JPH0543600A - 抗体または抗原固定化絹フイブロイン膜および免疫測定用センサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 抗体又は抗原が均一に固定化された膜および
該膜を用いた、バラツキのない高精度の測定が可能な免
疫センサーを提供することにある。 【構成】 グルタルアルデヒド重合体又は、塩化シアヌ
ル等を用いた共有結合により、抗体または抗原を固定化
した絹フィブロイン膜および該膜を装着してなる免疫測
定用センサー。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査などの免疫測
定試薬として用いられる抗体または抗原を固定化した絹
フィブロイン膜に関する。

【０００２】

【従来の技術】抗原抗体反応の高い特異性を利用して検
体中に含まれる特定の抗原あるいは抗体を、定性的にあ
るいは定量的に測定するために種々の免疫学的測定法が
用いられており、代表的なものとして酵素免疫測定法
（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）等が知られてい
るが、こうした免疫学的試験法に於いては、一般に測定
対象の抗原（あるいは抗体）に対応する抗体（あるいは
抗原）を化学結合法、吸着法あるいは包括法によって固
定化した不溶性担体（固相）と、酵素または放射性同位
元素などで標識した抗体（あるいは抗原）とが用いられ
る。

【０００３】こうした固相抗体の一つとして、抗体を包
括固定化した絹フィブロイン膜が報告されており、これ
を酸素電極に装着することを特徴とする免疫センサー
が、高感度、且つレンジの広い測定が可能であるととも
に繰り返し使用に耐え、有用性の高いものであることが
特開昭６３−１１７２５３号に於いて開示されている。
この抗体固定化絹フィブロイン膜を用いた免疫センサー
により高感度な測定が可能である理由の一つとして、絹
フィブロイン膜自体の酸素透過性が他の膜に比べて非常
に優れていることが挙げられる。

【０００４】ところが、包括法による抗体固定化絹フィ
ブロイン膜は、優れた性能を有している反面、抗体を固
定化する際の使用抗体量がやや多く、抗体固定化量を制
御しにくいほか、膜に均一に固定化しにくいといった欠
点を有していた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述の欠点
に鑑みなされたものであって、その目的とするところ
は、抗体または抗原が均一に固定化された絹フィブロイ
ン膜を提供するにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上述の目的は、共有結合
により抗体または抗原を固定化した絹フィブロイン膜お
よび該絹フィブロイン膜を電極デバイスに装着してなる
免疫測定用センサーにより達成される。

【０００７】本発明に用いられる抗体としては、例えば
以下のようなものが具体例として挙げられる。 （１）インシュリン，絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣ
Ｇ），胎盤性ラクトゲン，黄体形成ホルモン等のポリペ
プチド系ホルモンの抗体。 （２）ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＥ，α−フェトプ
ロテイン（ＡＦＰ），カルシノエンブリオニックアンチ
ゲン，Ｃ−反応性蛋白（ＣＲＰ），α１−アシッドグリ
コプロテイン（ＡＧＰ），ハプトグロビン等の血清蛋白
の抗体。 （３）大腸菌毒素，コレラトキシン，肝炎ウィルス，風
疹ウィルス，インフルエンザウィルス等の毒素あるいは
ウィルスの抗体。 （４）エストラジオール，プロゲストロン，テストステ
ロン，フェニトイン，プロカインアミド，カナマイシ
ン，ペニシリン，バルビツール酸等のステロイドホルモ
ンあるいは薬剤の抗体。

【０００８】これら抗体の種類は、ＩｇＧ，ＩｇＡ，Ｉ
ｇＭ等のクラス，あるいはこれらの抗体フラグメントい
ずれをも使用することが出来る。また、マウス，ラッ
ト，ウサギ，ヤギあるいはヒト等から常法によって採取
した抗体を使用することが出来るが、特に細胞融合法に
よって採取したモノクローナル抗体の使用が均質な抗体
が得られ、感度、精度の点で好ましい。なお、通常使用
する抗体はいずれも常法によって例えば、硫安塩析また
はＤＥＡＥイオン交換カラムクロマトグラフィー等で精
製して用いられる。

【０００９】本発明に用いられる抗原としては、分子内
にアミノ基等の官能基を有するものならばいずれの使用
も可能であり、上記抗体に対応する抗原等が挙げられ
る。

【００１０】本発明に用いられる絹フィブロイン膜とし
ては、生糸を石けん水溶液中に浸漬し、水，エチルアル
コール，塩化カルシウムと混合し、透析脱塩した後、グ
リセリンを加え、ガラス板上に流延して乾燥したもの等
を用いることができる。絹フィブロイン膜を製膜する際
の基板としては、ガラス板、アクリル板等が挙げられる
が、粗面板を用いることが好ましい。

【００１１】抗体あるいは抗原を絹フィブロイン膜に結
合させる方法としては、一般的な二官能性以上の結合剤
や縮合剤等の結合試薬を用いることができる他、スペー
サーを介して結合させる方法も用いられる。絹フィブロ
イン膜、及び抗体（あるいは抗原）のアミノ基、カルボ
キシル基、水酸基等の官能基が結合に有効に利用される
が、結合試薬の例を示すと、アミノ基相互間の結合試薬
（例えばジメチルスクシンイミデート等のアルキルジイ
ミデート類、酒石酸ジアジド等のアシルアジド類、１，
５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等のアリー
ルジハライド類、キシレン−ｍ−ジイソシアネート等の
イソシアネート類、Ｎ，Ｎ′−ｏ−フェニレンジマレイ
ミド等のジマレイミド類、その他、グルタルアルデヒド
等のジアルデヒド類，グルタルアルデヒド重合体、ブロ
ムシアン，塩化シアヌル等）、アミノ基とチオール基間
の結合試薬（例えば、メチル−４−メルカプトブチルイ
ミデート等のメルカプトアルキルイミデート類、γ−マ
レイミド酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等
のマレイミドカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル類）、水酸基とアミノ基間の結合試薬（ブロム
シアン、塩化シアヌル等）、あるいはカルボキシル基と
アミノ基間の結合試薬（例えば１−エチル−３−ジメチ
ルアミノプロピルカルボジイミド等の水溶性カルボジイ
ミド類）等が挙げられる。

【００１２】中でも、グルタルアルデヒド（特に重合化
処理を施したもの）あるいは塩化シアヌルを結合試薬と
して用いたものは、免疫センサー系における繰り返し測
定安定性能が良好であり、特に好ましい。

【００１３】グルタルアルデヒド重合体は、グルタルア
ルデヒドから自然発生的に生成するが、アルカリ存在下
６０℃中で数時間熱処理することによっても得られる。
また、グルタルアルデヒド水溶液に３級アミン、例えば
トリエチルアミンを触媒量添加することによっても得ら
れる（特開平２−４９５８７号公報）。

【００１４】このような結合試薬を反応させた絹フィブ
ロイン膜を、３．１２５×１０^-8Ｍ〜６．２５×１０^-6
Ｍの濃度の上記抗体あるいは抗原溶液中で４℃〜４０℃
の範囲内で数１０分〜数１０時間反応させ、よく洗浄す
る。

【００１５】更に本発明の抗体または抗原固定化絹フィ
ブロイン膜は、蛋白質，ペプチド，或はアミノ酸溶液中
で４〜４０℃の範囲内で数時間反応させてブロッキング
することによって、非特異吸着を抑えることができる。
ブロッキングに用いる蛋白質，ペプチド，アミノ酸とし
ては、牛血清アルブミン、卵白アルブミン等の蛋白質、
グリシン、アラニン、リジン、アルギニン、セリン、グ
ルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸及びペプチド
類等が挙げられる。

【００１６】本発明の免疫測定用センサーの電極デバイ
スとしては、酸素電極、塩素電極、過酸化水素電極等が
挙げられるが、酸素透過性が良いというフィブロイン膜
の特徴を生かせる点で酸素電極が特に好ましい。

【００１７】以下実施例によって本発明を更に詳細に説
明するが、それに先立って、実施例で用いた絹フィブロ
イン膜の製造例及び免疫測定に用いる酵素標識抗体の製
造例を参考例として示す。

【００１８】

【参考例】

参考例１（絹フィブロイン膜の製造） （１）フィブロイン水溶液の調製 生糸１００ｇを１．０重量％のマルセル石けん水溶液５
０００ｍｌ中に浸漬し、８０℃で３時間精練した。水洗
後、更に０．５重量％のマルセル石けん水溶液５０００
ｍｌに浸漬して８０℃で３時間精練し、セリシン等を実
質的に除去したフィブロイン原料７２ｇを得た。水１０
０ｇとエチルアルコール８０ｇの入ったニーダー中に塩
化カルシウム１５０ｇを溶解し、７５℃に昇温後、上記
のフィブロイン原料７０ｇを投入し、１時間攪拌下に溶
解した。次いで、１８０ｇの温水（７５℃）を加えて希
釈した。これを冷却した後、ホローファイバー型の透析
器を用いて、流水に対して透析脱塩し、５．７重量％の
フィブロイン水溶液１２００ｍｌを得た。塩化カルシウ
ムの残存量は０．０８％であった。

【００１９】（２）絹フィブロイン膜の製造 前記（１）のフィブロイン水溶液にグリセリンをフィブ
ロインに対して３０重量％加え、その溶液を四方を区切
ったガラス板に流延し、２０℃で１０時間乾燥すること
によって皮膜化させ、はく離することにより絹フィブロ
イン膜を得た。

【００２０】参考例２（絹フィブロイン膜の製造） 参考例１の（１）のフィブロイン水溶液にグリセリンを
フィブロインに対して３０重量％加え、その溶液を四方
を区切ったアクリル板に流延し、２０℃で１０時間乾燥
することによって皮膜化させ、はく離した。次いで、こ
の膜を８０％メタノール水溶液中に室温で３分間浸漬さ
せることにより不溶性の絹フィブロイン膜を得た。

【００２１】参考例３（カタラーゼ標識抗ヒトＡＦＰマ
ウスモノクローナル抗体の製造） （１）チオール化カタラーゼの製造 カタラーゼ溶液０．１６６ｍｌ（含量１５ｍｇ）を０．
０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で、２．５ｍｌに希
釈し、窒素曝気を６０ｍｌ／分で１０分間行い、次にメ
チル−４−メルカプトブチルイミデート１ｍｇを加え、
窒素雰囲気下に４℃で２時間反応させた。反応終了後、
窒素雰囲気のままダイアフローメンブラン（アミコン社
製）を用いて限外濾過により濃縮し、これに０．０５Ｍ
リン酸緩衝液３ｍｌ（ｐＨ７．０）を加え、再び限外濾
過した。この操作を３回繰り返して未反応のメチル−４
−メルカプトブチルイミデートを除き、チオール化カタ
ラーゼ溶液３ｍｌを得、窒素雰囲気下で保存した。

【００２２】（２）マレイミド化抗ヒトＡＦＰマウスモ
ノクローナル抗体の製造 抗ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗体溶液０．４２ｍ
ｌ（含量１０ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で５．０ｍｌに希釈し、Ｎ−（γ−マレイミドブチ
ロキシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ）０．５ｍｇをジオ
キサン０．５ｍｌに溶かして加えた。４℃で２時間反応
させた後、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０
００ｍｌで透析（２時間）を２回行ってマレイミド化抗
ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗体溶液６ｍｌ（含量
１０ｍｇ）を得た。

【００２３】（３）カタラーゼ標識抗ヒトＡＦＰマウス
モノクローナル抗体の製造 （１）で製造したチオール化カタラーゼ溶液２ｍｌ（含
量１０ｍｇ）と（２）で製造したマレイミド化抗ヒトＡ
ＦＰマウスモノクローナル抗体溶液３ｍｌ（含量５ｍ
ｇ）とを窒素雰囲気下で混合し、４℃で１６時間反応さ
せた。未反応のマレイミド基をブロックするためシステ
イン１ｍｇを加え４℃で３０分間反応後、１２０００ｒ
ｐｍ、５分間の遠心分離で沈澱物を除去し、高速液体カ
ラムクロマトグラフィーによって目的物を分離精製し
た。カラムは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−３０００ＳＷ
（東洋ソーダ製）を用い、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で溶出し、最初の画分を集めカタラーゼ標識
抗ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗体溶液１２ｍｌ
（含量４ｍｇ）を得た。

【００２４】

【実施例】

実施例１ （グルタルアルデヒド重合体を結合試薬とする方法）市
販グルタルアルデヒド水溶液を０．１Ｍホウ酸緩衝溶液
（ｐＨ１１）にて１重量％に希釈し、６０℃で１時間熱
処理することによりグルタルアルデヒド重合体水溶液を
得た。次いで参考例１で製造した絹フィブロイン膜を１
重量％グルタルアルデヒド重合体水溶液中に室温で３時
間浸漬させ、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水で十分洗
浄し、未反応のグルタルアルデヒド重合体を除去した。
更にこの膜を５０μｇ／ｍｌの抗ヒトＡＦＰマウスモノ
クローナル抗体（ＩｇＧ）を含有する０．０１Ｍリン酸
緩衝生理食塩水ｐＨ７．２中に室温で１５時間浸漬し、
次いでこの膜を０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水で十分
洗浄した。その後、この膜を１Ｍリジンを含有する０．
１Ｍリン酸緩衝溶液で室温下３時間浸漬することにより
ブロッキング処理を行い、更に、この膜を０．０１Ｍリ
ン酸緩衝生理食塩水で十分洗浄した後、０．１重量％ア
ジ化ナトリウムを含有する０．０１Ｍリン酸緩衝生理食
塩水（ｐＨ７．２）中で４℃にて保存した。

【００２５】実施例２ （塩化シアヌルを結合試薬とする方法）参考例２で製造
した絹フィブロイン膜を５０ｍｌの蒸留水中に浸漬さ
せ、溶液中のｐＨを８〜９に調整しながら室温で０．５
ｇの塩化シアヌルを含有するアセトン溶液１０ｍｌを１
０分間で滴下し、１Ｎ塩酸を滴下してｐＨを３にし反応
を停止させた。この溶液から膜を取り出し、０．０１Ｍ
リン酸緩衝生理食塩水で十分洗浄した。更に、この膜を
５０μｇ／ｍｌの抗ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗
体（ＩｇＧ）を含有する０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩
水（ｐＨ７．２）中に室温で１５時間浸漬し、次いでこ
の膜を０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水で十分洗浄し
た。その後、この膜を１Ｍリジンを含有する０．１Ｍリ
ン酸緩衝溶液で室温下３時間浸漬することによりブロッ
キング処理を行い、更に、この膜を０．０１Ｍリン酸緩
衝生理食塩水で十分洗浄した後、０．１重量％アジ化ナ
トリウムを含有する０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水中
で４℃にて保存した。

【００２６】実施例３ （ブロムシアン法）参考例１で製造した絹フィブロイン
膜を１０ｍｌの蒸留水中に浸漬させ、溶液中のｐＨを１
１〜１２に調整しながら室温で２．５重量％のブロムシ
アンを含有する蒸留水８ｍｌを５分間で滴下し、この溶
液から膜を取り出し、０．１Ｍの炭酸水素ナトリウム緩
衝溶液（ｐＨ９）で洗浄した。更に、この膜を５０μｇ
／ｍｌの抗ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗体（Ｉｇ
Ｇ）を含有する０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ
７．２）中に室温で１５時間浸漬し、次いでこの膜を
０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水で十分洗浄した。その
後、この膜を１Ｍリジンを含有する０．１Ｍリン酸緩衝
溶液で室温下３時間浸漬することによりブロッキング処
理を行い、更に、この膜を０．０１Ｍリン酸緩衝生理食
塩水で十分洗浄した後、０．１重量％アジ化ナトリウム
を含有する０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．
２）中で４℃にて保存した。

【００２７】実施例４ （アジド法）参考例１で製造した絹フィブロイン膜を
０．５Ｎの硫酸を含有するメタノール中に室温で２４時
間浸漬し、蒸留水で洗浄する。この膜を１重量％のヒド
ラジン水溶液に室温で２４時間浸漬し、蒸留水で洗浄し
た。次いで、この膜を０．５Ｍの亜硝酸ナトリウムを含
有する０．３Ｎの塩酸中に０℃で５分間浸漬し、蒸留水
で洗浄した。更に、この膜を５０μｇ／ｍｌの抗ヒトＡ
ＦＰマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ）を含有する
０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）中に室
温で１５時間浸漬し、次いでこの膜を０．０１Ｍリン酸
緩衝生理食塩水で十分洗浄した。その後、この膜を１Ｍ
リジンを含有する０．１Ｍリン酸緩衝溶液で室温下３時
間浸漬することによりブロッキング処理を行い、更に、
この膜を０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水で十分洗浄し
た後、０．１重量％アジ化ナトリウムを含有する０．０
１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）中で４℃にて
保存した。

【００２８】実施例５ （グルタルアルデヒドモノマーを結合剤とする方法）参
考例１で製造した絹フィブロイン膜を１０重量％グルタ
ルアルデヒドモノマーを含有する０．２Ｍの炭酸水素ナ
トリウム緩衝溶液（ｐＨ９）中に室温で３時間浸漬さ
せ、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水で十分洗浄し、未
反応のグルタルアルデヒドモノマーを除去した。更にこ
の膜を５０μｇ／ｍｌの抗ヒトＡＦＰマウスモノクロー
ナル抗体（ＩｇＧ）を含有する０．０１Ｍリン酸緩衝生
理食塩水中に室温で１５時間浸漬し、次いでこの膜を
０．１Ｍの水素化ホウ素ナトリウム水溶液中０℃で３分
間浸漬し、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水で十分洗浄
した。その後、この膜を１Ｍリジンを含有する０．１Ｍ
リン酸緩衝溶液で室温下３時間浸漬することによりブロ
ッキング処理を行い、更に、この膜を０．０１Ｍ生理食
塩水で十分洗浄した後、０．１重量％アジ化ナトリウム
を含有する０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．
２）中で４℃にて保存した。

【００２９】比較例１ （包括法）抗ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗体（Ｉ
ｇＧ）を生理食塩水に溶解し、２５０μｇ／ｍｌの抗体
溶液を調製した。次に、この溶液を四方を区切ったガラ
ス板上に抗体量が２０μｇ／ｃｍ² となるように流延
し、１５℃で３時間乾燥した。参考例１の（１）のフィ
ブロイン水溶液にグリセリンをフィブロインに対して３
０重量％加え、その溶液を抗体が塗布されたガラス板に
流延し、２０℃で１０時間乾燥することによって皮膜化
させ、はく離した。これを直径８ｍｍの円形に裁断し、
厚さ６０μｍの抗ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗体
固定化絹フィブロイン膜を得た。

【００３０】実施例６ （ヒトＡＦＰ測定用免疫センサーの作成）図５に示すよ
うに、反応セル（容量０．２ｍｌ）に本発明によって製
造された抗ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗体固定化
絹フィブロイン膜（実施例１，２）、あるいは抗ヒトＡ
ＦＰ抗体固定化絹フィブロイン膜（比較例１），酸素透
過膜，Ｏ−リング及びガルバニ型酸素電極（ＡＮ型、オ
リエンタル電気株式会社製）を順次装着してヒトＡＦＰ
測定用の酸素検出型免疫センサーを作成した。

【００３１】

【試験例】以下、試験例を挙げて本発明の効果を更に詳
細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

【００３２】試験例１ 抗体固定化量の均一性評価試験 （１）試料 実施例１及び比較例１の絹フィブロイン膜

【００３３】（２）試験方法 直径８ｍｍの円形に打ち抜いた試料を０．０１Ｍのリン
酸緩衝生理食塩水液（ｐＨ７．２）で十分洗浄し、濾紙
で抜き取り、次いで内径１．３ｍｍのガラス試験管に入
れ、以下の試験を行った。

【００３４】ヒトα−フェトプロティン（以下ＡＦＰと
記す）０と１０００ｎｇ／ｍｌを含有する０．０１Ｍリ
ン酸緩衝生理食塩水（０．５％牛血清アルブミン含有）
０．５ｍｌを前記のガラス試験管に入れ、３７℃で２時
間免疫反応を行った。次ぎに、蒸留水３ｍｌで３回洗浄
後、参考例３で製造した（特開昭６３−１０１７５４号
公報に開示）カタラーゼ標識抗ヒトＡＦＰマウスモノク
ローナル抗体１１μｇ／ｍｌを含有する０．０１Ｍリン
酸緩衝生理食塩水（０．５％牛血清アルブミン含有）
０．５ｍｌを同試験管に入れ、３７℃で２時間免疫反応
を行った。更に、蒸留水３ｍｌで３回洗浄後、０．０２
Ｍ過酸化水素−０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水１．０
ｍｌを加え、１０分間酵素反応を行った後、１規定硫酸
１．０ｍｌを加えて反応を停止させ、過酸化水素に基づ
く２４０ｎｍの吸光度（Ａ２４０）を測定した。この測
定から得られたＡＦＰ０ｎｇ／ｍｌと１０００ｎｇ／ｍ
ｌを加えた時の吸光度差（ｎ＝５）から算出したＣＶ値
（％）を比較することにより、抗体固定化量の均一性評
価を行った（ＣＶ値＝（標準偏差／平均値）×１００；
このＣＶ値が低い程、均一性が高いことを表す。）。

【００３５】尚、０．０２Ｍ過酸化水素−０．０１Ｍリ
ン酸緩衝生理食塩水１．０ｍｌに１規定硫酸１．０ｍｌ
を添加した時の吸光度（Ａ２４０）をブランク値とし
た。

【００３６】

【表１】

【００３７】表１からわかる通り、本発明によって製造
された共有結合法による抗体固定化絹フィブロイン膜
は、比較例１の包括法による抗体固定化絹フィブロイン
膜と比べてＣＶ値が低く、抗体固定化量が均一であり、
そのためバラツキのより少ない高精度の測定が可能とい
う点で優れたものであった。

【００３８】試験例２ 抗体固定化絹フィブロイン膜の性能試験 （１）試料 本発明によって製造された共有結合法による抗体固定化
絹フィブロイン膜（後述する実施例１〜５）、及び包括
法による抗体固定化絹フィブロイン膜（後述する比較例
１）

【００３９】（２）試験方法 直径８ｍｍの円形に打ち抜いた試料を０．０１Ｍのリン
酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で十分洗浄し、濾紙で
抜き取り、次いで内径１．３ｍｍのガラス試験管に入
れ、以下の試験を行った。

【００４０】ヒトα−フェトプロティン（以下ＡＦＰと
記す）０または１０００ｎｇ／ｍｌを含有する０．０１
Ｍリン酸緩衝生理食塩水（０．５％牛血清アルブミン含
有）０．５ｍｌを前記のガラス試験管に入れ、３７℃で
２時間免疫反応を行った。次に、蒸留水３ｍｌで３回洗
浄後、参考例３で製造したカタラーゼ標識抗ヒトＡＦＰ
マウスモノクローナル抗体１１μｇ／ｍｌを含有する
０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（０．５％牛血清アル
ブミン含有）０．５ｍｌを同試験管に入れ、３７℃で２
時間免疫反応を行った。更に、蒸留水３ｍｌで３回洗浄
後、０．０２Ｍ過酸化水素−０．０１Ｍリン酸緩衝生理
食塩水１．０ｍｌを加え、１０分間酵素反応を行った
後、１規定硫酸１．０ｍｌを加えて反応を停止させ、残
存過酸化水素に基づく２４０ｎｍの吸光度（Ａ２４０）
を測定した。

【００４１】尚、０．０２Ｍ過酸化水素−０．０１Ｍリ
ン酸緩衝生理食塩水１．０ｍｌに１規定硫酸１．０ｍｌ
を添加した時の吸光度（Ａ２４０）をブランク値とし
た。

【００４２】

【表２】

【００４３】表２からわかる通り、本発明によって製造
された共有結合法による抗体固定化絹フィブロイン膜
は、比較例１の包括法による抗体固定化絹フィブロイン
膜と同様に、免疫測定を行うのに十分な信号量が得られ
ることがわかった。

【００４４】試験例３ 免疫センサーによる抗体固定化絹フィブロイン膜の繰り
返し使用の安定性試験 （１）試料 実施例１，２及び比較例１の抗体固定化絹フィブロイン
膜

【００４５】（２）試験方法 実施例６で作成した酸素検出型免疫センサーを用い、図
１に示したフロー式の測定装置を組み、下記のヒトＡＦ
Ｐ標準溶液について以下のようにして繰り返し測定を行
った。

【００４６】即ち、ヒトＡＦＰ０又は１００ｎｇ／ｍｌ
を含有する０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（０．５％
牛血清アルブミン含有）をヒトＡＦＰの標準溶液とし
た。そしてカタラーゼ標識抗ヒトＡＦＰマウスモノクロ
ーナル抗体５．５μｇ／ｍｌを含有する同標準溶液０．
５ｍｌを反応セル（容量０．２ｍｌ）に導入し、７分間
静置して免疫反応を行った後、２０ｍｌ／分の流速で１
分間蒸留水を流して反応セルを洗浄した。次いで、２
６．５ｍＭの過酸化水素を含有する０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）０．２ｍｌを反応セルに導入し、酸素
電極の酸素濃度に比例した電流値を求め、この値をＡＤ
変換器により、電位置に変換した。続いて、０．１Ｍグ
リシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５、食塩２重量％含有）
を２０ｍｌ／分の流速で１分間流した後、２分間静置し
て結合したヒトＡＦＰとカタラーゼ標識抗ヒトＡＦＰマ
ウスモノクローナル抗体を解離させ、更に２０ｍｌ／分
の流速で１分間蒸留水を流して反応セルを洗浄した。

【００４７】操作はすべて３０℃で行い、酵素反応時以
外はすべて攪拌を行った。結果を図２（比較例１），図
３（実施例１），図４（実施例２）に示す。

【００４８】図２，図３，図４からわかる通り、本発明
によって製造された共有結合法による抗体固定化絹フィ
ブロイン膜（特にグルタルアルデヒド重合体或いは塩化
シアヌルを結合剤として用いたもの）は、比較例１の包
括法による抗体固定化絹フィブロイン膜と同様に、繰り
返し安定性に優れていた。

【００４９】

【発明の効果】本発明の、共有結合法により抗体（ある
いは抗原）を固定化した絹フィブロイン膜は、抗体を固
定化する際の使用抗体量が従来の包括法により固定化し
たものに比べて少なくて済み、抗体固定化量のより均一
な膜である（試験例１）。そのため、この膜を免疫測定
に使用した場合、バラツキのより少ない高精度の測定が
可能になり（試験例１）、しかも免疫測定を行うのに十
分な信号量が得られる（試験例２）。また、高純度の物
質精製を目的としたアフィニティー担体としても有効に
用いられる。特に、グルタルアルデヒド重合体あるいは
塩化シアヌルを結合剤として用いたものは、膜からの抗
体の脱離が少ないため繰り返し安定性に優れており、免
疫センサー用の固定化膜として有効に利用出来る（試験
例３）。

【図面の簡単な説明】

【図１】試験例３で用いたフロー式測定装置の概略図で
ある。

【図２】比較例１の抗体固定化絹フィブロイン膜（包括
法）を用いた免疫センサーの、繰り返し使用における安
定性を示す図である。

【図３】実施例１の抗体固定化絹フィブロイン膜（ＧＡ
重合体法）を用いた免疫センサーの、繰り返し使用にお
ける安定性を示す図である。

【図４】実施例２の抗体固定化絹フィブロイン膜（塩化
シアヌル法）を用いた免疫センサーの、繰り返し使用に
おける安定性を示す図である。

【図５】実施例６で作成した免疫センサーの概略図を表
わす。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 共有結合により抗体または抗原を固定化
   した絹フィブロイン膜。
2. 【請求項２】 共有結合の方法がグルタルアルデヒド又
   はその重合体あるいは塩化シアヌルを結合試薬として用
   いるものである請求項１記載の絹フィブロイン膜。
3. 【請求項３】 共有結合により抗体または抗原を固定化
   した絹フィブロイン膜を電極デバイスに装着してなる免
   疫測定用センサー。