操丝得到的丝线。蚕制备的丝线由丝心蛋白层以及围绕该层的丝胶蛋白层构成。
本发明中的蜘蛛是分类为蜘蛛目的动物，优选地是指分类为造网性的蜘蛛目的动物。进一步优选地是指大蜘蛛(Araneus ventricosus)或女郎蜘蛛。
本发明中的蜘蛛丝是指蜘蛛吐的丝即纤维状的蛋白质，具体是指造网蜘蛛吐的丝即例如牵引丝、框丝、停留丝、卵囊丝、横丝、捕捉丝、附着盘、织丝等，进一步优选地是指纵丝、横丝、框丝、牵引丝。
本发明中的蜘蛛丝蛋白质是指构成蜘蛛丝的蛋白质或具有构成蜘蛛丝的蛋白质特征的蛋白质。并非必须具有与天然的蜘蛛丝蛋白质完全相同的序列，也可以是人工设计、合成的蛋白质。由于天然的蜘蛛丝蛋白质的分子量巨大，因此产生天然蜘蛛丝蛋白质的基因同样巨大。为了提高制备效率，应进行基因的缩短、缺失、替换。另外，也可以是经设计得到的人工合成基因，该基因用于制备具有天然蜘蛛丝蛋白质的特征性序列的人工类似蛋白。
优选地可使用含有DP-1B、DP-2A中的至少5个氨基酸残基序列的蛋白质作为蜘蛛丝蛋白质。更为优选地是模拟作为主要组成蛋白的spidroin1的氨基酸序列，从而赋予丝线具有蜘蛛丝牵引丝强度、伸长度等期望性质。即希望本发明中的蜘蛛丝蛋白质是以甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、精氨酸、异亮氨酸、缬氨酸为组成成分，进一步优选地，使用含有如下序列的蜘蛛丝蛋白质，所述序列为自DP-1B编码的序列编号1所述的序列，或者由“蜘蛛丝蛋白质特有的重复序列”·“DP-2A的共有序列”·“丝线特有的重复序列”顺序组成的序列编号2所述的序列。
在具有基本相同功能的范围内，也包含序列编号1或2或3或4所述的序列存在1个或多个氨基酸缺失、替换或添加。也就是，应充分认识到，蛋白质虽然经过多种方法被改变，但仍旧保持其基本特征。这意味着与基本的多肽序列相比，虽然存在一个或多于一个的氨基酸缺失、替换或添加等变异，但是与基本的未变位序列具有相同的功能即预期的性质。
另外，为了利用转基因蚕高效地制备蜘蛛丝蛋白质，优选地使用如下基因，该基因与蚕丝腺表达基因的密码子使用频率相似。蚕丝腺表达基因可列举如下，丝心蛋白H链基因、丝心蛋白L链基因、P25蛋白基因等。可通过改变、变异等方法获得近似于蚕丝腺表达基因的密码子使用频率，该方法众所周知。具体地，使用改变产生蛋白质的基因的方法。例如可以单独或组合应用随机突变、定点诱变、基因同源重组或聚合酶链反应扩增法(PCR)等技术。还可以应用以下方法，例如用亚硫酸氢钠进行化学处理使尿嘧啶碱基取代胞嘧啶碱基、在含锰的反应液中进行PCR、在合成DNA时降低核苷酸使用的正确率的方法、使用市售的用于定点诱变的各种试剂盒等。还可以根据例如Sambrook等人所著“Molecular Cloning-ALaboratory Manual，第2版”，Cold Spring Harbor Laboratory 1989；村松正实所著“Lab-manual基因工程学”丸善株式会社1988；ェ一ルリツヒ、HE.所著“PCR技术，DNA扩增原理与应用”ストツクトンプレス1989等专著种描述的方法，或者也可以使用经过改良的上述方法。
希望本发明中的蜘蛛丝蛋白质与作为丝线组成蛋白的丝心蛋白H链中包含的多肽进行融合。优选地，蜘蛛丝蛋白质与丝心蛋白H链的C末端部分进行融合。特别优选地，蜘蛛丝蛋白质插入丝心蛋白H链的N末端部分和丝心蛋白H链的C末端部分之间。以该方式形成的含有蜘蛛丝蛋白质的融合蛋白通过包含于丝心蛋白H链蛋白质的C末端部分的半胱氨酸与丝心蛋白L链蛋白形成二硫键。
关于本发明所使用的蜘蛛丝蛋白质的分子量没有特别的限制。为了赋予蜘蛛丝具有的期望性质，希望高的分子量，但是，与此同时操控编码蜘蛛丝蛋白质的基因变得困难。因此，蜘蛛丝蛋白质分子量优选地在30kDa至300kDa范围内，更为优选地在30kDa至160kDa范围内。
本发明的丝线具有经改良的来自蜘蛛丝的优良特性。更具体地，与同种的非转基因蚕所产丝线相比至少应具备选自以下的特性之一，高抗拉强度与高伸长度、高弹性率与优良的伸缩性、抗屈曲性、高的断裂能即高韧性、粘着性、含水时的收缩性、优良的耐候性与耐光性，但并不意味着要具备以上全部特性。优选地显示至少一种选自高抗拉强度、高伸长度、高韧性的特性。
本发明中的用于使蚕生产含有蜘蛛丝蛋白质的丝线的启动子并无特别限制，但是，优选地具有高转录活性。例如，特开平6-261770与特开昭62-285787所述的果蝇热休克蛋白基因的启动子、蚕肌动蛋白基因的启动子(Nature Biotechnology 18，81-84，2000)等。但是，丝心蛋白H链基因启动子(GenBank登录号为V00094的第255至574号碱基、GenBank登录号为AF226688的第62118至62437号碱基)、丝心蛋白L链基因启动子(Gene，100：151-158：GenBank登录号为M76430)、丝胶蛋白基因启动子(GenBank登录号为AB007831的第599至1656号碱基)等在蚕丝腺细胞中具有高转录促进活性的启动子是合适的。另外，使用丝心蛋白H链基因启动子及其上游区(GenBank登录号AF226688的第57444至62437号碱基)可显示出高转录促进。
丝心蛋白H链基因的5’末端部分是具有通过启动子增强外源蛋白表达作用的DNA序列。该DNA序列含有丝心蛋白H链基因的第1外显子和第1内含子全长或其部分以及第2外显子的部分。另外，丝心蛋白H链基因的5’末端部分编码序列编号4所述的丝心蛋白H链蛋白质N末端部分的多肽。
用于转化蚕时，只要是能够进行昆虫细胞基因重组的昆虫用载体，使用时没有特别的限制。例如，由蚕核型多角体病毒(BmNPV)载体、整合有昆虫来源的DNA型转座子的质粒载体等，特别地优选后者。作为昆虫来源的DNA型转座子已知的有piggyBac、mariner(Insect Mol.Biol.9，145-155，2000)、以及Minos(Insect Mol.Biol.9，277-281，2000)等，本发明中优选piggyBac。
PiggyBac转座子是两端具有13个碱基对的反向序列、内部具有约2.1k碱基对的ORF的DNA转位因子。本发明所使用的PiggyBac转座子无特别限制，例如可以使用Trichoplusia in cell line TN-368、Autographacalifornica NPV(AcNPV)、Galleria mellonea NPV(GmMNPV)来源的转座子。优选地可以使用Trichoplusia in cell line TN-368来源的具有部分PiggyBac的质粒pHA3PIG与pPIGA3GFP(Nature biotechnology18，81-84，2000)，作为产生转座酶蛋白的辅助质粒。
通过辅助质粒产生的这些转座子由于在蚕细胞内显示转移活性，通过基于这些DNA型转座子制作的基因导入用载体，使蚕转化成为可能。特别地基于piggyBac制作的基因导入用质粒载体，通过微量注射入蚕卵，实际上成功地使蚕发生转化(Nat.Biotechnol.18，81-84，2000)。
例如利用piggyBac的性质，通过以下方法可以制备转基因蚕。首先，在蚕基因组序列中插入用于生产含有蜘蛛丝蛋白质的丝线的经设计基因。为此，可利用与田村等人(Nat.Biotechnol.18，81-84，2000)相同的方法进行。即，将piggyBac的一对反向重复序列整合入适当的质粒载体，将用于生产含有蜘蛛丝蛋白质的丝线的经设计基因插入至一对反向重复序列之间。随后将该基因导入用质粒载体和piggyBac的转座酶表达载体(辅助质粒)一起微量注入蚕卵。所述辅助质粒为piggyBac反向重复序列有一方或两方缺失的、实质上仅整合有piggyBac转座酶基因区的重组质粒载体。在该辅助质粒中，用于表达转座酶的启动子可利用未经改动的内源性转座酶启动子，或者也可以利用蚕肌动蛋白启动子或果蝇HSP70启动子等。为了便于筛选下一代蚕，在已添加用于生产含有蜘蛛丝蛋白质的丝线的经设计基因的蜘蛛丝蛋白质表达载体内，可同时整合入标记基因。在这种情况下，标记基因的上游整合入例如蚕肌动蛋白启动子或果蝇HSP70启动子等启动子序列，通过它们的作用使标记基因得以表达。
从微量注入了蜘蛛丝蛋白质表达载体的蚕卵孵化出幼蚕(G0代)，饲养幼蚕。该G0代蚕中有部分蚕整合入了用于生产含有蜘蛛丝蛋白质的丝线而经设计的基因。但是，该代蚕体内的全部细胞中只有部分细胞整合入了用于生产含有蜘蛛丝蛋白质的丝线而经设计的基因，为了获得全部细胞都整合入了用于生产含有蜘蛛丝蛋白质的丝线而经设计的基因的蚕，将G0代蚕进行交配，通过生殖细胞一定会获得这样的转基因蚕，其中传递了用于生产含有蜘蛛丝蛋白质的丝线而经设计的基因。也就是，将获得的全部G0代蚕与非重组蚕交配，或者G0代蚕之间交配，必须从下一代(G1代)蚕中挑选这样的转基因蚕，其含有用于生产含有蜘蛛丝蛋白质的丝线而经设计的基因。从G1代蚕中挑选转基因蚕可使用例如PCR方法或Southern印迹方法。另外，当整合了标记基因时，也可以利用其表现形式。例如作为标记基因而使用GFP等荧光蛋白基因时，用激发光照射G1代蚕卵或幼虫，可通过检测荧光蛋白发出的荧光进行挑选。
如上所挑选的蚕为转基因蚕，其染色体内部整合入了用于生产含有蜘蛛丝蛋白质的丝线而经设计的基因。而且，上述获得的转基因蚕与WO02/40528A1(专利文献3)所述的通过同源重组获得的转基因蚕不同，其残存正常的蚕丝心蛋白H链基因，即为具有一对丝心蛋白H链基因的转基因蚕。
本发明对丝线所含蜘蛛丝蛋白质的含量无特别限制，只要重量百分比在0.1％至30％的范围内即可。此时，希望在蚕吐丝行为不会防碍纤维化的范围。但是，含量大于等于30％有使强度降低的可能性。因此，为了保持强度和/或伸长度，并且赋予蜘蛛丝具有的期望性质，蛋白质含量更为优选地在0.1％至25％、更为优选地在1％至15％、进一步优选地在1％至10％范围内。
所含蜘蛛丝蛋白质在重量百分比0.1％至25％范围内的丝线例如如下产生，将符合读框的这样的基因结构连接在经XhoI处理后平端化的pigA3GFP质粒上，所述基因结构为在丝心蛋白H链上游启动子·丝心蛋白H链基因第一外显子·第一内含子区·第2外显子区的部分(GeneBank登录号AF226688的第57444至63513号碱基)的下游或者丝心蛋白H链启动子·丝心蛋白H链基因第一外显子·第一内含子·第二外显子区(GeneBank登录号AF226688的第62118至63513号碱基)的下游连接与编码序列编号1的肽多次重复的肽序列的碱基连接，然后在其下游区连接丝心蛋白H链C末端部分基因·丝心蛋白H链多聚A信号区(GeneBank登录号AF226688的第79099至79995号碱基)。将该基因导入用载体以及含有产生piggyBac转座酶蛋白的DNA的辅助质粒(pHA3PIG)配制成各含200μg/ml的0.5mM磷酸缓冲液(pH＝7.0)·5mM KCl溶液，在产卵后4小时内将3至20nl溶液微注射入蚕卵，制备转基因蚕。由此制作的转基因蚕生产含有蜘蛛丝蛋白质的丝线。
此时，根据导入基因在染色体的位置不同，在含有蜘蛛丝蛋白质的含量方面产生差异。
进一步地，对导入的蜘蛛丝蛋白质的肽序列的重复次数无特别限制，优选地为3至30次，进一步优选地为4至16次。
蜘蛛丝蛋白质的含量测定如下，茧溶化后，进行SDS-PAGE，使用银染色试剂盒(第一化学药品株式会社生产)，按照所附方法检测蜘蛛丝蛋白质，用分子成像仪(BioRad公司生产)测定以上结果的信号强度，与已知浓度的蛋白质例如猫干扰素的信号强度比较后可以测定蛋白质的含量。
对本发明所使用的DNA获取方法无特别限制。例如，基于已知的基因信息，使用PCR法进行基因扩增来获取DNA的方法；基于已知的基因信息，以同源性为指标从基因组文库或cDNA文库筛选等方法。在本发明中，这些基因包含基因多态性或使用突变剂进行人为突变处理形成的突变型。基因多态性是基因因自然突变导致基因碱基序列发生部分改变。
当蜘蛛丝蛋白质大量分泌至丝腺细胞外时，通过含有与丝心蛋白L链蛋白形成二硫键的半胱氨酸残基的丝心蛋白H链蛋白的C末端部分与蜘蛛丝蛋白质融合，在丝线中产生蜘蛛丝蛋白质成为可能。另外，丝心蛋白H链基因的C末端部分可以在蜘蛛丝蛋白质的N末端侧、C末端侧、蜘蛛丝蛋白质中的任意一种方式存在。该部分至少有一个半胱氨酸残基存在。在丝心蛋白H链蛋白中，对与丝心蛋白L链形成二硫键结合发挥作用的半胱氨酸残基位于距离丝心蛋白H链蛋白C末端的第20位。与蜘蛛丝蛋白质融合的丝心蛋白H链蛋白C末端部分的长度，只要不防碍与丝心蛋白L链形成二硫键，并无特别限制。
同样地，当蜘蛛丝蛋白质大量分泌至丝腺细胞外时，通过与含有与丝心蛋白H链蛋白形成二硫键的半胱氨酸残基的丝心蛋白L链蛋白融合，丝线中生产蜘蛛丝蛋白质也成为可能。但是，为了赋予含有蜘蛛丝蛋白质的丝线具有高伸长度、高强度等所期望的性质，优选地与丝心蛋白H链蛋白C末端部分融合。
本发明中“包含于丝心蛋白H链蛋白的多肽”是指含有与丝心蛋白L链蛋白形成二硫键的半胱氨酸残基的丝心蛋白H链蛋白C末端部分的多肽以和/或丝心蛋白H链基因的第一外显子和第二外显子的部分编码的多肽。作为含有与丝心蛋白L链蛋白形成二硫键的半胱氨酸残基的丝心蛋白H链蛋白C末端部分的多肽，优选地使用序列编号3所述的多肽。另外，作为丝心蛋白H链基因的第一外显子和第二外显子的部分编码的多肽，优选地使用序列编号4所述的多肽。此时，在基本上具有相同功能的范围内，可以使用存在一个或一个以上氨基酸缺失、替换或者添加的多肽。
有关多聚A的添加区域无特别限制，可以合适地使用丝心蛋白H链、丝心蛋白L链、丝胶蛋白等在丝腺大量表达的蛋白质基因的多聚A添加区域。
本发明中的转基因蚕是指为了产生含有含有蜘蛛丝蛋白质的丝线而经设计的基因结构的蚕。为了便于挑选重组体，可以整合入抗生素耐药性基因、来源于水母的绿色荧光蛋白质基因等标记基因。
本发明中的来源于水母的绿色荧光蛋白质(GFP)是指来源于多管水母的绿色荧光蛋白质，其特征在于经激发光照射发出绿色荧光。也可以使用荧光强度、荧光波长经改良的同类生物。
但是，为了发挥蜘蛛丝蛋白质具有的高强度、高伸长度特征，不优选将编码选择性标记蛋白的基因与编码蜘蛛丝蛋白质的基因符合读框地连接在一起，使与选择性标记蛋白一起作为融合蛋白表达。具有作为高结晶性纤维特性的蜘蛛丝蛋白质，与结晶性低的非纤维性GFP融合，可能导致丝线的结晶化受损、茧重量降低、丝线强度降低。因此，“蜘蛛丝蛋白质不与成为选择性标记的蛋白融合”这一点与WO02/40528A1(专利文献3)所公开的实施例不同，是为了不使强度、伸长度和/或韧度降低的重要现象。WO02/40528A1(专利文献3)所述的方法中，与GFP等选择性标记蛋白融合实际上是必要的，但是，本发明中与选择性标记蛋白融合不是必要的。
本发明中“具有一对丝心蛋白H链基因的转基因蚕”是指内源性蚕丝心蛋白H链基因中，不插入编码蜘蛛丝蛋白质的基因或者GFP等荧光蛋白基因这些被称之为外源的基因，保持正常的丝心蛋白H链基因，并且在丝心蛋白H链基因之外的区域导入了蚕原本没有的外源基因的转基因蚕。优选地是指在同源染色体上的同一基因座处存在一对丝心蛋白H链基因的转基因蚕。
对一对丝心蛋白H链基因之外的区域导入外源基因的确认通过以下方法进行，首先，使用反向PCR、或将蚕基因组经多种限制性酶处理，与作为探针的外源基因进行Southern杂交，通过常规方法进行克隆获得来自于转基因蚕基因组的插入了外源基因的片段。对如上得到的片段进行碱基序列确认的基础上，可以对丝心蛋白H链基因(GeneBank登录号AF226688第57444至79995号碱基)之外导入的外源基因进行确认。
蚕丝线主要是通过丝心蛋白H链蛋白进行纤维化而形成。因此，具有一对丝心蛋白H链基因是对转基因蚕所生产的丝线在强度和伸长度等性质方面均不降低的一个重要现象。
本发明中的基本保持丝心蛋白H链蛋白的结构是指，由丝心蛋白H链蛋白作为主要组成成分的丝心蛋白层的结构与非转基因蚕所产丝线的丝心蛋白层的形态相同，可通过光学或电子显微镜观察确定。基本上保持丝心蛋白H链蛋白结构是转基因蚕所生产的丝线在强度和伸长度等性质方面均不降低的一个重要现象。
这些蚕与非重组蚕或者与同为转基因蚕的蚕进行交配，则可使为了生产含有蜘蛛丝蛋白质的丝线而经设计的基因会传递给它们的后代而不会丢失，这样就可以通过后代生产出含有蜘蛛丝蛋白质的丝线。
因此，重组蚕繁殖后代数量增多则有可能大幅度提高含有蜘蛛丝蛋白质的丝线的产量。交配时选用与工业用蚕种进行交配，这样可能提高含有蜘蛛丝蛋白质的丝线的产量。这种情况下，适宜挑选已导入为用于生产含有目的蜘蛛丝蛋白质的丝线而经设计的基因的蚕并使其繁衍后代是必要的。此时，使用来自任意组织的细胞的DNA，通过PCR、Southern印迹等方法，对用于挑选重组蚕的标记基因以及用于生产含有蜘蛛丝蛋白质的丝线而经设计的基因的存在以及结构进行解析，这样就可以容易地判别出继承了重组蚕基因的后代。另外，当使用GFP等荧光蛋白基因时，用激发光照射蚕卵以及幼虫，通过检测荧光蛋白发出的荧光进行挑选。
向家蚕(Bombyx mori)卵中所含的细胞导入基因时，使用显微注射的方法较为适宜。当向卵进行显微注射时，不必向卵中细胞直接进行显微注射，仅向卵中进行显微注射就可以将基因导入。
本发明中的“与未基因重组的同种蚕生产的丝线相比，强度提高”是指反映出蜘蛛丝具有高强度这样的预期性质。具体就是，给丝线加重，直至断裂之前的断裂强度提高。
可以使用拉伸试验机(テンシロン)测定强度。断裂强度以直至断裂点之前的最大负荷(g)/细度(d)表示。细度的测定可以通过单位长度的负荷重量计算得到。可以判定转基因蚕所结茧得到的丝线的强度是否比非转基因蚕所结的茧得到的丝线强度有提高。优选地，与非转基因同种蚕所结茧得到的丝线相比，转基因蚕所结茧得到的丝线的强度提高大于等于1％。更为优选地，强度提高大于等于10％，进一步优选地，强度提高大于等于20％。
本发明中的“与未基因重组的同种蚕生产的丝线相比，伸长度提高”是指反映出蜘蛛丝具有高伸长度这样的预期性质。具体就是，给丝线加重，直至断裂之前的断裂伸长度提高。可以使用拉伸试验机(テンシロン)测定伸长度。可以判定转基因蚕所结茧得到的丝线的伸长度是否比非转基因蚕所结的茧得到的丝线的断裂伸长度有提高。优选地，与非转基因同种蚕所结茧得到的丝线相比，转基因蚕所结茧得到的丝线的伸长度提高大于等于1％。更为优选地，伸长度提高大于等于10％，进一步优选地，伸长度提高大于等于30％。
通过强度×(伸长度)1/2计算得到韧度，与非转基因同种蚕所生产的丝线进行比较时，优选地，与非转基因同种蚕所生产的丝线相比，韧度提高大于等于1％。更为优选地，韧度提高大于等于10％，进一步优选地，韧度提高大于等于40％。
本发明中的“使用含有蜘蛛丝蛋白质的丝线的织物”表示的是将蜘蛛丝蛋白质用于纵丝和/或横丝的织物。可以是仅由含有蜘蛛丝蛋白质的丝线组成的织物、也可以使用与非重组蚕的丝线形成的混纺丝、还可以使用与非丝线纤维形成的混纺丝、也可以作为被加工的表面处理剂使用，还可以作为被加工的非织造布使用。另外，也可以作为编织物的编织组织。对于织物的制作方法无特别限制，例举以下具体方法，平织、绫织、缎纹织、纱罗织等。
作为丝线中的蜘蛛丝蛋白质的存在形态，推测为分散和局部存在。局部存在是指在丝心蛋白层中重组蛋白部分集合在一起而存在。当局部存在时，电子显微镜观察乙酸双氧铀和铅的二重染色结果，观察到染色性不同的区域。或者将丝线用戊二醛固定、环氧树脂包埋、制成切片箔，使用针对重组蛋白的抗体行免疫电子显微镜观察，可以判定来源于重组蛋白的信号集中于丝心蛋白层中。当重组蛋白在丝线中分散存在时，经同样的免疫电子显微镜观察显示，在丝心蛋白层中来源于重组蛋白的信号不集中存在。
以蜘蛛丝蛋白质在丝线中分散存在为特征的本发明的丝线是包含组成丝线的丝心蛋白和蜘蛛丝蛋白质的复数蛋白(多聚体)的融合体。一般地，即便将两种多聚体混合，由于二者性质的差异而出现二者分离，二者的一些性质降低。对于丝线来讲就是，当组成丝线的丝心蛋白与丝心蛋白以外的重组蛋白混合、人工使其纤维化时，因二者的结晶性不同使得丝心蛋白与重组蛋白无法均一地混合，出现强伸长度这样的一些性质降低。通过本发明所揭示的方法，可以使组成丝线的丝心蛋白与丝心蛋白以外的重组蛋白均匀地混合，并且可以获得以重组蛋白在丝线中分散存在为特征的含有重组蛋白的丝线。该丝线没有降低丝心蛋白强伸长度，并且重组蛋白具有的期望性质可赋予该丝线。
以下通过实施例进一步详细说明本发明，但是，本发明不局限于实施例所述的内容。
实施例
实施例1家蚕(Bombyx mori)的基因组DNA制备
解剖5龄3日的蚕，取出后部的丝腺组织。用1×SSC洗净后，加入200μl DNA提取缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA pH8.0，100mM NaCl)。加入蛋白酶K(终浓度200μg/ml)，将组织在研磨器中充分研磨，再次加入350μl DNA提取缓冲液、60μl 10％SDS，混合。50℃保温2小时。加入500μl Tris-HCl饱和酚(pH8.0)，混合10分钟后，4℃10,000转/分钟离心5分钟，回收上清液。上清液用酚/氯仿处理，基因组DNA用乙醇进行沉淀。用加入RNase的灭菌水溶解使成100μg/ml，制备成稀释的基因组DNA溶液。
实施例2基因的制备
利用已知序列，制备其两端序列的引物，以适宜的DNA源作为模板通过PCR而获得目标基因。为了后面的基因操作，在引物的端部添加限制性酶切位点。
以家蚕基因组DNA为模板，使用引物5(序列编号5)和引物6(序列编号6)这两种引物进行PCR，从而获得丝心蛋白H链启动子·丝心蛋白H链基因第一外显子·第一内含子·第二外显子区域(GeneBank登录号AF226688碱基编号第62118～63513号：以下称为HP区域)。
以家蚕基因组DNA为模板，使用引物7(序列编号7)和引物8(序列编号8)这两种引物进行PCR，从而获得丝心蛋白H链上游启动子·丝心蛋白H链基因第一外显子·第一内含子区域(GeneBank登录号AF226688碱基编号第57444～62927号：以下称为HUP区域)。
以家蚕基因组DNA为模板，使用引物9(序列编号9)和引物10(序列编号10)这两种引物进行PCR，从而获得丝心蛋白H链C末端部分域基因·丝心蛋白H链多聚A信号区域(GeneBank登录号AF226688碱基编号第79099～79995号：以下称为HC区域)。
使用KODplus(东洋纺(株)生产)，按照所附方法进行PCR。也就是，以家蚕基因组DNA为模板，加入100ng家蚕基因组DNA，并加入以下各种试剂使其分别为：每一引物50pmol、10μl所附的10×PCR缓冲液、1mM MgCl2、0.2mM dNTPs、2单位KODplus，总量为100μl。使用Perkin-Elmer公司的DNA热循环仪，在以下条件下进行30次循环反应，DNA变性条件为94℃、15秒，引物的退火条件为55℃、30秒，延伸条件为68℃、60秒至300秒。
将以上反应液在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，按照通常方法提取、制备以下各DNA片段，约1.4kbp的HP区、约5.5kbp的HUP区、约0.8bp的HC区。上述DNA片段在多核苷酸激酶(宝酒造(株)生产)的作用下磷酸化后，用BamHI切割，之后使用T4DNA聚合酶按照确定方法进行钝端化，进而使其连接至脱磷酸化处理后的pUC19载体，使用宝酒造(株)生产的DNA Ligation Kit Ver.2于16℃过夜反应。按照常规方法将其用于大肠杆菌的转化，将获得的克隆在上述相同条件下行PCR，以便确认得到的转化体中插入了PCR片段。这些质粒进行序列测定以便确认得到的片段是各基因的碱基序列。
从ATCC以下株可能取得蜘蛛丝基因。大肠杆菌(E.coli)FP3227 69326 1993年6月15日、大肠杆菌FP2193 69327 1993年6月15日、大肠杆菌FP3350 69328 1993年6月15日。
另外，根据Reviews in Molecular Biology 74(2000)105-109或Appl.Microbiol.Biotechnol.47(1997)23-39所公开的方法可以采用人工合成的寡核苷酸制备。也就是，在人工合成的寡核苷酸两端，将BglII和BamHI的限制性酶识别部位设计在同一阅读框内，两者顺次连接可制备不同大小的蜘蛛丝基因。本实施例中序列编号1所述的DP-1B.33多肽重复4次得到DP4基因片段、DP-1B.33重复8次得到DP8基因片段、DP-1B.33重复12次得到DP12基因片段、DP-1B.33重复16次得到DP16基因片段。
按照相同的方法制备编码序列编号2所述多肽的寡核苷酸，将其连接构建编码如下蛋白质的质粒，该蛋白质是序列编号2所述多肽重复8次而形成，将质粒用BglII和BamHI切割，制备AEX基因片段。
实施例3用于导入基因的质粒的制备
利用pigA3GFP(Nature Biotechnology 18，81-84，2000)作为基因导入用质粒。也就是，从美国专利第6218185号公开的质粒p3E1.2中除去编码转座酶的区域，在该部分插入A3启动子(GenBank登录号U49854的第1764～2595号碱基)以及来源于pEGFP-N1载体(Clontech公司生产)的GFP以及来源于SV40多聚A添加序列(GenBank登录号U55762的第659～2578号碱基)的载体就是pigA3GFP，该载体可从独立行政法人农业生物资源研究所分给。位于该A3启动子上游侧的Xho I部位平端化，之后插入为了产生含有蜘蛛丝蛋白质的丝线而设计的基因。
本实施例中的经设计的用于生产含有蜘蛛丝蛋白质的丝线的基因组成是HP·DP16，12，8，4·HC以及HP·AEX·HC，进一步地为HUP·DP8，4·HC。
具体方法如下所示。
图1显示HP·DP16，12，8，4·HC以及HP·AEX·HC的制备策略。将实施例2制备的具有HP区的质粒与具有HC区的质粒用BamHI及SalI处理，将约1.4kbp片段与3.6kbp片段连接。用BamHI处理后脱磷酸化的质粒与通过实施例2获得的两端末端添加BglII以及BamHI的DP16片段、DP12片段、DP8片段、DP4片段以及AEX片段连接。对连接部位的碱基序列进行确认，连接部在同一框内读码时应顺序合适。各质粒用AscI处理，将含有编码蜘蛛丝蛋白质基因的DNA片段连接在经XhoI处理后补平的pigA3GFP质粒，从而制备出具有各种基因结构HP·DP16·HC、HP·DP12·HC、HP·DP8·HC、HP·DP4·HC、HP·AEX·HC的导入各种基因的载体。
图2显示HUP·DP8，4·HC的制备策略。将具有实施例2制备的HUP区的质粒用SphI和XhoI处理，得到了约5.5kbp的片段。如图2所示，将其与HP·DP8·HC、HP·DP4·HC制备过程中得到的质粒经SpHI和XhoI处理所获得的片段连接。确认连接部位的碱基序列，确认无碱基缺失、插入发生。各质粒用AscI处理，将含有编码蜘蛛丝蛋白质基因的DNA片段连接在经XhoI处理后平端化的pigA3GFP质粒，从而制备出具有各种基因结构HUP·DP8·HC、HUP·DP4·HC的导入各种基因的载体。
实施例4转基因蚕的制备
将实施例3所述的基因导入用载体以及生产piggyBac转座酶蛋白的辅助质粒DNA(pHA3PIG)(Nature biotechnology 18，81-84，2000可从农业生物资源研究所分与)配制成各含有200μg/ml的0.5mM磷酸缓冲液(pH7.0)·5mM KCl溶液，产卵后4小时内向500个蚕卵进行显微注射3至20nl上述溶液。pHA3PIG缺少piggyBac转座子的一个反向重复序列和5’侧翼区、转座酶基因的前导序列，取而代之的是整合有蚕肌动蛋白基因的5’侧翼区和前导序列。虽然pHA3PIG具有在肌动蛋白启动子的作用下产生piggyBac转座酶蛋白的功能，但是，由于缺少piggyBac转座子的一个反向重复序列，其自身DNA无法转移。从上述蚕卵孵化出的幼虫饲养得到的成虫(G0)进行群内交配，得到的后代(G1)可观察到水母绿色荧光蛋白(GFP)的荧光，筛选染色体中导入了水母绿色荧光蛋白基因的蚕。上述结果是，得到了通过水母绿色荧光蛋白的作用发射荧光的转基因蚕。转基因体的挑选就是，以内部交配得到的G1幼虫体内的GFP荧光为指标进行筛选。在后部丝腺组织中肌动蛋白启动子控制下的基因表达极低，另外，不与丝心蛋白L链蛋白结合，而这对于自丝腺组织向丝线中分泌是重要的。也就是说，本发明中的含有蜘蛛丝蛋白质的丝线中，不含有GFP。本发明中挑选转基因蚕是不以茧以及丝线中的GFP作为荧光指标。转基因蚕的制备结果如表1所示。
表1转基因蚕的制备结果
| 基因结构 | 接受注射的卵的数量 | 孵化的卵的数量 | G1总数量 | GFP阳性G1数量 | 转化率％ |
| HP·DP16·HC | 500 | 80 | 32 | 3 | 4.7 |
| HP·DP12·HC | 1056 | 169 | 51 | 8 | 7.8 |
| HP·DP8·HC | 500 | 202 | 93 | 14 | 7.1 |
| HP·DP4·HC | 500 | 171 | 81 | 13 | 8.2 |
| HP·AEX·HC | 500 | 211 | 96 | 15 | 7.8 |
| HUP·DP8·HC | 1824 | 544 | 170 | 4 | 1.2 |
| HUP·DP4·HC | 1152 | 414 | 139 | 7 | 2.5 |
实施例5通过Southern杂交确认蜘蛛丝蛋白质基因的导入
在导入HP·DP8·HC、HP·DP4·HC基因的G1蚕中任意挑选出显示GFP荧光的蚕，按照实施例1所述方法制备基因组DNA，用EcoRI进行限制性酶切，电泳后进行膜印迹。探针选用Amersham Pharmacia公司生产的Gene-ImageTM Random prime labelling and detection module，对DP8/BglII，BamHI片段标记后使用。按照所附方法检测编码蜘蛛丝蛋白质的基因。结果如图3所示。所研究的所有显示GFP荧光的蚕中，检测到了编码蜘蛛丝蛋白质的基因(以箭头表示)。另外，信号的大小有差异，考虑是由于在染色体上随机插入造成的。
实施例6转基因蚕所结茧的分析
下面进行丝线所含蜘蛛丝蛋白质的检测、含量测定。取非转基因蚕(WT)以及转基因蚕(导入HP·DP16·HC、HP·DP12·HC、HP·DP8·HC、HP·DP4·HC、HP·AEX·HC、HUP·DP8·HC、HUP·DP4·HC基因的蚕)的茧各10mg，加入4ml 60％LiSCN搅拌，之后室温静置过夜使茧溶解。用8M尿素·2％SDS·5％2-巯基乙醇将其稀释10倍作为样品，进行SDS-PAGE后，使用银染试剂盒(第一化学药品株式会社生产)按照所附方法检测蜘蛛丝蛋白质。用分子成像仪(BioRad公司生产)测定上述结果的信号强度，使用猫干扰素作为已知浓度的蛋白质，并与样品信号强度比较，从而测定样品蛋白质的含量。比较信号强度时采用BioRad公司生产的分子成像仪FXPro。
进一步地，使用ECL PlusTMWestern blotting Kit(AmershamPharmacia公司生产)，按照所附方法检测蜘蛛丝蛋白质。DP的检测可使用针对序列编号11所示CGAGQGGYGGLGSQAGRG肽的具有充分抗体价的特异性肽抗体，AEX的检测可使用针对序列编号12所示CGPGQQGPGGYGPGQQGPS肽的具有充分抗体价的特异性肽抗体，这些抗体均使用兔制备，采用上述抗体按照所附方法进行检测。也就是，将印迹的膜置于封闭液(5％脱脂奶·0.1％吐温20·PBS)中4℃封闭过夜。将膜用TPBS(0.1％吐温20·PBS)清洗2次，用TPBS稀释1000倍的抗蜘蛛丝蛋白质抗体室温处理1小时。将膜用TPBS清洗2次，进一步地用TPBS清洗5分钟共3次。之后，用TPBS稀释10000倍后，用HRP标记的抗兔IgG抗体室温处理1小时。将膜用TPBS清洗2次，进一步地用TPBS清洗5分钟共3次后，加入ECL PlusTM Western blotting Detection System(Amersham Pharmacia公司生产)的检测试剂(溶液A+溶液B)。用HyperfilmTMECLTM对发光底物曝光、显影。导入HP·DP16·HC、HP·DP8·HC、HP·DP4·HC、HP·AEX·HC、HUP·DP8·HC、HUP·DP4·HC基因结构的蚕所结茧的分析结果如图4所示。蜘蛛丝蛋白质的分子量与根据基因结构预测的分子量一致。另外，蜘蛛丝蛋白质所占的比例为重量百分比约0.1％至15％。进一步地，相当于丝心蛋白L链蛋白质的分子量大小增加，可检测到与丝心蛋白L链蛋白质呈二硫键状态的信号(以星号显示)。具有HUP基因结构的(HUP·DP8·HC、HUP·DP4·HC)与具有HP基因结构的(HP·DP8·HC、HP·DP4·HC)相比，前者蜘蛛丝蛋白质的含量增加。对于丝线中是否含有GFP，可使用GFP抗体(Cosmo Bio公司生产)通过Western分析进行判断，但是，未检测到GFP。
导入HP·DP16·HC、HP·DP12·HC、HP·DP8·HC、HP·DP4·HC、HP·AEX·HC、HUP·DP8·HC、HUP·DP4·HC基因结构的蚕所结茧(茧丝+蛹)的平均重量的测定采用雄10粒雌10粒进行，并比较。进一步地，测定蜘蛛蛋白的含量(重量％)。上述结果如表2所示。除了HP·AEX·HC外，未见茧的重量有大的改变。这表明DP蜘蛛丝蛋白质并不阻碍蚕丝心蛋白的纤维化。认为这是因为基因导入并非经同源重组，而是通过转座子进行的，蚕丝心蛋白H链基因并没有发生突变的结果。
表2
| 基因结构 | 平均重量mg | 蜘蛛丝蛋白质含量％ |
| 非重组 | 100 | 0 |
| HP·DP16·HC | 94 | 0.5 |
| HP·DP12·HC | 104 | 2 |
| HP·DP8·HC | 104 | 0.5至5 |
| HP·DP4·HC | 102 | 1至3 |
| HUP·DP8·HC | 77 | 4至18 |
| HUP·DP4·HC | 85 | 5至15 |
| HP·AEX·HC | 34 | 0.5至1 |
实施例7丝线的制备
将作为对照的非转基因蚕所结的茧，以及作为样品的导入HP DP8 HC基因结构的蚕所结的茧，在80℃进行干燥，使重量达到原重量的40％。将茧在3％Na2CO3溶液中于95℃煮2分钟，随后，于60℃煮3分钟，再次于95℃煮3分钟。在40℃的温水中清洗后，使用手工摇纱草缫丝器(齐藤机料)，通常从40粒茧中缫丝。得到非重组蚕丝线约1100m、重组蚕(HP·DP8·HC)丝线约1200m。
将得到的丝线在0.1％Na2CO3溶液中加温至60℃，随后，在1％橄榄油肥皂水溶液中煮沸1小时，用0.1％Na2CO3溶液清洗后，水洗，进行丝线精制。60℃干燥，得到精制的非重组丝线和精制的HP·DP8·HC丝线。精制前的丝线和精制后的丝线的扫描电子显微镜照片如图5(1500倍)所示。可见除去了表面的丝胶蛋白。另外，精制前后重量的对比结果为，非重组蚕丝线和HP·DP8·HC丝线的减练率均为16％，考虑是因为去除了丝胶蛋白。
实施例8丝线特性的测定
特性测定中，使用含有蜘蛛丝蛋白质的丝线，即按照实施例7所述方法制备的导入HP·DP8·HC基因结构的蚕所生产的丝线(HP·DP8·HC)，还使用了非重组蚕的丝线，它们于精制前和精制后分别接受特性的测定。在此，丝线中所含蜘蛛丝蛋白质的含量为，HP·DP8·HC为5％，非重组蚕丝线为0％。
细度的测定是根据每90m的重量计算得出。使用拉伸试验机(テンシロン)测定机械性能，抓点间隔20cm，牵引速度20cm/分钟，计算各10个样品的平均值。特性的比较结果如表3所示。
表3
| 非重组丝线(精制前) | HP·DP8·HC丝线(精制前) | 非重组丝线(精制后) | HP·DP8·HC丝线(精制后) | |
| 细度(d) | 57.7 | 87.7 | 43 | 56 |
| 强度(g/d) | 3.78 | 3.93 | 2.59 | 3.53 |
| 伸长度(％) | 32.6 | 37.8 | 13.2 | 19.1 |
| 韧度※ | 21.5 | 24.1 | 9.4 | 15.4 |
※韧度是通过强度×(伸长度)1/2计算得到
在所有的试验项目中，与非重组丝线相比，HP·DP8·HC丝线的特性均提高。特别是虽然经过了用于精制的加温处理，强度提高大于等于30％、伸长度提高大于等于40％、韧度提高大于等于60％。考虑这是精制后存留的丝心蛋白层含有的蜘蛛丝蛋白质的效果。
实施例9用含有蜘蛛丝蛋白质的丝线制作织物
使用HP·DP8·HC丝线制作布。取HP·DP8·HC丝线2根200T/m单捻，绫织法制作织物。
实施例10免疫电子显微镜观察
将导入HP·DP8·HC基因的转基因蚕与非重组蚕所结茧作为样品，使用针对寡聚肽CGAGQGGYGGLGSQAGRG具有充分抗体价的特异性肽抗体(DP抗体)，进行免疫电子显微镜观察。样品用2％戊二醛-0.1％二甲胂酸缓冲液室温固定1小时，然后用环氧树脂EPON81260℃聚合包埋48小时。用超薄切片刀制备超薄切片。使用1％BSA/PBS+1.5％山羊血清室温封闭30分钟。使用作为第一抗体的稀释5000倍的DP抗体4℃过夜处理。用1％BSA/PBS室温清洗10分，共清洗3次。使用作为第二抗体的anti-rabbit IgG Goat-Poly 10nm(British biocell international，LTD生产)室温处理1小时。1％BSA/PBS室温清洗10分钟，共清洗3次。用乙酸双氧铀和铅室温下二重染色，各5分钟，进行电子显微镜观察。图6显示非重组蚕生产的丝线的纵断面切片的结果。无法确认丝线中丝心蛋白层以及丝胶蛋白层存在蜘蛛丝蛋白质。图7显示导入HP·DP8·HC基因的转基因蚕生产的丝线的纵断面切片的结果。在导入HP·DP8·HC基因的转基因蚕生产的丝线的纵断面切片中，可确认在丝线中的丝心蛋白层可见作为黑色斑点的蜘蛛丝蛋白质分散存在。未观察到在一部位集中存在的形态。
产业上的可利用性
本发明所制备蜘蛛丝和丝线的复合丝(hybrid silk)由于保持了蜘蛛丝蛋白质高强度、高伸长度的特性，因此，可用于航空、宇宙开发、被服制造、绳索、医疗用线等各行业。
序列表
<110>东丽株式会社
<110>纳幕尔杜邦公司
<120>含有蜘蛛丝蛋白质的丝线以及产生该丝线的蚕
<130>FP1085SUBARU
<150>JP 2004-005489
<151>2004-01-13
<160>12
<210>1
<211>101
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly
1 5 10 15
Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala
35 40 45
Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln
50 55 60
Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln
65 70 75 80
Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly
85 90 95
Tyr Gly Gly Leu Gly
100 101
<210>2
<211>96
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Ser Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ala Gly Gly Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Gly Gly Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly
35 40 45
Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly
50 55 60
Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly
85 90 95 96
<210>3
<211>33
<212>PRT
<213>家蚕(Bombyx mori)
<400>3
Arg Ser Tyr Asp Tyr Ser Arg Arg Asn Val Arg Lys Ash Cys Gly Ile
1 5 10 15
Pro Arg Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys Val Asn
20 25 30
Cys
33
<210>4
<211>35
<212>PRT
<213>家蚕
<400>4
Met Arg Val Lys Thr Phe Val Ile Leu Cys Cys Ala Leu Gln Tyr Val
1 5 10 15
Ala Tyr Thr Asn Ala Asn Ile Asn Asp Phe Asp Glu Asp Tyr Phe Gly
20 25 30
Ser Asp Val
35
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
aatggcgcgc cgggagaaag catgaag 27
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
catggatccg acatcactcc caaaatagtc 30
<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
cccaatttgg cgcgcctcaa gacatccttg a 31
<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
gaatgctacc tcgaggttat gaaaatg 27
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
gctggatccc gcagttacga ctattctcgt cgt 33
<210>10
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
cttggcgcgc cacgacgtag acgtatagcc atcgg 35
<210>11
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<400>11
Cys Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Ala Gly
1 5 10 15
Arg Gly
18
<210>12
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<400>12
Cys Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln
1 5 10 15
Gly Pro Ser
19
Claims (26)
1、含有蜘蛛丝蛋白质的丝线，特征在于：其是通过具有一对丝心蛋白H链基因的转基因蚕制备的。
2、权利要求1所述的含有蜘蛛丝蛋白质的丝线，其特征在于：该丝线本质上保留了丝线丝心蛋白H链蛋白质的基本结构。
3、权利要求1或2所述的丝线，其特征在于：蜘蛛丝蛋白质在丝心蛋白蛋白质中分散存在。
4、权利要求1至3中任意一项所述的丝线，其特征在于：蜘蛛丝蛋白质与包含于丝心蛋白H链蛋白质中的多肽融合。
5、权利要求4所述的丝线，其特征在于：蜘蛛丝蛋白质插入至丝心蛋白H链蛋白质的N末端部分与C末端部分之间，通过包含于C末端部分的半胱氨酸与丝心蛋白L链蛋白质形成二硫键。
6、权利要求1至5中任意一项所述的丝线，其中蜘蛛丝蛋白质的含量为0.1％至25％重量百分比。
7、权利要求6所述的丝线，其中蜘蛛丝蛋白质的含量为1％至15％重量百分比。
8、权利要求7所述的丝线，其中蜘蛛丝蛋白质的含量为1％至10％重量百分比。
9、权利要求1至8中任意一项所述的丝线，其特征在于：蜘蛛丝蛋白质包含序列编号1的肽或者包含在序列编号1中具有一个或多个氧基酸缺失、替换或添加并具有蜘蛛丝蛋白质特性的肽。
10、权利要求9所述的丝线，其特征在于：包含权利要求9所述的肽重复3至30次的蜘蛛丝蛋白质。
11、权利要求10所述的丝线，其特征在于：包含权利要求9所述的肽重复4至16次的蜘蛛丝蛋白质。
12、权利要求1至8中任意一项所述的丝线，其特征在于：蜘蛛丝蛋白质包含序列编号2的肽或者包含在序列编号2中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加并具有蜘蛛丝蛋白质特性的肽。
13、权利要求12所述的丝线，其特征在于：包含权利要求12所述的肽重复3至30次的蜘蛛丝蛋白质。
14、权利要求13所述的丝线，其特征在于：所包含权利要求12所述的肽重复4至16次的蜘蛛丝蛋白质。
15、权利要求1至8中任意一项所述的丝线，其特征在于：蜘蛛丝蛋白质含有权利要求9所述的肽以及权利要求12所述的肽这两者。
16、权利要求5至15中任意一项所述的丝线，其特征在于：与蜘蛛丝蛋白质融合的丝心蛋白H链蛋白质的C末端部分为序列编号3的肽或者为在序列编号3中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加并具有2或3个半胱氨酸的肽。
17、权利要求5至16中任意一项所述的丝线，其特征在于：与蜘蛛丝蛋白质融合的丝心蛋白H链蛋白质的N末端部分为序列编号4的肽或者为在序列编号4中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的肽，编码所述肽的基因具有通过启动子增强外源蛋白质表达功能的肽。
18、权利要求1至17中任意一项所述的丝线，其特征在于：蜘蛛丝蛋白质不与成为选择性标记的蛋白质融合。
19、制备权利要求1至18中任意一项所述丝线的转基因蚕，其具有一对丝心蛋白H链基因，且编码蜘蛛丝蛋白质的基因导入一对丝心蛋白H链基因之外的区域。
20、权利要求19所述的转基因蚕，其特征在于：具有用于使转基因蚕表达蜘蛛丝蛋白质的丝心蛋白H链基因启动子。
21、权利要求19所述的转基因蚕，其特征在于：具有用于使转基因蚕表达蜘蛛丝蛋白质的丝心蛋白H链基因启动子及其上游区域。
22、权利要求20或21所述的转基因蚕，其特征在于：丝心蛋白H链基因第一外显子。第一内含子。第二外显子区域的全部或部分连接在丝心蛋白H链启动子下游。
23、权利要求19至22中任意一项所述的转基因蚕的制备方法，所述方法利用了转座子。
24、权利要求23所述的转基因蚕的制备方法，其特征在于：转座子为piggyBac转座子。
25、丝线的制备方法，其特征在于：通过权利要求19至22中任意一项所述的转基因蚕制备。
26、织物，其使用了权利要求1至18中任意一项所述的丝线。
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