CN1200145A - 高强度蛛丝蛋白的克隆方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产生编码来自产丝蜘蛛的丝蛋白质之DNA片段的方法。本发明还涉及编码该蛛丝蛋白质的DNA序列。本发明还进一步涉及用上述DNA序列产生蛛丝蛋白质的方法。克隆和生产本发明蛋白质的方法可适用于全部产丝蜘蛛。通过这些方法生成的克隆生产商业用量的高分子量丝蛋白质。由于从这类蛋白制造的丝有优越的强度特性,本发明克隆的丝蛋白质具有可观的产业价值。

Description

高强度蛛丝蛋白的克隆方法
发明领域
本发明涉及产生编码蛛丝蛋白质的DNA片段的新方法。本发明还涉及编码蛛丝蛋白质的DNA序列。本发明还进一步涉及用上述DNA序列生产蛛丝蛋白质的新方法。本发明还涉及纯化这些蛛丝蛋白质和用它们制造纤维和薄膜的方法。
通过本发明所开发的克隆生产商业用量的高分子量蛛丝蛋白质，其分子量范围从90,000到250,000以上，其分子量是从Nephilaclavipes所获得的天然主要ampulate(拖丝)蛛丝蛋白的40％到100％以上。由于从这些高分子量蛋白质制造的丝具有优越的物理特性，如高抗张强度和很大的弹性，本发明所克隆的丝蛋白质有可观的产业价值。
已通过本发明的几种方法克隆了这些蛛丝蛋白质并已在E.coli表达系统中产生这些天然序列的蛛丝克隆。然后已将这些表达系统用于生产各种部分或完整长度的天然蛛丝蛋白质，这些蛋白质已经以每升细胞量超过2克的水平表达。然后纯化这些蛛丝蛋白质并用于许多目的如精纺纤维，形成膜以及丝织有关的其他应用。
发明背景
众所周知，丝是由许多目的动物产生的(例如，昆虫，蜘蛛和蛆)。例如蜘蛛产生天然的高抗张强度的网和拖丝。另一方面，蚕虽然以高产率产生丝却具有被认为物理性质不如蛛丝蛋白质的丝蛋白质。例如蚕丝蛋白质具有的抗张强度远低于蛛丝蛋白质的抗张强度。球形织工(Orb weaver)和其他蜘蛛虽然自然产生少量的丝线(经济上不足以商业化)，却是强的丝线。事实上，蛛丝可比Kevlar的丝强数倍(9.5×104/3×104Jkg-1)。这些优越的强度特性使蛛丝蛋白丝线成为降落伞，帆，防护服和需要强力丝线的其他应用的优先选择。此外，这些蛛丝用做许多重金属和包括生物学武器在内的有机物的吸收膜。它们还有作为选择性结合DNA的吸收剂和作为许多其他化学物质，调料和香料的吸收剂的用途。
虽然可设想从培养蜘蛛可生产蛛丝，但几个方面的原由都说明这是行不通的。首先，除很难养育之外，在生长密度很高时蜘蛛会吃掉它们的近邻。其次，蜘蛛仅产生少量丝蛋白使得即使微克量的生产也惊人的昂贵。由于这些限制，生产商业用量的蛛丝蛋白质的唯一可行方法是将该蜘蛛基因克隆到一个可用来大规模生产的载体中。本发明达到了这个目的。
先前通过制造短的碱基对片段然后使用大量重复单位的方法已生产出合成的丝蛋白基因。已通过此方法得到有中等分子量的蛋白质(范围在20,000到80,000)。为达到各种物理性质，对这个方法做了改变并已生产出不同序列的合成蛋白质。例如，以前的工人已经使用通过用短的天然丝蛋白质并改变其序列而得到的序列。
然而这些先前使用的方法产生的材料次于天然丝。而且，在某些情况下，这种先前的技术还产生了不适合长期使用的克隆，而长期使用是商业应用所需要的。因此，本发明的目的之一是克服聚合短DNA序列所发生的上述问题。本发明通过产生编码高强度，高分子量丝蛋白质的长DNA而达到了这个目的。
由于高强度大的ampulate(拖丝)蜘蛛丝有这种潜力，已经研究了球形织工如Nephila clavipes的丝以期了解其强度的分子基础。研究人员还试图通过嵌入与蛛丝纤维高强度相关的重复元件，用有限的成功来克隆该天然蛋白或制造合成丝基因。
然而，伴随克隆丝蛋白有许多问题。首先，天然氨基酸序列由许多重复亚单位组成，因此没有许多可用于克隆该天然基因的单一位点。文献表明Nephila clavipes的拖丝蛛丝蛋白羧基端是显示出单一性的唯一区域。这导致了仅有少数克隆该天然基因的在先尝试，结果更多是制造合成蛋白的在先尝试。然而，由于被模拟的DNA序列的重复性，制做稳定的克隆及其产生的合成蛛丝蛋白质存在许多问题，例如有大量重复(特别是GCA重复)的DNA是不稳定的，因为转录错误和高几率重组缺失导致DNA经常改变。由于这些问题，许多克隆的完整性便成为疑问。
在自然界，丝基因是十分稳定的，因为重复和非重复区是混杂的。不幸的是，合成的基因没有将这种结构借给自身重组，特别是重组缺失的高度不稳定的。它们是因为没有足够量的基因被克隆而无法得到稳定的克隆，因此没有得到可构成其天然稳定性基础的非重复区。因此，获得有非重复及重复区的稳定克隆即是本发明的目的之一。
克隆拖丝蛛丝的另一个问题是该基因的大小。蛛丝蛋白质一般是200,000kDa或更高并且相应的基因还至少有一个内含子。这样，设想DNA片段的大小将是界于5-10Kb范围再加上任何内含子。用目前技术，这么大的基因仍是十分难于克隆的。本发明克服了这个困难。
由于其机械强度性质，大部分注意力被放在克隆蛛丝蛋白质方面。在了解Nephila clavipes拖丝丝方面的一个主要进展是由Xu等取得的(Proc.Natl.Acad.Sci.87：7120，1990)。Xu等确定了来自一个部分克隆的蜘蛛拖丝丝的重复序列的一部分。虽然这个重复单位编码达34个氨基酸，它不是完全保守的，因为在某些重复中该序列有缺失和改变。
然而，Xu等人发现在该序列中有两个重要区域--赋予蛛丝某些重复区性质的重复区和一个非重复(羧基端)区。Hinan和Lewis(J.Biol.Chem.267：19320，1992)报道了一个第二cDNA克隆，它被推测是来自第二蜘蛛蛋白。该序列有一个类似于Xu等人发现的重复区和一个羧基末端的非重复末端。Hinan和Lewis重复单位较长，它编码51个氨基酸并是高度可变的。
在由Lewis等人于1991年10月23日在欧洲专利申请EP0452925A2，发表的蛛丝蛋白质的表达中，只有小蛋白质片段以低产量被明显产生。这些小蛋白质片段可能不具有商业价值因为良好的机械性质仅来自于大蛋白质，特别是接近全长的大蛋白质。Lombardi等于1991年10月31日发表的国际专利申请  WO91/16351还以十分低的产量生产出重组蛛丝蛋白，但由于其小分子量这些克隆表现出低机械强度。
还推测因此而开发的蛛丝克隆不代表天然基因的真实拷贝。这一点通过许多研究得到证实例如Beckwith & Arcidiancono(J.Biol.Chem.269(9)：6661，1994)表明两种蜘蛛蛋白质有高同源性并且事实上可能代表相同的蛋白质。
虽然许多研究者已承认天然表达系统作为丝变异体是有用的。这些系统不能解决密码子偏爱方面的难题。如果认为使用高保守重复区可产生改进的蛋白质，这些合成的基因表达系统遇到DNA稳定性问题，低的表达速率和生成的蛋白质性质不如天然蛛丝的性质称心的麻烦。因此本发明的一个目的是解决这些问题。
Ferrari等在1988年5月19日发表的国际专利申请WO88/03553公开了合成的基因，这类基因产生的蛋白质具有丝-样性质。此外，一些拟天然纤维蛋白质的短的重复序列蛋白质由Cappello等开发出来，它们被发表在1990年5月17日国际专利申请WO90/05177。Floyd(国际专利申请WO94/29450，1994年12月22日发表)还试图用一些Xu等发现的天然重复单位开发一种蛛丝合成基因。然而所有这些克隆具有小的分子量从而使它们不具有所期望的天然蛛丝的性质。
本发明涉及部分和全长的蛛丝蛋白克隆的新合成。某些部分长度克隆还被聚合成分子量达到和超过天然蛛丝分子量的其他克隆。本发明已使开发具有全范围性质的天然丝样克隆成为可能。熟悉分子生物学的人员可使用这些克隆作为创建其他有用的丝性质，如强度，流动点，黏度和弹性的克隆的起点。而且，这些新序列可被用做设计其他合成基因的起点。因为某些蜘蛛将颜色或色素结合到其丝蛋白质中，这些方法还可容许天然着色的蛋白质。
本发明还涉及转染的宿主在培养基中发酵的独特化学方法。通过细菌发酵生产丝蛋白质的主要难题之一是蛋白质被蛋白酶部分降解。事实上，由蛋白酶产生的蛋白质降解速率在某些情况下可大于高分子量丝蛋白表达的速率，由此使商业操作成为不可实现的。本发明克服了这个潜在难题。
这些以及其他目的和本发明的优点从下面描述中被表现出来。
附图简述
图1显示编码蛛丝蛋白的2KbDNA序列
发明概述
本发明涉及生产编码丝蛋白的DNA片段的方法，其步骤包括(i)选择从产丝蜘蛛得到的靶DNA，该靶DNA包括多个重复和非重复区；(ii)选择至少10个核苷酸的单链DNA引物，该引物有一个与靶DNA中一个区域互补的DNA序列；和(iii)将该DNA引物反复与变性的靶DNA结合，并将结合的DNA引物和靶DNA核苷酸及有校读能力的DNA聚合酶一起温孵，以产生DNA片段。其中DNA片段与所述靶DNA互补并至少是2Kb。在更具体的实施方案中，可产生至少5Kb的DNA片段。
在上述产生编码丝蛋白的DNA片段之方法的进一步实施方案中，该方法包括使用两个不同的DNA引物代替一个引物的步骤。在仍是用一个单链DNA引物或两个不同的DNA引物产生DNA片段的该方法之进一步实施方案中，该靶DNA是通过反转录编码蛛丝的全长mRNA制得的cDNA，并且该方法进一步包括步骤(i)在该方法所制得的第一链cDNA的氨基末端加入一个引物位点和(ii)用该cDNA的多聚T区作为第一聚合酶引发区。仍是在这些生产DNA片段的方法的进一步实施方案中，用联接盒在该DNA的未知末端创建第二引物位点。仍是在进一步实施方案中，用末端转移酶在该DNA的未知末端创建第二引物位点以产生一个选自包括多聚dT，多聚dA，多聚dG和多聚dC的引物位点。
产生DNA片段的上述方法所用DNA引物可选自由起始和终止序列(i)-(xx)所代表的DNA给出如下：
         GGCGAATTCGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT；
   (ii)  GGCGAATTCACCCTGGGCTTGATAAACTGATTGAC；
  (iii)  GCATGCACGCATGGTGCATGGATGC；
   (iv)  TTCGAATTCATGGGCCCTGGACAACAAGGACCATCTGGACCT；
    (v)  GGAAGGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATG；
   (vi)  GAYGAYGGNAAYGCNGT；
  (vii)  TGNTGNCCSGTTCG；
 (viii)  CGSCGKCGSCCACGSCCSCG；
   (ix)  GTTAAATGTAAAATCAAGAGTTGCTAA；
    (x)  GGCCAATCTCTTTTGAGTGCATTTTAA；
   (xi)  TAAGCAACTCTTGATTTTACATTTAAC；
  (xii)  TTAAAATGCACTCAAAAGAGATTGGCC；
 (xiii)  TCAGCAGAATCTGGACAACAAGGCCCA；
  (xiv)  CCNCGNCCNCTYCC；
   (xv)  GGTGCAGCAGCAGCAGCTGCWGG；
  (xvi)  GGTGGTGCCGGACAAGGAGGMTATGGAGGWCTTGGA；
 (xvii)  GGWGGACGAGGTGGATTA；
(xviii)  GATAAAAAGAAATATGCTGCAGAACTTCACTTGGTTCAC；
  (xix)  CARGCNGGNGCNGCNGSNGGNGGNTTYGGNCC；and
   (xx)  GGNGGNGCNGCNGGNCARGCNGGNGCNGCNGSNGGNGGNTTYG
         GNCCNGGNGCNGGNGGN，
其中N＝G，A，T，C；V＝G，A，C；B＝G，T，C；H＝A，T，C；D＝G，A，T；K＝G，T；S＝G，C；W＝A，T；M＝A，C；Y＝C，T；和R＝A，G。
产生DNA片段的该方法的另一实施方案中，通过与至少含上述序列(i)-(xx)之一的DNA探针杂交选择该靶DNA，该探针被可逆结合到一个支持物上以富集编码丝的DNA片段。
在产生编码丝蛋白DNA片段的另一方法实施方案即被称作聚合方法中，该方法包括步骤(i)选择一个编码从产丝蜘蛛获得的丝蛋白的靶DNA，该靶DNA包括多个重复和非重复区；(ii)选择第一对不同的DNA引物，两引物与该靶DNA中的一个区域互补，并且第一对引物中至少有一个由序列(i)-(xxvi)所代表；(iii)通过第一对DNA引物与变性靶DNA的重复结合并将结合的DNA引物和靶DNA与核苷酸和有校读能力的DNA聚合酶一起温孵以产生第一DNA片段，该第一DNA片段与靶DNA互补并至少是2Kb。此聚合方法进一步包括步骤(iv)选择第二对不同的DNA引物，该第二对DNA引物与第一对DNA引物的两个序列相比至少有一个是不同的，并且第二对DNA引物中至少有一个由序列(i)-(xxvi)所代表；(v)通过第二对DNA引物与变性靶DNA重复结合并将该结合的DNA引物和靶DNA与核苷酸和校读能力的DNA聚合酶一起温孵来生产第DNA片段，与第一DNA片段相比第二DNA片段是不同的，并且还与靶DNA互补，该第DNA片段至少是2Kb；(vi)限制性酶解第一和第二DNA片段；并(vii)将第一和第二DNA片段的限制酶解部分重组到被聚合的DNA中，该聚合的DNA编码蛛丝蛋白并至少是4Kb长。
在上述聚合方法的更具体的实施方案中，全部引物都由序列(i)-(xxvi)所代表。在另一具体聚合方法实施方案中，全部引物都是不同的。在仍是一个更具体的聚合方法实施方案中，聚合的DNA至少是6Kb到8Kb长。
在DNA序列实施方案中，本发明涉及编码蛛丝蛋白的一个DNA序列，其中该DNA序列包括多个重复和非重复区并有至少2Kb长。在更具体的实施方案中，该DNA序列有至少5Kb长。在仍是本发明的一个更具体的DNA序列实施方案中，该DNA包括如图1描述的序列。
在产生丝蛋白方法的实施方案中，本发明包括步骤(i)选择一个DNA；(ii)将该DNA插入一个表达载体；(iii)用该表达载体转染宿主细胞；(iv)在培养基中发酵被转染的宿主以生产丝蛋白；和(v)回收丝蛋白。在更具体的丝蛋白生产方法实施方案中，用于发酵被转染的宿主的培养基含有蛋白酶抑制剂。在一个更进一步丝蛋白生产方法的实施方案中，该方法包括步骤(i)用超声能量破坏宿主细胞；(ii)用超声能量重悬浮丝蛋白；和(iii)离心破碎的宿主细胞以使细胞膜与丝蛋白分开。在这些丝蛋白生产方法中，丝蛋白的纯化通过超滤或乙醇沉淀来完成。
精纺丝蛋白所用的方法实施方案中，本发明涉及一种方法包括步骤(i)浓缩由超滤或乙醇沉淀纯化的丝蛋白；(ii)将浓缩的丝蛋白拉成纤维；(iii)精纺丝纤维以生产丝线；和(iv)洗丝线以除去任何增溶剂试剂。增溶剂选自六氟异丙醇，氢氧化钠，氢氧化钾，尿素，尿素磷酸酯，锂盐，有机溶剂，盐酸胍，硫酸铵，醋酸，磷酸，二氯醋酸，甲酸和硫酸。精纺丝还有一种更具体的方法，该方法进一步包括用锡或钛的氧化物包被丝纤维或丝线的步骤。
在纤维实施方案中，本发明涉及含根据本发明的任何方法制造的蛛丝线的一种纤维。在进一步的纤维实施方案中，该纤维包括根据本发明的任何方法结合Kelvlar，石墨或碳纤维，以及蚕丝制成的蛛丝线。
该蛋白可被用做涂层，挤压成纤维或制成聚合膜。
发明详述
产丝蜘蛛DNA来源
在本发明的方法被专门开发以克隆Nephila clavipes大的ampulate(拖丝)蛛丝。克隆和生产丝蛋白质的方法可用于所有的产丝蜘蛛。
作为群体，蜘蛛的丝分泌腺可达8种。虽然没有一个蜘蛛的种有全部8种丝分泌腺，所有的蜘蛛至少有3种丝分泌腺并且多数蜘蛛有5种分泌腺。每种分泌腺产生不同类型的丝，它们具有不同的性质。例如，某些丝干燥得快，而其他的丝保持粘性。
蜘蛛归属于节肢动物门，蜘蛛纲和蜘蛛目。真正的蜘蛛归于Labidognatha亚目。其他蜘蛛类型包括梳足(comb footed)，蟹形(crab)，捕鱼者(fisher)，漏斗网(funnel web)，麻梳斑(hackled-band)，球形织工(orbweavers)，跳蛛(jumping)和魔面枝(ogre faced stick)。来自下面任何属的蜘蛛可按照本发明被使用：Micrathena，Mastophora，Araneus，Argiope，Nephila或Gasteracantha。
球形织工是其中结果最好的的蜘蛛群，因为它们吐出的丝有很高的强度和柔韧性。球形织工被称为Argiopidae并包括：箭头型Micrathena sagittata，流星锤蜘蛛Mastophora sornigera，迷宫Metepeira labysrinthea，石斑Araneus marmoreus，黑黄花园Argiope bruennichi，金丝Nephila clavipes，和棘身Gasteracantha cancriformis。
因为Nephila clavipes的丝线结实并且其丝分泌腺大而易于切割，已对Nephila clavipes进行了最多的遗传研究。其他的球形织工也产生结实的丝线。
虽然所有的蜘蛛都产丝，形成丝线的蛋白质的分子组成变化很大并有不同的用途。例如，Antrodiatus蜘蛛吐出只含两种蛋白质的简单类型的丝。相反，被称为网织者的Araneoidea科蜘蛛产生达8种不同类型的丝。球形织工用数种蛋白质产生各种丝以生成较大强度和柔韧性的网。
蛛丝蛋白质还有不同的质量，取决于其是由那一种丝分泌腺分泌出。已知最强的丝来自球形织工的大的ampulate分泌腺。在球形织工产生的8种丝中，大的ampulate(拖丝)丝由于其物理强度和非粘性质而被选择用于这个研究。虽然碳水化合物与该纤维有关，这种拖丝丝由蛋白质组成。在蜘蛛的吐丝器中，液体丝经过不可逆转变成为含高相对比例的丙氨酸和甘氨酸的不溶性形式。这种纤维包含一个具有灵活界面的反平行β折叠。这种丝的氨基酸组成(在下表中显示)模拟本发明的克隆的氨基酸组成。
Nephila clavipes大的ampulate蛛丝的氨基酸组成百分比
氨基酸   蛋白质   220Kd带  190kD带
谷氨酸    8.52     9.77     9.35
丝氨酸    3.51     2.57     2.79
甘氨酸   41.66    45.88    44.80
精氨酸    1.28     1.98     2.28
丙氨酸   25.25    28.57    28.35
脯氨酸    0.78     0.37     0.51
酪氨酸    4.20     3.25     3.26
亮氨酸    4.82     4.62     4.48
丝聚合物，ACS，论文集，丝氨酸，544，1994。
克隆
两个引物PCR的克隆
虽然许多研究试图用PCR技术克隆重复的丝基因，至少已出现两个问题。这些PCR技术对长度为8-15Kb的基因不能以良好的忠实性转录DNA。事实上，在这类文献中所报道的大多数克隆转录都有转录错误。因此，本发明开始克服这些缺点并发现通过使用某种程度的简并引物可产生一个或多个PCR产物。
使用了来自Nephila clavipes腹部的基因组DNA。为从蜘蛛分离该DNA，严格遵循了Sambrook等的分子克隆：一实验室手册，1-3卷，冷泉港实验室，纽约(1989)中描述的制备方法。这个方法产生超过2Kb的高分子量基因组DNA。
发明者用许多与Xu等人公开的序列数据相关的引物做了实验。所用的某些引物在上文作为序列(i)-(xx)公开。虽然Bechwith &Arcidiacono也试用了这些引物，本发明者是用双引物PCR克隆系统产生达2Kb长度的蛛丝蛋白之第一人。本发明者还能用被要求专利保护的cDNA和下述单位点克隆方法生产较高Kb的蛛丝蛋白质。
使用从如Xu等人和Hinman和Lewis定义的spidrin 1得到的引物生成PCR克隆的初始条件。用有Taq聚合酶(Stratagene产品号600131，许可证来自Perkin Elmer，Stratagen，11011 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA)的常规PCR，发明者仅能得到达700-1000bp的PCR产物。这证实了其它人的发现。甚至这些小片段也被认为是质量上可疑的。用Taq延伸因子(Stratagene产品号600148)，得到一些达1900左右的带如实施例1所示。然而，当使用另一种有校读作用的聚合酶时(Takara Taq LA)，仅得到一条主要的带如下面实施例2中所描述的。
实施例1：用Taq聚合酶克隆
在本实施例中，通过Beckwith&Arcidiacono的方法分离的Nephila clavipes DNA被与下面两引物一起使用：
引物(i)
GGCGAATTCGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT，
和(ii)GGCGAATTCACCCTAGGGCTTGATAAACTGATTGAC。
引物(i)编码基于正向阅读框的聚丙氨酸重复序列。将框内起始密码和BamH1和EcoR I前导限制性位点插入作为悬垂以便于克隆的前导序列还被插入到引物中。引物(ii)是基于Xu等的反向序列的PCR引物(bp2218到2242)。这个序列还有一个框内终止密码子和一个EcoR I限制位点。如本实施例和实施例2中所示，结果取决于PCR条件并且在无更新的聚合酶时是非阳性的。常规的Taq和Taq的延伸因子产生的结果不同，推测是由于错读或假引发的结果。
PCR混合液如下：5微升Taq延伸因子缓冲液(Stratagene)；1微升Taq聚合酶5微克/微升(Stratagene)；1微升的1微克/微升DNA模板(蜘蛛基因组DNA)；1微升的2微摩尔引物(i)于水中；1微升的2微摩尔引物(ii)于水中；5微升NTP’s(各2微摩尔的dATP，dCTP，dGTP和dTTP，pH7.0)；45微升的Taq延伸因子(Stratagene)；和水到总体积100微升。
PCR循环条件如下：94℃放置2分钟；和PCR条件(30循环)：60℃退火1分钟；和94℃变性1分钟。或者，60℃退火1分钟和72℃延伸2分钟的PCR条件可用72℃处理2分钟代替。
取5微升一份该反应混合物用1％琼脂糖电泳显示DNA带进行分析。用此技术，达到7条DNA带，它们被推测为代表该序列中的一些丙氨酸重复区。最大的DNA片段是1900-2000bp(并被认为是2Kb片段)。这基本上与实施例2中得到的是同样的带。用Gene CapsuleTM(货号786-001自Gene Technology Inc.，3830 Washington Blvd.，St.Louis，MO63108)从胶中切下带，用酚和乙醇沉淀。用下面实施例中描述的方法将这些带克隆到E.coliXL1 MRF’超感受态细胞。在用引物(ii)和(iii)使用实施例2中描述的Takara Ex Taq LA聚合酶PCR条件时也发现了2Kb片段。
实施例2：用Takara Taq LA聚合酶克隆
用研钵和研杵研磨蜘蛛腹部分离基因组DNA并按照Sambrook等的分子克隆：实验室手册1-3卷，冷泉港实验室，纽约(1989)的方法提取。
本实施例的克隆用下列引物完成：
引物(iii)GCATGCACGCATGGTGCATGGATGC，和
引物(ii)GGCGAATTCACCCTAGGGCTTGATAAACTGATTGAC。
引物(iii)从Mello等，丝聚合物，ACS，论文集，Ser 544(1994)描述的肽序列4制得。引物(ii)如上述实施例1的描述制得。
使用下述PCR混合液和条件。PCR混合液：5微升10X Takara LAPCR缓冲液；5微升Takara dNTP混合液；1微升引物(iii)(2微摩尔)；1微升引物(ii)(2微摩尔)；1微升校读活性的TakaraEx Taq；1微升蜘蛛基因组DNA；水到总体积50微升；和50微升的矿物油。Takara LA PCR缓冲液，dNTP混合液，和Takara Ex Taq由Panvera公司565Science Dr.，Madison，WI 53711分销的Takara Roll试剂盒提供。PCR循环条件如下：初始放置94℃1分钟；PCR条件(30循环)：68℃1分钟退火和延长；并4℃下后放置。
为插入该2Kb片段到E.coli中，选用熟悉的载体pUC18，因为该质粒有数个克隆位点并能表达好蛋白质。还知道该载体适合于用熟知的引物进行序列分析。为插入该2Kb片段到E.coli XL1 MRF’中，pUC18首先在从Sigma Chemical Co.，P.O.Box 14508，St.Louis，MO 63178-9916获得的1微克/微升DNA制备液中制备。限制酶也类似的被使用以消化该插入片段。限制酶实验方案如下：5微克或以下的质粒或DNA插入片段；5微升的限制酶10X缓冲液；5微升1毫克/毫升乙酰化BSA；5微升限制酶(EcoR I)；水到终体积50微升；并37℃温孵3小时。
在酚抽提后还要对载体处理并用EcoR I限制酶彻底酶解。该载体类似的被小牛肠碱性磷酸酯酶(CIAP)处理。该处理防止载体重连接。
除了限制性实验方案外，CIAP实验方案如下：10微升CIAP 10X缓冲液含500毫摩尔tris-HCI，pH9.0，10毫摩尔氯化镁，1毫摩尔氯化锌和10毫摩尔亚精胺；1单位CIAP；水到终体积100微升；和37℃温孵60分钟。在37℃，一CIAP单位每分钟将水解6.0毫摩尔的对硝基苯磷酸酯。在含1.0毫摩尔氯化锌，1.0毫摩尔氯化镁，pH10.4的0.1摩尔甘氨酸缓冲液中测定这些单位。下一步是连接该插入片段到pUC18中。为达此目的，用酚提取和乙醇沉淀纯化该DNA并然后按下述实验方案连接。
连接实验方案：100毫微克载体DNA；100毫微克或以下的DNA插入片段；1单位T4DNA连接酶(Weiss Unite)；1微升连接酶10X缓冲液；加水补足终体积10微升；和室温温孵1小时。
然后用Clonetech方法将该新载体插入从Clonetech Laboratories，Inc.，4030 Fabian Way，Palo Alto，CA 94303获得的E.coli XL1 MRF′中以便进入超感受态细胞。
通过青霉素抗性在LB肉汤中筛选转化子，10克/升细菌蛋白胨，5克/升酵母膏，和5克/升氯化钠，用50微克/微升青霉素。通过首先查看适当大小的质粒(约4.3Kb)检查克隆中的适当插入片段。还用生物素标记的探针和杂交检测检查插入片段。对转化中的5个最好的插入检测了被插入的蛋白的表达，因为在这种方式时蛋白质应在pUC18中表达。
用上述PCR技术容易生成该2Kb的插入片段。这个技术产生的结果比下面三个方法都好：通过基于肽序列分析的探针筛选丝的鸟枪克隆库(Xu等)；来自丝分泌腺的cDNA插入片段(Hinman和Lewis)；和使用Taq聚合酶或其他非校读聚合酶的PCR(Beckwith和Arcidiacono)。
与上述三个方法比较，实施例2的PCR技术快速，不向序列引入其他报道的方法明显引入的错误。并且只直接对目的基因。本技术仅用蛛丝的氨基末端或羧基末端的少量序列就能对除主要ampulate(拖丝)丝以外的丝或有类似性质的其他蜘蛛丝进行测序。
为确定是否蛋白质正在E.coli宿主中表达，开展抗体检测以便确定蛛丝蛋白。下面讨论这些抗体检测。此外，SDS胶表明2Kb的插入片段正在以高产率产生94kDa蛋白。按照Mellow等，Silk Polymerw，ACS，Symposium Ser.544(1994)的方法进行凝胶电泳。用LB肉汤，从该细菌生产的总蛋白质产率范围在0.1-10％。用Bio-Rad Laboratories，3300Regatta Blvd.，Richmond，CA94804，的BioRad试剂盒#170-6460进行的Western印记也证实该蛋白质是丝蛋白，并且它是抗体反应所显示的唯一蛋白质。
按照正常条件用Promega银序列分析仪，货号Q4130Promega公司，2800Woods Hollow Rdlk Madison，WI 53711-5399，对此2Kb插入片段以及本发明者开发的其他插入片段测序。用多引物，缺失克隆和基于实施例1的其他克隆进行此实验。图1中给出的DNA和蛋白质序列对该序列作了表征。
来自cDNA的克隆
许多研究者试图克隆Nephila clavipes蛛丝却少有成功因为克隆到小片段时。从dDNA克隆所牵涉的问题包括不能得到全长的mRNA，蛋白质的反转录和可靠性都不好。另一主要问题是从丝分泌腺不能得到满意量的mRNA。本发明的cDNA技术(于下面描述)解决了这些难题。
实施例3
A.全长mRNA的开发
在本克隆技术成功之前，必须解决获得全长mRNA问题。由于在蜘蛛的丝分泌腺中mRNA拷贝数十分低，就决定用蚕丝Bombyx mori以开发出从蜘蛛丝分泌腺取得全长mRNA的类似方法。在尝试了数个分离mRNA方法之后发现PerSeptive Diagnostics(Cambridge，MA)的mRNA纯化试剂盒能始终如一的分离到全长mRNA而没有任何可见的降解。此mRNA纯化技术用生物磁珠分离法和寡(dT)20颗粒分离mRNA。
B.长而精确的PCR技术的开发
开发过程的下一步是将mRNA转变成良好的第一链模板，然后可靠的复制DNA。用Invitrogen Cycle mRNA反转录仪，3985 B SorrentoValley Blvd.，San Diego，CA 92121的Invitrogen公司的cDNA循环试剂盒L1310-01和PCR扩增系统证明不令人满意，因为生成的引物只适合于扩增小片段mRNA。此后，发明者决定开发他们自己的技术以获得一个10Kb的mRNA。此方法的第一个部分是使反转录反应最佳化。通过尝试各种反转录酶，包括AMV(Avian Myelobastosis病毒)，反转录酶(M5101)和被修饰成除去了核酸酶H活性的(M-MLV(MoloneyMurine Lerkemia病毒)反转录酶(M5301)找出了生成第一链的优选反转录酶。见Tanese & Goff，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.85：1977(1988)。M5101和M5301均得自Promega公司，2800 WoodsHollow Road，Nadison，WI 53711。按照Promega指导使用的M-MLV是优选的，因为它给出最高的可靠性和最长的产物长度。因此推荐使用M-MLV和下列反转录酶实验方案：2微升10X反转录酶缓冲液；2微升M-MLV反转录酶(Promega)；2微升二巯基苏糖醇；1微升多聚d(T)20；和13微升mRNA。
生成第一链后，有必要扩增该mRNA片段(在用酚抽提和乙醇沉淀后)。由于mRNA有多聚A末端，使用多聚T的引物。在另一端，需要标记序列并存在几种可能性。若将一个标记盒放在一个加工过的末端，该技术对低数目的第一链DNA有低的连接几率。由于mRNA的多A末端接近编码该蛋白质的羧基端，标记一个末端的方法是现成的。因此，采用仅标记一个末端的方法并使用末端转移酶。优选的方法是使用末端转移酶加多A到第一链的3’端。这通过单引物法从mRNA的cDNA两端扩增来完成。该方法如下：10微升末端转移酶缓冲液(Promega配方)；1微升末端转移酶(Promega)；5微升上述反转录方法得到的第一链DNA；1微升寡d(T)612；1微升d(A)；和7微升水；并在37℃温孵1小时。末端转移酶缓冲液和末端转移酶均得自Promega公司，2800 WoodsHollow Rd.，Madison，WI 53711-5399，货号M1871。
然后再用酚和乙醇沉淀分离DNA，并进行PCR。下面描述的技术产生在一端有多dA而在另一端有dT的DNA链。对这样一个需要用多T做引物的长而精确的cDNA扩增方法在长段DNA上进行PCR的问题通过使用下面Takara LA DNA扩增法得到解决。cDNA的PCR扩增如下：1微升来自上述末端转移酶方法的DNA；10微升10XTakara LA缓冲液；10微升dNTPs(Takara)；1微升多d(T)20引物；1微升TakaraEx Taq LA聚合酶；78微升水；和100微升矿物油。PCR条件如下：94℃初始放置1分钟；扩增循环(40)是：94℃30秒钟；55℃2分钟；和72℃3分钟；继之以2℃后放置。
该扩增开始显示一条多重mRNA带。为得到需要的特异引物，首先，只用编码丝蛋白非重复区的2Kb的引物(ii)扩增由最初扩增物得到的cDNA，该2Kb片段还通过使用第一次PCR得到的cDNA1微升结合了终止密码子。这样产生的单链cDNA仅有一个末端的多d(A)。此新引物仅扩增丝蛋白的选择性文库。这还产生了一条优先扩增丝蛋白cDNA的带。其次，使用PCR方法，其中与引物(ii)和多d(T)20一起使用1微升上述反应液。完成此反应后，用溴乙锭在琼脂糖凝胶上形成三条清楚的mRNA带。这些mRNA带表明形成于蛛丝基因的三个不同大小的mRNA带，该三个基因编码约95kDa，190kDa，和220kDa的蛋白质。在天然蛛丝中，190kDa和220kDa蛋白质被加强，而所有三种蛋白质都被形成。如电泳所证实的，在克隆和天然蜘蛛拖丝丝中都产生同样的三种蛋白质。这对显示克隆正确的基因是重要的。这些结果另人信服的表明根据PCR分析在该蛋白质存在三个起始部位，因为它们的最后2Kb片段是同源的。这些片段中最大的有14Kb长。两个最大的片段随后被克隆。如上面实施例2中注释的，通过用Sma I平端限制性切开pUC18并用CIAP处理克隆了最大的一个片段。通过连接它到如上实施例2所示的载体中而平端插入cDNA。用试剂盒号200230，Stratagene Cloning Systems，11011 North Torrey Pines Rd.，La Jolla，CA 92037将其转化超感受态E.coli XL1 Blue MRF′。
通过用1％琼脂糖凝胶检测插入片段的大小鉴定有插入的阳性转化子。然后通过使用PCR和多d(T)20引物测定正确插入的阳性插入片段。还通过下面讨论的抗体方法测定这些阳性结果。用SDS电泳胶测定大的mRNA的抗体检测所得的阳性结果并发现产生三个不同的蛋白质，也提供了多起始位点。一个蛋白质稍微大于2Kb片段而其他两个蛋白质稍微短于天然蛛丝拖丝蛋白质。然而，用Western染色法给这些高分子量染色是困难的，而这对天然蛋白质来说也是一样。
虽然未试图插入起始密码子或肯定阅读框是正确的，这些克隆产生了大量的蛋白质。事实上，某些克隆产生太多的蛋白质以至妨碍了生长。就发明者所知，一个培养物显示出这样多的目标蛋白质的合成还是首次。正如下面发酵一节所进一步解释的，令人惊奇的发现是培养条件，如低温，帮助提高了蛋白质的生产。已发现那些蛋白质干扰用于测序的质粒DNA的分离，从而当DNA编码细菌中的蛋白质时，难于得到适当的序列。然而，这些蛋白质中的每一个的序列的最后部分是相同的(除在氨基末端的少数不同之外，而这部分在某些克隆是缺失的)。这些克隆在羧基端具有相同的序列(至少1900个的碱基)因为它们阅读同样的DNA编码区。
从单位点引物系统克隆
如前面所述，引物(ii)是独有的，因为它编码大的ampulate(拖丝)丝蛋白的羧基端。然而，有必要开发一种方法，该方法将进一步伸入氨基方向并有助于延伸出整个序列。已开发出两个此类方法。一个是用鸟枪法制造DNA克隆，这在下面讨论。不大可能认为有人能将完整的基因克隆到一个插入片段中并用这个方法制造蛋白质。由于发明者知道所述羧基端对其他所关注的蛛丝是唯一的，他们认为可以开发出一个PCR方法，它必须以一个已知的唯一位点为起始点。这个技术，即第二个方法，将连接盒与DNA末端相牵连，尽管使用末端转移酶同样是有效的。
实施例4
为便利在DNA末端做唯一的标记，从而可开发结合于该位点的PCR引物，Takara试剂盒的一些序列盒被开发出来。下面公开的序列盒系统被使用。
序列盒1.Sau3A盒
5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGA-3’
3’-CATGTATTACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTAG-5’
序列盒2.EcoR I盒
5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGAG-3’
3’-CATGTATTACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTCTTAA-5’
序列盒3.Hind III盒
5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’
3’-CATGTATTACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTTCGA-5’
序列盒4.Pst I盒
5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGCA-3’
3’-CATGTATTACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTG-5’
序列盒5.Sal I盒
5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGAG-3’
3’-CATGTATTACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTCAGCT-5’
序列盒6.Sba I盒
5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGAT-3’
3’-CATGTATTACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTAGATC-5’
引物C1
     5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCG-3’
引物C2
      5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’
引物(ii)
      5’-GGCGAATTCACCCTAGGGCTTGATAAACTGATTGAC-3’
见Isegawa等，Mol & CeH.Probes 6：467(1992)
为进行此鉴定，有必要在上述限制性位点之一消化高分子量蜘蛛基因组DNA。限制性消化方法如下：2微升的1微克/微升基因组DNA；20单位的适当限制酶(根据六个上述限制性盒之一或所提供的其他盒，同样的限制性盒与限制酶一起使用)；5微升的10X限制酶缓冲液；蒸馏水到总体积50微升；并在37℃温孵3小时。
然后清洗该限制性消化物并通过乙醇沉淀再浓缩和重新溶解于无菌水。然后将序列盒连接到各自的DNA消化物。连接反应方法如下：5微升基因组DNA消化物；2.5微升一种适当的序列盒(如上述的1-6)(20毫微克/微升)；7.5微升Takara连接溶液；并室温温孵30分钟。
然后清洗该连接反应混合物并用乙醇沉淀再浓缩和重新溶解于5微升无菌水中。因为Takara试剂盒的Taq没有校读活性或高可靠性，使用Takara LA PCR试剂盒的试剂和聚合酶并产生十分精确的转录。使用的实验方案描述如下：
第一个PCR扩增混合液有2微升DNA溶液；1微升序列盒7(引物C1)；1微升序列盒9(引物(ii))；10微升10X LA Ex Taq聚合酶缓冲液；1微升Ex Taq LA聚合酶；10微升dNTPs(每种2.5mM)；和水到总体积100微升。PCR反应条件如下：94℃开始放置1分钟；扩增(30循环)：94℃30秒钟；55℃2分钟；和72℃1-3分钟；2℃后放置。
在第一次PCR扩增后，在同样条件下进行第二次PCR扩增，不同的是基因组DNA溶液用1微升第一PCR的产物替换并且序列盒7(引物C1)被用序列盒8(引物C2)替换。
第二PCR产物的琼脂糖凝胶显示序列盒系统中的三个带：Pst I，Hind III和EcoR I。这些是长度大于40Kb和某些是大于100Kb的浅带。若凝胶中出现明显的显带，则被推断是由于极端长的PCR产物，尽管发明者没能发现任何这样长的PCR的报道。然后从凝胶切下这些PCR产物的每一个并通过Gene Clean再纯化。这些产物都是平端片段并直接克隆到pUC18的Sma I平末端限制位点和转化进入E.coli XL1 BlueMRF′。若在插入时全部这些插入片段有某种程度的缺失，它们仍产生超过20Kb的质粒克隆(一般约23Kb)，这对插入完整的拖丝蛛丝基因是足够长的。如下面讨论的，由于高浓度的丝产生而导致的生化问题，E.coli转化子在肉汤培养中生长的不太好。
像前面讨论的cDNA转化子那样，这些转化子生长的不太好并看上去形成像丝样的绒团。为此，本发明者们开始确定是否产生了蜘蛛丝。下述的抗体和凝集实验显示产生了大量的丝蛋白。SDS凝胶电泳检测了三种蛋白质的存在(推测是来自于上述实施例3所描述的cDNA的作用)并且最大的两个片段在整个长度上与天然蛛丝相配。Western印记也显示用cDNA所得到的同样结果，即，较小的丝片段染色很好。由于沉淀和其他问题，十分大的蛋白质在Western杂交中没有像天然丝那样显示阳性。实施例3反应像本实施例。然而在两种情况下和用天然蛛丝时较大蛋白质染色是阴性的。
在这些克隆中有许多生长还存在一些值得注意的问题--类似于用cDNA克隆所观察到的但产量高得惊人。其中的一些克隆在37℃在像LB肉汤类的肉汤培养中生长不好。有趣的是，据发明者推测随该克隆带来了启动子并助长了生产速率。避免与质粒DNA相结合的全长丝之测序问题(它引起在在琼脂糖凝胶上形成带)的一个方法是亚克隆进入产生非蛋白质或小分子量蛋白质的次级克隆中。这个问题比上面描述的cDNA克隆所观察到的问题或下述聚合物所观察到的问题更严重。这些克隆像cDNA克隆产生大量的蛋白质并可被用于大规模生产。该DNA序列的最后2Kb已经被确定以与使该序列成为完整的2Kb插入片段相配。
从基因组丝DNA进行鸟枪克隆
虽然已知此具体方法用于克隆蚕丝DNA，本发明发现此技术还适合蛛丝DNA分离。然而预期将不得不通过杂交探针筛选达50,000个克隆以发现适当的含完整基因的克隆。与上面讨论的其他克隆方法不同，不期望这些克隆(或仅少量克隆)中的任何克隆将不经广泛剪接而产生蛋白质。因此，本发明者开始改进这个技术。本发明者研制的改进涉及使用生物素标记的探针，如那些用于进行克隆的，附着在玻璃珠上的生物素探针。已发现这个技术将在克隆前富集至少含部分丝基因的序列。该生物素探针筛选含杂交到该探针的专一区域的DNA序列。因此，DNA片段可能不含完整的基因。然而，这个技术被用于得到蛛丝基因并用做生成蛋白质表达克隆的起点。与实施例1-4中描述的克隆技术比较，这些鸟枪法是初步的方法但仍是克隆Nephila和其他蛛丝蛋白质的适合方法。
实施例5
借助于生物素探针用杂交探针筛选克隆是已知的。例如，Sigma试剂盒(Cool-1)(Sigma化学公司，14508信箱，Louis街，MO63178-9916)提供按照BioRad方法杂交的Sigma硝酸纤维素膜上克隆的斑点杂交之最终显影试剂。这些方法有许多种并且大多数熟悉分子生物学的人员已经实践了这类技术。
浓缩杂交到生物素标记探针的DNA片段的技术未被人们所熟知。在此系统中，DNAL(Lake Success，NY)M-280玻璃珠被用于用下面方法预富集基因组DNA。首先，生物素探针与Dynabeads M-280Streptavidin混合于离心管中。100微升的珠和100微升的生物素探针(1微克/微升)混在一起并使之在室温结合10分钟。此珠被装载于有管磁铁的离心管中并将液体轻轻倒出。然后用含0.1摩尔氯化钠的TE缓冲液洗3次。将在95℃2分钟预变性的基因组DNA100微升加入到此珠。在42℃让珠与DNA杂交2小时，使用等量的结合溶液，该溶液是2X并含10毫摩尔tris HCI(pH7.5)，1毫摩尔EDTA和2摩尔氯化钠。然后将温度降低到室温并在杂交液中洗珠3次。然后将富集的DNA用含0.1摩尔氯化钠的0.15摩尔的氢氧化钠洗脱。将此DNA浓缩到5微升水中并通过插入到pUC18载体的Sma I位点使之克隆。仍用结合到蛛丝序列的各种生物素标记探针筛选正确的片段。对阳性克隆测序。此技术是非常有效的但在筛选上需要做较多工作。由于可富集DNA以致筛选仅需要不到500个克隆。然而若没有富集，则必须筛选200,000到2千万个克隆以得到一个含丝基因的克隆。
聚合方法
使用实施例1和实施例2中描述的双引物克隆技术和基于Nephila型序列的20多种不同引物，那些2Kb的插入片段是克隆的最大蛛丝片段。由此，推论制造较大片段需要不同的技术。考虑到由于根据蛋白质测序的现有信息未产生较大的片段，需要这种技术从向氨基端编码的部分蛋白质获得另外的序列信息。虽然2Kb片段含盖全长的40％，聚合方法对增加长度特征被认为是必要的--因为长度通常随丝聚合物的大小而变化。因此，发明者希望聚合2Kb插入片段以制造比天然基因大的蛋白质。
本发明的发明者推断PCR将形成聚合这些插入片段的适当方法，因为它避免所报道的序列的重复。本发明的聚合方法在下面实施例中给出。
具有各种有用限制位点的PCR片段构造由修饰现有开始和终止引物的悬垂端来完成。其他开始和终止引物如上述的引物(i)和(ii)有不同的限制位点，除缺失了终止框架密码子因此蛋白质将继续被翻译进入贯穿所述位点的mRNA外，还使较长的构建物被制造出来。开始时，起始密码子被留下来从而存在多个蛋白质帮助检查缺失和增加转录。生成有独特限制位点的不同2Kb插入片段所用的引物在下面给出。这些引物被称为(xxi)-(xxvi)。
有BamH I位点的引物(xxi)
5’-GGCGGATCCGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT-3’
有Hind III位点的引物(xxii)
5’-GGCAAGCTTGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT-3’
有Sal I位点的引物(xxiii)
5’-GGCGTCGACGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT-3’
有BamH I位点但无终止密码子的引物(xxiv)
5’-GGCGGSTCCACCCAAGGGCTTGATAAACTGATTGAC-3’
有Hind III位点但无终止密码子的引物(xxv)
5’-GGCAAGCTTACCCAAGGGCTTGATAAACTGATTGAC-3’
有Sal I位点但无终止密码子的引物(xxvi)
5’-GGCGTCGACACCCAAGGGCTTGATAAACTGATTGAC-3’
实施例6(4Kb构建物)
用pUC18的2Kb插入片段通过引物(i)和(xxv)的PCR生成本实施例的4Kb构建物。引物(ii)和(xxii)被用于独立进行的反应，该反应与上述实施例2相关，不同的是用起始2Kb的质粒代替基因组DNA。用LA(长而精确)PCR技术，被发现的DNA片段是有新的限制位点的2Kb片段和代表完整质粒的两条带。
然后按照公司的指导手册通过1％琼脂糖凝胶(70伏在8厘米胶上电泳90分钟)--Gene Capsules(Geno Technology，Inc.St.Louis，MO63108)分离这些带。用EcoR I和Hind III双限制性酶切这些带并用EcoR I切2微克的载体和用如上述实施例2中的CIAP处理。然后通过酚抽提和乙醇沉淀再纯化两个2Kb片段的每个片段和载体并溶解进入10微升的TE缓冲液。Sambrook等描述了TE缓冲液。每5微升一份被加入到连接反应液中(如上述实施例2中的连接反应中)并连接在一起。用Invitrogen电穿孔仪，货号S1670-01(购自Invitrogen公司，3985 BSorrento Valley Vlvd，San Diego，CA 92121)，提供的常规细菌方法将它们电穿孔到E.coli XL1 Blue MRF′细胞(试剂盒号200230)，E.coli TOPP细胞(试剂盒号200241)和E.coli Sure细胞(试剂盒号200238)中。E.coli细胞得自Stratagene Coning Systems，11011North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92137。由于较少转化子有缺失，Sure细胞产生较好的结果。成功的转化子产生94和188kDa的蛋白质，其中的后者类似于在有关天然蛛丝的文献中报道的190kDa蛋白质。
实施例7(6Kb聚合构建物)
用上述实施例2的方法通过3个片段的PCR生成本实施例中的6Kb构建物这个方法包括用三个2Kb构建物和下面的引物组：组1：引物(i)和(xxiv)；组2：引物(xxi)和(xxv)；和组3：引物(xxii)和(ii)。
它们以实施例6的4Kb聚合构建物中描述的同样方式被构建进入pUC18。然而发现在某些使用Sure细胞的情况，缺失没有产生比天然丝大的蛋白质，在许多情况中如用引物(i)和引物(ii)和转化子DNA的PCR产物琼脂糖凝胶所判断的，有些缺失没有发生。Sure细胞是优选的，因为它们是重组缺陷型。正如所期望的，在DNA大到一定大小以上时，它变得不稳定并缺失了重复片段。
实施例8(8Kb聚合构建物)
本实施例的8Kb构建物恰如上面实施例的6Kb构建物被生成，不同的是4个2Kb片段从下面4组引物被生成：组1：引物(i)和(xxiv)；组2：引物(xxi)和(xxv)；组3：引物(xxii)和(xxvi)；和组4：引物(xxiii)和(ii)。
它们被插入的方式与实施例6和7的其他插入片段是相同的。即使在几乎所有情况都发生了缺失，比天然丝大的蛋白质被产生说明该聚合方法可被用于制造性质优良的合成丝。用这个技术和全长DNA，该序列可被改变以产生天然丝DNA的聚合物单位，该聚合物是有比正常高得多的分子量的终产物。其中的一些克隆产生大小上类似于或大于全长天然丝的蛋白质。
从其他技术如cDNA法和上述单一位点系统得到的克隆还可被剪接在一起以制造其他聚合物。用全长克隆或从其剪接的片段经过本发明的聚合技术使达800kDa的克隆成为可能。
载体与生产系统
对于蛛丝蛋白质的克隆，E.coli和pUC18是优选的起始生产系统。两者都有高可靠性的良好稳定的表达并通过它们的细胞膜分泌丝蛋白。虽然唯一的一个表达系统实施例被给出，编码天然蛋白质或从它们获得的聚合物可用于任何载体或基因组结合系统方面的应用。因为载体和宿主的可能列表长得不能再长，下面仅给出少数实施例。
细菌系统
E.coli表达系统是优选的因为它们有产生很高水平的重组蛋白质和分泌它们到细胞膜外所必要的生物化学机制。它们还易于用简单发酵生长。此外，该系统的许多蛋白质生产的主要问题已经被解决以至它们属于最通用的表达系统。pUC18属于最常用的载体。除pUC为其中之一的通用人造质粒外，基于裂解噬菌体，噬菌体质粒嵌合体，和穿梭载体的其他载体也可作为表达插入的系统。这类质粒的实例包括pBR322，pSP-64，pUR278和pORF1。噬菌体载体的实例包括λ，12001，λgt10，Charon 40，M13mp19和从天然细菌噬菌体修饰的其他噬菌体。
芽孢杆菌(Bacillus)表达系统，包括B.subtilis系统，也可被使用。这些细菌有通过宿主良好分泌的优点，这就导致较少的加工步骤和加工成本。虽然可使用表达盒，用迄今所研究的载体宿主系统发现表达盒不是必须的。一种可起E.coli和Bacillus穿梭载体作用的噬菌体质粒嵌合体是pTZ18R，它可从Pharmacia买到(Piscataway，NJ)。
许多其他细菌系统可被用于表达。
被保藏的克隆
一个代表性克隆于1995年7月2日被保藏在American Type CultureCollection(12301 Parklawn Dr. Rockville，Maryland 20852)并给予ATCC号69832。保藏物包括E.coli XL1 MRF′细胞，菌种名称PA21，含带有全长蛛丝基因能表达全长Nephila clavipes丝蛋白的pUC18质粒(23Kb)。
酵母和霉菌系统
Saccharoomyces cerevisiae，Schizosaccharomcyces pombe，Pichiapastoris，Asperillus sp.，Hansenula sp.，和Streptomyces sp.可被用做表达系统。然而Aspergillus和Pichia系统是例外，很少有证据表明这些系统会产生比细菌更多的蛋白质或经得起验证的产量增大。然而这些系统对产生USP或食品等级的物质更合需要，因为细菌发酵物有毒素和与其结合的热原，而这些酵母和霉菌系统中的许多已显示作为食品级的物质是安全的。
植物转化系统
植物系统可被用于生产转基因蛋白质如丝。虽然蛋白质的质量可能低于微生物系统中产生的蛋白质质量，植物培养是十分便宜的。可使用Agrobacter型转染系统，它使遗传学属性进入植物基因组。用基因枪插入法，电穿孔法或一些其他插入工具可通过细菌如Agrobactertumafaciens LB4404插入这些系统。一旦被插入，它们可以稳定形式和可遗传方式结合进植物基因组中。这些植物系统有许多优点，如方便培育和大量收获。农民有经验栽培这种产业重要性的植物如烟草，大豆，油菜子和其他野生农作物，它们是对丝生产有意义的主要植物。目前的方法有从烟草和大豆纯化高分子量蛋白质。
昆虫系统
可使用Baculovirus表达系统并且该系统在昆虫细胞系中高水平表达蛋白质是众所周知的。通过一些载体包括pBacPAK6，pBacPAK8或pBacPAC9完成复制和高效转染。它们可被用于高水平表达尽管它们可能不如其他系统那样低成本。
其他动物系统
还有许多载体可被用于插入各种动物。虽然它们目前是不具有商业价值的载体宿主系统，但可应用在该蛋白质将来成为有用之物的地方。
发酵方法
被转染宿主的第一次发酵在LB中进行，其中含10克细菌蛋白胨，5克Bacto酵母提取物和5克盐和蒸馏水到一升终浓度。在此特定的肉汤中观察到大量产蛛丝细菌的沉淀或絮状物。此观察是重要的，因为它表明了蛋白质通过细胞膜被分泌出来。然而这些高分泌率似乎使细胞有些渗漏。因此，增加生理盐浓度可能稳定培养物。
发明者发现在低温时，特别是在室温或室温以下，蛋白质生产增加。还发现，较高温时发酵培养基中的蛋白质消失得比在室温或室温以下快。这个现象表明在约37℃的较高温诱导出蛋白酶。值得注意的是，像许多蛋白酶如溶菌酶或蛋白酶K那样，该蛋白酶似乎不降解蛛丝蛋白质。这些不需要的代谢作用在低温时最小。这可能是由于在低温时诱导出休克蛋白质。
还发现发酵培养基的成分影响蛋白酶活性。例如，两天培养物的尿素SDS凝胶没有显示出在LB培养基中生长时的蛋白质降解，但当培养物在补充了葡萄糖(10克葡萄糖，10克蛋白胨和5克酵母膏并蒸馏水到一升)的LB培养基上生长时，24小时后有大量的蛋白质降解。经补充的LB培养基和LB肉汤的唯一不同是LB肉汤含10克/升的氯化钠，而经补充的培养基含等量的葡萄糖。
由于这个蛋白酶的问题的发现，对蛋白酶抑制剂做了研究。人们认为若一种便宜的蛋白酶抑制剂能够被发现并搀入培养基，对发酵物的增加是有益的。被测试的化合物包括氯化锌，硫酸铜，EDTA二钠，氯化钠，硼酸，聚乙二醇(B-二氨基乙酯)，苯甲基磺酰氟，N，N，N′，N′-四乙酸，1，10啡咯啉，1，10啡咯啉铁复合物，蔗糖，葡萄糖，乳糖，果糖，甘油，胨和酵母膏。所发现的最有效的抑制剂是氯化钠或氯化钾的盐添加物。硼酸也被发现是良好的抑制剂。其他化合物是无效的。事实上，简单的蔗糖，特别是乳糖和葡萄糖，促进蛋白酶活性。胨和酵母膏不影响蛋白酶活性。用AOAC官方方法969.11，即用于测试啤酒中蛋白水解防冻酶的一种方法，测试这些化合物。为进行此测试，取1毫升培养物进行测试。活性蛋白酶存在时，仅数秒内该溶液变清。蛋白酶阴性的样品在60℃半小时或20℃过夜后显出浑浊。此测试被用做快速质量控制工具，筛选各种培养基的产蛋白水解酶能力。
试图使用各种培养基发酵。业已发现复合培养基表现出色。然而，使用比LB肉汤中所含低10倍的胨和酵母膏达到可接受的蛋白质产量。这种较简单的并且便宜的培养基产生出可观的蛋白质。这种培养基含下列成分：1.2克磷酸氢二钾，1.1克磷酸二氢钠，4.0克氯化钠，0.45克硫酸镁，2.0克硫酸铵，0.04克硝酸钠，0.03克氯化钙，0.02克硫酸铁，0.01克硫酸锰，0.01克硼酸，0.0005克钼酸钠，0.005克氯化钴，0.5克甘氨酸，1.0克丙氨酸，1.0克酵母膏，10克甘油，蒸馏水到1升，pH调到7.0。宽范围的培养基成分被用于本发明的发酵。这些培养基成分的范围可包括盐，甘油(或其他碳源)和酵母膏或其他矿物营养成分。若培养基比较便宜，它一般产生低水平的丝蛋白。
其他主要必须的最佳化发酵条件是氧，营养物水平和温度。30℃时的厌氧条件被发现是优选的。此外，碳源应以相对高的水平被加入以使生长和蛋白质表达最大化。例如，每升使用10克葡萄糖和10克甘油。
抗体测试
抗体测试被开发出以确定是否蛛丝蛋白质正在E.coli宿主中表达，用蚕丝和蜘蛛大的ampulate分泌腺丝以三种动物宿主进行抗体测试。
为生成这些抗体，蚕丝蛋白质取自做茧前第五星级的Bombyx mori蛆。通过挑选这类蛆，得到的丝是粘性的并且这类蛆看上去是透明的而可辨认。用无菌技术解剖取出黏液丝。然后将丝直接加入到佐剂中。另外，可抽出来自蜘蛛的大的ampulate分泌腺之蛛丝。然而，有必要溶解该蛛丝。通过将其悬浮在8摩尔的溴化锂在95℃加热5分钟进行溶解。该蛛丝和蚕丝被用于制造丝的抗体。
为生成该抗体，用8摩尔的尿素取代溴化锂并通过离心最终置于2摩尔的尿素中。一旦该样品置于尿素中，将两种丝任何之一与10毫升(1∶10)Freund′s完全佐剂混合。将其腹膜内注射给小鼠，兔或山羊以生成抗体。在第21天到28天，用该丝和Freund′s不完全佐剂增强免疫动物。到第五周，可以每周采血并收集血清中的抗体。该血清被用于血凝实验或Western杂交。对小鼠，兔和山羊使用这个方法，采血并分离血清。这样从每种动物中产生抗蚕丝和蛛丝的多克隆抗体。用标准的血凝实验对这些血清做抗体滴定并发现所有的血清至少有256滴度。
血凝实验
通过包被1％RBCs(Sigma Cat#R-3378)进行血凝实验。溶解的丝(1毫克)被加入到1毫升的1％RBCs中。在室温将其涡流混合数次并于冰箱中过夜。次日晨，通过在磷酸缓冲的生理盐水(pH7.2)中离心洗RBCs三次以除去任何非吸附蛋白质。然后将敏化的RBCs稳定在冰箱中2周或更长时间。
为进行血清血凝实验，25微升抗血清被连续稀释(2倍稀释)并加入25微升的敏化RBCs。对照孔也类似连续稀释并加入非敏化的(25微升)RBCs。室温中轻摇微量滴定板10分钟并将板温孵在室温90分钟，不要搅动。用Rose和Friedman方法(临床免疫学手册，第二版，美国微生物学会(1980))评估它们。因为其重复单位的类似性，许多丝有类似的折叠结构。因此，认为由于三级结构的类似性，可能存在一些交叉反应。业已发现蚕丝抗血清与蛛丝蛋白质敏化的RBC′s有交叉反应并发现蛛丝蛋白抗血清与蚕丝蛋白RBC′s有交叉反应。这类交叉反应成为主要工具以至可以对两组抗体测试一个培养物确证该丝不是由于另外的E.coli蛋白造成的。
我们还发现了另外的筛选方法，它基于用丝抗原包被RBC′s。已发现如果我们超声洗细胞，分离细胞膜并取其上清夜，我们可通过2倍连续稀释用它代替血清。在将25微升丝敏化的细胞铺在RBC′s上时，它们呈现典型的血凝实验，这可被用于转化子的第一次筛选。据推论，丝蛋白有粘性末端，它在溶液中会粘连到其他丝蛋白并交联到RBC′s。本实验使用同样机制，依此机制丝蛋白连接并从溶液中沉降出来。我们没有发现任何其他基于此机制的蛋白质检测参考资料。因此，我们期望这是一个很特异的丝和丝样蛋白质的检测。
为在菌落上进行血凝实验，用在PBS中离心洗细菌培养物3次并最终到100微升PBS中。用Brason 450超声仪在冰浴中以1/8英寸管尖，40％功率和20％负载周期对其超声处理2分钟。该溶液用于敏化PBC′s。检测在与上面相同的方法进行不同的是每次对一个不同的细菌分离物。在所有情况下，成功的产生丝蛋白的培养物有至少16的滴度并通常是256滴度。该方法被用于筛选上述质粒琼脂糖凝胶和杂交所发现的10个最有希望的分离物。在2Kb插入的情况，保留少数最好的分离物供进一步使用。
丝蛋白质的纯化
本发明还包括纯化和精纺丝蛋白的技术。这些步骤对加工该蛋白质成其终产品形式是必要的。该蛋白质可被用做涂层深入到纤维中，或制成一种聚合膜。
从发酵培养基纯化丝蛋白可通过两步工序完成。首先，通过连续离心可除去细菌细胞和沉淀的蛋白质。留在肉汤中的其余物质通过超滤被分离，因为大多数分子量在80,000之上的蛋白质是丝。然后可将得自连续离心的蛋白质丝系列与超滤方法结合。在细胞膜上可发现大批的其余蛋白质。通过用超声破细胞，所述细胞破碎并且其内的蛋白质被移出。
本发明的一个重要发现是使用超声溶解蛛丝，使其不用被清洗和完全干燥。然后此再溶解的丝蛋白质溶液可被离心以除去细胞膜。除去细胞膜后，蛋白质既可通过超离心被进一步纯化也可精纺。为精纺丝，保持丝在溶液中是重要的。然而，先前的方法使用十分粗糙的化学品保留丝的溶解性用于精纺操作。
各种化合物将保持丝蛋白在精纺加工前不沉淀。这些化合物包括各种盐，锂盐，钠和钾的氢氧化物，磷酸脲，盐酸胍，尿素，和六氟异丙醇--他们全都溶解丝。通过本发明还发现超滤纯化后，通过加入乙醇，甲醇，其他醇或类似溶剂可进一步进行纯化。这种纯化的丝蛋白物质通过超声或通过加入一种或多种上述盐化合物可被重新溶解。由丝蛋白溶解中成本和环境因素所决定的优选化合物是钠和钾的氢氧化物，氯化钠，氯化钾和氯化锂或结合超声或蛋白质纯化用醇类一起使用的溴化锂。
类似于其他丝蛋白质，蛛丝蛋白不易溶解。虽然有资料表明蛛丝可溶于粗化合物如甲酸(88％)，本发明者发现它会引起全长蛋白质的降解。然而，本发明者发现丝纤维可被再溶于LiSCN，LiBr，LiCI，尿素，六氟异丙醇，盐酸胍和类似的变性剂。一旦丝蛋白被溶解，较少的蛋白质变性剂包括尿素可被用于防止蛋白质再沉淀。在不可逆精纺成丝线前最可能推荐的是使用可溶性蛋白质。因此已经被从完全干燥的丝蛋白再溶解的丝蛋白和从发酵过程回收后还从未被完全干燥的丝蛋白被推荐用于精纺加工。
进一步加工丝蛋白成纤维
丝的一般加工
蚕丝蛋白一般以下面方式被加工。为使丝纤维的强度足以用于纺织，多至5个纤维被绞在一起。第一次缫丝后，丝被重绕成绞在一起的丝束。
然后生丝经过几道叫做拈丝的工序。丝束被清洗和缠绕在大线轴或筒管上。这些筒管被放在并丝架上，在那里单丝线被并丝和缠在一起以得到需要的丝线大小。然后该丝线被缠绕并用拈丝架的锭子抽出
然后拈丝架的丝筒管被放在水中并且丝在滚筒之间被伸展开。在拈丝架上的伸长程度影响纤维的直径。在伸展架上，丝线被制作得光洁而平滑。在最终被织成布料前，拈丝的丝线被煮沸以除去任何残余水溶性蛋白或其他粘性物质。因为煮沸步骤降低丝的重量，丝被沾入铁或锡的盐中以重获得失去的重量。在此沾入步骤中，丝纤维吸收一些这类盐而加重但不失其光泽。
蛛丝蛋白的专门加工
上述方法产生的蛛丝蛋白质以蚕丝蛋白质相同的方式可被加工成纤维。这需要精纺或挤压蛋白质或蛋白溶液以得到直径范围可在5微米到200微米或以上的丝线。在该加工的第一步是从发酵液浓缩丝蛋白。浓缩步骤可通过数种方法来完成，方法包括使用只容许给定分子量范围的物质通过的膜技术。用这些膜的一个缺点是成本。其他更具成本效益的浓缩丝蛋白质和除去宿主载体的方法包括连续离心或分批离心。此外，然后可用超声能量裂解细菌细胞壁并使细胞壁内产生的丝蛋白质挽出到液体培养基。为使丝蛋白质与细菌细胞壁分开，高浓度盐是有帮助的。
这时，蛋白质溶液通过各种醇可被沉淀出培养基。有用的醇包括甲醇，异丙醇和乙醇。以前的技术达到在加工中的这一步丝蛋白可被溶解于锂盐和含氟的有机溶剂。然而，这个方法是昂贵的并且有严重的环境问题。在本发明的一个更优选的实施方案中，用醇类或滤器浓缩蛛丝蛋白质然后通过使用氯化钠水溶液结合超声使其在溶液中保持粘性直到它们被挤压成丝。如有必要，可加入尿素，钠或钾的氢氧化物或锂盐如前述技术加工中公开的那样。然而，因为氯化钠和超声，可能仅需要使用很低浓度的这些物质。应注意的是，在纯化时使用过高的超声能量，延长的超声或高克分子浓度的锂盐可降低丝蛋白质的分子量。
一旦用小直径管或其他产生小直径纤维的方法挤压该蛋白，该蛋白可以类似于蚕丝的方式被加工。一旦该蛋白被暴露于空气和被干燥，它就不再溶于氯化钠或被超声处理。
然后可用类似于对蚕丝所使用的设备对该丝蛋白预伸展或拈丝。类似于对蚕丝所使用的，也可用煮沸方法。煮沸失去的大多数重量不是如蚕丝纤维加工时的水溶性蛋白质，而是残留盐份和发酵培养基的水溶性营养成分。若在此加工步骤期间失去的20-25％的重量通常是来自生蚕丝的话，则预期当经受煮沸水以清洁最终的丝或以准备其用于染色时失去的不到5％的重量是来自于本发明的蛛丝。
通过使用本发明的方法，丝蛋白的天然颜色可通过筛选编码进一步进入基因组DNA的引物而得到。本发明克隆和方法中产生的蛛丝蛋白质所观察到的有白色，黄色，粉红色和浅紫色。天然颜色的选择对编排纺织纤维的生产是有价值的，因为在许多情况下它将减小颜色印染的需要和相关的成本。
通过卷或缠绕两股或两股以上的线在一起制造较大的纱线蛛丝蛋白长丝可被以蚕丝类似的方式处理。此外，这些纱线可与碳或石墨纤维，硼或硼镀石墨纤维，或Kevlar混纺以制造惊人高强度纺织材料用于防弹服或其他应用中。相反，通过使用较小的纱线(包含三到五股纤维并且只含纯蛛丝)可生产有非常平滑感觉和光泽的纤维。该最终纺织品的弹性和其他性质可部分的通过挤压和精纺加工后对长丝或纤维的加工来控制。在蚕丝业的拈丝加工标准方面，与蚕丝加工不同的加工参数的主要改变是当它们被从初始蛋白质溶液抽丝或挤压出丝或以后的加工时，单股长丝的前延伸或伸展的程度。
除上述之外，蛛丝蛋白长丝的高强度性质容许其他加工改变。一种此类加工变量是丝线的在线涂布，用各种物质引入颜色，增加的强度，光泽，虹彩和增加纤维在外观，感觉或强度上市场化性能的其他质量。在线涂布可通过数种方法包括在挤压，缠绕或拈丝步骤中使蛛丝长丝通过各种浴池或槽来完成。在线蒸汽淀积也可被使用。在线蒸汽淀积物质到丝蛋白上时必须考虑到一些残留的盐份或其他发酵化合物可能在长丝开始被形成时出现，这些长丝在形成后易于保持湿度除非用烘箱，风扇或其他办法干燥。在某些情况下，推荐使用挤压后煮沸以除去全部痕量发酵培养基和再增溶化学物质--两者在织入纤维时均可引起皮肤的过敏反应。可蒸汽淀积在蛛丝蛋白质上的物质包括锡和钛的氧化物。这些氧化物在长丝上形成一层，其厚度取决于烘箱的条件。虽然钛层可产生较高强度的纤维，一些人对二氧化钛层有过敏反应并且这可能限制其用途在服装以外的应用中。然而氧化锡对人的皮肤接触是GRAS(普遍推荐为安全的)并因此可被用于服装应用方面。
蛛丝蛋白质的膜可通过包括浇铸的几种方法来生产，其中丝蛋白溶液被浇在或洒在板片上或通过使用滚筒。膜在浇铸或滚压前还可通过加入化合物到蛋白质中而被修饰。这包括活性分子的掺入，这些活性分子可起香料，调料，吸收剂或对各种生物试剂或武器的反应剂作用。膜可具有在加工中添加的颜色或者来自丝克隆蛋白质的天然颜色可被选择以引入一种天然色。

Claims (28)

1.产生编码丝蛋白的DNA片段的一种方法，包括步骤：选择从产丝蜘蛛收获的靶DNA，所述靶DNA包括多个重复和非重复区；选择至少10个核苷酸的单链DNA引物，该引物含与所述靶DNA中一个区域互补的DNA序列；和重复结合DNA引物与变性DNA，并将所述结合的DNA引物和靶DNA与核苷酸和有校读活性的DNA聚合酶一起温孵以产生所述DNA片段，其中所述DNA片段与所述靶DNA互补并至少是2Kb。
2.权利要求1的方法，包括使用两个不同的DNA引物的步骤。
3.权利要求1或2的方法，其中所述靶DNA是通过将编码蛛丝的全长mRNA反转录生成的cDNA；加入一个引物位点到所生成的第一链cDNA的氨基末端；和使用该cDNA的多聚dT区作为第一聚合酶引发区。
4.  权利要求1或2的方法，其中第二引物位点通过使用连接盒被创建在DNA的未知末端。
5.权利要求1或2的方法，其中第二引物位点通过使用末端转移酶被创建在DNA的未知末端以生成一个选自包含多聚dT，多聚dA，多聚dG和多聚dC的引物位点。
6.权利要求1或2的方法，包括选择Micrathena，Mastophora，Metepeira，Araneus，Argiope，Nephila，或Gasteracantha属的一种蜘蛛的步骤。
7.权利要求6的方法，包括选择由序列(i)-(xx)代表的引物DNA：
    (i)  GGCGAATTCGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT；
   (ii)  GGCGAATTCACCCTAGGGCTTGATAAACTGATTGAC；
  (iii)  GCATGCACGCATGGTGCATGGATGC；
   (iv)  TTCGAATTCATGGGCCCTGGACAACAAGGACCATCTGGACCT；
    (v)  GGAAGGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATG；
   (vi)  GAYGAYGGNAAYGCNGT；
  (vii)  TGNTGNCCSGTTCG；
 (viii)  CGSCGKCGSCCACGSCCSCG；
   (ix)  GTTAAATGTAAAATCAAGAGTTGCTAA；
    (x)  GGCCAATCTCTTTTGAGTGCATTTTAA；
   (xi)  TAAGCAACTCTTGATTTTACATTTAAC；
  (xii)  TTAAAATGCACTCAAAAGAGATTGGCC；
 (xiii)  TCAGCAGAATCTGGACAACAAGGCCCA；
  (xiv)  CCNCGNCCNCTYCC；
   (xv)  GGTGCAGCAGCAGCAGCTGCWGG；
  (xvi)  GGTGGTGCCGGACAAGGAGGMTATGGAGGWCTTGGA；
 (xvii)  GGWGGACGAGGTGGATTA；
(xviii)  GATAAAAAGAAATATGCTGCAGAACTTCACTTGGTTCAC；
  (xix)  CARGCNGGNGCNGCNGSNGGNGGNTTYGGNCC；and
   (xx)  GGNGGNGGNGCNGGNCARGCNGGNGCNGCNGSNGGNGGNTTYG
         GNCCNGGNGCNGGNGGN，
其中N＝G，A，T，C；V＝G，A，C；B＝G，T，C；H＝A，T，C；D＝G，A，T；K＝G，T；S＝G，C；W＝A，T；M＝A，C；Y＝C，T；和R＝A，G。
8.权利要求7的方法，其中所述靶DNA通过被杂交到含序列(i)-(xx)的DNA探针而被筛选，该探针可逆结合到支持物以富集编码丝DNA片段。
9.权利要求6的方法，其中所述DNA片段是至少5Kb。
10.一个编码蛛丝蛋白的DNA序列，所述DNA序列包含多个重复和非重复区并有至少2Kb长度。
11.权利要求10的DNA，其中所述DNA序列含至少5Kb长度。
12.权利要求10或11的DNA，其中所述蜘蛛属于Micrathena，Mastophora，Metepeira，Araneus，Argiope，Nephila或Gasteracantha属。
13.权利要求11的DNA，其中所述蜘蛛是Nephila clavipes。
14.权利要求12的DNA，其中所述DNA包含图1说明的序列。
15.一种聚合方法，包括以下步骤：筛选编码从产丝蜘蛛收获丝蛋白的靶DNA，所述靶DNA包含多个重复和非重复区；选择第一对不同的DNA引物，所述第一对DNA引物均与所述靶DNA一个区域互补，至少所述第一对DNA引物中之一由序列(i)-(xxvi)代表：
    (i)  GGCGAATTCGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT；
   (ii)  GGCGAATTCACCCTAGGGCTTGATAAACTGATTGAC；
  (iii)  GCATGCACGCATGGTGCATGGATGC；
   (iv)  TTCGAATTCATGGGCCCTGGACAACAAGGACCATCTGGACCT；
    (v)  GGAAGGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATG；
   (vi)  GAYGAYGGNAAYGCNGT；
  (vii)  TGNTGNCCSGTTCG；
 (viii)  CGSCGKCGSCCACGSCCSCG；
   (ix)  GTTAAATGTAAAATCAAGAGTTGCTAA；
    (x)  GGCCAATCTCTTTTGAGTGCATTTTAA；
   (xi)  TAAGCAACTCTTGATTTTACATTTAAC；
  (xii)  TTAAAATGCACTCAAAAGAGATTGGCC；
 (xiii)  TCAGCAGAATCTGGACAACAAGGCCCA；
  (xiv)  CCNCGNCCNCTYCC；
   (xv)  GGTGCAGCAGCAGCAGCTGCWGG；
  (xvi)  GGTGGTGCCGGACAAGGAGGMTATGGAGGWCTTGGA；
 (xvii)  GGWGGACGAGGTGGATTA；
(xviii)  GATAAAAAGAAATATGCTGCAGAACTTCACTTGGTTCAC；
  (xix)  CARGCNGGNGCNGCNGSNGGNGGNTTYGGNCC；and
   (xx)  GGNGGNGGNGCNGGNCARGCNGGNGCNGCNGSNGGNGGNTTYG
         GNCCNGGNGCNGGNGGN；
  (xxi)  GGCGGATCCGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT；
 (xxii)  GGCAAGCTTGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT；
(xxiii)  GGCGTCGACGGATCCATGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCT；
 (xxiv)  GGCGGSTCCACCCAAGGGCTTGATAAACTGATTGAC；
  (xxv)  GGCAAGCTTACCCAAGGGCTTGATAAACTGATTGAC；and
 (xxvi)  GGCGTCGACACCCAAGGGCTTGATAAACTGATTGAC
通过重复结合DNA引物与变性DNA并将所述结合的DNA引物和靶DNA与核苷酸和对有校读活性的DNA聚合酶一起温孵以产生第一DNA片段，所述第一DNA片段与所述靶DNA互补并至少是2Kb；所述聚合方法进一步包括选择第二对不同的DNA引物，在与所述第一对DNA引物的两个序列相比时至少所述第二对DNA引物之一是不同的，并且至少所述第二对DNA引物中之一由序列(i)-(xx)代表：通过重复结合所述第二对DNA引物与变性靶DNA并将所述结合的DNA引物和靶DNA与核苷酸和有校读活性的DNA聚合酶一起温孵而产生第二DNA片段，与所述第一DNA片段相比，所述第二DNA片段是不同的并也与所述靶DNA互补，所述第二DNA片段至少是2Kb；限制性酶切所述第一和第二DNA片段；和重组所述第一和第二DNA的限制性片段进被聚合的DNA，所述被聚合的DNA编码蛛丝蛋白并是至少4Kb。
16.权利要求15的聚合方法，其中所有DNA引物由序列(i)-(xxvi)代表。
17.权利要求16的聚合方法其中所有的DNA引物是不同的。
18.权利要求15-17的聚合方法，其中所述聚合的DNA是至少6Kb。
19.权利要求18的聚合方法，其中所述聚合的DNA是至少8Kb。
20.一种生产丝蛋白的方法，包括步骤：筛选权利要求12的DNA，插入所述DNA到一个表达载体中；用所述表达载体转染宿主细胞；在培养基中发酵所述的被转染细胞以生产丝蛋白；和回收所述丝蛋白。
21.权利要求20的方法，其中所述培养基含蛋白酶抑制剂。
22.权利要求21的生产丝蛋白的方法，进一步包括步骤：应用超声能量破碎宿主细胞；应用超声能量重悬浮丝蛋白；和离心所述被破碎的细胞以将细胞膜与所述丝蛋白分开。
23.权利要求22的生产丝蛋白的方法，进一步包括通过超滤或乙醇沉淀纯化丝蛋白的步骤。
24.精纺丝蛋白的方法，它包括浓缩权利要求23的被纯化的丝蛋白；抽丝被浓缩的丝蛋白纤维；精纺丝纤维以生产丝线；和清洗丝线以除去任何增溶剂的步骤。
25.权利要求24的精纺丝方法，其中增溶剂选自氢氧化钠，氢氧化钾，六氟异丙醇，盐酸胍，尿素，尿素磷酸酯，锂盐，有机溶剂，硫酸铵，醋酸，磷酸，二氯乙酸，甲酸和硫酸。
26.权利要求24的精纺方法，进一步包括用锡或钛涂层所述丝纤维或丝线。
27.一种包含权利要求24所制造的丝线的纤维。
28.权利要求27的纤维，进一步含蚕丝，Kevlar，石墨或碳纤维。
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