ES2856873T3 - Biomaterial multicapa para la regeneración de tejidos y la cicatrización de las heridas - Google Patents

Abstract

Una composición multicapa de biomaterial, que comprende: una primera y segunda capa; la primera capa comprende una matriz porosa del biomaterial, en donde la matriz porosa del biomaterial se caracteriza por un tamaño medio de los poros de al menos 200 μm y la segunda capa comprende un biomaterial impermeable, la segunda capa impermeable a una solución acuosa, en donde la matriz porosa del biomaterial y/o el biomaterial impermeable comprende la fibroína de la seda y en donde la composición multicapa de biomaterial se caracteriza porque cuando se une a un sitio de una herida o defecto de un órgano hueco, la primera capa proporciona un armazón para la regeneración del tejido y la segunda capa sella la herida o el defecto.

Description

DESCRIPCIÓN

Biomaterial multicapa para la regeneración de tejidos y la cicatrización de las heridas

Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio bajo 35 U.S.C. § 119(e) de la Solicitud Provisional de los EE. UU. Núm.

61/595,233 presentada el 6 de febrero del 2012.

Apoyo del gobierno

Esta invención se realizó con fondos federales bajo la Subvención Núm. P41 EB002520 otorgada por los Institutos Nacionales de Salud y los Institutos Nacionales de Bioingeniería e Imágenes Biomédicas y las Subvenciones Núm. P50 DK065298-06, T32DK60442 y K99DK083616-01A2 otorgadas por los Institutos Nacionales de Salud y los Institutos Nacionales de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales. El gobierno de los EE. UU. tiene determinados derechos en la invención.

Campo técnico

La tecnología descrita en la presente descripción se refiere a las composiciones del biomaterial y a los métodos para fabricarlas y usarlas.

Antecedentes

Se han explorado varios biomateriales, que incluyen las matrices acelulares, los injertos de tejido y las sustancias poliméricas (por ejemplo, PGA) para su uso en la regeneración de tejidos y/o la cicatrización de las heridas. Sin embargo, los armazones existentes, si bien permiten un determinado nivel de regeneración de los tejidos, conducen al fracaso del injerto a largo plazo debido a la contractura del implante, la rotura del injerto y/o la fibrosis. Estos problemas provocan retrasos en la cicatrización de las heridas e incluso morbilidad. El documento US 2008/147197 describe una composición que comprende una primera y una segunda capa; la primera capa comprende una matriz porosa del biomaterial y la segunda capa comprende un biomaterial impermeable.

El documento US 2003/114917 describe un injerto de endoprótesis que comprende una capa impermeable y una capa porosa. La capa porosa se forma al poner en contacto una mezcla de una solución acuosa del biomaterial y NaCl sobre la capa no porosa preformada; la sal se lixivia con agua. el injerto de endoprótesis comprende fármacos. Resumen

La tecnología descrita en la presente descripción está dirigida a las composiciones multicapas del biomaterial y a los métodos relacionados con las mismas. Las capas de estas composiciones difieren en sus propiedades físicas y proporcionan una composición completa que sirve tanto como un armazón para la regeneración de los tejidos como un sustrato suturable capaz de sellar una herida o defecto del tejido.

En un aspecto, la presente invención está dirigida a una composición multicapa de biomaterial como se define en la reivindicación 1. En algunas modalidades, la matriz puede ser una estructura seleccionada del grupo que consiste en: espumas; hidrogeles; fibras electrohiladas; geles; esteras de fibra; esponjas; armazones tridimensionales; esteras no tejidas; materiales tejidos; materiales de punto; haces de fibras y fibras. En algunas modalidades, la fibroína de la seda puede comprender la fibroína de la seda de Bombyx mori. En algunas modalidades, la primera y segunda capas pueden comprender el mismo biomaterial. En algunas modalidades, la primera y segunda capas pueden comprender diferentes biomateriales. En un aspecto, descrito en la presente descripción es una composición que comprende una primera y una segunda capa; la primera capa comprende una matriz porosa de la fibroína de la seda y la segunda capa comprende una película impermeable de la fibroína de la seda. En algunas modalidades, la composición puede comprender además un agente. En algunas modalidades, el agente puede seleccionarse del grupo que consiste en: un antibiótico; un agente para atraer a las células; una célula; una célula madre; un ligando; un factor de crecimiento; una plaqueta y un componente de la matriz extracelular.

En algunas modalidades, el tamaño medio de los poros de la matriz del biomaterial puede ser de al menos 200 pm. En algunas modalidades, el tamaño medio de los poros de la matriz del biomaterial puede ser de al menos 300 pm. En algunas modalidades, el tamaño medio de los poros de la matriz del biomaterial puede ser de al menos 400 pm. En algunas modalidades, el tamaño medio de los poros de la matriz del biomaterial puede ser de aproximadamente 200 pm a aproximadamente 600 pm. En algunas modalidades, el tamaño medio de los poros de la matriz del biomaterial puede ser de aproximadamente 300 pm a aproximadamente 500 pm. En algunas modalidades, el tamaño medio de los poros de la matriz del biomaterial puede ser de aproximadamente 400 pm. En algunas modalidades, el tamaño medio de los poros de la matriz del biomaterial puede ser de aproximadamente 300 pm.

En algunas modalidades, la capa impermeable puede tener un espesor de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 600 pm. En algunas modalidades, la capa impermeable puede tener un espesor de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 400 pm. En algunas modalidades, la capa impermeable puede tener un espesor de aproximadamente 150 pm a aproximadamente 250 pm. En algunas modalidades, la capa impermeable puede tener un espesor de aproximadamente 25 pm a aproximadamente 150 pm. En algunas modalidades, la capa impermeable puede tener un espesor de aproximadamente 200 pm. En algunas modalidades, la composición puede tener un espesor de aproximadamente 0,01 cm a aproximadamente 5 cm. En algunas modalidades, la composición puede tener un espesor de aproximadamente 0,1 cm a aproximadamente 3 cm. En algunas modalidades, la composición puede tener un espesor de aproximadamente 0,1 cm a aproximadamente 2 cm. En algunas modalidades, la composición puede tener un espesor de aproximadamente 1 cm.

En algunas modalidades, la composición puede tener una forma seleccionada del grupo que consiste en: una hoja; un tubo y una hoja contorneada.

En un aspecto, la presente invención está dirigida a un método como se define en la reivindicación 7. En un aspecto, la tecnología descrita en la presente descripción se refiere a un método para producir una composición como se describe en la presente descripción, el método comprende; (a) fundir una mezcla de la solución acuosa del biomaterial y NaCl; (b) poner en contacto la composición resultante de la etapa (a) con el agua. En algunas modalidades, la etapa (a) se puede realizar con la solución en contacto con una capa del biomaterial impermeable preexistente. En algunas modalidades, el NaCl puede ser granular.

En algunas modalidades, la solución del biomaterial puede ser una solución de la fibroína de la seda. En algunas modalidades, la solución de la fibroína de la seda puede tener una concentración de aproximadamente 2 % p/vol a aproximadamente 15 % p/vol. En algunas modalidades, la solución de la fibroína de la seda puede tener una concentración de aproximadamente 4 % p/vol a aproximadamente 10 % p/vol. En algunas modalidades, la solución de la fibroína de la seda puede tener una concentración de aproximadamente 6 % p/vol.

En algunas modalidades, la mezcla se puede fundir durante aproximadamente 12 horas a aproximadamente 96 horas. En algunas modalidades, la mezcla se puede fundir durante aproximadamente 24 horas a 72 horas. En algunas modalidades, la mezcla se puede fundir durante aproximadamente 48 horas. En algunas modalidades, la etapa (b) puede continuar durante aproximadamente 12 horas a aproximadamente 120 horas. En algunas modalidades, la etapa (b) puede continuar durante aproximadamente 24 horas a aproximadamente 96 horas. En algunas modalidades, la etapa (b) puede continuar durante aproximadamente 72 horas.

En algunas modalidades, el agua puede ser agua destilada. En algunas modalidades, el agua se puede eliminar y reemplazar con un volumen fresco de agua al menos una vez durante la etapa (b). En algunas modalidades, durante la etapa de fundición, la mezcla de la solución del biomaterial y NaCl puede estar en contacto con una capa impermeable. En algunas modalidades, la capa impermeable del biomaterial puede comprender la fibroína de la seda.

En algunas modalidades, el método puede comprender además una primera etapa de fundición de una solución de la fibroína de la seda para formar una capa impermeable de la fibroína de la seda. En algunas modalidades, la solución de la fibroína de la seda puede tener una concentración de aproximadamente 2 % p/vol a aproximadamente 15 % p/vol. En algunas modalidades, la solución de la fibroína de la seda puede tener una concentración de aproximadamente 4 % p/vol a aproximadamente 10 % p/vol. En algunas modalidades, la solución de la fibroína de la seda puede tener una concentración de aproximadamente 8 % p/vol.

En algunas modalidades, la composición puede producirse en condiciones estériles o esterilizarse después de que se complete la etapa de enjuague. En algunas modalidades, la composición se puede producir en forma lineal. En algunas modalidades, la composición se puede producir en forma tubular. En algunas modalidades, el método puede comprender además la adición de un agente a al menos una capa. En algunas modalidades, el agente puede ser un agente terapéutico. En algunas modalidades, el método puede comprender además alterar el contenido de hojas p de una capa de la fibroína de la seda. En algunas modalidades, el contenido de hojas p de una capa de la fibroína de la seda se puede alterar mediante el uso de un método seleccionado del grupo que consiste en: poner en contacto la capa con vapor de agua; el secado; la deshidratación; el recocido con agua; el estiramiento; la compresión; la inmersión en disolvente; la inmersión en metanol; la inmersión en etanol; el ajuste de pH; el tratamiento térmico y la sonicación. En algunas modalidades, el contenido de hojas p de una capa de la fibroína de la seda se puede alterar después de añadir un agente a la capa.

En un aspecto, la tecnología descrita en la presente descripción se refiere a un método para la cicatrización de las heridas o reparar un defecto del tejido, el método comprende aplicar una composición como se describe en la presente descripción a la herida o al defecto del tejido. En algunas modalidades, la herida o el defecto del tejido se puede ubicar en un órgano hueco. En algunas modalidades, el órgano hueco se puede seleccionar del grupo que consiste en: la vejiga; una parte del tracto gastrointestinal; el estómago y los intestinos. En algunas modalidades, la herida o el defecto del tejido se puede seleccionar del grupo que consiste en: una herida o defecto de la piel; una úlcera diabética; una herida o defecto óseo; una herida o un defecto en la articulación; una herida o defecto del menisco; una herida o defecto del cartílago articular; una herida o defecto del tejido blando; una herida o defecto del tejido pulmonar y una herida o defecto renal. En algunas modalidades, la capa impermeable se puede orientar para evitar el movimiento del material dentro o fuera de la herida o defecto.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa el análisis de microscopía electrónica de barrido y el ensayo de tracción de las propiedades estructurales y mecánicas de las composiciones bicapa producidas de acuerdo con el Método 1 del Ejemplo 1.

La Figura 2 representa el análisis de microscopía electrónica de barrido y el ensayo de tracción de las propiedades estructurales y mecánicas de las composiciones bicapa producidas de acuerdo con el Método 2 del Ejemplo 1.

La Figura 3 representa las imágenes de los cistogramas de las vejigas 1 y 3 meses posteriores a la implantación. La Figura 4 representa la evaluación urodinámica de la vejiga aumentada con la seda a los 3 meses de la implantación en comparación con los controles no aumentados.

Las Figuras 5A-5B representan los resultados de los análisis estructurales y mecánicos de los grupos de armazones. La Figura 5A representa las fotomicrografías de las imágenes SEM representativas que demuestran las vistas superiores y en sección transversal de las configuraciones de la matriz. Recuadro: Vista inferior del armazón FF. La Figura 5B representa los resultados de la evaluación de la resistencia máxima a la tracción (UTS), el módulo elástico (EM) y el % de alargamiento hasta la falla (ETF) en los grupos de las matrices definidos en la Figura 5A. Medias ± desviación estándar por punto de datos. (*) representa los datos previamente reportados en Gomez y otros, 2011.

Las Figuras 6A-6B representan la caracterización de la incidencia y el tamaño de los cálculos urinarios en las vejigas regeneradas. La Figura 6A es una tabla de cuantificación de la frecuencia y el diámetro de los cálculos en las vejigas aumentadas con cada grupo de la matriz y los controles de cistotomía. La Figura 6B representa las fotomicrografías de los cálculos urinarios en las vejigas regeneradas y en los controles. Las flechas indican los cálculos. Barra de escala = 2,5 mm.

Las Figuras 7A-7B representan el análisis cistométrico y la cuantificación de los parámetros urodinámicos en las vejigas aumentadas después de 10 semanas posteriores a la implantación. La Figura 7A representa los trazados cistométricos representativos de los ciclos de evacuación mostrados por los controles de cistotomía, vejigas aumentadas GS1, GS2 y FF. (*) indica los vacíos individuales. La Figura 7B representa una tabla de las comparaciones de los parámetros urodinámicos entre los grupos experimentales mostrados en [A]. (*) = p <0,05 en comparación con los controles de cistotomía.

Las Figuras 8A-8C demuestran que las vejigas aumentadas con la seda muestran aumentos de capacidad con el tiempo. Las Figuras 8A (preop) y 8B (3 meses posteriores al implante) representan los cistogramas de las vejigas. La Figura 8C representa el análisis cistométrico de la capacidad de la vejiga (capacidad a 20 cm de H2O) antes de la operación y 3 meses después del aumento con el armazón de la seda.

Las Figuras 9A-9D representan el análisis estructural del armazón bicapa de seda y la integración de la vejiga porcina. Las Figuras 9A (vista lateral) y 9B (vista superior) representan las imágenes de la microscopía electrónica de un armazón bicapa. La Figura 9C representa una imagen de una composición del armazón bicapa. La figura 9D representa una vista de la cúpula de la vejiga con un armazón implantado.

Las Figuras 10A-10B representan el análisis de la formación de los cálculos en los implantes. La Figura 10A representa una tabla de la frecuencia y el diámetro de los cálculos en cada grupo de tratamiento. La Figura 10B representa las fotografías de la formación de los cálculos.

Las Figuras 11A-11B representan los trazados cistométricos representativos de los ciclos de evacuación presentados por los grupos experimentales (Figura 11A) y las comparaciones de los parámetros urodinámicos (Figura 11B) de los trazados mostrados en la Figura 11B. (*) = p <0,05 en comparación con la cistotomía Las Figuras 12A-12B representan los gráficos de las propiedades de tracción (Figura 12A) y funcionales (Figura 12B) de los tejidos regenerados de la vejiga. La Figura 12a representa los perfiles de tensión-deformación de los tejidos regenerados y control. La Figura 12B representa las respuestas de contracción en el músculo liso intacto (+M) y desmucosalizado (-M) en respuesta al carbacol en los cultivos de órganos en baño. Tejido regenerado por cúpula. Vejiga normal del cuerpo. Las concentraciones molares de carbacol se muestran en el eje x.

La Figura 13 representa un esquema del modelo de ileoplastia en ratas para la implantación de la seda bicapa. La Figura 14 representa los gráficos de los análisis del ensayo de tracción de los tejidos de la vejiga porcina nativa y regenerada realizados para evaluar la tensión mecánica.

Las Figuras 15A-15B representan los esquemas de las modalidades ilustrativas de las composiciones descritas en la presente descripción.

La Figura 16 representa una electromicrografía que demuestra la presencia de los poros primarios y secundarios en una capa porosa.

La Figura 17 representa las fotografías de las observaciones macroscópicas del tejido del íleon de rata implantado con un armazón bicapa de seda a las 10 semanas posteriores a la implantación. Los recuadros discontinuos indican el tejido regenerado.

La Figura 18 representa las imágenes de las observaciones macroscópicas del tejido (panel izquierdo) y microCT (panel derecho) del tracto gastrointestinal implantado con un armazón bicapa de seda 10 semanas posteriores a la operación. Las imágenes demuestran la continuidad del tracto GI después de la instalación del agente de contraste (se realizó una ileoplastia). Las flechas indican el área del tejido regenerado.

Las Figuras 19A-19B demuestran que los armazones de la seda apoyan la continuidad uretral después de la uretroplastia de injerto en los conejos. La Figura 19A representa una imagen del modelo del procedimiento quirúrgico e implantación de la seda dentro de la uretra del conejo. La Figura 19B representa los uretrogramas retrográficos que demuestran que no hay reducción en el calibre uretral o formación de contracción después de 3 meses de la implantación de la seda. Los controles representan las uretras que se incidieron quirúrgicamente, claosaron y se mantuvieron en paralelo con los animales implantados con la seda. Los resultados son representativos de los animales N = 2 realizados con los implantes de la seda, así como los controles. Las flechas indican el sitio de implantación original o una lesión simulada.

Descripción detallada

En la presente descripción se describen las composiciones relacionadas con una composición multicapa del biomaterial y los métodos relacionados con la misma. Como se describe en la presente descripción, los inventores han demostrado que las composiciones multicapa del biomaterial que comprenden al menos una capa porosa de la matriz del biomaterial y una capa impermeable del biomaterial proporcionan un armazón para la regeneración de los tejidos, propiedades de elasticidad que imitan los tejidos nativos, un sustrato fácilmente suturable y la capacidad de sellar eficazmente una herida o defecto (por ejemplo, evitar el paso de fluidos y/o materiales celulares a través de la herida o defecto). Como se demuestra adicionalmente, estas composiciones multicapa proporcionan mejoras en la cicatrización de las heridas en comparación con las composiciones monocapa.

En un aspecto, en la presente descripción se describe una composición que comprende una primera y una segunda capa; la primera capa comprende una matriz porosa del biomaterial y la segunda capa comprende un biomaterial impermeable.

Como se usa en la presente descripción, el término "matriz" se refiere a la estructura física que contiene el biomaterial. Los ejemplos no limitantes de las estructuras de la matriz incluyen las espumas; los hidrogeles; las fibras electrohiladas; los geles; las esteras de fibra; las esponjas; los armazones tridimensionales; las esteras no tejidas; los materiales tejidos; los materiales de punto; los haces de fibras y las fibras y otros formatos de materiales (ver, por ejemplo, Rockwood y otros Nature Protocols 2011 6:1612-1631 y las publicaciones de patente de los EE. UU.

2011/0167602; 2011/0009960; 2012/0296352 y la Patente de los EE. UU. Núm. 8,172,901). La estructura de la matriz se puede seleccionar por un experto en la técnica que depende de la aplicación prevista de la composición, por ejemplo, las matrices electrohiladas pueden tener un área de superficie mayor que las espumas y, por lo tanto, pueden ser preferibles en las aplicaciones donde, por ejemplo, se regenera el tejido pulmonar y/o renal, ya que la mayor superficie fomenta el intercambio de masa/gas.

En algunas modalidades, la composición es un hidrogel. Como se usa en la presente descripción, el término "hidrogel" se refiere a una estructura polimérica tridimensional que es insoluble en agua pero que es capaz de absorber y retener grandes cantidades de agua para formar una estructura estable, a menudo blanda y maleable. En algunas modalidades, el agua puede penetrar entre las cadenas poliméricas de la red polimérica, lo que provoca posteriormente el hinchamiento y la formación de un hidrogel. En general, los hidrogeles son superabsorbentes. Los hidrogeles tienen muchas propiedades deseables para las aplicaciones biomédicas. Por ejemplo, pueden hacerse no tóxicos y compatibles con el tejido y son muy permeables al agua, los iones y a las moléculas pequeñas. Los hidrogeles son superabsorbentes (pueden contener más del 99 % de agua) y pueden estar compuestos de polímeros naturales (por ejemplo, la seda) o sintéticos, por ejemplo, PEG.

En algunas modalidades, la capa impermeable puede tener forma de película. El espesor de la película puede variar de nanómetros a milímetros. Por ejemplo, el espesor de la película puede variar entre aproximadamente 1 nm y aproximadamente 1000 mm. En algunas modalidades, el espesor de la película puede ser de aproximadamente 1 nm a 1000 nm, de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 1000 mm, de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 1000 pm. En algunas modalidades, el espesor de la película puede ser de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 750 pm, de aproximadamente 750 nm a aproximadamente 500 pm, de aproximadamente 1000 nm a aproximadamente 250 pm, de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 100 pm, de aproximadamente 25 pm a aproximadamente 75 pm. En algunas modalidades, el espesor de la película varía de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 1 mm.

En algunas modalidades, la capa porosa de la matriz puede tener forma de una espuma. Las espumas se pueden preparar a partir de los métodos conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, la liofilización y la formación de espuma con gas en los que el agua es el disolvente o el nitrógeno u otro gas es el agente de expansión, respectivamente o, por ejemplo, al lixiviar con sal y/o partículas solubles en agua.

La matriz del biomaterial de la primera capa es una matriz porosa del biomaterial, es decir, la matriz tiene porosidad. Como se usa en la presente descripción, el término "porosidad" significa el volumen fraccional (sin dimensión) de la composición que se compone de un espacio abierto, por ejemplo, poros u otras aberturas. Por lo tanto, la porosidad mide los espacios vacíos en un material y es una fracción del volumen de vacíos respecto al volumen total, como un porcentaje entre 0 y 100 % (o entre 0 y 1). Ver, por ejemplo, Coulson J.M. y otros, Chemical Engineering, 1978, volumen 2, 3ra edición, Pergamon Press, 1978, página 126). La determinación de la porosidad de la matriz es bien conocida por un experto en la materia, por ejemplo, mediante el uso de las técnicas estandarizadas, tales como la porosimetría de mercurio y la adsorción de gas, por ejemplo, la adsorción de nitrógeno. Generalmente, la porosidad de la composición puede variar de 0,5 a 0,99, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 0,99 o de aproximadamente 0,8 a aproximadamente 0,95. En algunas modalidades, la porosidad de la composición puede ser de al menos 0,75. En algunas modalidades, la porosidad de la composición puede ser de al menos 0,8. En algunas modalidades, la porosidad de la composición puede ser de al menos 0,9.

La capa porosa proporciona, por ejemplo, la migración celular y la regeneración de los tejidos. El tamaño de los poros de la capa porosa puede variar, por ejemplo, de acuerdo con el tamaño y/o forma de las células y/o tejido que se regenerará. Como se usa en la presente descripción, el término "tamaño de los poros" se refiere a un diámetro o un diámetro efectivo de las secciones transversales de los poros. El término "tamaño de los poros" también puede referirse a un diámetro medio o un diámetro efectivo medio de las secciones transversales de los poros, basado en las medidas de una pluralidad de los poros. El diámetro efectivo de una sección transversal que no es circular es igual al diámetro de una sección transversal circular que tiene la misma área de sección transversal que la de la sección transversal no circular. En algunas modalidades, un hidrogel puede hincharse cuando el hidrogel está hidratado. Los tamaños de los poros pueden cambiar luego en dependencia del contenido de agua en el hidrogel. Los poros se pueden llenar con un líquido, tales como agua o aire. Un experto en la técnica entenderá que los poros pueden presentar una distribución de tamaños alrededor del "tamaño" indicado. A menos que se indique lo contrario, el término "tamaño", como se usa en la presente descripción, se refiere al modo de distribución del tamaño de los poros, es decir, el valor que aparece con mayor frecuencia en la distribución del tamaño.

Los poros pueden tener una sección transversal o una abertura sustancialmente redondas. Lo que se entiende por "sustancialmente redondo" es que la relación de las longitudes de los ejes perpendiculares más largo al más corto de la sección transversal de los poros es menor o igual a aproximadamente 1,5. Sustancialmente redondo no requiere un eje de simetría. En algunas modalidades, la relación de las longitudes entre los ejes más largo y más corto de la sección transversal de los poros es menor o igual a aproximadamente 1,5, menor o igual a aproximadamente 1,45, menor o igual a aproximadamente 1,4, menor o igual a aproximadamente 1,35, menor o igual a aproximadamente 1,30, menor o igual a aproximadamente 1,25, menor o igual a aproximadamente 1,20, menor o igual a aproximadamente 1,15 menor o igual a aproximadamente 1,1.

En algunas modalidades, el tamaño medio de los poros de la matriz del biomaterial puede ser de al menos 200 pm. En algunas modalidades, el tamaño medio de los poros de la matriz del biomaterial puede ser de al menos 300 pm. En algunas modalidades, el tamaño medio de los poros de la matriz del biomaterial puede ser de al menos 400 pm. En algunas modalidades, el tamaño medio de los poros de la matriz del biomaterial puede ser de aproximadamente 200 pm a aproximadamente 600 pm. En algunas modalidades, el tamaño medio de los poros de la matriz del biomaterial puede ser de aproximadamente 300 pm a aproximadamente 500 pm. En algunas modalidades, el tamaño medio de los poros de la matriz del biomaterial puede ser de aproximadamente 400 pm. En algunas modalidades, el tamaño medio de los poros de la matriz del biomaterial puede ser de aproximadamente 300 pm. El tamaño medio de los poros de la matriz puede ser el tamaño medio (por ejemplo, el diámetro) de todos los poros de la matriz. En algunas modalidades, el tamaño medio de los poros de la matriz puede ser el tamaño medio de los poros (por ejemplo, el diámetro) de todos los poros primarios de la matriz. En algunas modalidades, la matriz puede comprender poros primarios y secundarios (ver, por ejemplo, la Figura 16; donde un solo poro primario 14 está contenido dentro del círculo de línea discontinua y se indica un poro secundario 16). Los poros primarios tienen un diámetro sustancialmente mayor que los poros secundarios y los poros secundarios interconectan los poros primarios. En algunas modalidades, los poros primarios son la población de los poros que tienen un diámetro medio de al menos 3 veces el tamaño medio de los poros de los poros restantes.

La segunda capa de la composición comprende una capa impermeable del biomaterial. Como se usa en la presente descripción, "impermeable" se refiere a un material que puede evitar el paso de una solución acuosa a través del material a una temperatura, tensión y presión de fluido particulares. En algunas modalidades, la capa impermeable puede no tener poros observables. En algunas modalidades, la capa impermeable puede no tener poros observables que transiten por todo el espesor de la capa.

Las composiciones descritas en la presente descripción pueden ser elásticas. Por ejemplo, la composición puede tener una extensibilidad de aproximadamente 500 %, aproximadamente 400 %, 300 %, 200 %, 100 %, 50 % o aproximadamente 25 %. En algunas modalidades, la composición puede tener un módulo elástico en el intervalo de aproximadamente 10-2 kPa a aproximadamente 103 kPa. Como se usa en la presente descripción, el término "módulo elástico" se refiere a la tendencia de un objeto o sustancia a deformarse elásticamente (es decir, no permanentemente) cuando se le aplica una fuerza. Generalmente, el módulo elástico de un objeto se define como la pendiente de su curva de tensión-deformación en la región de deformación elástica. Especificar cómo se medirán la tensión y la deformación, incluidas las direcciones, permite definir muchos tipos de módulos elásticos. El módulo de Young (E) describe la elasticidad a la tracción o la tendencia de un objeto a deformarse a lo largo de un eje cuando se aplican fuerzas opuestas a lo largo de ese eje; se define como la relación entre la tensión de tracción y la deformación por tracción. A menudo se lo denomina simplemente como el módulo elástico. El módulo de fibras (K) describe la elasticidad volumétrica o la tendencia de un objeto a deformarse en todas las direcciones cuando se carga uniformemente en todas las direcciones; se define como la tensión volumétrica sobre deformación volumétrica y es la inversa de la compresibilidad. El módulo de fibras es una extensión del módulo de Young a tres dimensiones. Otros tres módulos elásticos son la relación de Poisson, el primer parámetro de Lame y el módulo de onda P. En algunas modalidades, la composición puede tener un módulo elástico en el intervalo de aproximadamente 1 kPa a aproximadamente 25 kPa. En algunas modalidades, la composición puede tener un módulo elástico de aproximadamente 5 kPa, aproximadamente 10 kPa, aproximadamente 15 kPa o aproximadamente 20 kPa. En algunas modalidades, la composición puede tener un módulo de Young en el intervalo de aproximadamente 15 kPa a aproximadamente 35 kPa.

La primera y segunda capas están dispuestas de modo que la segunda capa reviste y/o cubre no más del 70 % del área superficial de la primera capa, por ejemplo, 70 % o menos, 60 % o menos, 50 % o menos, 40 % o menos o 30 % o menos del área superficial de la primera capa. En algunas modalidades, en donde toda la composición tiene una forma que se aproxima a un cuboide, la primera capa puede revestir y/o cubrir una cara del cuboide. En algunas modalidades, en donde toda la composición tiene una forma que se aproxima a un cuboide, la primera capa puede revestir y/o cubrir la totalidad de una cara del cuboide. En algunas modalidades, donde toda la composición tiene una forma que se aproxima a una hoja o plano, la primera capa puede revestir y/o cubrir una cara de la hoja o del plano. En algunas modalidades, donde toda la composición tiene una forma que se aproxima a una hoja o plano, la primera capa puede revestir y/o cubrir la totalidad de una cara de la hoja o del plano.

Cada una de las capas de la composición puede comprender uno o más biomateriales. Como se usa en la presente descripción, "biomaterial" se refiere a un material que es biocompatible y biodegradable. Como se usa en la presente descripción, el término "biocompatible" se refiere a las sustancias que no son tóxicas para las células. En algunas modalidades, se considera que una sustancia es "biocompatible" si su adición a las células in vitro da como resultado una muerte celular menor o igual a aproximadamente el 20 %. En algunas modalidades, se considera que una sustancia es "biocompatible" si su adición a las células in vivo no induce inflamación y/u otros efectos adversos in vivo. Como se usa en la presente descripción, el término "biodegradable" se refiere a las sustancias que se degradan en condiciones fisiológicas. En algunas modalidades, una sustancia biodegradable es una sustancia que se descompone mediante la maquinaria celular. En algunas modalidades, una sustancia biodegradable es una sustancia que se degrada mediante procesos químicos.

Los ejemplos no limitantes de los biomateriales incluyen, la fibroína de la seda; PGA; colágeno; fibronectina, queratina, ácido poliaspártico, polilisina, alginato, quitosano, quitina, ácido hialurónico, glicosaminoglicano, seda, fibrina, MATRIGEL®, ácido algínico, ácido pectínico, carboximetilcelulosa, ácido hialurónico, heparina, sulfato de heparina, carboximetilquitosano, pululano, gellan, xantano, gelatina, carboximetil almidón, carboximetil dextrano, sulfato de condroitina, guar catiónico, almidón catiónico, ésteres de algínico o pectínico y similares. En algunas modalidades, una capa de la composición puede comprender uno o más biomateriales, por ejemplo, un biomaterial, dos biomateriales, tres biomateriales, cuatro biomateriales o más biomateriales. En algunas modalidades, la primera y la segunda capa pueden comprender el mismo biomaterial y/o la misma combinación de biomateriales. En algunas modalidades, la primera y la segunda capa pueden comprender diferentes biomateriales y/o diferentes combinaciones de biomateriales.

En las modalidades de acuerdo con la invención, al menos una de la capa de la matriz del biomaterial o la capa impermeable del biomaterial comprende la fibroína de la seda. En algunas modalidades, ambas capas pueden comprender la fibroína de la seda. En algunas modalidades, cualquier capa puede consistir en la fibroína de la seda. En algunas modalidades, ambas capas pueden consistir en la fibroína de la seda. En algunas modalidades, la fibroína de la seda comprende la fibroína de la seda de Bombyx mori. Como se usa en la presente descripción, el término "fibroína de la seda" incluye la fibroína de los gusanos de la seda y la proteína de la seda de las arañas o los insectos. Ver, por ejemplo, Lucas y otros, 13 Adv. Protein Chem. 107 (1958). Puede usarse cualquier tipo de la fibroína de la seda. La fibroína de la seda producida por los gusanos de la seda, tales como Bombyx mori, es la más común y representa un recurso renovable y amigable con el planeta. Por ejemplo, la fibroína de la seda puede obtenerse por la extracción de sericina de los capullos de B. mori. Los capullos de los gusanos de la seda orgánicos también están disponibles comercialmente. Sin embargo, hay muchas sedas diferentes, que incluyen la seda de araña (por ejemplo, obtenida de Nephila clavipes), sedas transgénicas, sedas genéticamente modificadas, tales como las sedas de bacterias, levaduras, células de mamíferos, animales transgénicos o plantas transgénicas (ver, por ejemplo, el documento WO 97/08315; la Patente de los EE. UU. Núm. 5,245,012) y las variantes de las mismas que pueden usarse. Puede prepararse una solución acuosa de la fibroína de la seda mediante el uso de las técnicas conocidas en la técnica. Los procesos adecuados para preparar una solución de la fibroína de la seda se divulgan, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de los EE. ^u U con núm. de serie 11/247,358; WO/2005/012606 y WO/2008/127401. La solución de la fibroína de la seda se puede diluir a una concentración más baja con agua desionizada o se puede concentrar, por ejemplo, hasta aproximadamente el 30 % (p/v), si se desea. Además, la fibroína de la seda puede modificarse químicamente con agentes activos en la solución, por ejemplo mediante reacciones de acoplamiento de diazonio o carbodiimida, interacción avidina-biodina o modificación genética y similares, para alterar las propiedades físicas y funcionalidades de la proteína de la seda. Ver, por ejemplo, PCT/US09/64673; PCT/US10/41615; PCT/US10/42502; Solicitud de los EE. UU. con núm. de serie 12/192,588. En algunas modalidades, la fibroína de la seda usada en la presente descripción puede reducirse en sericina mediante cualquier método conocido en la técnica.

Alternativamente, la solución de la fibroína de la seda se puede producir mediante el uso de los disolventes orgánicos. Tales métodos se han descrito, por ejemplo, en Li, M. y otros, J. Appl. Poly Sci. 2001, 79, 2192-2199; Min, S. y otros Sen'I Gakkaishi 1997, 54, 85-92; Nazarov, R. y otros, Biomacromolecules 2004 mayo-junio; 5(3):718-26. Se conocen en la técnica varios métodos para producir la matriz de la seda. En algunas modalidades, se puede producir un hidrogel de la seda al sonicar una solución de la seda que contiene la seda o la fibroína de la seda. Ver, por ejemplo, la Solicitud de Pat. de los EE. UU. Núm. U.S. 2010/0178304 y la Solicitud Internacional Núm.: WO 2008/150861.

En modalidades alternativas, la matriz de la seda se puede producir al aplicar una tensión cortante a una solución de la seda. Ver, por ejemplo, la Solicitud Internacional Núm.: Wo 2011/005381 que describe los métodos para producir gelificación de la fibroína de la seda inducida por vórtice para la encapsulación y la entrega.

En otras modalidades, el hidrogel de la seda se puede producir al modular el pH de una solución de la seda. El pH de la solución de la seda se puede alterar al someter la solución de la seda a un campo eléctrico y/o al reducir el pH de la solución de la seda con un ácido. Ver, por ejemplo, la Solicitud de los EE. UU. Núm.: US 2011/0171239, para obtener detalles sobre los métodos de producción de los geles de la seda inducidos por pH.

Cualquiera y/o ambas capas de las composiciones descritas en la presente descripción pueden comprender además micropartículas y/o nanopartículas, por ejemplo, micropartículas y/o nanopartículas de biomateriales, que opcionalmente comprenden un agente terapéutico. A modo de ejemplo no limitativo, se conocen en la técnica varios métodos para producir micropartículas o nanopartículas de la seda. En algunas modalidades, las micropartículas o nanopartículas de la seda se pueden producir mediante un método de separación de fases de alcohol polivinílico) (PVA) como se describe en, por ejemplo, la Solicitud Internacional Núm. WO 2011/041395, que describe los métodos de gelificación de la fibroína de la seda mediante el uso de la sonicación. Otros métodos para producir las micropartículas o nanopartículas de la seda, por ejemplo, se describen en la Solicitud de los EE.UU. Núm. US 2010/0028451 y la Solicitud Internacional. Núm.: Wo 2008/118133 (que usa un lípido como plantilla para hacer microesferas o nanoesferas de la seda) y en Wenk y otros J Control Release 2008; 132: 26-34 (que usa el método de aerosol para producir microesferas o nanoesferas de la seda) se puede usar con el propósito de fabricar micropartículas o nanopartículas de la seda que encapsulan un agente terapéutico. En algunas modalidades, las micropartículas o nanopartículas de la seda se pueden insertar adicionalmente en un biopolímero, por ejemplo, para prolongar la liberación de un agente terapéutico durante un período de tiempo. En algunas modalidades, el biopolímero puede ser un hidrogel de la seda para encapsular las micropartículas o nanopartículas de la seda cargadas con el agente terapéutico. Ver, por ejemplo, la Solicitud Internacional. Núm.: WO 2010/141133 para los métodos de producción de los armazones de la fibroína de la seda para la entrega de los antibióticos.

Las capas de la presente composición pueden comprender además al menos un agente, por ejemplo, 1 agente, 2 agentes, 3 agentes, 4 agentes, 5 agentes o más agentes. Como se usa en la presente descripción, un "agente" se refiere a cualquier molécula o combinación de moléculas añadidas a una composición durante la construcción que a) no está presente en el biomaterial usado para construir la composición. En algunas modalidades, el agente puede ser un agente bioactivo o un material bioactivo. Como se usa en la presente descripción, "agentes bioactivos" o "materiales bioactivos" se refieren a los materiales biológicos de origen natural, por ejemplo, los materiales de la matriz extracelular, tales como la fibronectina, vitronección y laminina; las citocinas y los factores de crecimiento y los factores de diferenciación. Los "agentes bioactivos" también se refieren a los materiales, moléculas o compuestos sintetizados artificialmente que tienen un efecto biológico en una célula, tejido u órgano biológico. Los pesos moleculares del agente bioactivo pueden variar desde muy bajos (por ejemplo, moléculas pequeñas, 200-500 Daltons) a muy altos (por ejemplo, ADN plasmídico, ~ 2 000 000 Daltons). En algunas modalidades, el agente bioactivo es una molécula pequeña. Como se usa en la presente descripción, el término "molécula pequeña" puede referirse a los compuestos que son "similares a los productos naturales", sin embargo, el término "molécula pequeña" no se limita a compuestos "similares a los productos naturales". Más bien, una molécula pequeña se caracteriza típicamente porque contiene varios enlaces carbono-carbono y tiene un peso molecular de menos de 5000 Daltons (5 kD). En algunas modalidades, una molécula pequeña puede tener un peso molecular de menos de 3 kD. En algunas modalidades, una molécula pequeña puede tener un peso molecular de menos de 2 kD. En algunas modalidades, una molécula pequeña puede tener un peso molecular de menos de 1 kD. En algunas modalidades, una molécula pequeña puede tener un peso molecular de menos de 700 D.

En algunas modalidades, el agente bioactivo es un agente terapéutico. Como se usa en la presente descripción, el término "agente terapéutico" se refiere a una sustancia usada en el diagnóstico, tratamiento o prevención de una enfermedad. Cualquier agente terapéutico conocido por los expertos en la técnica como beneficioso en el diagnóstico, tratamiento o prevención de una enfermedad se contempla como agente terapéutico en el contexto de la presente invención. Los agentes terapéuticos incluyen los compuestos farmacéuticamente activos, las hormonas, los factores de crecimiento, las enzimas, ADN, ADN plásmido, ARN, ARNip, virus, las proteínas, los lípidos, las moléculas proinflamatorias, los anticuerpos, los antibióticos, los agentes antiinflamatorios, los nucleótidos antisentido y los ácidos nucleicos transformantes o las combinaciones de los mismos. Cualquiera de los agentes terapéuticos puede combinarse en la medida en que dicha combinación sea biológicamente compatible.

Los agentes terapéuticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los que se encuentran en Harrison's Principles of Internal Medicine, 13a edición, Eds. T.R. Harrison y otros McGraw-Hill NY, Nueva York; Physicians 'Desk Reference, 50a edición, 1997, Oradell Nueva Jersey, Medical Economics Co.; Pharmacological Basis of Therapeutics, 8a edición, Goodman y Gilman, 1990; Farmacopea de los Estados Unidos, The National Formulary, USP XII NF XVII, 1990; la edición actual de Goodman and Oilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics y la edición actual de The Merck Index.

Los ejemplos no limitantes de los agentes pueden incluir un antibiótico; un agente para atraer a las células; una célula; una célula madre; un ligando; un factor de crecimiento; una plaqueta un antiinflamatorio; un componente de la matriz extracelular; las enzimas, las proteínas, los ácidos nucleicos, los anticuerpos, los antibióticos, los agentes hemostáticos y similares, como se describe en la presente descripción. Ver, por ejemplo, los documentos WO2004/062697 y WO2005/012606. El agente puede representar cualquier material que se pueda insertar en los biomateriales. Por ejemplo, el agente activo puede ser un agente terapéutico o un material biológico, tales como los péptidos, los ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN, ARNip), los análogos de los ácidos nucleicos, los nucleótidos, los oligonucleótidos, los ácidos nucleicos peptídicos (PNA), los aptámeros, los anticuerpos o los fragmentos o porciones de los mismos (por ejemplo, los paratopos o las regiones determinantes de la complementariedad), las moléculas similares a los anticuerpos, los antígenos o los epítopos, las hormonas, los antagonistas de las hormonas, los factores de crecimiento o los factores de crecimiento recombinantes y los fragmentos y las variantes de los mismos, mediadores de la unión celular (tal como RGD), las citocinas, las moléculas pequeñas, los fármacos, los colorantes, los aminoácidos, las vitaminas, los antioxidantes, los antifúngicos, los antivirales, los profármacos o las combinaciones de los mismos. Ver, por ejemplo, el documento PCT/US09/44117; Solicitud de Patente de los EE. UU. con núm. de serie 61/224,618). El agente activo también puede ser una combinación de cualquiera de los agentes mencionados anteriormente. Una célula, por ejemplo una plaqueta, puede ser autóloga del sujeto u obtenida de un donante.

Los agentes antibióticos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, actinomicina; aminoglucósidos (por ejemplo, neomicina, gentamicina, tobramicina); inhibidores de la p-lactamasa (por ejemplo, ácido clavulánico, sulbactam); glicopéptidos (por ejemplo, vancomicina, teicoplanina, polimixina); ansamicinas; bacitracina; carbacefem; carbapenémicos; cefalosporinas (por ejemplo, cefazolina, cefaclor, cefditoren, ceftobiprol, cefuroxima, cefotaxima, cefipeme, cefadroxil, cefoxitina, cefprozil, cefdinir); gramicidina; isoniazida; linezolid; macrólidos (por ejemplo, eritromicina, claritromicina, azitromicina); mupirocina; penicilinas (por ejemplo, amoxicilina, ampicilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, oxacilina, piperacilina); ácido oxolínico; polipéptidos (por ejemplo, bacitracina, polimixina B); quinolonas (por ejemplo, ciprofloxacina, ácido nalidíxico, enoxacina, gatifloxacina, levaquina, ofloxacina, etc.); sulfonamidas (por ejemplo, sulfasalazina, trimetoprim, trimetoprim-sulfametoxazol (cotrimoxazol), sulfadiazina); tetraciclinas (por ejemplo, doxiciclina, minociclina, tetraciclina, etc.); monobactamas, tales como aztreonam; cloranfenicol; lincomicina; clindamicina; etambutol; mupirocina; metronidazol; pefloxacina; pirazinamida; tiamfenicol; rifampicina; tiamfenicl; dapsona; clofazimina; quinupristina; metronidazol; linezolid; isoniazida; piracil; novobiocina; trimetoprima; fosfomicina; ácido fusídico u otros antibióticos tópicos. Opcionalmente, los agentes antibióticos también pueden ser péptidos antimicrobianos, tales como las defensinas, la magainina y la nisina o un bacteriófago lítico. Los agentes antibióticos también pueden ser las combinaciones de cualquiera de los agentes enumerados anteriormente. Ver también el documento PCT/US2010/026190.

En algunas modalidades, el agente bioactivo puede ser un factor de crecimiento o una citocina. Los factores de crecimiento y las citocinas adecuados incluyen, pero no se limitan a, el factor de células madre (SCF), el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), el factor estimulante de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), el factor 1 derivado de las células estromales, factor de acero, VEGF, TGFp, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), angiopoyetinas (Ang), factor de crecimiento epidérmico (EGF), bFGF, HNF, NGF, proteína morfogénica ósea (BMP), factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF), factor de crecimiento de los hepatocitos, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), interleucina (IL)-3, IL-1a, IL-1p, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 e IL-13, factores estimulantes de colonia, trombopoyetina, eritropoyetina, ligando fit3 y factor a de necrosis tumoral (TNFa). Otros ejemplos se describen en Barrientos y otros Wound Repair Regen 2008 16:585-601; Peplow y Baxter Photomed Laser Surg 201230:617-36; Demidova-Rice y otros Adv Skin Wound Care 201225:349-370; Kiwanuka y otros Clin Plast Surg 20129:239-248.

La composición puede comprender además los agentes hemostáticos ya que los agentes hemostáticos actúan típicamente para detener el sangrado y el sellador de los tejidos puede unirse y cerrar los defectos en los tejidos. La combinación de los agentes hemostáticos en el biomaterial puede presentar, por lo tanto, las características deseables durante la reparación quirúrgica para prevenir o detener el sangrado así como promover la reconstrucción del tejido. Los agentes hemostáticos ilustrativos adecuados para su uso en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, la trombina, la fibrina, el fibrinógeno, la gelatina, el colágeno, el polisacárido, la celulosa, los factores sanguíneos y las combinaciones de los mismos.

También se pueden mezclar los materiales adicionales en el biomaterial. Tales materiales incluyen, pero no se limitan a, el ácido poliaspártico, la polilisina, el alginato, la policaprolactona, el ácido poliláctico, el ácido poliglicólico, los polihidroxialcanoatos, los dextranos, los polianhídridos, PEO, PEG, glicerol (ver el documento PCT/US2009/060135) y otros polímeros biocompatibles, ver el documento WO 2004/0000915.

El biomaterial se puede modificar si se desea. Un experto en la técnica puede seleccionar los métodos apropiados para modificar los biomateriales, por ejemplo, en dependencia de los grupos laterales del biomaterial, la reactividad deseada del biomaterial y/o la densidad de carga deseada en el biomaterial. En una modalidad, la modificación de un biomaterial puede usar la química de las cadenas laterales de los aminoácidos, tales como las modificaciones químicas a través de los enlaces covalentes o las modificaciones a través de la interacción electrostática. Los métodos de modificación química ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, la reacción de acoplamiento de la carbodiimida (ver, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los EE. UU. Núm. US 2007/0212730), la reacción de acoplamiento del diazonio (ver, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los EE. UU. Núm. US 2009/0232963), interacción avidina-biotina (ver, por ejemplo, la Solicitud Internacional Núm.: WO 2011/011347) y pegilación con un derivado químicamente activo o activado del polímero PEG (ver, por ejemplo, la Solicitud Internacional Núm. WO 2010/057142). Como un ejemplo adicional no limitante, los biomateriales, por ejemplo, la fibroína de la seda también puede modificarse a través de la modificación genética para alterar las funcionalidades del biomaterial (ver, por ejemplo, la Solicitud Internacional Núm. WO 2011/006133). Por ejemplo, la fibroína de la seda puede modificarse genéticamente, lo que puede proporcionar una modificación adicional de la seda, tal como la inclusión de un polipéptido de fusión que comprende un dominio de proteína fibrosa y un dominio de mineralización, que puede usarse para formar un compuesto orgánico-inorgánico. Ver el documento WO 2006/076711. Además, el biomaterial puede combinarse con una sustancia química, tal como el glicerol, que, por ejemplo, afecta la flexibilidad de la composición. Ver, por ejemplo, el documento WO 2010/042798, las películas modificadas de la seda que contienen glicerol.

En algunas modalidades, el biomaterial proporciona una liberación controlada de la entrega de los agentes activos insertados (por ejemplo, los agentes terapéuticos o los materiales biológicos). La liberación controlada permite administrar dosis a lo largo del tiempo, con cinética de liberación controlada. En algunos casos, la entrega del agente terapéutico o del material biológico es continuo en el sitio donde se necesita el tratamiento, por ejemplo, durante varias semanas. La liberación controlada a lo largo del tiempo, por ejemplo, durante varios días o semanas, o más, permite la entrega continua del agente terapéutico o del material biológico para obtener los tratamientos preferidos. El vehículo de entrega controlada es ventajoso porque protege al agente terapéutico o al material biológico de la degradación in vivo en los fluidos y tejidos corporales, por ejemplo, por las proteasas. Ver, por ejemplo, el documento PCT/US09/44117. La liberación controlada del agente del biomaterial puede diseñarse para que se produzca a lo largo del tiempo, por ejemplo, durante más de aproximadamente 12 horas o 24 horas, inclusive; mayor de 1 mes o 2 meses o 5 meses, inclusive. El tiempo de liberación se puede seleccionar, por ejemplo, para que ocurra durante un período de tiempo de aproximadamente 12 horas a 24 horas o aproximadamente de 12 horas a 1 semana. En otra modalidad, la liberación puede ocurrir, por ejemplo, del orden de aproximadamente 1 mes a 2 meses, inclusive. El tiempo de liberación controlada se puede seleccionar en función de la afección tratada. Por ejemplo, un perfil de liberación particular puede ser más eficaz donde se desea una liberación constante y una dosis local alta.

En una modalidad alternativa, los biomateriales pueden incluir las nanopartículas plasmónicas para formar los elementos fototérmicos. Se ha demostrado que la terapia térmica ayuda en la entrega de varios agentes, ver Park y otros, Effect of Heat on Skin Permeability, 359 Intl. J. Pharm. 94 (2008). En una modalidad, pueden usarse ráfagas cortas de calor en áreas muy limitadas para maximizar la permeabilidad con efectos perjudiciales mínimos en los tejidos circundantes. Por lo tanto, el biomaterial dopado con partículas plasmónicas puede añadir especificidad a la terapia térmica al enfocar la luz para generar calor solo localmente por medio de los biomateriales. En algunas modalidades, los biomateriales pueden incluir los agentes fototérmicos, tales como las nanopartículas de oro.

Donde se hace referencia al "espesor" de la composición descrita en la presente descripción, se hace referencia a la distancia desde una superficie de la composición a una segunda superficie de la composición medida a lo largo de la línea más corta que cruzará ambas capas (ver, por ejemplo, la Figura 14B). En algunas modalidades, la capa impermeable puede tener un espesor de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 600 pm. En algunas modalidades, la capa impermeable puede tener un espesor de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 400 pm. En algunas modalidades, la capa impermeable puede tener un espesor de aproximadamente 150 pm a aproximadamente 250 pm. En algunas modalidades, la capa impermeable puede tener un espesor de aproximadamente 25 pm a aproximadamente 150 pm. En algunas modalidades, la capa impermeable puede tener un espesor de aproximadamente 200 pm. En algunas modalidades, la composición puede tener un espesor de aproximadamente 0,01 cm a aproximadamente 5 cm. En algunas modalidades, la composición puede tener un espesor de aproximadamente 0,1 cm a aproximadamente 3 cm. En algunas modalidades, la composición puede tener un espesor de aproximadamente 0,1 cm a aproximadamente 2 cm. En algunas modalidades, la composición puede tener un espesor aproximadamente 1 cm.

Las composiciones descritas en la presente descripción pueden formarse en cualquier forma y tamaño deseados. La forma de la composición puede ser, a modo de ejemplo no limitativo, una hoja; un tubo y una hoja contorneada. En algunas modalidades, las composiciones se pueden formar en láminas sustancialmente planas. En algunas modalidades, las composiciones se pueden formar en láminas contorneadas, por ejemplo, lámina que tiene al menos una curva, arco o ángulo. En algunas modalidades, el contorno de la hoja puede ser de manera tal que coincida con el contorno deseado del tejido a regenerar. En algunas modalidades, la composición se puede formar en un tubo o una porción de un tubo, por ejemplo, una hoja que está curvada, a lo largo de una dimensión, al menos 45 grados, por ejemplo, 45 grados o más, 90 grados o más, 180 grados o más, 200 grados o más, 240 grados o más, 300 grados o más o 360 grados o más.

En algunas modalidades, la capa impermeable puede extenderse más allá de la capa porosa, por ejemplo, si la capa porosa forma un cubo de 2" x 2", la capa impermeable puede formar una hoja de 3" x 3" en una cara del cubo. Esto puede proporcionar un sellado más completo alrededor de la herida y/o el defecto del tejido y/o proporcionar un sustrato para, por ejemplo, suturar.

En un aspecto, se describe en la presente descripción un método para producir una composición como se describe en la presente descripción, el método comprende poner en contacto una matriz porosa del biomaterial con una capa impermeable del biomaterial. Las interacciones proteína-proteína entre las dos capas a menudo son suficientes para mantener el contacto entre las dos capas, particularmente cuando la matriz porosa del biomaterial se forma mientras está en contacto con la capa impermeable. En modalidades adicionales, las capas se pueden recocer mediante el uso de los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, el recocido con agua o exponer las capas a un metanol para reducir la solubilidad en agua (ver, por ejemplo, Hu y otros Biomacromolecules 2011 12:1686-1696). En modalidades adicionales, las capas pueden comprender los agentes que hacen que las capas mantengan el contacto, por ejemplo, una capa puede comprender un anticuerpo y la otra capa puede comprender el ligando para ese anticuerpo.

En un aspecto, se describe en la presente descripción un método para producir una composición como se describe en la presente descripción, el método comprende; (a) fundir una mezcla de la solución acuosa del biomaterial y una sal o partícula soluble en agua; (b) poner en contacto la composición resultante de la etapa (a) con agua. En algunas modalidades, la sal puede ser NaCl.

La fundición puede comprender la solidificación y/o gelificación de un biomaterial acuoso a lo largo del tiempo a medida que se deshidrata gradualmente. Los métodos para fundir los biomateriales, por ejemplo, la fibroína de la seda, se conocen en la técnica y se describen en la presente descripción. Ver, por ejemplo, se han explorado las descripciones de la generación de los hidrogeles (WO2005/012606; PCT/US08/65076; PCT/US08/65076), las películas ultrafinas (WO2007/016524), las películas gruesas, revestimientos de conformación (WO2005/000483; WO2005/123114), las microesferas (PCT/US2007/020789), las matrices porosas 3D (WO2004/062697), las combinaciones de las películas, las microesferas y las matrices porosas (PCT/US09/44117), los bloques sólidos (WO2003/056297) y las fibras con diámetros que varían desde la nanoescala (WO2004/0000915) a varios centímetros (Patente de los EE. UU. Núm. 6,902,932) con implicaciones en los biomateriales y en la medicina regenerativa (WO2006/042287; Solicitud de Patente de los EE. UU. con núm. de serie 11/407,373; PCT/US08/55072).

El espesor de un material producido por la fundición puede controlarse, por ejemplo, al alterar la cantidad y la concentración de la solución del biomaterial y la velocidad de secado o mediante la manipulación física, por ejemplo, al cortar el producto fundido. La forma y el tamaño de un biomaterial fundido puede controlarse mediante la selección de un recipiente de fundición, por ejemplo, el recipiente puede tener sustancialmente la forma y/o tamaño y/o contorno que se desea que adopte el material fundido.

En algunas modalidades, la capa impermeable se forma espontáneamente en el fondo de la composición. En la Figura 15A se representa un esquema de una modalidad ilustrativa de tal composición, en donde la capa impermeable 10 está compuesta del mismo biomaterial (sustancialmente a la misma concentración) que la capa porosa de la matriz 12. En algunas modalidades, la capa impermeable formada espontáneamente puede estar compuesta, sustancialmente, del mismo biomaterial que la matriz porosa. En el Ejemplo 9 se expone una modalidad ilustrativa de un protocolo para producir tales composiciones.

En algunas modalidades, la etapa (a), como se describe anteriormente en la presente descripción, se puede realizar con la solución en contacto con una capa impermeable del biomaterial preexistente. La capa impermeable preexistente puede haber sido fundida en el mismo molde de fundición o fundida en un molde diferente y/u obtenida por otros métodos (por ejemplo, electrohilado). La capa impermeable preexistente se puede orientar en el molde de fundición en cualquier configuración y/o ubicación deseada, por ejemplo, en el fondo o en el lateral del molde.

En algunas modalidades, la capa impermeable puede comprender un biomaterial diferente, una mezcla de biomateriales (y, por ejemplo, los agentes) o diferentes concentraciones del biomaterial como la capa porosa de la matriz. En la Figura 15^b se representa un esquema de una modalidad ilustrativa de tal composición, en donde la capa impermeable 10 está compuesta por un biomaterial diferente al de la capa porosa de la matriz 12.

En algunas modalidades, la capa impermeable del biomaterial puede comprender la fibroína de la seda. En algunas modalidades, el método puede comprender además una primera etapa de fundición de una solución de la fibroína de la seda para formar una capa impermeable de la fibroína de la seda. En algunas modalidades, la solución de la fibroína de la seda puede tener una concentración de aproximadamente 2 % p/vol a aproximadamente 15 % p/vol. En algunas modalidades, la solución de la fibroína de la seda puede tener una concentración de aproximadamente 4 % p/vol a aproximadamente 10 % p/vol. En algunas modalidades, la solución de la fibroína de la seda puede tener una concentración de aproximadamente el 8 % p/vol. Se pueden formar las películas, por ejemplo, las películas de la fibroína de la seda adecuadas para su uso como biocapas impermeables mediante la fundición de una solución de la fibroína de la seda purificada que cristaliza tras la exposición al aire, la humedad o el gas de nitrógeno seco, como algunos ejemplos, sin la necesidad de las reacciones de reticulación exógena o reticulación posterior al procesamiento para la estabilización. Ver, por ejemplo, los documentos PCT/US07/83600; PCT/US07/83620; PCT/US07/83605.

En algunas modalidades, los poros de la matriz porosa están formados por la sal o la partícula soluble en agua a través de la lixiviación de sal. En algunas modalidades, la sal o la partícula soluble en agua puede ser granular. En algunas modalidades, la sal o la partícula soluble en agua puede comprender los cristales y/o los granos que tienen un tamaño medio de aproximadamente 300 pm a aproximadamente 1000 pm. En algunas modalidades, la sal o las partículas solubles en agua pueden comprender los cristales y/o los granos que tienen un tamaño medio de aproximadamente 400 pm a aproximadamente 800 pm. En algunas modalidades, la sal o la partícula soluble en agua puede comprender los cristales y/o los granos que tienen un tamaño medio de aproximadamente 500 pm a aproximadamente 600 pm.

En algunas modalidades, la solución del biomaterial usada para formar la matriz del biomaterial puede ser una solución de la fibroína de la seda. En algunas modalidades, la solución de la fibroína de la seda puede tener una concentración de aproximadamente 2 % p/vol a aproximadamente 15 % p/vol. En algunas modalidades, la solución de la fibroína de la seda puede tener una concentración de aproximadamente 4 % p/vol a aproximadamente 10 % p/vol. En algunas modalidades, la solución de la fibroína de la seda puede tener una concentración de aproximadamente 6 % p/vol.

La mezcla se puede fundir hasta que se produzca el espesor deseado de la capa porosa. El tiempo necesario variará, como se describe en otra parte de la presente descripción y un experto en la técnica lo determinará y ajustará fácilmente. En algunas modalidades, la mezcla se puede fundir durante aproximadamente 12 horas a aproximadamente 96 horas. En algunas modalidades, la mezcla se puede fundir durante aproximadamente 24 horas a 72 horas. En algunas modalidades, la mezcla se puede fundir durante aproximadamente 48 horas.

La etapa (b) de los métodos descritos anteriormente en la presente descripción elimina la sal o la partícula soluble en agua, lo que deja los poros en la matriz del biomaterial. La etapa (b) puede continuar, por ejemplo, hasta que la sal o la partícula soluble en agua se haya eliminado sustancialmente de la composición, por ejemplo, hasta que quede menos del 10 % de la sal o de la partícula soluble en agua y/o hasta que el 90 % de los poros (por ejemplo, los poros primarios) ya no contienen granos detectables y/o cristales de sal o partículas solubles en agua. Por lo tanto, la cantidad de tiempo necesaria para la etapa (b) puede variar de acuerdo con el espesor de la composición, el volumen de agua usado, la temperatura del agua y/o si se hace que el agua fluya y/o se agite, como es entendido por un experto en la técnica. En algunas modalidades, la etapa (b) puede continuar durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 semanas. En algunas modalidades, la etapa (b) puede continuar durante aproximadamente 12 horas a aproximadamente 120 horas. En algunas modalidades, la etapa (b) puede continuar durante aproximadamente 24 horas a aproximadamente 96 horas. En algunas modalidades, la etapa (b) puede continuar durante aproximadamente 72 horas. El agua usada en la etapa (b) puede ser, por ejemplo, agua destilada, agua desionizada y/o agua esterilizada. En algunas modalidades, el agua puede ser agua destilada. En algunas modalidades, el agua puede comprender además, por ejemplo, un tampón, un conservante y/o un agente. En algunas modalidades, el agua se puede eliminar y reemplazar con un volumen fresco de agua al menos una vez durante la etapa (b). En algunas modalidades, el agua se puede eliminar continuamente y reemplazar con volúmenes frescos de agua durante la etapa (b), por ejemplo, se puede proporcionar un flujo continuo de agua sobre, alrededor y/o a través de la composición.

Las composiciones descritas en la presente descripción se pueden usar para aumentar la cicatrización de las heridas y/o la regeneración de los tejidos. Por consiguiente, las composiciones descritas en la presente descripción se pueden proporcionar en condiciones estériles antes de la implantación en un sujeto. En algunas modalidades, la composición se puede producir en condiciones estériles. En algunas modalidades, la composición se puede esterilizar después de su formación. Puede usarse cualquier método de esterilización conocido en la técnica, por ejemplo, esterilización en autoclave, irradiación gamma o esterilización por haz de electrones.

En algunas modalidades, la composición se puede producir en forma lineal. En algunas modalidades, la composición se puede producir en forma plana. En algunas modalidades, la composición se puede producir en forma contorneada. En algunas modalidades, la composición se puede producir en forma tubular.

Las composiciones se pueden proporcionar en una multitud de tamaños y formas para adaptarse a las aplicaciones particulares, por ejemplo, un tamaño y forma apropiados para tratar un defecto de la vejiga y/o un tamaño y forma apropiados para tratar un defecto óseo. Alternativamente, las composiciones descritas en la presente descripción pueden ser cortadas y/o formadas por un profesional médico para las aplicaciones individuales, por ejemplo, una hoja de 4" x 4" de una composición como se describe en la presente descripción puede cortarse para adaptarse a una herida circular de 2" de diámetro. En algunas modalidades, la capa porosa también se puede reducir de espesor, por ejemplo, al cortar o rebanar, para lograr el espesor total deseado, por ejemplo, un espesor que es aproximadamente el mismo que el tejido en el que se va a implantar la composición. El tamaño y la forma necesarios para las aplicaciones particulares de la cicatrización de las heridas y/o regeneración de los tejidos pueden ser determinados fácilmente por un experto en la técnica.

En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción pueden comprender la adición de un agente a al menos una capa. En algunas modalidades, el agente puede ser un agente terapéutico. Los ejemplos no limitantes de los agentes se describen anteriormente en la presente descripción.

La fibroína de la seda se puede modificar después de que se forme una matriz y/o una capa impermeable y/o después de que se adicione un agente a la capa. En algunas modalidades, después de la formación de la matriz de la seda y/o la capa impermeable, el método puede comprender además exponer la matriz de la seda y/o la capa impermeable a un postratamiento que afectará al menos una propiedad de la fibroína de la seda. Por ejemplo, el postratamiento de un material de la seda puede afectar las propiedades de la fibroína de la seda, incluido el contenido de las hojas beta, la solubilidad, la capacidad de carga del agente activo, el tiempo de degradación, la permeabilidad del agente activo o cualquier combinación de los mismos. En algunas modalidades, se puede hacer que una capa que comprende la fibroína de la seda forme láminas beta, por ejemplo, después de que se haya añadido un agente a la capa. Las opciones de procesamiento posterior de la seda, por ejemplo, para aumentar el contenido de las hojas beta, incluye, pero no está limitado a, controlar el secado lento (Hu y otros Biomacromolecules 2011 12:1686-1696; Lu y otros, 10 Biomacromolecules 1032 (2009)), recocido con agua (Jin y otros, Water-Stable Silk Films with Reduced p-Sheet Content, 15 Adv. Funct. Mats. 1241 (2005)) y Hu y otros Biomacromolecules 2011 12:1686-1696), estiramiento (Demura & Asakura, Immobilization of glucose oxidase with Bombyx mori silk fibroin by only stretching treatment and its application to glucose sensor, 33 Biotech & Bioengin.

598 (1989)), compresión e inmersión en disolvente, que incluye metanol (Hofmann y otros, 2006), etanol (Miyairi y otros, 1978), glutaraldehído (Acharya y otros, 2008) y 1-etil-3-(3-dimetil aminopropil) carbodiimida (EDC) (Bayraktar y otros, 2005); ajuste del pH (ver, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los EE. UU. Núm. US2011/0171239), tratamiento térmico, tensión cortante (ver, por ejemplo, la Solicitud Internacional Núm.: WO 2011/005381), sonicación (ver, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los EE. UU. Núm. U.S. 2010/0178304; PCT/US2010/036841 y la Solicitud Internacional Núm.: WO 2008/150861) y cualquier combinación de los mismos. Ver, por ejemplo, los documentos WO/2004/062697; WO 2008/127404; Wang y otros, 36 Intl. J. Biol. Macromol. 66-70 (2005) y Kim y otros, 5 Biomacromol. 786-92 (2004); Matsumoto y otros, 110 J. Phys. Chem. B 21630-38 (2006).

En un aspecto, se describe en la presente descripción un método para la cicatrización de las heridas o la reparación de un defecto del tejido, el método comprende aplicar una composición como se describe en la presente descripción a la herida o al defecto del tejido. Los ejemplos no limitantes de las heridas y/o los defectos del tejido pueden incluir una herida o defecto de la piel; una úlcera diabética; una herida o defecto óseo; una herida o un defecto en la articulación; una herida o defecto del menisco; una herida o defecto del cartílago articular; una herida o defecto del tejido blando; una herida o defecto del tejido pulmonar; una quemadura; una herida o defecto del hígado; una herida o defecto del páncreas; una herida o defecto de la vesícula biliar; una herida o defecto renal; una herida o defecto en la pared del corazón y/o una herida o defecto del tejido vascular. En algunas modalidades, la herida o defecto puede ser el resultado de una lesión o enfermedad (por ejemplo, trauma o enfermedad degenerativa). En algunas modalidades, la herida o defecto puede crearse quirúrgicamente, por ejemplo, una incisión o extirpación quirúrgica del tejido o material en exceso, dañado o patológico (por ejemplo, extirpación de un tumor).

En algunas modalidades, las composiciones descritas en la presente descripción se pueden usar para tratar las heridas o los defectos de la columna vertebral, por ejemplo, las heridas o los defectos del disco intravertebral. En algunas modalidades, la composición descrita en la presente descripción puede proporcionarse en una hoja o tubo flexible y colocarse para colocarse alrededor de la columna vertebral, por ejemplo, con la capa impermeable orientada junto a la columna vertebral y la capa de la matriz orientada sobre la superficie exterior de la composición cuando se coloca en la columna vertebral. Sin desear ceñirse a la teoría, la capa de la matriz puede proporcionar las propiedades de soporte de carga mientras que la capa impermeable no se adhiere o no se une a la columna vertebral.

Las heridas a tratar incluyen las abiertas o las cerradas o de origen agudo o crónico. En una modalidad, las composiciones pueden usarse para tratar una herida abierta. Las heridas abiertas incluyen, pero no se limitan a, las incisiones o las heridas incisas; las laceraciones o las heridas irregulares en forma de lágrimas causadas por algún traumatismo cerrado; avulsión; abrasiones (rozaduras), tales como las heridas superficiales en las que se raspa la capa superior de la piel (la epidermis); las heridas punzantes, tales como las causadas por un objeto que perfora la piel; las heridas por penetración, tales como las causadas por un objeto que entra y sale de la piel y las heridas de bala. Las heridas a tratar aquí también pueden incluir las heridas cerradas, tales como las contusiones, los hematomas, aplastamiento, las heridas crónicas o agudas.

En algunas modalidades, la capa impermeable se puede orientar para evitar el movimiento del material dentro o fuera de la herida o defecto. A modo de ejemplo no limitativo, la capa impermeable puede evitar que los fluidos y/o los contaminantes entren en una herida (por ejemplo, al evitar que entre suciedad en la piel o al evitar que entren los fluidos en el pulmón) y/o la capa impermeable puede evitar que los fluidos y/o los materiales que salgan de un tejido a través de la herida o defecto (por ejemplo, al evitar que los fluidos se escapen de la vejiga o de los intestinos a través de un defecto o herida).

En algunas modalidades, las composiciones se pueden colocar sobre una herida o defecto. En algunas modalidades, las composiciones se pueden unir al sitio de una herida o defecto, por ejemplo, mediante suturas, grapas y/o el uso de adhesivos. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente cómo fijar una composición como se describe en la presente descripción a una herida particular y/o defecto del tejido.

Las composiciones descritas en la presente descripción, en virtud de las diferentes propiedades de las múltiples capas, pueden proporcionar un armazón para la regeneración del tejido y, al mismo tiempo, sellar el contenido de un órgano hueco y/o evitar la entrada de los fluidos y/o las partículas (por ejemplo, los residuos) en la región que cubre la composición. Por consiguiente, en algunas modalidades, la herida o el defecto del tejido se ubica en un órgano hueco. Los ejemplos no limitantes de los órganos huecos incluyen la vejiga; una parte del tracto gastrointestinal; el estómago y los intestinos.

En algunas modalidades, la composición se puede aplicar a una herida y/o defecto en un hueso. Las composiciones bicapa descritas en la presente descripción imitan las diferencias y la orientación de los tejidos óseos compactos y esponjosos, de esta manera se promueve la regeneración de los tejidos del tejido óseo.

En algunas modalidades, las composiciones descritas en la presente descripción pueden usarse para promover la cicatrización de las heridas o la reparación de un defecto del tejido en una articulación portadora de carga. Los grados cualitativamente diferentes de rugosidad superficial de las composiciones descritas en la presente descripción (por ejemplo, una película de la fibroína de la seda es más suave que una espuma de la fibroína de la seda) pueden proporcionar una superficie lisa para la lubricación de las articulaciones mientras que la superficie más rugosa puede amortiguar los impactos y proporcionar la integración del tejido huésped. Las mismas ventajas son aplicables a la reparación del menisco y del cartílago articular.

La invención también proporciona kits y el dispositivo que contiene los biomateriales y/o las composiciones descritas en la presente descripción y las instrucciones para llevar a cabo cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción.

Por conveniencia, el significado de algunos términos y frases usados en la especificación, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas se proporcionan más abajo. A menos que se indique lo contrario o quede implícito en el contexto, los siguientes términos y frases incluyen los significados que se proporcionan más abajo. Las definiciones se proporcionan para ayudar a describir las modalidades particulares y no pretenden limitar la invención reivindicada, porque el alcance de la invención está limitado únicamente por las reivindicaciones. A menos que se explique de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Si existe una aparente discrepancia entre el uso de un término en la técnica y su definición proporcionada en la presente descripción, prevalecerá la definición proporcionada dentro de la especificación.

Por conveniencia, aquí en la especificación se recogen determinados términos, empleados en la presente descripción, ejemplos y reivindicaciones adjuntas.

Los términos "aumentado", "aumentar" o "mejorar" se usan todos en la presente descripción para significar un aumento en una cantidad estadísticamente significativa. En algunas modalidades, los términos "aumentado", "aumentar" o "mejorar" pueden significar un aumento de al menos un 10 % en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo, un aumento de al menos aproximadamente un 20 % o al menos aproximadamente un 30 % o al menos aproximadamente el 40 % o al menos aproximadamente el 50 % o al menos aproximadamente el 60 % o al menos aproximadamente el 70 % o al menos aproximadamente el 80 % o al menos aproximadamente el 90 % o hasta y que incluye un 100 % de aumento o cualquier aumento entre 10-100 % en comparación con un nivel de referencia o al menos aproximadamente 2 veces o al menos aproximadamente 3 veces o al menos aproximadamente 4 veces o al menos aproximadamente 5 veces o al menos un aumento de aproximadamente 10 veces o cualquier aumento entre 2 y 10 veces o más en comparación con un nivel de referencia. En el contexto de un marcador o síntoma, un "aumento" es un aumento estadísticamente significativo en tal nivel.

Como se usa en la presente descripción, un "sujeto" significa un ser humano o animal. Usualmente el animal es un vertebrado, tal como un primate, un roedor, un animal doméstico o un animal de caza. Los primates incluyen los chimpancés, los monos cangrejeros, los monos arañas y los macacos, por ejemplo, Rhesus. Los roedores incluyen los ratones, las ratas, las marmotas, los hurones, los conejos y los hámsteres. Los animales domésticos y de caza incluyen las vacas, las caballos, los cerdos, los ciervos, los bisontes, los búfalos, las especies felinas, por ejemplo, el gato doméstico, las especies caninas, por ejemplo, el perro, el zorro, el lobo, las especies de aves, por ejemplo, el pollo, el emú, el avestruz y los peces, por ejemplo, la trucha, el bagre y el salmón. En algunas modalidades, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un primate, por ejemplo, un ser humano. Los términos "individuo", "paciente" y "sujeto" se usan indistintamente en la presente descripción.

Preferentemente, el sujeto es un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano, un primate no humano, un ratón, una rata, un perro, un gato, un caballo o una vaca, pero no se limita a estos ejemplos. Los mamíferos diferentes a los seres humanos pueden usarse ventajosamente como sujetos que representan los modelos animales de cicatrización de las heridas. Un sujeto puede ser masculino o femenino.

Un "sujeto que necesita" tratamiento para una afección particular puede ser un sujeto que tiene esa afección, diagnosticado con esa afección o en riesgo de desarrollar esa afección.

Como se usa en la presente descripción, los términos "tratar", "tratamiento" o "mejora" se refieren a los tratamientos terapéuticos, en donde el objetivo es revertir, aliviar, mejorar, inhibir, ralentizar o detener la progresión o gravedad de una enfermedad asociada con una enfermedad o trastorno, por ejemplo, una herida o defecto del tejido. El término "tratar' incluye reducir o aliviar al menos un efecto o síntoma adverso de una afección, enfermedad o trastorno asociado con una herida o defecto del tejido. El tratamiento es generalmente "eficaz" si se reducen uno o más síntomas o marcadores clínicos. Alternativamente, el tratamiento es "eficaz" si la progresión de una enfermedad se reduce o se detiene. Es decir, "tratamiento" incluye no sólo la mejora de los síntomas o marcadores, sino también el cese o al menos la desaceleración del progreso o empeoramiento de los síntomas en comparación con lo que se esperaría en ausencia de tratamiento. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de uno o más síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la enfermedad, retraso o enlentecimiento de la progresión de la enfermedad, mejoría o paliación del estado de la enfermedad, remisión (parcial o total) y/o disminución de la mortalidad, ya sea detectable o indetectable. El término "tratamiento" de una enfermedad también incluye proporcionar alivio de los síntomas o efectos secundarios de la enfermedad (incluido el tratamiento paliativo).

El término "estadísticamente significativo" o "significativamente" se refiere a la significación estadística y generalmente significa una desviación estándar de dos (2SD) o mayor diferencia.

Aparte de los ejemplos operativos o donde se indique de otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción usadas en la presente descripción deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". El término "aproximadamente" cuando se usa en relación con los porcentajes puede significar ± 1 %.

Como se usa en la presente descripción, el término "que comprende" o "comprende" se usa en referencia a las composiciones, los métodos y el o los componentes respectivos de los mismos, que son esenciales para el método o composición, pero abiertos a la inclusión de los elementos no especificados, ya sean esenciales o no.

El término "que consiste en" se refiere a las composiciones, los métodos y los componentes respectivos del mismo como se describe en la presente descripción, que son exclusivos de cualquier elemento no mencionado en esa descripción de la modalidad.

Como se usa en la presente descripción, el término "que consiste esencialmente en" se refiere a aquellos elementos requeridos para una modalidad determinada. El término permite la presencia de los elementos que no afectan materialmente la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s) o funcional(es) de esa modalidad.

Los términos en singular "un", "una" y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. Similarmente, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. Aunque pueden usarse los métodos y los materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción en la práctica o en el ensayo de esta divulgación, se describen los métodos y los materiales adecuados más abajo. La abreviatura "por ejemplo" se deriva del latín exempli gratia y se usa en la presente descripción para indicar un ejemplo no limitante. Por lo tanto, la abreviatura "por ejemplo" es sinónimo del término "por ejemplo".

Las definiciones de los términos comunes en la biología celular y en la biología molecular se pueden encontrar en "The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", 19a edición, publicado por Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-19-0); Robert S. Porter y otros (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); Benjamin Lewin, Genes X, publicado por Jones & Bartlett Publishing, 2009 (ISBN-10: 0763766321); Kendrew y otros (eds.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) y Current Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan y otros, eds.

A menos que se indique lo contrario, la presente invención se realizó mediante el uso de los procedimientos estándar, como se describe, por ejemplo, en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU. (2001); Davis y otros, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., Nueva York, EE. UU. (1995); Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, y otros, ed., John Wiley and Sons, Inc.) y Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique por R. lan Freshney, editor: Wiley-Liss; 5a edición (2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather y David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998).

La tecnología descrita en la presente descripción se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que de ninguna manera deben interpretarse como una limitación adicional.

Ejemplos

Ejemplo 1: Hoja de la seda bicapa para la reparación de los órganos huecos

En la presente descripción se describe un biomaterial tridimensional compuesto de la fibroína de la seda derivada de los capullos del gusano de la seda de Bombyx mori. Este armazón se compone de una estructura bicapa que consiste de una capa porosa reforzada por una capa de barrera delgada e impermeable. Este armazón está diseñado para su uso, por ejemplo, en la reparación de los defectos de los órganos huecos, tal como la vejiga urinaria en los procedimientos, tal como la cistoplastia de ampliación. La estructura bicapa de la composición permite, por ejemplo, la retención del contenido de los órganos huecos (es decir, la orina) posteriores a la implantación inicial en los sitios del defecto, mientras que la capa porosa permite el crecimiento del tejido huésped durante la consolidación del defecto.

Preparación de las soluciones de la seda: Se hirvieron los capullos del gusano de la seda de B. mori durante 20 min en una solución acuosa de Na2CO3 a 0,02 M y luego se enjuagaron minuciosamente con agua destilada para extraer las proteínas de sericina tipo pegamento y la cera. La fibroína de la seda extraída se disolvió luego en una solución de LiBr a 9,3 M a 60 °C durante 6 h. Esta solución se dializó en agua destilada mediante el uso de un casete de diálisis Slide-a-lyzer (MWCO, 3500) durante 4 d lo que produce una solución acuosa de la fibroína de la seda al 8 % (p/vol) (ver, por ejemplo, Kim y otros, 2004; que es incorporado como referencia en la presente descripción en su totalidad). Más abajo se describen dos métodos para fundir la matriz de la seda resultante.

Preparación de la matriz:

Método 1: Se usó una variante de una técnica de lixiviación de sal/fundición con disolvente publicada anteriormente (Kim y otros, 2004). Se vertieron 75 ml de una solución acuosa de la fibroína de la seda (6 % p/vol) en un recipiente rectangular de fundición (12 cm x 10 cm) y se mezcló NaCl granular (150 g, tamaño del cristal medio de 500-600 pM) con la solución de la seda. Se dejó fundir la solución resultante durante 2 días a temperatura ambiente y luego se eliminó el NaCl mediante lavado en agua destilada durante 2 días. Se logró la formación espontánea del armazón bicapa. Se usó la microscopía electrónica de barrido y el ensayo de tracción para determinar las propiedades estructurales y mecánicas (Figura 1).

Método 2: Se vertieron 20 ml de una solución acuosa de la fibroína de la seda (8 % p/vol) en un recipiente rectangular de fundición (12 cm x 10 cm) y se secaron en una campana de flujo laminar para lograr la formación de una película de la seda. A continuación, como se describió anteriormente, se vertieron 75 ml de una solución acuosa de la fibroína de la seda (6 % p/vol) en el recipiente rectangular de fundición (12 cm x 10 cm) y se mezcló NaCl granular (150 g, tamaño del cristal medio de 500-600 pM) con la solución de la seda encima de la película de la seda. Se dejó fundir la solución resultante durante 2 días a temperatura ambiente y luego se eliminó el NaCl mediante lavado en agua destilada durante 2 días. Se produjo la fusión de la película de la seda y la matriz de fibras para generar un armazón bicapa. Se usó la microscopía electrónica de barrido y el ensayo de tracción para determinar las propiedades estructurales y mecánicas (Figura 2).

Evaluaciones quirúrgicas: el procedimiento de cistoplastia de ampliación robótica usado para validar el rendimiento de la matriz de la seda producida en el Método 1. El armazón se implantó durante 3 meses en los que el animal se cateterizó durante 1 semana después de la operación y luego se dejó evacuar espontáneamente. Se examinó la estructura de la vejiga porcina aumentada y los riñones después de 3 meses de implantación de la matriz de la seda. No se observó evidencia de hidronefrosis. Se realizaron análisis histológicos e inmunohistoquímicos del tejido regenerado de la vejiga apoyado por la matriz de la seda después de 3 meses de implantación, que compara el tejido regenerado con las regiones no aumentadas del tejido de la vejiga. El tejido regenerado mostró una morfología que imitaba a la de las regiones no aumentadas, además de mostrar expresión de la a-actina, la uroplaquina, p63, la citoqueratina y SM22a, tanto en la periferia como en el centro del tejido regenerado (datos no mostrados). Además, se observó que la matriz de la seda se degradaba durante el curso de la implantación (datos no mostrados y Figura 3). La Figura 4 representa la evaluación urodinámica de la vejiga aumentada con la seda a los 3 meses de la implantación en comparación con los controles no aumentados.

Ejemplo 2: El efecto de las técnicas de procesamiento de la matriz en el rendimiento de los armazones de la seda en un modelo de rata de cistoplastia de ampliación

Las patologías del tracto urinario congénitas y adquiridas, como la vejiga neurogénica, la extrofia de la vejiga y las válvulas uretrales posteriores, requieren de manera rutinaria enterocistoplastia para reducir el almacenamiento urinario y las presiones de evacuación y mitigar el riesgo de daño renal e incontinencia. Aunque el uso de los segmentos gastrointestinales autólogos representa el estándar de oro de la atención para la reconstrucción de la vejiga, esta estrategia se asocia con complicaciones importantes que incluyen infección crónica del tracto urinario, anomalías metabólicas y neoplasias malignas secundarias. Los biomateriales que incluyen la matriz acelular de la vejiga, la submucosa del intestino delgado (SIS) y el ácido poliglicólico (PGA), ya sea solos o sembrados con fuentes de células primarias o progenitoras de la vejiga, se han explorado previamente como alternativas para la reparación de los defectos de la vejiga en una variedad de modelos animales así como estudios clínicos a corto plazo. A pesar de la capacidad de estas matrices para apoyar la regeneración del tejido de la vejiga, la restauración de la función de los órganos a menudo se ve obstaculizada por las propiedades subóptimas del armazón que con frecuencia conducen al fracaso del injerto a largo plazo debido a la contractura del implante, la rotura del injerto y/o la fibrosis. Por lo tanto, existe una necesidad clínica importante de desarrollar nuevas configuraciones del armazón que puedan superar estas limitaciones y, por lo tanto, servir como opciones viables para la ingeniería de tejidos de la vejiga.

Los biomateriales a base de la fibroína de la seda abarcan una gama única de propiedades que incluyen alta resistencia estructural y elasticidad, plasticidad de procesamiento diversa y biodegradabilidad ajustable que los hace muy adecuados para la consolidación de los defectos de los órganos huecos. Como se describe en la presente descripción, se evaluó el rendimiento de los biomateriales de la seda en un modelo de rata de cistoplastia de ampliación. Se comparó la capacidad de varias configuraciones del armazón 3-D producidas a partir de diferentes técnicas de procesamiento, incluido el hilado en gel o la fundición con disolvente/lixiviación con sal, por su potencial para apoyar la reparación del tejido de la vejiga y las respuestas funcionales de la evacuación. Se planteó la hipótesis de que la lixiviación con NaCl de las soluciones de la fibroína de la seda de base acuosa puede ofrecer ventajas particulares sobre el hilado en gel para la construcción de los biomateriales para la ingeniería de tejidos de la vejiga.

Al manipular el diámetro del cristal de NaCl, el método de fundición con disolvente/lixiviación con sal permite una mayor escalabilidad del tamaño de los poros del armazón (470-940 pm) [Kim y otros, 2005] en relación con la liofilización de las matrices hiladas en gel que habitualmente genera diámetros de poro por debajo de 200 pm. Además, se utilizan concentraciones más bajas de las soluciones de la fibroína de la seda para la formación de los armazones lixiviados con NaCl (<10 % p/vol) en comparación con la técnica de hilado en gel que requiere soluciones que contienen 20-30 % p/vol para la fabricación de los armazones. Un análisis sistemático del impacto de los métodos de procesamiento en la capacidad de los armazones de la seda para apoyar la regeneración del tejido de la vejiga es una etapa crucial en el desarrollo de las configuraciones del biomaterial para la reparación clínica de los órganos.

Materiales y métodos

Biomateriales. Se prepararon las soluciones acuosas de la fibroína de la seda a partir de los capullos del gusano de la seda de Bombyx mori mediante el uso de los procedimientos descritos anteriormente [Kim y otros, 2005]. Se fabricaron tres grupos distintos de las matrices a base de la seda a partir de estas soluciones mediante una técnica de hilado en gel [Lovett y otros, 2008] o un método de fundición con disolvente/lixiviación con sal [Kim y otros, 2005]. Se produjeron los armazones hilados en gel al hilar las soluciones de la seda concentradas [25-30 % (p/vol), 0,5 ml/armazón] en un mandril giratorio (200 rpm) y axialmente oscilatorio (6 mm de diámetro) mediante el uso de una plataforma y de un programa de hilado de gel personalizada. Con este método se generaron dos grupos de matrices que previamente se demostró que apoyaban el aumento de la vejiga murina, pero con diferentes propiedades estructurales y mecánicas, con varias condiciones de enrollamiento y enrollamiento posteriores [Mauney y otros, 2011; Gomez y otros, 2011]. Las matrices GS1 se centrifugaron con una velocidad de giro axial (ASR) de 2 mm/s seguido de tratamiento con metanol. Los armazones GS2 se componían de 0,4 ml de la solución de la seda hilada a una ASR de 40 mm/s seguida de 0,1 ml hilado a 2 mm/s para consolidar los espacios entre las fibras de la seda resultantes. Este grupo de matriz se sometió luego a liofilización y tratamiento posterior con metanol. El grupo de armazón FF se componía por las espumas porosas tridimensionales de la seda que se recocieron a películas de la seda en su cara externa superior. Brevemente, se vertió una solución de la fibroína de la seda (8 % p/vol) en un recipiente de fundición rectangular y se secó en una campana de flujo laminar durante 48 h para lograr la formación de una película de la seda. Luego se mezcló una solución de la fibroína de la seda al 6 % p/vol con NaCl granular tamizado (tamaño medio del cristal 500-600 pM) y se colocó en capas sobre la superficie de la película de la seda. Se dejó fundir la solución resultante durante 48 horas y posteriormente se eliminó el NaCl al lavar el armazón durante 72 horas en agua destilada con cambios de volumen regulares. Se produjo la fusión de la película de la seda con la matriz de espuma de fibras para generar una configuración del armazón de bicapa. Luego los grupos de la matriz de la seda se esterilizaron en etanol al 70 %, se enjuagaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante la noche y se sometieron a los procedimientos analíticos o quirúrgicos descritos más abajo. Los armazones de la submucosa del intestino delgado (SIS) (Cook, Bloomington, IN) se evaluaron en paralelo como puntos estándar de comparación, ya que este biomaterial se ha utilizado previamente en enfoques de aumento de la vejiga en los modelos animales y humanos [Kropp y otros, 1998; Caione y otros, 2012].

Microscopía electrónica de barrido (SEM). Se realizó un análisis estructural de los grupos de matrices con el fin de evaluar las diferencias en la morfología del armazón generadas por diversas técnicas de fabricación. Las muestras de las matrices se recubrieron por pulverización con oro y se obtuvieron las imágenes mediante el uso de un microscopio electrónico de barrido Hitachi S-520.

Ensayos mecánicos. Los ensayos de tracción uniaxial se realizaron como se describió anteriormente [Gomez y otros, 2011] en un marco de ensayo Instron 3366 (Norwood, MA) equipado con una celda de carga de 100 N de capacidad y abrazaderas neumáticas Biopuls. Los grupos de matrices (N = 3-4 por grupo) se hidrataron en PBS durante al menos 24 h para alcanzar un equilibrio de hinchamiento antes del ensayo. Las muestras del ensayo se sumergieron en un recipiente de ensayo a temperatura controlada (Biopuls) lleno de PBS (37 °C). Se usó un modo de control de desplazamiento con una velocidad de desplazamiento de la cruceta de 5 mm/min y la longitud del calibre fue de 15 mm. El módulo de elasticidad inicial (EM), la resistencia máxima a la tracción (UTS) y el % de alargamiento hasta la rotura se calcularon a partir de los gráficos de tensión/deformación. El EM se calculó mediante el uso de un ajuste de mínimos cuadrados (LS) entre una carga de 0,02 N y una deformación del 5 % más allá de este punto de carga inicial. La UTS se determinó como el valor de esfuerzo más alto alcanzado durante el ensayo y el % de alargamiento hasta la falla fue el último punto de datos antes de una disminución > 10 % en la carga.

Aumento de la vejiga de rata. Los grupos de biomateriales se evaluaron en un modelo de aumento de la vejiga mediante el uso de las ratas Sprague Dawley inmunocompetentes hembra adultas (6 semanas de edad, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) mediante el seguimiento de los protocolos aprobados por IACUC como se describió anteriormente [Tu y otros, 2012]. Brevemente, los animales se anestesiaron mediante la inhalación de isoflurano y luego se afeitaron para exponer el sitio quirúrgico. Luego se realizó una incisión de laparotomía en la línea media baja y se diseccionó el tejido subyacente (músculo recto y peritoneo) para dejar al descubierto la vejiga. La porción anterior (inmediatamente distal a la cúpula) de la vejiga se marcó con suturas de polipropileno (Prolene) 7-0 en una configuración cuadrada. Luego se hizo una incisión de cistotomía longitudinal en la pared anterior de la vejiga en el medio de estas suturas de sujeción mediante el uso de unas tijeras finas para crear un defecto de la vejiga. Luego se unió una pieza cuadrada del biomaterial (7 x 7 mm2) en este sitio mediante el uso de una sutura continua de vicryl 7-0. Además, un grupo control de los animales que recibieron una cistotomía sola se trató de manera similar. Se confirmó un sellado hermético al llenar la vejiga con una solución salina estéril mediante instilación a través de una aguja hipodérmica de calibre 30. Los grupos con las matrices y control se evaluaron de forma independiente durante 10 semanas de la implantación con los animales posteriormente sometidos a los análisis cistométricos, histológicos e inmunohistoquímicos descritos más abajo.

Análisis cistométricos. La urodinámica de la vejiga se evaluó en todos los roedores mediante el uso de la cistometría consciente sin restricciones a las 10 semanas posteriores a la implantación, como se describió anteriormente [Tu y otros, 2012]. Antes de esto, se insertó quirúrgicamente un catéter suprapúbico en la vejiga. Después de la inducción con la anestesia con isoflurano, los animales se prepararon y cubrieron de forma estéril. Se hizo una incisión en la línea media dorsal entre las escápulas de las ratas. Se creó una laparotomía mediante el uso de una incisión en la línea media ventral. Un tubo de polietileno-50 con una punta ensanchada se tunelizó desde la incisión dorsal hasta la cavidad peritoneal. Se usó una puntada de prolene 6-0 en bolsa de tabaco para asegurar la punta ensanchada del tubo de polietileno-50 en la cúpula de la vejiga. El tubo de polietileno-50 exteriorizado en la cara dorsal se unió a un adaptador de cierre luer y se aseguró a la piel con una sutura de seda 3-0. La cistometría se realizó de 1-3 días después de la colocación del catéter suprapúbico. El catéter suprapúbico se conectó a un transductor de presión fisiológica (modelo MLT844, ADInstruments, Colorado Springs, CO) para permitir la medición de la presión intravesical, mientras que la vejiga se infundió continuamente con PBS estéril a 100 pl/min. El volumen residual posterior a la evacuación se midió mediante la aspiración del catéter suprapúbico al final de la cistometría. Después del establecimiento de un patrón de evacuación regular, se extrapolaron muchas otras variables de los trazados cistométricos, tales como la distensibilidad, el volumen de la evacuación, la presión máxima de la evacuación, el intervalo entre las contracciones y las contracciones espontáneas de no evacuación (SNVC). Se analizaron un total de 6 animales por grupo con 4 evacuaciones por animal para determinar los parámetros urodinámicos.

Análisis histológicos e inmunohistoquímicos. Después de 10 semanas de la implantación, los animales se sacrificaron por asfixia con CO² y se extirparon las vejigas para el procesamiento histológico estándar. En resumen, los órganos se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 %, se deshidrataron en alcoholes graduados y luego se insertaron en parafina en una orientación axial para capturar toda la superficie circunferencial de la vejiga dentro de cada sección. La orientación correcta (anterior frente a posterior) dentro del bloque de parafina se determinó mediante la colocación de suturas en la muestra. Se cortaron secciones (10 pm) y luego se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) o tricrómico de Masson (MTS) como se describió previamente [Gomez y otros, 2011]. Para el análisis inmunohistoquímico (IHC), se detectaron los marcadores del músculo liso contráctil, tales como la a-actina del músculo liso (a-SMA) y SM22a; las proteínas asociadas al urotelio, las uroplaquinas (UP) y p63; los marcadores neuronales y endoteliales, Fox3 y CD31, respectivamente, mediante el uso de los siguientes anticuerpos primarios: antia-SMA [Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, cat. # A2457, dilución 1:200], antiSM22a [Abcam, Cambridge, Ma , cat. # Ab14106, dilución 1:200], antipan-UP [antisueros de conejo producidos contra extractos de UP bovinos totales, dilución 1:100], antip63 [Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, cat. # sc-8431, dilución 1:200], antiFox3 [Abcam, cat. # ab104225, dilución 1:200], antiCD31 [Abcam, cat. # ab228364, dilución 1:100]. Luego las secciones se incubaron con los anticuerpos secundarios conjugados con Cy3 de la misma especie (Millipore, Billerica, MA) y los núcleos se contratiñeron con 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Las muestras se visualizaron mediante el uso de un microscopio Axioplan-2 (Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY) y se adquirieron las imágenes representativas mediante el uso del software Axiovision (versión 4,8).

Análisis estadístico. Las medidas urodinámicas se analizaron mediante las ecuaciones de estimación generalizadas con la prueba de Bonferroni post-hoc mediante el uso de software estadístico disponible comercialmente (software SAS9.3, www.sas.com). Los valores estadísticamente significativos se definieron como p <0,05. Los parámetros urodinámicos se muestran como medias ± desviación estándar.

Resultados y discusión

Los análisis SEM de los grupos con las matrices de la seda revelaron que las técnicas de procesamiento de los armazones, así como los distintos parámetros de fabricación, condujeron a diferencias selectivas en la arquitectura estructural del biomaterial general (Figura 5A). Como se observó en estudios anteriores [Mauney y otros, 2011; Gomez y otros, 2011; Franck y otros, 2013], los armazones GS1 consistían en multilaminados compactos de las fibras de la seda orientadas en paralelo, mientras que las matrices GS2 estaban compuestas por hojas similares a láminas porosas (intervalo del tamaño de poro, 5-50 pm) reforzadas por una capa exterior densa. Por el contrario, los armazones FF consistían en una estructura bicapa con compartimentos dictados por el modo de fabricación. La capa de fundición con disolvente/lixiviada con NaCl comprendía la fibra de la matriz y se parecía a una configuración de espuma con poros grandes (tamaño de poro, ~ 400 pm) interconectados por una red de poros más pequeños dispersos a lo largo de su periferia. Esta capa se fusionó en la cara externa con una película de la seda homogénea, no porosa (200 pm de espesor) generada por el recocido de las soluciones de la seda deshidratadas durante la fundición de la matriz. También se observó la oclusión de los poros de la capa de NaCl/fundición con disolvente en la matriz de fibras a lo largo del plano adyacente a los recipientes de fundición en los armazones producidos en ausencia de las películas de la seda (datos no mostrados); sin embargo, la continuidad de esta característica fue heterogénea a lo largo del área superficial así como altamente variable entre las réplicas de la matriz. Los ensayos de tracción de los armazones FF antes de la implantación (Figura 5B) demostraron un menor grado de UTS y EM en comparación con las propiedades publicadas anteriormente de ambas configuraciones de matriz hilada en gel [Gomez y otros, 2011]. Los armazones SIS presentaron UTS y EM sustancialmente más altos en comparación con todos los grupos de la seda. Las mediciones de alargamiento a la falla revelaron que el grupo FF era ~ 4 veces más elástico que cualquier otra configuración de matriz probada, lo que sugiere que aunque estos armazones tenían UTS respectivos más bajos, podían lograr mayores grados de deformación; una ventaja potencial para la consolidación de los defectos de la vejiga altamente distensibles.

El compartimento poroso de la espuma de la configuración del armazón FF independiente de la película de la seda recocida se analizó en primer lugar por su potencial para apoyar la integración del defecto de la vejiga dentro del modelo de rata de cistoplastia de ampliación. Durante la implantación inicial, se observaron grados deficientes de retención de la sutura del armazón que condujeron a dehiscencia en la línea de la sutura entre la matriz y la pared de la vejiga. Además, las evaluaciones ex vivo del cierre inicial del defecto después de la integración quirúrgica demostraron fugas de líquido prominentes en el centro del armazón junto con una falla del implante para apoyar la distensión de la vejiga durante la instilación de la solución salina. La incapacidad de las espumas de la seda para restaurar la integridad de los sitios defectuosos se debe presumiblemente a la naturaleza porosa interconectada de este tipo de armazón que era insuficiente para imitar la función de barrera de la pared nativa de la vejiga después de un aumento de la presión intravesical. En contraste, se observó que los armazones FF que consisten en las películas de la seda recocidas a la cara exterior de las espumas porosas de la seda apoyan la integridad y distensión del órgano después de una integración quirúrgica similar al rendimiento de las configuraciones de los armazones de la seda hilada en gel y SIS. Estos resultados demuestran que el compartimento de la película de la seda recocida es esencial para que el grupo FF de bicapa mantenga la consolidación inicial del defecto dentro de este sistema modelo.

Durante el transcurso del período de implantación de 10 semanas, las tasas de supervivencia de los animales aumentados en 3 de los 4 grupos de armazones fueron similares a los controles de cistotomía antes de la eutanasia programada. La reconstrucción de la vejiga con los grupos GS1 y FF mostró tasas de supervivencia del 100 % (10/10 para GS1 y 8/8 para FF) mientras que los animales implantados con SIS presentaron una tasa de supervivencia del 88 % (8/9); ambos valores fueron comparables a la tasa del 90 % observada después de la cistotomía sola. En contraste, los animales implantados con los armazones GS2 mostraron una tasa de supervivencia reducida del 60 % (9/15). Todas las muertes espontáneas de los animales en cada grupo ocurrieron dentro de la primera semana postoperatoria y los análisis post-mortem revelaron ascitis urinaria como la causa probable en todos los casos debido a la perforación del armazón. Los informes anteriores que implementaron las matrices GS2 para el aumento de la vejiga murina demostraron una tasa de supervivencia del 100 % (6/6), sin embargo, la mayor tendencia a la muerte de los animales por las fugas de orina en el armazón observada en este estudio se relaciona presumiblemente con el aumento en el área del armazón usada entre la rata y los modelos murinos. El proceso de liofilización utilizado durante la construcción de GS2 es propenso a generar microfracturas en la capa exterior no porosa de esta configuración de armazón (Figura 5A) [Gomez y otros, 2011] de esta manera se aumenta la posibilidad de que la integridad de la matriz se vea comprometida con el aumento del área superficial.

Después de 10 semanas después de la operación, las evaluaciones macroscópicas del tejido del tracto urinario inferior no revelaron signos de moco vesical o hidronefrosis en ninguno de los animales sacrificados; sin embargo, la presencia de los cálculos vesicales luminales fue evidente en todos los grupos experimentales examinados (Figuras 6A-6B). Estos datos son consistentes con otros estudios previos que han demostrado que la formación de los cálculos en la vejiga es una ocurrencia común en los modelos de rata de la reconstrucción de la vejiga con los materiales acelulares biodegradables [Kropp y otros, 1995; Vaught y otros, 1996; Iijima y otros, 2007]. La incidencia de los cálculos urinarios fue la más alta en las cohortes de la seda hilada en gel con los animales aumentados con las matrices GS1 y GS2 al presentar una frecuencia del 75 % y 71 %, respectivamente. Los implantes SIS provocaron grados similares de formación de los cálculos en comparación con una frecuencia del 57 %. Por el contrario, las ratas sometidas a la cistotomía sola o la implantación del armazón FF demostraron la menor incidencia respectiva de formación de los cálculos del 13 % y 20 %. Además, también se encontró que los diámetros de los cálculos en estos grupos eran sustancialmente menores (2 mm) en comparación con todas las demás condiciones experimentales (3-4 mm). Estos resultados muestran que la frecuencia y la extensión de la formación de cálculos en la vejiga dentro del modelo de cistoplastia de ampliación de rata depende de la composición del biomaterial (seda frente a SIS), así como del método de procesamiento utilizado para la construcción de los armazones de la seda.

El examen histológico de secciones de vejiga completa (H&E y MTS) demostró que cada grupo de armazones apoyó grados robustos de crecimiento interno del tejido conectivo que atravesaba desde la periferia de la pared de la vejiga nativa hasta el interior del sitio del defecto original (datos no mostrados). Las matrices GS1 y GS2 residuales se ubicaron en el lumen de la vejiga y estaban principalmente intactas, al presentar un grado mínimo de degradación. Estos resultados son consistentes con las observaciones macroscópicas del tejido en donde se encontraron restos de los armazones de ambos grupos encapsulados dentro de los cálculos vesicales luminales. En contraste con nuestro estudio anterior [Gomez y otros, 2011], la tasa de degradación del armazón in vivo no se elevó sustancialmente por la arquitectura porosa de las matrices GS2 en comparación con el grupo GS1 no poroso. Un aumento en el área GS2 utilizada en la rata (7 x 7 mm2) frente al modelo murino (4 x 4 mm2) puede haber permitido una estabilidad estructural mejorada y, por lo tanto, una menor fragmentación de la matriz de fibras después de 10 semanas de la implantación. De hecho, se han informado relaciones similares entre los perfiles de degradación y la ampliación de las dimensiones del armazón para una variedad de las formulaciones de los biomateriales [Wu y otros, 2004].

Se descubrió que el patrón de degradación de los armazones FF dependía de la arquitectura estructural de la matriz bicapa con la región porosa que presenta grados extensos de fragmentación dentro de la pared de la vejiga mientras que las películas de la seda no porosas permanecían en gran parte intactas. Los niveles iniciales más altos de la fibroína de la seda utilizados para la construcción de la película con respecto al compartimento poroso también pueden haber contribuido a las diferencias observadas en el perfil de degradación. Además, la mayor tasa de degradación demostrada por las regiones porosas de los armazones FF en comparación con las matrices GS2 presumiblemente estaba relacionada con el aumento en el tamaño de los poros, así como con el menor contenido de la fibroína de la seda que habría permitido una exposición más eficiente del interior de la matriz a las enzimas proteolíticas y la posterior hidrólisis del polímero. El análisis del perfil de degradación de los armazones de colágeno SIS reveló una fragmentación más extensa con respecto a todos los grupos de la seda con grados mínimos de matriz residual detectada dentro del lumen de la vejiga. En conjunto, estos datos demuestran que los armazones de la seda investigados en este estudio son estructuralmente más estables que las matrices SIS in vivo; sin embargo, se pueden lograr alteraciones en la tasa de degradación del armazón de la seda a través de diferentes técnicas de procesamiento de los armazones con el método de fundición con disolvente/lixiviación con sal, lo que fomenta mayores grados de degradación de la matriz en comparación con los protocolos de hilado en gel.

Para cada grupo de biomateriales, los análisis de H&E y MTS demostraron la presencia de haces de músculo liso robustos (H&E: rosa; MTS: rojo) localizados en toda la periferia de la pared de la vejiga regenerada (datos no mostrados). Las evaluaciones de IHC revelaron que las capas de músculo liso reconstituidas de todos los grupos de armazón se tiñeron positivamente para la expresión de la proteína contráctil a-SMA y SM22a en grados similares a los observados con los controles de la cistotomía que indican una maduración prominente del músculo liso (datos no mostrados). No se detectó evidencia de eventos fibróticos severos en estas regiones en ninguno de los grupos experimentales examinados. Además, una lámina propia rica en ECM poblada con poblaciones fibroblásticas también fue evidente en los tejidos regenerados apoyados por todas las configuraciones de las matrices. En comparación con los controles de la cistotomía, se observaron las características histológicas dentro de la lámina propia indicativas de las reacciones inflamatorias mínimamente agudas en cada sitio de implantación caracterizadas por la presencia de granulocitos eosinófilos dispersos; sin embargo, no se observó evidencia de eventos inflamatorios crónicos sustanciales en respuesta a ninguna condición experimental.

Las evaluaciones histológicas también demostraron que cada grupo de implantes apoyó la formación de un urotelio multicapa que cubre toda la superficie luminal del sitio del defecto original (datos no mostrados). La naturaleza transicional del urotelio se confirmó en todos los tejidos regenerados mediante análisis IHC en donde las capas de las células basales e intermedias positivas para p63 estaban revestidas con las células superficiales luminales negativas para p63. Se observaron diversos grados de hiperplasia en los compartimentos de las células basales e intermedias apoyados por todos los grupos de implantes en comparación con los controles de la cistotomía. Esta característica puede reflejar una maduración urotelial incompleta ya que se requiere la normalización de la proliferación de las células basales/intermedias durante la cicatrización de las heridas para lograr la estratificación del tejido nativo [de Boer y otros, 1994; Gomez y otros, 2011]. Sin embargo, en todos los grupos de las matrices se observó una expresión robusta de la proteína pan-UP en las capas de las células tanto superficiales como intermedias regeneradas a niveles similares a los observados en los tejidos control. La expresión y ensamblaje de las proteínas UP en heterodímeros que forman membranas unitarias asimétricas es esencial para mantener la integridad de la barrera de permeabilidad urotelial [Kong y otros, 2004].

Los análisis de IHC revelaron evidencia de los procesos de inervación y vascularización de novo en los tejidos regenerados apoyados por cada grupo de implantes (datos no mostrados). Los vasos que contenían las células endoteliales positivas para CD31 prominentes estaban presentes en todos los sitios del defecto original, mientras que los linajes neuronales que mostraban expresión de la proteína perinuclear Fox3 se encontraron localizados en la región suburotelial de las paredes de las vejigas regeneradas de manera similar a los controles de la cistotomía. Estos resultados demuestran que las configuraciones del armazón de la seda descritas en este estudio son capaces de apoyar la regeneración del músculo liso vascularizado inervado y de los tejidos uroteliales a niveles comparables a las matrices SIS convencionales en un modelo de rata de reparación de los defectos de la vejiga.

La funcionalidad de las vejigas reconstruidas se evaluó mediante cistometría consciente sin restricciones después de 10 semanas de la implantación del biomaterial. El volumen de evacuación se usó como marcador sustituto de la capacidad de la vejiga, dado que los volúmenes residuales posteriores a la evacuación fueron similares en cada grupo experimental (datos no mostrados) [Chang y otros, 2009]. Las ratas aumentadas con los armazones GS1 y FF tenían volúmenes medios de evacuación significativamente más altos en comparación con los controles de cistotomía y en contraste con los otros grupos de armazones, GS2 y SIS. De acuerdo con los volúmenes más grandes de evacuación, los animales con los implantes GS1 y FF también tuvieron intervalos de intercontracción significativamente más largos en comparación con los niveles del control, lo que indica una mayor capacidad funcional de la vejiga ya que se requirió más tiempo para el llenado de la vejiga entre los ciclos de evacuación. Las SNVC se usaron como medida de la hiperactividad del detrusor, como se describió anteriormente [Abrams y otros, 2003]. Las ratas implantadas con las matrices SIS, GS1 y GS2 tuvieron números significativamente más altos de SNVC en comparación con el grupo de la cistotomía. En contraste, los animales aumentados con los armazones FF mostraron niveles de SNVC similares a los controles. La diferencia en SNVC probablemente se deba al aumento en la frecuencia y el tamaño de los cálculos intraluminales observados en los grupos SIS, GS1 y GS2 con respecto a los grupos control y FF, ya que se sabe que los cálculos en la vejiga provocan la irritación del órgano lo que provoca hiperactividad del detrusor e incontinencia urgente [Blaivas y otros, 2009]. La elasticidad es una medida de la capacidad de la vejiga urinaria para almacenar grandes volúmenes de orina a presiones intravesicales bajas. Se observaron ganancias significativas en la elasticidad de la vejiga en las ratas implantadas con los armazones FF en comparación con los controles de la cistotomía y en contraste con todas las demás configuraciones de los armazones. Sin embargo, las presiones intravesicales máximas fueron similares entre todos los grupos experimentales. Estos resultados son consistentes con la capacidad de los armazones FF para apoyar la regeneración del tejido de la vejiga con una capacidad funcional incrementada en relación con los controles y las propiedades mecánicas distensibles (Figuras 7A-7B).

Referencias

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Gomez P, Gil ES, Lovett ML, Rockwood DN, Di Vizio D y otros (2011) The effect of manipulation of silk scaffold fabrication parameters on matrix performance in a murine model of bladder augmentation. Biomaterials 32: 7562-7570.

Chang SJ, Yang SS. Variability, related factors and normal reference value of post-void residual urine in healthy kindergarteners. J Urol. Octubre del 2009; 182(4 Supl):1933-8. doi: 10.1016/j.juro.2009.02.086.

Abrams P. Describing bladder storage function: overactive bladder syndrome and detrusor overactivity. Urology. Noviembre del 2003; 62(5 Supl 2):28-37; discusión 40-2.

Hofmann S, Hagenmüller H, Koch AM, Müller R, Vunjak-Novakovic G, Kaplan DL, Merkle HP, Meinel L. Control of in vitro tissue-engineered bone-like structures using human mesenchymal stem cells and porous silkscaffolds. Biomaterials. Febrero del 2007; 28(6):1152-62. Epub 7 de noviembre del 2006.

Wu L, Ding J. In vitro degradation of three-dimensional porous poly(D,L-lactide-co-glycolide) scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. Diciembre del 2004; 25(27):5821-30.

Kropp BP, Eppley BL, Prevel CD, Rippy MK, Harruff RC, Badylak SF, Adams MC, Rink RC, Keating MA. Experimental assessment of small intestinal submucosa as a bladder wall substitute. Urology. Septiembre de 1995; 46(3):396-400.

Ejemplo 3

Actualmente, los segmentos gastrointestinales autólogos se utilizan como la opción principal para los procedimientos reconstructivos de la vejiga a pesar de su morbilidad inherente y su significativa tasa de complicaciones. Los biomateriales derivados de la fibroína de la seda de Bombyx mori representan alternativas atractivas para la ingeniería de tejidos de la vejiga dada su robustez mecánica, plasticidad de procesamiento y biodegradabilidad. Como se describe en la presente descripción, se planteó la hipótesis de que las matrices acelulares de la seda mediarían eficazmente en la regeneración de los tejidos en un modelo animal grande de aumento de la vejiga. Métodos. Se generaron los armazones (6 x 6 cm2) a partir de las soluciones acuosas de la fibroína de la seda al 6 % mediante un proceso de lixiviación con cloruro de sodio/fundición con disolvente descrito anteriormente. Se realizaron ensayos de microscopía electrónica de barrido (SEM) y de tracción para determinar las propiedades estructurales y mecánicas de los armazones antes de la implantación. Las matrices se anastomosaron a la cúpula de la vejiga de los cerdos Yorkshire (N = 6) mediante cistoplastia de ampliación abierta o asistida por robot. Después de un período inicial de drenaje del catéter de 7 días, los cerdos se dejaron evacuar espontáneamente y se alojaron durante 3 meses. Se usó un análisis cistométrico para determinar la capacidad de la vejiga tanto antes de la operación como a los 3 meses posteriores a la operación. Después de la eutanasia, se evaluaron los análisis histológicos (H&E y tricrómico de Masson) e inmunohistoquímicos (IHC) de la expresión de la proteína contráctil del músculo liso (a-actina y SM22a), los marcadores asociados al urotelio (citoqueratinas, p63 y uroplaquinas) y los marcadores de inervación (Fox3) y la vascularización (factor de von willebrand (wWF)) en la periferia y en el centro del sitio de implantación original, así como en una región de control no quirúrgica. Los resultados demuestran que los armazones de la seda apoyan la regeneración urotelial y del músculo liso, así como la inervación y vascularización del sitio del defecto. La periferia y el centro del implante mostró una expresión robusta del marcador de regeneración del músculo liso (a-actina, SM22a), urotelial (citoqueratinas, p63 y uroplaquinas), neuronal (Fox3) y vascular (vonWBF, factor de von willebrand) 3 meses después de la operación (datos no mostrado).

Las vejigas aumentadas con la seda mostraron un aumento de capacidad con el tiempo (Figuras 8A-8B) y presentaron propiedades funcionales y de tracción similares a los controles nativos (Figuras 12A-12B).

Los armazones acelulares bicapa de seda representan un sistema de biomaterial eficaz para mediar la regeneración del tejido de la vejiga y los resultados funcionales en un modelo animal grande. Estas matrices pueden ofrecer ventajas sobre los segmentos gastrointestinales convencionales y otros biomateriales celularizados para la cistoplastia de ampliación.

Ejemplo 4

Se generaron los armazones (6 x 6 cm2) a partir de las soluciones acuosas de la fibroína de la seda al 6 % mediante un proceso de lixiviación con cloruro de sodio/fundición con disolvente descrito anteriormente. Se realizaron ensayos de microscopía electrónica de barrido (SEM) y tracción para determinar las propiedades estructurales y mecánicas de los armazones antes de la implantación. Las matrices se anastomizaron a la cúpula de la vejiga de los cerdos Yorkshire no enfermos (N = 2) mediante cistoplastia de ampliación abierta o asistida por robot y se mantuvieron durante 3 meses. Se usó un análisis cistométrico para determinar la capacidad de la vejiga tanto antes de la operación como a los 3 meses posteriores a la operación. Después de la eutanasia, se evaluaron los análisis histológicos (H&E y tricrómico de Masson) e inmunohistoquímicos (IHC) de la expresión de la proteína contráctil del músculo liso (a-actina y SM22a) y de los marcadores asociados al urotelio (citoqueratinas y uroplaquinas) en la periferia y el centro del sitio de implantación original así como una región de control no quirúrgica.

La caracterización SEM de las matrices de la seda demostró la formación de una estructura de capa bl que consiste en una red porosa interna (tamaño de poro ~ 300 pm reforzado en un lado por una capa delgada de la seda amorfa (-50 pm de espesor) que resultó en la oclusión de los poros superficiales. Los ensayos de tracción de los armazones de la seda revelaron una resistencia máxima a la tracción promedio de 430 kPa, un módulo de tracción de 70 kPa y un alargamiento hasta la falla del 28 %. Después de 1 semana de la cateterización inicial, los animales fueron capaces de evacuar voluntariamente durante todo el período de implantación. Los análisis cistométricos de las vejigas aumentadas a los 3 meses posteriores a la operación revelaron aumentos sustanciales (> 2 veces) en la capacidad del órgano en comparación con los valores preoperatorios y los controles no operados con el mismo peso. Las evaluaciones histológicas y de IHC de las regiones periférica y central de los tejidos regenerados demostraron una formación robusta del haz de músculo liso que muestra la expresión de la a-actina y la SM22a, así como la presencia de un urotelio de múltiples capas que presenta una positividad prominente de la uroplaquina y la citoqueratina similar a las regiones control. Además, se observó una degradación sustancial de la matriz de la seda con solo restos discretos del armazón presentes dentro del interior del sitio de implantación sin que se observaran áreas de fibrosis o formación de cálculos.

Los armazones acelulares bicapa de seda representan un sistema de biomaterial eficaz para mediar la regeneración del tejido de la vejiga y los resultados funcionales en un modelo animal grande y pueden ofrecer ventajas sobre los segmentos gastrointestinales convencionales y los biomateriales celularizados previamente descritos para la cistoplastia de ampliación.

Ejemplo 5

Se generaron los armazones (6 x 6 cm2) a partir de las soluciones de la fibroína de la seda al 6 % mediante el uso de un proceso de fundición con disolvente/lixiviación con cloruro de sodio. Las matrices se anastomosaron a la cúpula de la vejiga de los cerdos Yorkshire (N = 6 ) y se mantuvieron durante 3 meses. Se usó un análisis cistométrico para determinar la capacidad de la vejiga tanto antes de la operación como a los 3 meses. Los tejidos regenerados se evaluaron mediante análisis histológicos (H&E y tricrómico de Masson) e inmunohistoquímicos (INC) de la expresión de las proteínas contráctiles del músculo liso (a-actina y SM22a), los marcadores asociados al urotelio (citoqueratinas, p63, uroplaquinas) y los marcadores de inervación (Fox3) y vascularización (factor von willebrand (vWF)). Las regiones control no quirúrgicas sirvieron como controles negativos.

Después de la implantación del armazón, 5/6 cerdos sobrevivieron a la eutanasia programada de 3 meses, mientras que 1 animal se sacrificó durante la primera semana debido a ascitis urinaria. Después de 1 semana de la cateterización inicial, 4/5 animales fueron capaces de evacuar voluntariamente durante todo el período de implantación. Los análisis cistométricos de las vejigas aumentadas (4/5 animales) a los 3 meses posteriores a la operación revelaron aumentos sustanciales (> 2 veces) en la capacidad del órgano en comparación con los valores preoperatorios y los controles no quirúrgicos. En 4/5 animales, las evaluaciones histológicas y por IHC de los tejidos regenerados demostraron haces robustos del músculo liso que muestran la a-actina y la SM22a, así como la presencia de un urotelio de transición que presenta positividad para la uroplaquina, p63 y citoqueratina similar a las regiones control. También se observaron células positivas para Fox3 y vWF en todo el sitio del implante, lo que indica inervación y vascularización de novo.

Después de 1 semana de la derivación urinaria inicial a través de un catéter uretral, los animales fueron capaces de evacuar voluntariamente. La cistometría a los 3 meses reveló aumentos sustanciales (> 2 veces) en la capacidad de la vejiga en 5/6 cerdos aumentados en comparación con los valores preoperatorios y con los controles no operados del mismo peso. Las evaluaciones histológicas y de IHC de las regiones tanto periférica y como central de los tejidos regenerados demostraron una formación robusta del músculo liso, así como un urotelio multicapa, similar a las regiones control no quirúrgicas. Los marcadores de inervación y vascularización también fueron evidentes en el tejido regenerado. Los tejidos regenerados se evaluaron mediante análisis histológicos (H&E y tricrómico de Masson) e inmunohistoquímicos (IHC) para los marcadores proteicos contráctiles del músculo liso (a-actina y SM22a), uroteliales (citoqueratinas, p63, uroplaquinas), inervación (Fox3) y vascularización (CD31).

Los armazones acelulares de la seda representan un sistema del biomaterial eficaz para mediar la regeneración del tejido de la vejiga y los resultados funcionales en un modelo animal grande y ofrecen ventajas sobre los segmentos GI y los biomateriales celularizados descritos anteriormente para la cistoplastia de ampliación.

Ejemplo 6

Se produjeron dos grupos de armazones de la seda mediante un proceso de hilado en gel y consistieron en láminas multilaminadas compactas y lisas (GS1) o láminas rugosas y porosas de tipo laminar (GS2). Los armazones FF de la seda se produjeron con un método de fundición con disolvente/lixiviación con sal y consistieron en espumas porosas recocidas para formar películas compactas. Los aumentos de la vejiga se realizaron en ratas Sprague Dawley con armazones acelulares (7 x 7 mm2) y los animales se mantuvieron durante 10 semanas. Los armazones de la submucosa del intestino delgado (SIS) se evaluaron en paralelo mientras que los animales control recibieron una cistotomía sola. Se evaluó un total de 8-10 animales por grupo mediante el uso de los ensayos de cistometría, histológicos (H&E y tricrómico de Masson) e inmunohistoquímicos (IHC) a las 10 semanas posteriores a la operación.

Los tejidos regenerados se analizaron para la expresión de las proteínas contráctiles del músculo liso (a-actina y SM22a), los marcadores asociados al urotelio (p63 y uroplaquinas) y los marcadores de inervación (Fox3) y vascularización (factor de von willebrand (wWF)). La expresión robusta de estos marcadores dentro del sitio de integración, lo que demuestra que los grupos de armazones apoyan el urotelio y el músculo liso vascularizado e inervado. Los armazones de la seda apoyan la consolidación del defecto y la configuración influye en la formación de los cálculos, como se muestra en las Figuras 10A-10B. Además, las configuraciones de los armazones de la seda influyen de manera diferente en la función de la evacuación, como se muestra en las Figuras 11A-11B.

Se demostró que las variaciones en la estructura del armazón de la seda influyen en la frecuencia de la formación de los cálculos urinarios con el grupo FF que muestra una incidencia del 20 % de los cálculos en comparación con las tasas del 71 y 75 % observadas en los grupos GS1 y GS2. Los análisis histológicos y de IHC demostraron extensiones comparables de regeneración del músculo liso y expresión de la proteína contráctil (a-actina y SM22a) dentro de los sitios de defectos originales de todos los grupos. Los tejidos regenerados en cada grupo también contenían un urotelio de transición con expresión positiva de la uroplaquina y la proteína p63. La inervación y vascularización de novo de los tejidos regenerados también se confirmó en cada grupo mediante la expresión robusta de las proteínas Fox3 y ^c D31. El análisis cistométrico reveló aumentos significativos en los volúmenes de evacuación en todos los grupos en comparación con los controles de cistotomía. La frecuencia de las contracciones de no evacuación fue similar en las ratas FF en comparación con los controles, sin embargo, las cohortes GS1 y GS2 presentaron una hiperactividad significativa, lo que sugiere un aumento en la disfunción del detrusor con estas matrices.

Los armazones de la seda promueven la regeneración del tejido de la vejiga con un rendimiento funcional de evacuación que depende de las técnicas iniciales de fabricación del biomaterial.

Ejemplo 7

Las composiciones bicapa de seda descritas anteriormente en la presente descripción se usaron para reparar un defecto del íleon creado quirúrgicamente (Figura 13). El tejido del íleon en el sitio de la implantación de la composición bicapa se regeneró (Figura 17) y demostró continuidad del tracto GI a las 10 semanas posteriores a la operación, según lo determinado por el examen macroscópico y la exploración microCT (Figura 18). Se realizaron los análisis histológicos e inmunohistológicos de la región regenerada proximal del íleon aumentado con el armazón bicapa de seda 10 semanas posteriores a la operación. Se observó la expresión de los marcadores contráctiles del músculo liso (a-SMA y SM22 a) así como de los marcadores epiteliales (pancitoqueratinas) en el tejido regenerado (datos no mostrados).

Ejemplo 8

Se prepararon las composiciones bicapa de seda de acuerdo con el Método 2 del Ejemplo 1, por ejemplo, se fundió una espuma de la fibroína de la seda mientras estaba en contacto con una película de la fibroína de la seda preexistente y se usó para regenerar el tejido de la vejiga porcina.

Métodos: Las matrices se anastomizaron a la cúpula de la vejiga de los cerdos Yorkshire (N = 4) mediante cistoplastia de ampliación abierta y después de un período inicial de drenaje del catéter de 7 días, se mantuvieron durante 3 meses. Se usó el análisis cistométrico para determinar la capacidad de la vejiga tanto antes de la operación como a los 3 meses posteriores a la operación (Tabla 1). Después de la eutanasia, se evaluaron los análisis histológico (H&E) e inmunohistoquímico (iHc) de la expresión de la proteína contráctil del músculo liso (aactina y SM22a), los marcadores asociados al urotelio (citoqueratinas, p63 y uroplaquinas) y los marcadores de inervación (sinaptofisina) y vascularización (CD31) en la periferia y en el centro del sitio de implantación original, así como en una región control no quirúrgica. La expresión de los marcadores indicó la regeneración urotelial y del músculo liso, así como la vascularización y la inervación en el área del implante. Se realizaron los análisis del ensayo de tracción del tejido de la vejiga porcina regenerado y nativo para evaluar las propiedades mecánicas (Figura 14). El tejido regenerado se comportó, en promedio, de manera similar al tejido nativo.

Tabla 1: Capacidad de la vejiga (capacidad con 20 cm de H2O) antes de la operación y a los 3 meses después del aumento con armazón de la seda.

Ejemplo 9

Los capullos del gusano de la seda de B. mori se hirvieron durante 20 min en una solución acuosa de Na2CO3 a 0,02 M y luego se enjuagaron minuciosamente con agua destilada para extraer las proteínas de sericina de tipo pegamento y la cera. La fibroína de la seda extraída se disolvió luego en una solución de LiBr a 9,3 M a 60 °C durante 6 h. Esta solución se dializó en agua destilada mediante el uso de un casete de diálisis Slide-a-lyzer (MWCO, 3500) durante 4 d lo que produce una solución acuosa de la fibroína de la seda al 8 % (peso/vol). Se vertieron 75 ml de una solución acuosa de la fibroína de la seda (6 % p/vol) en un recipiente de fundición rectangular (12 cm x 10 cm) y se mezcló con NaCl granular (150 g, tamaño medio del cristal 500-600 pM) con la solución de la seda. Se dejó fundir la solución resultante durante 2 días a temperatura ambiente y luego se eliminó el NaCl mediante lavado en agua destilada durante 2 días. La formación espontánea del armazón bicapa se logró con una oclusión aleatoria de los poros que se produjo en la parte inferior del plano de la matriz adyacente a la cara del recipiente de fundición. Para la implantación, el compartimento poroso puede recortarse en espesor para permitir que el espesor total del armazón bicapa se aproxime al espesor del tejido huésped circundante. El área del armazón también se recortó para acomodar el área del defecto.

Ejemplo 10

Las Figuras 19A-19B demuestran que los armazones de la seda apoyan la continuidad uretral después de la uretroplastia de injerto en los conejos. La Figura 19A representa una imagen del modelo del procedimiento quirúrgico e implantación de la seda dentro de la uretra de los conejos. La Figura 19B representa los uretrogramas retrográficos que demuestran que no hay reducción en el calibre uretral o formación de estenosis después de 3 meses de la implantación de la seda. Los controles representan las uretras que se incidieron quirúrgicamente, claosaron y se mantuvieron en paralelo con los animales implantados con la seda. Los resultados son representativos de los animales N = 2 realizados con los implantes de la seda, así como los controles. Las flechas indican el sitio de implantación original o una lesión simulada.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición multicapa de biomaterial, que comprende:

una primera y segunda capa;

la primera capa comprende una matriz porosa del biomaterial, en donde la matriz porosa del biomaterial se caracteriza por un tamaño medio de los poros de al menos 200 pm y la segunda capa comprende un biomaterial impermeable, la segunda capa impermeable a una solución acuosa, en donde la matriz porosa del biomaterial y/o el biomaterial impermeable comprende la fibroína de la seda y

en donde la composición multicapa de biomaterial se caracteriza porque cuando se une a un sitio de una herida o defecto de un órgano hueco, la primera capa proporciona un armazón para la regeneración del tejido y la segunda capa sella la herida o el defecto.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde la matriz porosa del biomaterial es una estructura seleccionada del grupo que consiste en: espumas; hidrogeles; fibras electrohiladas; geles; esteras de fibras; esponjas; armazones tridimensionales; esteras no tejidas; materiales tejidos; materiales de punto; haces de fibras y fibras.

3. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la matriz porosa del biomaterial y el biomaterial impermeable comprenden el mismo biomaterial.

4. La composición de la reivindicación 1, en donde la primera capa comprende una matriz porosa de la fibroína de la seda y la segunda capa comprende una película impermeable de la fibroína de la seda.

5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un agente, en donde opcionalmente el agente se selecciona del grupo que consiste en: un antibiótico; un agente para atraer a las células; una célula; una célula madre; un ligando; un factor de crecimiento; una plaqueta y un componente de la matriz extracelular.

6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tamaño medio de los poros de la matriz del biomaterial es: al menos 300 pm; al menos 400 pm; de aproximadamente 200 pm a aproximadamente 600 pm; de aproximadamente 300 pm hasta aproximadamente 500 pm; aproximadamente 400 pm; o aproximadamente 300 pm.

7. Un método para producir una composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el método comprende; poner en contacto una matriz porosa del biomaterial con una capa impermeable del biomaterial.

8. Un método para producir una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, el método comprende:

(a) fundir una mezcla de la solución acuosa del biomaterial y NaCl;

(b) poner en contacto la composición resultante de la etapa (a) con agua.

9. El método de la reivindicación 8, en donde la etapa (a) se realiza con la solución en contacto con una capa impermeable del biomaterial preexistente.

10. El método de la reivindicación 8, en donde la matriz porosa del biomaterial y/o el biomaterial impermeable comprende además uno o más miembros seleccionados del grupo que consiste en: PGA; colágeno; óxido de polietileno, colágeno, fibronectina, queratina, ácido poliaspártico, polilisina, alginato, quitosano, quitina y ácido hialurónico.

11. El método de la reivindicación 10, en donde la solución de la fibroína de la seda tiene una concentración de:

de aproximadamente 2 % p/vol a aproximadamente 15 % p/vol; de aproximadamente 4 % p/vol a aproximadamente 10 % p/vol o aproximadamente 6 % p/vol.

12. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la segunda capa es: de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 600 pm de espesor; de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 400 pm de espesor; de aproximadamente 150 pm a aproximadamente 250 pm de espesor; de aproximadamente 25 pm a aproximadamente 150 pm de espesor; aproximadamente 200 pm de espesor.

13. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la composición es: de aproximadamente 0,01 cm a aproximadamente 5 cm de espesor; de aproximadamente 0,1 cm a aproximadamente 3 cm de espesor; de aproximadamente 0,1 cm a aproximadamente 2 cm de espesor o aproximadamente 1 cm de espesor.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7-13, en donde el método comprende además añadir un agente a al menos una capa, en donde opcionalmente el agente es un agente terapéutico.

15. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso en un método para la cicatrización de las heridas o reparación de un defecto del tejido, el método comprende aplicar dicha composición a la herida o defecto del tejido, en donde la capa impermeable está orientada para evitar el movimiento del material dentro o fuera de la herida o defecto.