JPH10197535A - 免疫測定方法 - Google Patents
免疫測定方法Info
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- JPH10197535A JPH10197535A JP8356742A JP35674296A JPH10197535A JP H10197535 A JPH10197535 A JP H10197535A JP 8356742 A JP8356742 A JP 8356742A JP 35674296 A JP35674296 A JP 35674296A JP H10197535 A JPH10197535 A JP H10197535A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 検体中に含まれる測定対象物のホルモン、酵
素、血清蛋白質、腫瘍抗原、ＤＮＡ結合性蛋白質、サイ
トカイン、細菌、ウイルス、原虫等の抗原又はこれら抗
原に対する抗体を感度よく免疫測定する方法の提供。 【解決手段】 繊維状蛋白質と固相とをリンカー試薬を
用いて結合させた後、更にその繊維状蛋白質と抗原又は
抗体とを前記リンカー試薬とは異なるリンカー試薬を用
いて結合させ、そのものを検体及び標識された抗原又抗
体と反応させた後、繊維状蛋白質の分解酵素を反応さ
せ、固相から遊離した標識物質を測定して検体中の測定
対象物を免疫測定する。
素、血清蛋白質、腫瘍抗原、ＤＮＡ結合性蛋白質、サイ
トカイン、細菌、ウイルス、原虫等の抗原又はこれら抗
原に対する抗体を感度よく免疫測定する方法の提供。 【解決手段】 繊維状蛋白質と固相とをリンカー試薬を
用いて結合させた後、更にその繊維状蛋白質と抗原又は
抗体とを前記リンカー試薬とは異なるリンカー試薬を用
いて結合させ、そのものを検体及び標識された抗原又抗
体と反応させた後、繊維状蛋白質の分解酵素を反応さ
せ、固相から遊離した標識物質を測定して検体中の測定
対象物を免疫測定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、繊維状蛋白質と固
相とをリンカー試薬を用いて結合させた後、更にその繊
維状蛋白質と抗原又は抗体とを前記リンカー試薬とは異
なるリンカー試薬を用いて結合させ、そのものを検体及
び標識された抗原又は抗体と反応させた後、繊維状蛋白
質の分解酵素を反応させる免疫測定方法に関する。
相とをリンカー試薬を用いて結合させた後、更にその繊
維状蛋白質と抗原又は抗体とを前記リンカー試薬とは異
なるリンカー試薬を用いて結合させ、そのものを検体及
び標識された抗原又は抗体と反応させた後、繊維状蛋白
質の分解酵素を反応させる免疫測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、生体内に含まれるホルモン、酵
素、血清蛋白質、腫瘍抗原、ＤＮＡ結合性蛋白質、サイ
トカイン、細胞、ウイルス、原虫等又はこれらに対する
抗体を測定することが行われ、疾患の早期診断や治療の
モニター等に利用されている。この測定法では抗原又は
抗体が結合した固相と、標識された抗原又は抗体と、検
体とを混合して固相上に免疫複合体を形成させた後、固
相に結合した標識物質の測定から検体中の測定対象物を
検出する標識免疫測定法が広く行われている。固相を用
いる測定法は、バウンド／フリー（Ｂ／Ｆ）分離により
固相に結合した標識物質だけを選択的に測定を行うた
め、操作性がよく感度の高い測定法として知られてい
る。
素、血清蛋白質、腫瘍抗原、ＤＮＡ結合性蛋白質、サイ
トカイン、細胞、ウイルス、原虫等又はこれらに対する
抗体を測定することが行われ、疾患の早期診断や治療の
モニター等に利用されている。この測定法では抗原又は
抗体が結合した固相と、標識された抗原又は抗体と、検
体とを混合して固相上に免疫複合体を形成させた後、固
相に結合した標識物質の測定から検体中の測定対象物を
検出する標識免疫測定法が広く行われている。固相を用
いる測定法は、バウンド／フリー（Ｂ／Ｆ）分離により
固相に結合した標識物質だけを選択的に測定を行うた
め、操作性がよく感度の高い測定法として知られてい
る。
【０００３】しかしながら、この方法では固相を洗浄し
ても固相上に非特異的に吸着している標識物質は除去で
きず、免疫複合体を形成して結合した標識物質とは区別
することができない。その結果、非特異吸着による標識
物質は測定の際のバックグランドを上昇させることとな
り、Ｓ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比が低下し、殊に低濃
度の測定対象物の測定では満足すべき結果が得られなか
った。そこで、固相上に免疫複合体を形成して結合され
た標識物質だけを選択的に測定するために、還元、酸化
又は交換反応で開裂する結合を免疫複合体中に形成させ
た試薬を用い、免疫複合体で結合した標識物質だけを固
相から遊離させて測定する方法が見出された。この測定
法としては、免疫複合体を形成させる試薬中にジスルフ
ィド結合（Ｓ−Ｓ結合）を設ける方法、デキストランを
ジスルフィド結合を利用して架橋する方法、ビオチン−
アビジン結合を設ける方法等である（特開昭５３−１３
０４２４号，特開平２−２２２８３７号参照）。
ても固相上に非特異的に吸着している標識物質は除去で
きず、免疫複合体を形成して結合した標識物質とは区別
することができない。その結果、非特異吸着による標識
物質は測定の際のバックグランドを上昇させることとな
り、Ｓ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比が低下し、殊に低濃
度の測定対象物の測定では満足すべき結果が得られなか
った。そこで、固相上に免疫複合体を形成して結合され
た標識物質だけを選択的に測定するために、還元、酸化
又は交換反応で開裂する結合を免疫複合体中に形成させ
た試薬を用い、免疫複合体で結合した標識物質だけを固
相から遊離させて測定する方法が見出された。この測定
法としては、免疫複合体を形成させる試薬中にジスルフ
ィド結合（Ｓ−Ｓ結合）を設ける方法、デキストランを
ジスルフィド結合を利用して架橋する方法、ビオチン−
アビジン結合を設ける方法等である（特開昭５３−１３
０４２４号，特開平２−２２２８３７号参照）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】固相上の免疫複合体に
形成されたジスルフィド結合を開裂させる方法では、還
元反応により開裂を行うため選択的且つ完全に分解する
ことが難しく、試薬中の標識物質に対しても多大な影響
を与えることがあった。また、デキストランを糖分解酵
素で分解する方法では、修飾された糖残基の分解反応速
度が遅く完全に解離させるには長い反応時間を必要とし
た。また更にビオチン−アビジン結合を用いる方法は、
過剰のビオチン又はアビジンを免疫複合体を形成した溶
液中に添加し、平衡反応を一方に移動させてビオチン−
アビジン結合を解離させるため、開裂を完全に行うため
には長時間を要し、さらに完全には解離を行うことがで
きないなどの問題点があった。
形成されたジスルフィド結合を開裂させる方法では、還
元反応により開裂を行うため選択的且つ完全に分解する
ことが難しく、試薬中の標識物質に対しても多大な影響
を与えることがあった。また、デキストランを糖分解酵
素で分解する方法では、修飾された糖残基の分解反応速
度が遅く完全に解離させるには長い反応時間を必要とし
た。また更にビオチン−アビジン結合を用いる方法は、
過剰のビオチン又はアビジンを免疫複合体を形成した溶
液中に添加し、平衡反応を一方に移動させてビオチン−
アビジン結合を解離させるため、開裂を完全に行うため
には長時間を要し、さらに完全には解離を行うことがで
きないなどの問題点があった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは鋭
意研究した結果、繊維状蛋白質と固相とをリンカー試薬
を用いて結合させた後、更にその繊維状蛋白質と抗原又
は抗体とを前記リンカー試薬とは異なるリンカー試薬を
用いて結合させ、そのものを検体及び標識された抗原又
は抗体と反応させた後、繊維状蛋白質の分解酵素を反応
させて固相から遊離する標識物を測定する免疫測定方法
を見出し、本発明を完成するに至った。
意研究した結果、繊維状蛋白質と固相とをリンカー試薬
を用いて結合させた後、更にその繊維状蛋白質と抗原又
は抗体とを前記リンカー試薬とは異なるリンカー試薬を
用いて結合させ、そのものを検体及び標識された抗原又
は抗体と反応させた後、繊維状蛋白質の分解酵素を反応
させて固相から遊離する標識物を測定する免疫測定方法
を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】本発明の測定には繊維状蛋白質と固相とを
リンカー試薬を用いて結合させた後、更にその繊維状蛋
白質と抗原又は抗体とを前記リンカー試薬とは異なるリ
ンカー試薬を用いて結合した固相を用いることができ
る。この繊維状蛋白質としては、動物の結合組織、骨、
歯、ジン帯、腱、真皮等に存在する例えばコラーゲン、
ゼラチン等を挙げることができる。このコラーゲンとゼ
ラチンとは酵素分解性のコラーゲン又はゼラチンであれ
ば分子量及び性状に限定はなく、いかなる動物（ホ乳
類、鳥類、魚類等）から取得したものであってもよい。
ゼラチンとしてはコラーゲンを加熱処理、酸又はアルカ
リによる化学処理して製造した例えば酸処理ゼラチン、
アルカリ処理ゼラチン等を挙げるとができる。さらにこ
のコラーゲン又はゼラチンをアミノ基、イミノ基、カル
ボキシル基、メルカプト基、水酸基等の官能基を周知の
方法を利用し導入し、化学的に修飾したコラーゲン誘導
体又はゼラチン誘導体を用いることもできる。
リンカー試薬を用いて結合させた後、更にその繊維状蛋
白質と抗原又は抗体とを前記リンカー試薬とは異なるリ
ンカー試薬を用いて結合した固相を用いることができ
る。この繊維状蛋白質としては、動物の結合組織、骨、
歯、ジン帯、腱、真皮等に存在する例えばコラーゲン、
ゼラチン等を挙げることができる。このコラーゲンとゼ
ラチンとは酵素分解性のコラーゲン又はゼラチンであれ
ば分子量及び性状に限定はなく、いかなる動物（ホ乳
類、鳥類、魚類等）から取得したものであってもよい。
ゼラチンとしてはコラーゲンを加熱処理、酸又はアルカ
リによる化学処理して製造した例えば酸処理ゼラチン、
アルカリ処理ゼラチン等を挙げるとができる。さらにこ
のコラーゲン又はゼラチンをアミノ基、イミノ基、カル
ボキシル基、メルカプト基、水酸基等の官能基を周知の
方法を利用し導入し、化学的に修飾したコラーゲン誘導
体又はゼラチン誘導体を用いることもできる。
【０００７】また、固相としては免疫測定用の各種固相
を挙げるとができ、例えばプラスチック製の試験管内
壁、マイクロプレートウエルの内壁、ガラスビーズ、ポ
リスチレン等から製造されたプラスチックビーズ、セル
ロース、ニトロセルロース等のメンブレン、フェライト
粒子（例えば特開平３−１１５８６２号、同７−９２１
６８号参照）等を挙げることができる。
を挙げるとができ、例えばプラスチック製の試験管内
壁、マイクロプレートウエルの内壁、ガラスビーズ、ポ
リスチレン等から製造されたプラスチックビーズ、セル
ロース、ニトロセルロース等のメンブレン、フェライト
粒子（例えば特開平３−１１５８６２号、同７−９２１
６８号参照）等を挙げることができる。
【０００８】固相に結合させる抗原又は抗体は、測定対
象物に対する抗体、抗原又はこれらの誘導体を挙げるこ
とができる。本発明の測定対象物は、例えばテオフィリ
ン、フェニトイン、バルプロ酸等の薬剤、カルシトニ
ン、サイロキシン、エストロゲン、エラストラジオール
等の低分子抗原、ＣＥＡ、ＡＦＰ、フェリチン、ＣＡ１
９−９、ＣＡ１２５等の腫瘍関連抗原、ＨＩＶ、ＡＴＬ
Ａ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＴＰ等のウイルス抗原、ＴＳＨ、
インスリン等の高分子ホルモン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、
ＩＬ−６等のサイトカイン、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等の各種
クロースファクター等の他、前記測定対象物に対する抗
体、ウイルスのＤＮＡ、ＲＮＡに対する抗体等である。
固相に結合させる抗体は、ポリクローナル抗体又はモノ
クローナル抗体の他、これらの抗体を酵素処理及び／又
は還元処理して製造したＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａ
ｂ’）2 等の抗体フラグメントであってもよい。
象物に対する抗体、抗原又はこれらの誘導体を挙げるこ
とができる。本発明の測定対象物は、例えばテオフィリ
ン、フェニトイン、バルプロ酸等の薬剤、カルシトニ
ン、サイロキシン、エストロゲン、エラストラジオール
等の低分子抗原、ＣＥＡ、ＡＦＰ、フェリチン、ＣＡ１
９−９、ＣＡ１２５等の腫瘍関連抗原、ＨＩＶ、ＡＴＬ
Ａ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＴＰ等のウイルス抗原、ＴＳＨ、
インスリン等の高分子ホルモン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、
ＩＬ−６等のサイトカイン、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等の各種
クロースファクター等の他、前記測定対象物に対する抗
体、ウイルスのＤＮＡ、ＲＮＡに対する抗体等である。
固相に結合させる抗体は、ポリクローナル抗体又はモノ
クローナル抗体の他、これらの抗体を酵素処理及び／又
は還元処理して製造したＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａ
ｂ’）2 等の抗体フラグメントであってもよい。
【０００９】またリンカー試薬としては、免疫測定用の
試薬を製造するために使用される例えばマレイミド試
薬、グルタルアルデヒド、塩化シアヌリル、カルボジイ
ミド試薬等を挙げるとができる（ペプチド合成法，丸善
株式会社，（昭和５０年）；酵素免疫測定法，共立出版
（１９８７年）；蛋白質核酸酵素 別冊第３１号（１９
８７年）参照）。マレイミド試薬としては、例えばＮ−
サクシニミジルマレイミド酢酸、Ｎ−サクシニミジル
４−マレイミド酪酸（ＧＭＢＳ）、Ｎ−サクシニミジル
マレイミドヘキサン酸、Ｎ−サクシニミジル ４−（Ｎ
−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン
酸、Ｎ−スルホサクシニミジル ４−マレイミドメチル
−シクロヘキサン−１−カルボン酸等、カルボジイミド
試薬としては例えばジシクロヘキシルカルボジイミド
（ＤＣＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３
−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）等を挙げることがで
きる。カルボジイミド試薬では官能基を縮合させて例え
ばアミド基、エステル基等を形成し、結合させることが
できる。
試薬を製造するために使用される例えばマレイミド試
薬、グルタルアルデヒド、塩化シアヌリル、カルボジイ
ミド試薬等を挙げるとができる（ペプチド合成法，丸善
株式会社，（昭和５０年）；酵素免疫測定法，共立出版
（１９８７年）；蛋白質核酸酵素 別冊第３１号（１９
８７年）参照）。マレイミド試薬としては、例えばＮ−
サクシニミジルマレイミド酢酸、Ｎ−サクシニミジル
４−マレイミド酪酸（ＧＭＢＳ）、Ｎ−サクシニミジル
マレイミドヘキサン酸、Ｎ−サクシニミジル ４−（Ｎ
−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン
酸、Ｎ−スルホサクシニミジル ４−マレイミドメチル
−シクロヘキサン−１−カルボン酸等、カルボジイミド
試薬としては例えばジシクロヘキシルカルボジイミド
（ＤＣＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３
−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）等を挙げることがで
きる。カルボジイミド試薬では官能基を縮合させて例え
ばアミド基、エステル基等を形成し、結合させることが
できる。
【００１０】固相には、まず繊維状蛋白質と固相とをリ
ンカー試薬によって結合させる。次いで抗原又は抗体を
前記リンカー試薬とは異なるリンカー試薬を用いて反応
させることにより測定に用いる固相を製造することがで
きる。また、繊維状蛋白質を二価性官能基を有するリン
カー試薬と反応させ官能基を導入し、次にこの官能基と
は反応しないリンカー試薬により固相と反応させた後、
あらかじめ繊維状蛋白質に導入した官能基と抗原又は抗
体とを反応させて製造することができる。この方法によ
ると抗原又は抗体は繊維状蛋白質を介して選択的に固相
に結合することができる。この製造法は、例えばマレイ
ミド試薬と繊維状蛋白質とを反応させた後、繊維状蛋白
質に残存するアミノ基と固相のカルボキシル基とをカル
ボジイミド試薬によってアミド基を形成して結合し、次
に繊維状蛋白質に残るマレイミド基と抗体のチオール基
とを結合させる方法等である。この方法により得られた
固相は、固相上に特定の割合で抗原又は抗体が結合され
るため、繊維状蛋白質の分解酵素で切断されやすく、短
時間での分解が可能となりに測定時間を短縮することが
できる。
ンカー試薬によって結合させる。次いで抗原又は抗体を
前記リンカー試薬とは異なるリンカー試薬を用いて反応
させることにより測定に用いる固相を製造することがで
きる。また、繊維状蛋白質を二価性官能基を有するリン
カー試薬と反応させ官能基を導入し、次にこの官能基と
は反応しないリンカー試薬により固相と反応させた後、
あらかじめ繊維状蛋白質に導入した官能基と抗原又は抗
体とを反応させて製造することができる。この方法によ
ると抗原又は抗体は繊維状蛋白質を介して選択的に固相
に結合することができる。この製造法は、例えばマレイ
ミド試薬と繊維状蛋白質とを反応させた後、繊維状蛋白
質に残存するアミノ基と固相のカルボキシル基とをカル
ボジイミド試薬によってアミド基を形成して結合し、次
に繊維状蛋白質に残るマレイミド基と抗体のチオール基
とを結合させる方法等である。この方法により得られた
固相は、固相上に特定の割合で抗原又は抗体が結合され
るため、繊維状蛋白質の分解酵素で切断されやすく、短
時間での分解が可能となりに測定時間を短縮することが
できる。
【００１１】一方標識された抗原又は抗体は、標識免疫
測定法に用いられる標識試薬を挙げることができ、周知
の方法に従い標識物と抗原又は抗体とを結合させて製造
することができる。標識物としては、標識免疫測定法に
用いられる例えば酵素、放射性同位元素、蛍光物質、発
光物質等を挙げることができる。酵素としては例えばパ
ーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリ性ホスファターゼ
（Ａｌｐ）、β−ガラクトシダーゼ等を挙げることがで
きる。放射性同位元素としては、例えばヨウ素１２５、
トリチウム等、蛍光物質としては、例えばローダミン、
ウンベリフェロン等、発光物質としては、例えばルミノ
ール又はイソルミノール誘導体、アクリジニウムエステ
ル誘導体等を挙げることができる。またこの抗原又は抗
体としては、実施する測定法又は測定対象物に対応した
抗原、抗体又はこれらの誘導体を挙げることができる。
この標識された抗原又は抗体は前記抗原又は抗体結合固
相の製造法に従い、共有結合又は非共有結合を作る方法
を利用して製造することができる。放射性同位元素を標
識するにはボルトンハンター試薬を用いることができ
る。非共有結合の方法としては物理吸着法を挙げること
ができる。
測定法に用いられる標識試薬を挙げることができ、周知
の方法に従い標識物と抗原又は抗体とを結合させて製造
することができる。標識物としては、標識免疫測定法に
用いられる例えば酵素、放射性同位元素、蛍光物質、発
光物質等を挙げることができる。酵素としては例えばパ
ーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリ性ホスファターゼ
（Ａｌｐ）、β−ガラクトシダーゼ等を挙げることがで
きる。放射性同位元素としては、例えばヨウ素１２５、
トリチウム等、蛍光物質としては、例えばローダミン、
ウンベリフェロン等、発光物質としては、例えばルミノ
ール又はイソルミノール誘導体、アクリジニウムエステ
ル誘導体等を挙げることができる。またこの抗原又は抗
体としては、実施する測定法又は測定対象物に対応した
抗原、抗体又はこれらの誘導体を挙げることができる。
この標識された抗原又は抗体は前記抗原又は抗体結合固
相の製造法に従い、共有結合又は非共有結合を作る方法
を利用して製造することができる。放射性同位元素を標
識するにはボルトンハンター試薬を用いることができ
る。非共有結合の方法としては物理吸着法を挙げること
ができる。
【００１２】本発明の免疫測定方法は、前記抗原又は抗
体結合固相及び標識された抗原又は抗体を用いて周知の
１ステップ法、ディレイ１ステップ法、２ステップ法等
のサンドイッチ法、競合法で行い、免疫反応により固相
上に形成される免疫複合体の標識物だけを測定すること
により実施することができる。例えば抗原を検出する２
ステップ法では固相と抗原を含む検体とを緩衝液中でイ
ンキュベーション（例えば５〜５０℃、５分〜１日）し
た後、固相を洗浄液で洗浄する。次に標識抗体を含む緩
衝液中に固相を移し、さらにインキュベーション（例え
ば５〜５０℃、５分〜１日）した後、固相を再び洗浄す
る。次いで、固相上に形成された免疫複合体に繊維状蛋
白質の分解酵素を作用させて固相を分離した後、溶液中
に遊離した標識物の測定を行う方法である。この分解反
応は酵素の反応条件下で、通常４℃から４２℃で３０秒
から１０分間程度反応させることにより行うことができ
る。
体結合固相及び標識された抗原又は抗体を用いて周知の
１ステップ法、ディレイ１ステップ法、２ステップ法等
のサンドイッチ法、競合法で行い、免疫反応により固相
上に形成される免疫複合体の標識物だけを測定すること
により実施することができる。例えば抗原を検出する２
ステップ法では固相と抗原を含む検体とを緩衝液中でイ
ンキュベーション（例えば５〜５０℃、５分〜１日）し
た後、固相を洗浄液で洗浄する。次に標識抗体を含む緩
衝液中に固相を移し、さらにインキュベーション（例え
ば５〜５０℃、５分〜１日）した後、固相を再び洗浄す
る。次いで、固相上に形成された免疫複合体に繊維状蛋
白質の分解酵素を作用させて固相を分離した後、溶液中
に遊離した標識物の測定を行う方法である。この分解反
応は酵素の反応条件下で、通常４℃から４２℃で３０秒
から１０分間程度反応させることにより行うことができ
る。
【００１３】本発明の繊維状蛋白質の分解酵素として
は、標識物に影響を及ぼさない分解酵素であれば使用す
ることができ、例えばコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ等を
挙げることができる。この分解酵素は、単独又は混合し
て使用することができる。
は、標識物に影響を及ぼさない分解酵素であれば使用す
ることができ、例えばコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ等を
挙げることができる。この分解酵素は、単独又は混合し
て使用することができる。
【００１４】標識物の測定には、その標識物質によって
放射性同位元素を放射線測定装置で測定する他、発光、
蛍光、発色等を目視又は比色計、蛍光光度計、フォトン
カウンター、感光フィルム等の測定機器により測定を行
うこともできる。さらに標識物がパーオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）、アルカリホスファターゼ（Ａｌｐ）、β−ガラ
クトシダーゼ（β−Ｇａｌ）等の酵素の場合にはその酵
素活性を発光基質、蛍光基質、発色基質等を加えて反応
を行い前記測定機器により測定を行うことができる（例
えば石川栄治著「酵素免疫測定法」医学書院発行参
照）。本発明の免疫測定法に用いられる検体としては、
例えば全血、血清、血漿、尿、リンパ液等の体液を挙げ
ることができる。
放射性同位元素を放射線測定装置で測定する他、発光、
蛍光、発色等を目視又は比色計、蛍光光度計、フォトン
カウンター、感光フィルム等の測定機器により測定を行
うこともできる。さらに標識物がパーオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）、アルカリホスファターゼ（Ａｌｐ）、β−ガラ
クトシダーゼ（β−Ｇａｌ）等の酵素の場合にはその酵
素活性を発光基質、蛍光基質、発色基質等を加えて反応
を行い前記測定機器により測定を行うことができる（例
えば石川栄治著「酵素免疫測定法」医学書院発行参
照）。本発明の免疫測定法に用いられる検体としては、
例えば全血、血清、血漿、尿、リンパ液等の体液を挙げ
ることができる。
【００１５】
【実施例】以下、本発明を参考例、実施例及び比較例に
よりさらに詳細に説明する。
よりさらに詳細に説明する。
【００１６】参考例１ ＣＴ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒
子の作製 ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）５００μｌに特開
平３−１１５８６２号実施例４に記載の方法に従い取得
した５％カルボキシル化フェライト粒子５ｍｇを分散さ
せ、これに水溶性カルボジイミド５ｍｇを加えた。室温
で２０分間反応させた後、上清を除去し、抗カルシトニ
ン抗体であるＣＴ−０２抗体（１ｍｇ／ｍｌ，２０ｍＭ
リン酸緩衝液，ｐＨ４．５）３００μｌを加え、攪拌し
た。２時間後、この粒子を２％ＢＳＡ溶液（０．１Ｍト
リス−塩酸，１ｍＭ塩化マグネシウム，０．１ｍＭ塩化
亜鉛，ｐＨ７．５）で洗浄し、これをこのＢＳＡ溶液に
分散させＣＴ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒子を得た。
子の作製 ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）５００μｌに特開
平３−１１５８６２号実施例４に記載の方法に従い取得
した５％カルボキシル化フェライト粒子５ｍｇを分散さ
せ、これに水溶性カルボジイミド５ｍｇを加えた。室温
で２０分間反応させた後、上清を除去し、抗カルシトニ
ン抗体であるＣＴ−０２抗体（１ｍｇ／ｍｌ，２０ｍＭ
リン酸緩衝液，ｐＨ４．５）３００μｌを加え、攪拌し
た。２時間後、この粒子を２％ＢＳＡ溶液（０．１Ｍト
リス−塩酸，１ｍＭ塩化マグネシウム，０．１ｍＭ塩化
亜鉛，ｐＨ７．５）で洗浄し、これをこのＢＳＡ溶液に
分散させＣＴ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒子を得た。
【００１７】参考例２ マレイミド化ゼラチンの作製 ６ｍｇ／ｍｌのゼラチン溶液（宮城化学社製）（０．１
Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ７．０）１．３ｍｌにＮ−スクシ
ンイミジル−４−マレイミド酪酸（ＧＭＢＳ，同仁化学
製）溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）２２μｌを添加し、１時間
室温で反応させた後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４．
５）にて平衡化したＰＤ−１０カラムを用いて未反応の
ＧＭＢＳを除去し、マレイミド化ゼラチン溶液１．５ｍ
ｌを得た。
Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ７．０）１．３ｍｌにＮ−スクシ
ンイミジル−４−マレイミド酪酸（ＧＭＢＳ，同仁化学
製）溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）２２μｌを添加し、１時間
室温で反応させた後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４．
５）にて平衡化したＰＤ−１０カラムを用いて未反応の
ＧＭＢＳを除去し、マレイミド化ゼラチン溶液１．５ｍ
ｌを得た。
【００１８】参考例３ マレイミド化ゼラチン架橋粒子
の作製 参考例２で作製したマレイミド化ゼラチン溶液１５０μ
ｌ中に前記カルボキシル化フェライト粒子５．０ｍｇを
懸濁し、これに水溶性カルボジイミド（ナカライ社，１
５０−２２）水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）１０７μｌを添
加した。１時間攪拌した後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で３回洗浄し、これをマレイミド化ゼラチン
架橋粒子を得た。
の作製 参考例２で作製したマレイミド化ゼラチン溶液１５０μ
ｌ中に前記カルボキシル化フェライト粒子５．０ｍｇを
懸濁し、これに水溶性カルボジイミド（ナカライ社，１
５０−２２）水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）１０７μｌを添
加した。１時間攪拌した後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で３回洗浄し、これをマレイミド化ゼラチン
架橋粒子を得た。
【００１９】参考例４ ゼラチン架橋ＣＴ０２抗体（Ｉ
ｇＧ）結合粒子の作製 抗カルシトニン抗体（ＣＴ０２抗体）１ｍｇを５０ｍＭ
炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に平衡化した
ＰＤ−１０カラムを用いて緩衝液交換を行い、１．４ｍ
ｇ／ｍｌのイミノチオラン溶液１８μｌを添加した。室
温にて３０分間反応後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
４．５）にて平衡化したＰＤ−１０を用いて緩衝液交換
を行い、未反応のイミノチオランを除きイミノチオラン
化ＣＴ０２抗体とした。参考例３で作製したマレイミド
化ゼラチン架橋粒子５ｍｇにイミノチオラン化ＣＴ０２
抗体３００μｇを添加し攪拌した。２時間後、この粒子
を２％ＢＳＡ溶液（０．１Ｍトリス−塩酸，１ｍＭ塩化
マグネシウム，０．１ｍＭ塩化亜鉛，ｐＨ７．５）で洗
浄し、これを前記ＢＳＡ溶液に分散させゼラチン架橋Ｃ
Ｔ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒子とした。
ｇＧ）結合粒子の作製 抗カルシトニン抗体（ＣＴ０２抗体）１ｍｇを５０ｍＭ
炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に平衡化した
ＰＤ−１０カラムを用いて緩衝液交換を行い、１．４ｍ
ｇ／ｍｌのイミノチオラン溶液１８μｌを添加した。室
温にて３０分間反応後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
４．５）にて平衡化したＰＤ−１０を用いて緩衝液交換
を行い、未反応のイミノチオランを除きイミノチオラン
化ＣＴ０２抗体とした。参考例３で作製したマレイミド
化ゼラチン架橋粒子５ｍｇにイミノチオラン化ＣＴ０２
抗体３００μｇを添加し攪拌した。２時間後、この粒子
を２％ＢＳＡ溶液（０．１Ｍトリス−塩酸，１ｍＭ塩化
マグネシウム，０．１ｍＭ塩化亜鉛，ｐＨ７．５）で洗
浄し、これを前記ＢＳＡ溶液に分散させゼラチン架橋Ｃ
Ｔ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒子とした。
【００２０】参考例５ ＣＴ０２抗体（Ｆａｂ’）の作
製 ＣＴ０２抗体１ｍｇ／ｍｌ（０．２Ｍ酢酸ソーダ緩衝液
（ｐＨ４．２））、１ｍｌに２０μｇのペプシン（ベー
リンガーマンハイム，１０８０５７）を加え３７℃で１
０時間インキュベートした。ｐＨを７．０に合わせてあ
らかじめ０．１Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，２Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したスパーデ
ックスＧ−２００、ゲル濾過カラム（ファルマシア，１
６／６０）で６３ｍｌから７９ｍｌに溶出された分画を
セントプレップ３０００（アミコン）によって濃縮しＦ
（ａｂ’）2 分画をそれぞれ３００μｇ得た。この抗体
３００μｇに２−メルカプトエタノールアミンを加え１
０ｍＭとして３７℃、２時間インキュベートした。あら
かじめ０．１Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ，
２Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰＤ−１０カ
ラムにより２メルカプトエタノールアミンを除きＣＴ０
２抗体のＦａｂ’分画を２６０μｇ得た。
製 ＣＴ０２抗体１ｍｇ／ｍｌ（０．２Ｍ酢酸ソーダ緩衝液
（ｐＨ４．２））、１ｍｌに２０μｇのペプシン（ベー
リンガーマンハイム，１０８０５７）を加え３７℃で１
０時間インキュベートした。ｐＨを７．０に合わせてあ
らかじめ０．１Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，２Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したスパーデ
ックスＧ−２００、ゲル濾過カラム（ファルマシア，１
６／６０）で６３ｍｌから７９ｍｌに溶出された分画を
セントプレップ３０００（アミコン）によって濃縮しＦ
（ａｂ’）2 分画をそれぞれ３００μｇ得た。この抗体
３００μｇに２−メルカプトエタノールアミンを加え１
０ｍＭとして３７℃、２時間インキュベートした。あら
かじめ０．１Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ，
２Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰＤ−１０カ
ラムにより２メルカプトエタノールアミンを除きＣＴ０
２抗体のＦａｂ’分画を２６０μｇ得た。
【００２１】参考例６ ゼラチン架橋ＣＴ０２抗体（Ｆ
ａｂ’）結合粒子の作製 参考例３で作製したマレイミド化ゼラチン架橋粒子５ｍ
ｇに参考例５で調製したＣＴ０２−Ｆａｂ’分画１００
μｇを添加し２時間攪拌した。その後、この粒子を２％
ＢＳＡ溶液（０．１Ｍトリス−塩酸、１ｍＭ塩化マグネ
シウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、ｐＨ７．５）で洗浄し、
これを前記ＢＳＡ溶液に分散させゼラチン架橋ＣＴ０２
抗体（Ｆａｂ’）結合粒子を得た。
ａｂ’）結合粒子の作製 参考例３で作製したマレイミド化ゼラチン架橋粒子５ｍ
ｇに参考例５で調製したＣＴ０２−Ｆａｂ’分画１００
μｇを添加し２時間攪拌した。その後、この粒子を２％
ＢＳＡ溶液（０．１Ｍトリス−塩酸、１ｍＭ塩化マグネ
シウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、ｐＨ７．５）で洗浄し、
これを前記ＢＳＡ溶液に分散させゼラチン架橋ＣＴ０２
抗体（Ｆａｂ’）結合粒子を得た。
【００２２】参考例７ Ａｌｐ標識ＣＴ０８／０ＣＴ１
抗体の作製 ヒトカルシトニンと反応する抗カルシトニン抗体ＯＣＴ
１又はＣＴ０８抗体１ｍｇ／ｍｌ（２００ｍＭ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ４．２），株式会社関西新技術研究
所）２ｍｌをペプシン４０μｇで３７℃、１０時間反応
させた後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製し
てＯＣＴ１又はＣＴ０８抗体のＦ（ａｂ’）2 分画をそ
れぞれ７３０μｇと６７０μｇを得た。さらに、この分
画をそれぞれ参考例５と同様に２メルカプトエタノール
アミンで還元しＯＣＴ１又はＣＴ−０８抗体のＦａｂ’
分画を作製した。次にアルカリ性ホスファターゼ（Ａｌ
ｐ）とＧＭＢＳとを反応させ、未反応のＧＭＢＳを除き
マレイミド化アルカリ性ホスファターゼを得た。このマ
レイミド化アルカリ性ホスファターゼを前記ＯＣＴ１及
びＣＴ−０８抗体のＦａｂ’分画の混合液に加え反応を
行い、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製するこ
によりＡｌｐ標識ＣＴ０８／ＯＣＴ１抗体を得た。得ら
れたＡｌｐ標識ＣＴ０８／ＯＣＴ１抗体は分子量３４万
でＡｌｐ：Ｆａｂ’抗体＝１：４の割合で結合している
ことがわかる。
抗体の作製 ヒトカルシトニンと反応する抗カルシトニン抗体ＯＣＴ
１又はＣＴ０８抗体１ｍｇ／ｍｌ（２００ｍＭ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ４．２），株式会社関西新技術研究
所）２ｍｌをペプシン４０μｇで３７℃、１０時間反応
させた後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製し
てＯＣＴ１又はＣＴ０８抗体のＦ（ａｂ’）2 分画をそ
れぞれ７３０μｇと６７０μｇを得た。さらに、この分
画をそれぞれ参考例５と同様に２メルカプトエタノール
アミンで還元しＯＣＴ１又はＣＴ−０８抗体のＦａｂ’
分画を作製した。次にアルカリ性ホスファターゼ（Ａｌ
ｐ）とＧＭＢＳとを反応させ、未反応のＧＭＢＳを除き
マレイミド化アルカリ性ホスファターゼを得た。このマ
レイミド化アルカリ性ホスファターゼを前記ＯＣＴ１及
びＣＴ−０８抗体のＦａｂ’分画の混合液に加え反応を
行い、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製するこ
によりＡｌｐ標識ＣＴ０８／ＯＣＴ１抗体を得た。得ら
れたＡｌｐ標識ＣＴ０８／ＯＣＴ１抗体は分子量３４万
でＡｌｐ：Ｆａｂ’抗体＝１：４の割合で結合している
ことがわかる。
【００２３】実施例１ コラゲナーゼ分解によるカルシ
トニンの測定 参考例７で作製したＡｌｐ標識ＣＴ０８／ＯＣＴ１抗体
７０μｌと１ｎｇ／ｍｌのカルシトニンを含むＢＳＡ溶
液７０μｌをカートリッジ中で混合し、３７℃で１０分
間インキュベートした。反応後にこの混合液のうち１０
０μｌをＢＳＡ溶液にて０．０６％に懸濁した参考例４
のゼラチン架橋ＣＴ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒子、参考
例６のゼラチン架橋ＣＴ０２抗体（Ｆａｂ’）結合粒子
６２．５μｌ、又は参考例１で作製したＣＴ０２抗体
（ＩｇＧ）結合粒子６２．５μｌと混合し３７℃で１０
分間インキュベートした。このカートリッジに磁石を接
して粒子を集磁させ上清を廃液し洗浄を行った。その
後、このカートリッジに２０ｍＭビストリス−塩酸、
０．０５％アジ化ナトリウム、１ｍＭ塩化カルシウム
（ｐＨ８．０）緩衝液で希釈した１２０μｇ／ｍｌのコ
ラゲナーゼ（和光純薬社製）４０μｌを添加して攪拌
後、室温２分間放置した。さらにこのカートリッジに磁
石を接して粒子を集磁させ、粒子と上清を分離し上清を
別カートリッジに移した。この粒子と別カートリッジに
移した上清のそれぞれに発光基質である３−（４−メト
キシスピロ〔１，２’−ジオキセタン−３，２’−
（５’−クロロ）トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デ
カン〕−４−イル）フェニルホスフェート ２ナトリウ
ム塩（ＣＳＰＤ）を２００μｇ／ｍｌを含む基質液
（０．１Ｍ ＤＥＡ−塩酸，１ｍＭ塩化マグネシウム，
ｐＨ１０．０）を２５０μｌ加え３７℃、５分間反応さ
せ、フォトンカウンターにて測定した。ブランク値とＳ
／Ｎの結果とともに上清中又は粒子の標識物の測定結果
を図１〜３に示す。また、上記３種の粒子とコラゲナー
ゼとを反応させて溶液中へＡｌｐが遊離する割合を測定
した結果を図４に示す。
トニンの測定 参考例７で作製したＡｌｐ標識ＣＴ０８／ＯＣＴ１抗体
７０μｌと１ｎｇ／ｍｌのカルシトニンを含むＢＳＡ溶
液７０μｌをカートリッジ中で混合し、３７℃で１０分
間インキュベートした。反応後にこの混合液のうち１０
０μｌをＢＳＡ溶液にて０．０６％に懸濁した参考例４
のゼラチン架橋ＣＴ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒子、参考
例６のゼラチン架橋ＣＴ０２抗体（Ｆａｂ’）結合粒子
６２．５μｌ、又は参考例１で作製したＣＴ０２抗体
（ＩｇＧ）結合粒子６２．５μｌと混合し３７℃で１０
分間インキュベートした。このカートリッジに磁石を接
して粒子を集磁させ上清を廃液し洗浄を行った。その
後、このカートリッジに２０ｍＭビストリス−塩酸、
０．０５％アジ化ナトリウム、１ｍＭ塩化カルシウム
（ｐＨ８．０）緩衝液で希釈した１２０μｇ／ｍｌのコ
ラゲナーゼ（和光純薬社製）４０μｌを添加して攪拌
後、室温２分間放置した。さらにこのカートリッジに磁
石を接して粒子を集磁させ、粒子と上清を分離し上清を
別カートリッジに移した。この粒子と別カートリッジに
移した上清のそれぞれに発光基質である３−（４−メト
キシスピロ〔１，２’−ジオキセタン−３，２’−
（５’−クロロ）トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デ
カン〕−４−イル）フェニルホスフェート ２ナトリウ
ム塩（ＣＳＰＤ）を２００μｇ／ｍｌを含む基質液
（０．１Ｍ ＤＥＡ−塩酸，１ｍＭ塩化マグネシウム，
ｐＨ１０．０）を２５０μｌ加え３７℃、５分間反応さ
せ、フォトンカウンターにて測定した。ブランク値とＳ
／Ｎの結果とともに上清中又は粒子の標識物の測定結果
を図１〜３に示す。また、上記３種の粒子とコラゲナー
ゼとを反応させて溶液中へＡｌｐが遊離する割合を測定
した結果を図４に示す。
【００２４】参考例８ ＳＰＤＰ化デキストランの作製 ０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）で希釈した２０ｍ
ｇ／ｍｌデキストラン溶液１ｍｌに７．４ｍｇ／ｍｌの
メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液１２５μｌを添加し、遮
光して室温３０分間反応させた。エチレングリコール１
２５μｌを添加しさらに室温で３０分間反応させた後、
０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、５％エチレンジアミン緩
衝液（ｐＨ９．５）にて平衡化したＰＤ−１０を用いて
緩衝液交換を行った。次に１．２ｍｇ／ｍｌの濃度にな
るように水素化ホウ素ナトリウムを添加し、４℃で一晩
反応させる。次いで酢酸を体積比１／６５量を添加し攪
拌後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて平衡化
したＰＤ−１０を用いて緩衝液交換を行い、５．６ｍｇ
／ｍｌのアミノデキストラン１．５ｍｌを得た。このア
ミノデキストラン８３３μｌにＤＭＦに溶解した２０ｍ
ｇ／ｍｌのＳＰＤＰ４４４μｌを添加し室温１時間反応
後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて平衡化し
たＰＤ−１０を用いて緩衝液交換を行い未反応のＳＰＤ
Ｐを除去し、４ｍｇ／ｍｌ、ＳＰＤＰ化デキストラン
１．５ｍｌを得た。
ｇ／ｍｌデキストラン溶液１ｍｌに７．４ｍｇ／ｍｌの
メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液１２５μｌを添加し、遮
光して室温３０分間反応させた。エチレングリコール１
２５μｌを添加しさらに室温で３０分間反応させた後、
０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、５％エチレンジアミン緩
衝液（ｐＨ９．５）にて平衡化したＰＤ−１０を用いて
緩衝液交換を行った。次に１．２ｍｇ／ｍｌの濃度にな
るように水素化ホウ素ナトリウムを添加し、４℃で一晩
反応させる。次いで酢酸を体積比１／６５量を添加し攪
拌後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて平衡化
したＰＤ−１０を用いて緩衝液交換を行い、５．６ｍｇ
／ｍｌのアミノデキストラン１．５ｍｌを得た。このア
ミノデキストラン８３３μｌにＤＭＦに溶解した２０ｍ
ｇ／ｍｌのＳＰＤＰ４４４μｌを添加し室温１時間反応
後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて平衡化し
たＰＤ−１０を用いて緩衝液交換を行い未反応のＳＰＤ
Ｐを除去し、４ｍｇ／ｍｌ、ＳＰＤＰ化デキストラン
１．５ｍｌを得た。
【００２５】参考例９ ＳＰＤＰデキストラン架橋粒子
の作製 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で０．５％に懸濁
した特開平３−１１５８６２号の実施例に記載された５
％アミノシラン化フェライト粒子１ｍｌにＤＭＦで溶解
した２０ｍｇ／ｍｌのＳＰＤＰ溶液５０μｌを添加し室
温で２時間反応させた。エタノールと０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）で２回ずつ洗浄後、０．１ＭＤＴＴ
を体積比１／５容量加え室温にて３０分間反応した。
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄後、参考
例６で調製したＳＰＤＰ化デキストラン７５０μｌを加
え、さらに室温３０分間反応させＳＰＤＰデキストラン
架橋粒子を調製した。
の作製 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で０．５％に懸濁
した特開平３−１１５８６２号の実施例に記載された５
％アミノシラン化フェライト粒子１ｍｌにＤＭＦで溶解
した２０ｍｇ／ｍｌのＳＰＤＰ溶液５０μｌを添加し室
温で２時間反応させた。エタノールと０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）で２回ずつ洗浄後、０．１ＭＤＴＴ
を体積比１／５容量加え室温にて３０分間反応した。
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄後、参考
例６で調製したＳＰＤＰ化デキストラン７５０μｌを加
え、さらに室温３０分間反応させＳＰＤＰデキストラン
架橋粒子を調製した。
【００２６】参考例１０ ＡＦＰ抗体（Ｆａｂ’）の作
製 抗ＡＦＰ抗体１ｍｇ／ｍｌ（０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ４．２））、１ｍｌに２０μｇのペプシン
（ベーリンガーマンハイム，１０８０５７）を加え３７
℃で１０時間インキュベートした。ｐＨを７．０に合わ
せてあらかじめ０．１Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ，２Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したスー
パーデックスＧ−２００、ゲル濾過カラム（ファルマシ
ア，１６／６０）で６３ｍｌから７９に溶出された分画
をセントプレップ３０００（アミコン）によって濃縮し
た。抗ＡＦＰ抗体のＦ（ａｂ’）2 分画をそれぞれ３０
０μｇ得た。さらに抗ＡＦＰ抗体のＦ（ａｂ’）2 分
画、３００μｇに２メルカプトエタノールアミンを加え
１０ｍＭとして３７℃、２時間インキュベートした。あ
らかじめ０．１Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，２Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰＤ−１
０により２メルカプトエタノールアミンを除きＦａｂ’
分画を２６０μｇ得た。
製 抗ＡＦＰ抗体１ｍｇ／ｍｌ（０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ４．２））、１ｍｌに２０μｇのペプシン
（ベーリンガーマンハイム，１０８０５７）を加え３７
℃で１０時間インキュベートした。ｐＨを７．０に合わ
せてあらかじめ０．１Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ，２Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したスー
パーデックスＧ−２００、ゲル濾過カラム（ファルマシ
ア，１６／６０）で６３ｍｌから７９に溶出された分画
をセントプレップ３０００（アミコン）によって濃縮し
た。抗ＡＦＰ抗体のＦ（ａｂ’）2 分画をそれぞれ３０
０μｇ得た。さらに抗ＡＦＰ抗体のＦ（ａｂ’）2 分
画、３００μｇに２メルカプトエタノールアミンを加え
１０ｍＭとして３７℃、２時間インキュベートした。あ
らかじめ０．１Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，２Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰＤ−１
０により２メルカプトエタノールアミンを除きＦａｂ’
分画を２６０μｇ得た。
【００２７】参考例１１ デキストラン架橋抗ＡＦＰ抗
体結合粒子の作製 参考例９で作製したＳＰＤＰデキストラン架橋粒子５ｍ
ｇに参考例１０で調製した抗ＡＦＰ抗体のＦａｂ’分画
１００μｇを添加し室温で２時間攪拌し反応させた。こ
の粒子を２％ＢＳＡ溶液（０．１Ｍトリス−塩酸，１ｍ
Ｍ塩化マグネシウム，０．１ｍＭ塩化亜鉛，ｐＨ７．
５）で洗浄し、これを前記ＢＳＡ溶液に分散させデキス
トラン架橋抗ＡＦＰ抗体結合粒子を得た。
体結合粒子の作製 参考例９で作製したＳＰＤＰデキストラン架橋粒子５ｍ
ｇに参考例１０で調製した抗ＡＦＰ抗体のＦａｂ’分画
１００μｇを添加し室温で２時間攪拌し反応させた。こ
の粒子を２％ＢＳＡ溶液（０．１Ｍトリス−塩酸，１ｍ
Ｍ塩化マグネシウム，０．１ｍＭ塩化亜鉛，ｐＨ７．
５）で洗浄し、これを前記ＢＳＡ溶液に分散させデキス
トラン架橋抗ＡＦＰ抗体結合粒子を得た。
【００２８】参考例１２ ゼラチン架橋抗ＡＦＰ抗体結
合粒子の調製 参考例３で作製したマレイミド化ゼラチン架橋粒子５ｍ
ｇに参考例１０で調製した抗ＡＦＰ抗体のＦａｂ’分画
１００μｇを添加し、２時間攪拌した。その後、この粒
子を２％ＢＳＡ溶液（０．１Ｍトリス−塩酸，１ｍＭ塩
化マグネシウム，０．１ｍＭ塩化亜鉛，ｐＨ７．５）で
洗浄し、これを前記ＢＳＡ溶液に分散させゼラチン架橋
抗ＡＦＰ抗体結合粒子を得た。
合粒子の調製 参考例３で作製したマレイミド化ゼラチン架橋粒子５ｍ
ｇに参考例１０で調製した抗ＡＦＰ抗体のＦａｂ’分画
１００μｇを添加し、２時間攪拌した。その後、この粒
子を２％ＢＳＡ溶液（０．１Ｍトリス−塩酸，１ｍＭ塩
化マグネシウム，０．１ｍＭ塩化亜鉛，ｐＨ７．５）で
洗浄し、これを前記ＢＳＡ溶液に分散させゼラチン架橋
抗ＡＦＰ抗体結合粒子を得た。
【００２９】実施例２ ＡＦＰの測定 参考例１２で作製した０．０１５％ゼラチン架橋抗ＡＦ
Ｐ抗体結合粒子２５０μｌの３０ｎｇ／ｍｌのＡＦＰを
含むサンプル１０μｌを混合し、カートリッジ中３７℃
で１０分間反応させた。この後、このカートリッジに磁
石を接して粒子を集磁させ上清を廃液し洗浄を行った。
次にＢＳＡ溶液で０．３μｇ／ｍｌに希釈した参考例７
と同様の方法で作製したＡｌｐ標識抗ＡＦＰ抗体２５０
μｌを混合し、３７℃で１０分間インキュベーションし
た。このカートリッジに磁石を接して粒子を集磁させ上
清を廃液し洗浄を行った。その後、このカートリッジに
２０ｍＭビストリス−塩酸、０．０５％アジ化ナトリウ
ム、１ｍＭ塩化カルシウム（ｐＨ８．０）緩衝液で希釈
した１２０μｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（和光）４０μｌ
を添加し、攪拌後室温で２分間放置した。さらにこのカ
ートリッジに磁石を接して粒子を集磁させ、粒子と上清
を分離し上清を別のカートリッジに移した。この粒子と
別カートリッジに移した上清のそれぞれに発光基質であ
るＣＳＰＤを２００μｇ／ｍｌを含む基質液（０．１Ｍ
ＤＥＡ−塩酸、１ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ１０．
０）を２５０μｌ加え３７℃、５分間反応させ、フォト
ンカウンターにて測定した。その結果を図５〜７に示
す。さらにＡｌｐの遊離割合を図８に示す。
Ｐ抗体結合粒子２５０μｌの３０ｎｇ／ｍｌのＡＦＰを
含むサンプル１０μｌを混合し、カートリッジ中３７℃
で１０分間反応させた。この後、このカートリッジに磁
石を接して粒子を集磁させ上清を廃液し洗浄を行った。
次にＢＳＡ溶液で０．３μｇ／ｍｌに希釈した参考例７
と同様の方法で作製したＡｌｐ標識抗ＡＦＰ抗体２５０
μｌを混合し、３７℃で１０分間インキュベーションし
た。このカートリッジに磁石を接して粒子を集磁させ上
清を廃液し洗浄を行った。その後、このカートリッジに
２０ｍＭビストリス−塩酸、０．０５％アジ化ナトリウ
ム、１ｍＭ塩化カルシウム（ｐＨ８．０）緩衝液で希釈
した１２０μｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（和光）４０μｌ
を添加し、攪拌後室温で２分間放置した。さらにこのカ
ートリッジに磁石を接して粒子を集磁させ、粒子と上清
を分離し上清を別のカートリッジに移した。この粒子と
別カートリッジに移した上清のそれぞれに発光基質であ
るＣＳＰＤを２００μｇ／ｍｌを含む基質液（０．１Ｍ
ＤＥＡ−塩酸、１ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ１０．
０）を２５０μｌ加え３７℃、５分間反応させ、フォト
ンカウンターにて測定した。その結果を図５〜７に示
す。さらにＡｌｐの遊離割合を図８に示す。
【００３０】参考例１３ ＡＦＰの測定（従来法） 参考例１１で作製した０．０１５％デキストラン架橋抗
ＡＦＰ抗体結合粒子２５０μｌに３０ｎｇ／ｍｌのＡＦ
Ｐを含むサンプル１０μｌを混合し、カートリッジ中３
７℃で１０分間反応させた。その後、このカートリッジ
に磁石を接して粒子を集磁させ上清を廃液し洗浄を行っ
た。次にＢＳＡ溶液で０．３μｇ／ｍｌに希釈した前記
方法で作製したＡｌｐ標識ＡＦＰ抗体２５０μｌを混合
し、３７℃、１０分間インキュベートした。このカート
リッジに磁石を接して粒子を集磁させ上清を廃液し洗浄
を行った。その後、このカートリッジに２０ｍＭビスト
リス−塩酸、０．０５％アジ化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．５）で希釈した１２０μＵ／ｍｌのデキストラナー
ゼ（和光純薬社製）４０μｌを添加し、攪拌後室温で２
分間放置した。さらにこのカートリッジに磁石を接して
粒子を集磁させ、粒子と上清を分離し上清を別カートリ
ッジに移した。この粒子と別カートリッジに移した上清
のそれぞれに発光基質であるＣＳＰＤを２００μｇ／ｍ
ｌを含む基質液（０．１ＭＤＥＡ−塩酸，１ｍＭ塩化マ
グネシウム，ｐＨ１０．０）を２５０μｌ加え３７℃、
５分間反応させ、フォトンカウンターで測定した。その
結果を図５〜７に示す。さらにＡｌｐの遊離割合を図８
に示す。
ＡＦＰ抗体結合粒子２５０μｌに３０ｎｇ／ｍｌのＡＦ
Ｐを含むサンプル１０μｌを混合し、カートリッジ中３
７℃で１０分間反応させた。その後、このカートリッジ
に磁石を接して粒子を集磁させ上清を廃液し洗浄を行っ
た。次にＢＳＡ溶液で０．３μｇ／ｍｌに希釈した前記
方法で作製したＡｌｐ標識ＡＦＰ抗体２５０μｌを混合
し、３７℃、１０分間インキュベートした。このカート
リッジに磁石を接して粒子を集磁させ上清を廃液し洗浄
を行った。その後、このカートリッジに２０ｍＭビスト
リス−塩酸、０．０５％アジ化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．５）で希釈した１２０μＵ／ｍｌのデキストラナー
ゼ（和光純薬社製）４０μｌを添加し、攪拌後室温で２
分間放置した。さらにこのカートリッジに磁石を接して
粒子を集磁させ、粒子と上清を分離し上清を別カートリ
ッジに移した。この粒子と別カートリッジに移した上清
のそれぞれに発光基質であるＣＳＰＤを２００μｇ／ｍ
ｌを含む基質液（０．１ＭＤＥＡ−塩酸，１ｍＭ塩化マ
グネシウム，ｐＨ１０．０）を２５０μｌ加え３７℃、
５分間反応させ、フォトンカウンターで測定した。その
結果を図５〜７に示す。さらにＡｌｐの遊離割合を図８
に示す。
【００３１】
【発明の効果】本発明の免疫測定法は、従来の方法に比
べ低いブランクでの測定が可能となり、大幅なＳ／Ｎの
向上が達成できた。その結果、本発明では検体中に含ま
れる低濃度の測定対象物を感度よく測定することがで
き、各種疾患の早期診断や治療のモニター等に利用する
ことができる。また、従来のデキスランを用いて架橋す
る方法に比べ短い反応時間で酵素分解が行われるため、
短時間での測定が達成される。
べ低いブランクでの測定が可能となり、大幅なＳ／Ｎの
向上が達成できた。その結果、本発明では検体中に含ま
れる低濃度の測定対象物を感度よく測定することがで
き、各種疾患の早期診断や治療のモニター等に利用する
ことができる。また、従来のデキスランを用いて架橋す
る方法に比べ短い反応時間で酵素分解が行われるため、
短時間での測定が達成される。
【図１】ゼラチン架橋ＣＴ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒
子、ゼラチン架橋ＣＴ０２抗体（Ｆａｂ’）結合粒子及
びＣＴ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒子を用いてカルシトニ
ンを測定した時のシグナル値を示す図である。
子、ゼラチン架橋ＣＴ０２抗体（Ｆａｂ’）結合粒子及
びＣＴ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒子を用いてカルシトニ
ンを測定した時のシグナル値を示す図である。
【図２】ゼラチン架橋ＣＴ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒
子、ゼラチン架橋ＣＴ０２抗体（Ｆａｂ’）結合粒子及
びＣＴ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒子を用いてカルシトニ
ンを測定した時のブランク値を示す図である。
子、ゼラチン架橋ＣＴ０２抗体（Ｆａｂ’）結合粒子及
びＣＴ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒子を用いてカルシトニ
ンを測定した時のブランク値を示す図である。
【図３】ゼラチン架橋ＣＴ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒
子、ゼラチン架橋ＣＴ０２抗体（Ｆａｂ’）結合粒子及
びＣＴ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒子を用いてカルシトニ
ンを測定した時Ｓ／Ｎ値を示す図である。
子、ゼラチン架橋ＣＴ０２抗体（Ｆａｂ’）結合粒子及
びＣＴ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒子を用いてカルシトニ
ンを測定した時Ｓ／Ｎ値を示す図である。
【図４】ゼラチン架橋ＣＴ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒
子、ゼラチン架橋ＣＴ０２抗体（Ｆａｂ’）結合粒子及
びＣＴ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒子を用いてカルシトニ
ンを測定した時の標識物の遊離割合（リリース率）を示
す図である。
子、ゼラチン架橋ＣＴ０２抗体（Ｆａｂ’）結合粒子及
びＣＴ０２抗体（ＩｇＧ）結合粒子を用いてカルシトニ
ンを測定した時の標識物の遊離割合（リリース率）を示
す図である。
【図５】ゼラチン架橋抗ＡＦＰ抗体結合粒子及びデキス
トラン架橋抗ＡＦＰ抗体結合粒子を用いてＡＦＰを測定
した時のシグナル値を示す図である。
トラン架橋抗ＡＦＰ抗体結合粒子を用いてＡＦＰを測定
した時のシグナル値を示す図である。
【図６】ゼラチン架橋抗ＡＦＰ抗体結合粒子及びデキス
トラン架橋抗ＡＦＰ抗体結合粒子を用いてＡＦＰを測定
した時のブランク値を示す図である。
トラン架橋抗ＡＦＰ抗体結合粒子を用いてＡＦＰを測定
した時のブランク値を示す図である。
【図７】ゼラチン架橋抗ＡＦＰ抗体結合粒子及びデキス
トラン架橋抗ＡＦＰ抗体結合粒子を用いてＡＦＰを測定
した時のＳ／Ｎ値を示す図である。
トラン架橋抗ＡＦＰ抗体結合粒子を用いてＡＦＰを測定
した時のＳ／Ｎ値を示す図である。
【図８】ゼラチン架橋抗ＡＦＰ抗体結合粒子及びデキス
トラン架橋抗ＡＦＰ抗体結合粒子を用いてＡＦＰを測定
した時の標識物の遊離割合（リリース率）を示す図であ
る。
トラン架橋抗ＡＦＰ抗体結合粒子を用いてＡＦＰを測定
した時の標識物の遊離割合（リリース率）を示す図であ
る。
Claims (4)
- 【請求項１】 繊維状蛋白質と固相とをリンカー試薬を
用いて結合させた後、更にその繊維状蛋白質と抗原又は
抗体とを前記リンカー試薬とは異なるリンカー試薬を用
いて結合させ、そのものを検体及び標識された抗原又は
抗体と反応させた後、繊維状蛋白質の分解酵素を反応さ
せることからなる免疫測定方法。 - 【請求項２】 繊維状蛋白質が、コラーゲン又はゼラチ
ンである請求項１記載の測定法。 - 【請求項３】 リンカー試薬が、マレイミド試薬、グル
タルアルデヒド、塩化シアヌル又はカルボジイミド試薬
である請求項１記載の測定方法。 - 【請求項４】 分解酵素が、ゼラチナーゼ又はコラゲナ
ーゼである請求項１記載の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35674296A JP3287249B2 (ja) | 1996-12-27 | 1996-12-27 | 免疫測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35674296A JP3287249B2 (ja) | 1996-12-27 | 1996-12-27 | 免疫測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10197535A true JPH10197535A (ja) | 1998-07-31 |
| JP3287249B2 JP3287249B2 (ja) | 2002-06-04 |
Family
ID=18450550
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35674296A Expired - Fee Related JP3287249B2 (ja) | 1996-12-27 | 1996-12-27 | 免疫測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3287249B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021531780A (ja) * | 2018-07-24 | 2021-11-25 | ニューサウス イノベーションズ プロプライアタリー リミティド | ３ｄ印刷のためのバイオインク |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6600831B1 (en) | 1999-03-23 | 2003-07-29 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Connection processing method for radiation images |
| JP4040222B2 (ja) | 1999-03-23 | 2008-01-30 | 富士フイルム株式会社 | 放射線画像の連結処理方法および放射線画像処理装置 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55156865A (en) * | 1978-10-06 | 1980-12-06 | Toyo Jozo Co Ltd | Organism component measuring compound and its manufacture plus organism component measuring composition, organism component measuring method and organism component measuring kit |
| JPS6324155A (ja) * | 1986-04-03 | 1988-02-01 | スカルボ インコ−ポレイテツド，ウエスト コ−スト | 結合測定法に使用される開裂可能な標識 |
| JPH04204379A (ja) * | 1990-11-30 | 1992-07-24 | Hitachi Ltd | 生体成分分析法 |
| JPH0543600A (ja) * | 1991-08-08 | 1993-02-23 | Kanebo Ltd | 抗体または抗原固定化絹フイブロイン膜および免疫測定用センサー |
| JPH06505802A (ja) * | 1991-03-12 | 1994-06-30 | イー・アイ・デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー | 遊離自在リガンドを用いた特異的結合アッセイ方法 |
-
1996
- 1996-12-27 JP JP35674296A patent/JP3287249B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55156865A (en) * | 1978-10-06 | 1980-12-06 | Toyo Jozo Co Ltd | Organism component measuring compound and its manufacture plus organism component measuring composition, organism component measuring method and organism component measuring kit |
| JPS6324155A (ja) * | 1986-04-03 | 1988-02-01 | スカルボ インコ−ポレイテツド，ウエスト コ−スト | 結合測定法に使用される開裂可能な標識 |
| JPH04204379A (ja) * | 1990-11-30 | 1992-07-24 | Hitachi Ltd | 生体成分分析法 |
| JPH06505802A (ja) * | 1991-03-12 | 1994-06-30 | イー・アイ・デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー | 遊離自在リガンドを用いた特異的結合アッセイ方法 |
| JPH0543600A (ja) * | 1991-08-08 | 1993-02-23 | Kanebo Ltd | 抗体または抗原固定化絹フイブロイン膜および免疫測定用センサー |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021531780A (ja) * | 2018-07-24 | 2021-11-25 | ニューサウス イノベーションズ プロプライアタリー リミティド | ３ｄ印刷のためのバイオインク |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3287249B2 (ja) | 2002-06-04 |
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