JPH05133952A - イムノグロブリン類のイムノアツセイ - Google Patents
イムノグロブリン類のイムノアツセイInfo
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- JPH05133952A JPH05133952A JP12532892A JP12532892A JPH05133952A JP H05133952 A JPH05133952 A JP H05133952A JP 12532892 A JP12532892 A JP 12532892A JP 12532892 A JP12532892 A JP 12532892A JP H05133952 A JPH05133952 A JP H05133952A
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 イムノグロブリンのイムノアッセイ方法およ
び試薬を提供する。 【構成】 該方法において、イムノグロブリンを含むと
考えられる試料および興味あるイムノグロブリンの検出
に有用な試薬は、水性媒体中に一工程で合される。一方
の試薬は、該イムノグロブリンに結合可能な第1の抗原
に結合される小分子を含み、他方の試薬は、該イムノグ
ロブリンに結合可能な第2の抗原に結合される信号発生
手段を含んでなる。
び試薬を提供する。 【構成】 該方法において、イムノグロブリンを含むと
考えられる試料および興味あるイムノグロブリンの検出
に有用な試薬は、水性媒体中に一工程で合される。一方
の試薬は、該イムノグロブリンに結合可能な第1の抗原
に結合される小分子を含み、他方の試薬は、該イムノグ
ロブリンに結合可能な第2の抗原に結合される信号発生
手段を含んでなる。
Description
【0001】発明の背景 1. 発明の分野 イムノグロブリン類は、抗体として機能し、生体に対し
て外来性である分子の存在に対する応答において免疫的
に有態な生体(すなわち完全な免疫系を有する生体)の
特定の細胞(β−リンパ球)により産生される蛋白質の
類である。
て外来性である分子の存在に対する応答において免疫的
に有態な生体(すなわち完全な免疫系を有する生体)の
特定の細胞(β−リンパ球)により産生される蛋白質の
類である。
【0002】それらの化学構造および免疫系においては
たす異なった機能に基づいて、5つの分類のイムノグロ
ブリン(Ig):IgA、IgD、IgE、IgGおよ
びIgMがある。通常はそれらの存在は感染を示すもの
であることから、イムノグロブリンの存在を同定するイ
ムノアッセイは、感染の初期診断に有用である。
たす異なった機能に基づいて、5つの分類のイムノグロ
ブリン(Ig):IgA、IgD、IgE、IgGおよ
びIgMがある。通常はそれらの存在は感染を示すもの
であることから、イムノグロブリンの存在を同定するイ
ムノアッセイは、感染の初期診断に有用である。
【0003】肝炎は、イムノグロブリン検出に基づくイ
ムノアッセイが有用となる感染症である。このようなア
ッセイは、純粋に診断のための道具のみならず、血液の
輸血前スクリーニングおよび可能な提供者のスクリーニ
ングのためにも有用である。B型肝炎または血清肝炎
は、世界的に発生しており、一般に共用する皮下注射針
を介して疾患の伝染が行なわれる薬剤使用者に見られ
る。B型肝炎は、通常はウイルス抗原の存在確認により
診断される。B型肝炎表面抗原、核抗原およびこれらの
抗原に向けられた抗体用のアッセイキットは、商業的に
入手可能である。表面抗原(HBsAg)は、発症以前
で、疾患の攻撃開始から数ヶ月まで血清中に検出可能で
あることから、HBsAgのアッセイが好ましい。HB
sAgは、出現する最初のウイルスマーカである。
ムノアッセイが有用となる感染症である。このようなア
ッセイは、純粋に診断のための道具のみならず、血液の
輸血前スクリーニングおよび可能な提供者のスクリーニ
ングのためにも有用である。B型肝炎または血清肝炎
は、世界的に発生しており、一般に共用する皮下注射針
を介して疾患の伝染が行なわれる薬剤使用者に見られ
る。B型肝炎は、通常はウイルス抗原の存在確認により
診断される。B型肝炎表面抗原、核抗原およびこれらの
抗原に向けられた抗体用のアッセイキットは、商業的に
入手可能である。表面抗原(HBsAg)は、発症以前
で、疾患の攻撃開始から数ヶ月まで血清中に検出可能で
あることから、HBsAgのアッセイが好ましい。HB
sAgは、出現する最初のウイルスマーカである。
【0004】2. 関連技術の記述 米国特許第4,292,403号は、Igイムノアッセ
イに関し、ここにおいては、結合抗−Igを試料と共に
インキュベートし、次いでIgに結合可な抗原と共にイ
ンキュベートし、最後に標識抗−抗原断片と共にインキ
ュベートする。各インキュベーションに引続いて洗浄工
程が行なわれ、また抗体は固体担体に対して共有結合ま
たは吸着により結合される。
イに関し、ここにおいては、結合抗−Igを試料と共に
インキュベートし、次いでIgに結合可な抗原と共にイ
ンキュベートし、最後に標識抗−抗原断片と共にインキ
ュベートする。各インキュベーションに引続いて洗浄工
程が行なわれ、また抗体は固体担体に対して共有結合ま
たは吸着により結合される。
【0005】米国特許第4,273,756号は、Ig
アッセイを記述しており、ここにおいては結合抗−Ig
を試験試料に接触せしめ、洗浄し、次いでIgに結合可
能な標識抗原と反応させる。米国特許第4,020,1
51号は、Igアッセイに関するもので、ここにおいて
は、第一に試料中のIgに非免疫学的表面に直接吸着さ
れ、引続いて標識抗−Igと反応させる。米国特許第
4,837,167号は、高親和性モノクローナル抗−
Igを用いて多重−決定因子抗原を測定する同時サンド
イッチアッセイを記述している。
アッセイを記述しており、ここにおいては結合抗−Ig
を試験試料に接触せしめ、洗浄し、次いでIgに結合可
能な標識抗原と反応させる。米国特許第4,020,1
51号は、Igアッセイに関するもので、ここにおいて
は、第一に試料中のIgに非免疫学的表面に直接吸着さ
れ、引続いて標識抗−Igと反応させる。米国特許第
4,837,167号は、高親和性モノクローナル抗−
Igを用いて多重−決定因子抗原を測定する同時サンド
イッチアッセイを記述している。
【0006】Bradleyらの、Journal o
f Clinical Microbiology 5
(5):521−530(1977)は、HAVウイル
ス関連IgM類イムノグロブリンを記述するもので、こ
れにおいては、HAVおよび放射標識IgG抗−HAV
が、IgMを含むと考えられる患者の血清により被覆さ
れた試験管に加えられる。米国特許第4,474,87
8号は、肝炎抗原に対するサンドイッチ酵素イムノアッ
セイに関するもので、これにおいては試料を結合抗体と
共にインキュベートし、次いで酵素標識抗体と共にイン
キュベートする。
f Clinical Microbiology 5
(5):521−530(1977)は、HAVウイル
ス関連IgM類イムノグロブリンを記述するもので、こ
れにおいては、HAVおよび放射標識IgG抗−HAV
が、IgMを含むと考えられる患者の血清により被覆さ
れた試験管に加えられる。米国特許第4,474,87
8号は、肝炎抗原に対するサンドイッチ酵素イムノアッ
セイに関するもので、これにおいては試料を結合抗体と
共にインキュベートし、次いで酵素標識抗体と共にイン
キュベートする。
【0007】米国特許第4,818,688号は、B型
肝炎核抗原(HBcAg)に対する抗体のアッセイを記
述するもので、これにおいては標識抗体が、固定化HB
cAgへの結合について試料中の抗体と競合する。米国
特許第4,098,876号は、肝炎関連抗原に対する
逆サンドイッチアッセイに関するもので、試料が標識抗
体と共にインキュベートされ、引続いて固定化抗体とイ
ンキュベートされる。Bussianらの、Clini
cal Chemistry34(6):1315(1
988)は、HAVに対するIgM抗体のアッセイが記
述され、試料がビオチン化抗−IgM、次いでストレプ
トアビジン被覆固相と共にインキュベートされ、複合体
が洗浄され、次いでHAVと混合され、新たな複合体が
洗浄され、次いで標識抗−HAVと混合される。
肝炎核抗原(HBcAg)に対する抗体のアッセイを記
述するもので、これにおいては標識抗体が、固定化HB
cAgへの結合について試料中の抗体と競合する。米国
特許第4,098,876号は、肝炎関連抗原に対する
逆サンドイッチアッセイに関するもので、試料が標識抗
体と共にインキュベートされ、引続いて固定化抗体とイ
ンキュベートされる。Bussianらの、Clini
cal Chemistry34(6):1315(1
988)は、HAVに対するIgM抗体のアッセイが記
述され、試料がビオチン化抗−IgM、次いでストレプ
トアビジン被覆固相と共にインキュベートされ、複合体
が洗浄され、次いでHAVと混合され、新たな複合体が
洗浄され、次いで標識抗−HAVと混合される。
【0008】米国特許第4,271,140号は、二重
レセプタ複合体におけるビオチンおよびアビジンの使用
に関し、これにおいては、ビオチンおよびアビジンは非
免疫的、可逆的結合系を形成する。米国特許第4,29
8,685号は、アビジン被覆固相に結合するビオチン
化抗体の使用を記述するもので、これにおいては、試料
中に存在する分析対象物が抗体との結合について非標識
分析対象物と競合する。米国特許第4,935,339
号は、一工程イムノアッセイに関し、これにおいては、
ビオチン化第1免疫的結合相手、試験試料、標識第2免
疫的結合相手および担体に結合されたビオチン−結合蛋
白質の全てが合される。
レセプタ複合体におけるビオチンおよびアビジンの使用
に関し、これにおいては、ビオチンおよびアビジンは非
免疫的、可逆的結合系を形成する。米国特許第4,29
8,685号は、アビジン被覆固相に結合するビオチン
化抗体の使用を記述するもので、これにおいては、試料
中に存在する分析対象物が抗体との結合について非標識
分析対象物と競合する。米国特許第4,935,339
号は、一工程イムノアッセイに関し、これにおいては、
ビオチン化第1免疫的結合相手、試験試料、標識第2免
疫的結合相手および担体に結合されたビオチン−結合蛋
白質の全てが合される。
【0009】米国特許第4,343,896号は、同一
抗原に対して生成される異なった動物種由来の2種類の
抗体を使用するアッセイを記述するもので、これにおい
ては、一方の抗体が標識され、他方の抗体が第3の抗体
により不溶化される。米国特許出願番号07/389,
659号(ヨーロッパ特許発行番号第411,945
号、日本国特許出願番号206628/90およびカナ
ダ特許出願番号2,022,517−3に対応)は、特
異的結合対に結合される小分子および第2の特異的結合
対に結合される第2の小分子を使用するイムノアッセイ
に関し、これにおいて、両結合対の構成体は、分析対象
物に結合可能である。該アッセイは、また、支持体に結
合される第1の小分子に対するレセプタ、および標識に
結合される第2の小分子に対するレセプタの使用も含
む。
抗原に対して生成される異なった動物種由来の2種類の
抗体を使用するアッセイを記述するもので、これにおい
ては、一方の抗体が標識され、他方の抗体が第3の抗体
により不溶化される。米国特許出願番号07/389,
659号(ヨーロッパ特許発行番号第411,945
号、日本国特許出願番号206628/90およびカナ
ダ特許出願番号2,022,517−3に対応)は、特
異的結合対に結合される小分子および第2の特異的結合
対に結合される第2の小分子を使用するイムノアッセイ
に関し、これにおいて、両結合対の構成体は、分析対象
物に結合可能である。該アッセイは、また、支持体に結
合される第1の小分子に対するレセプタ、および標識に
結合される第2の小分子に対するレセプタの使用も含
む。
【0010】発明の要約 特定のイムノグロブリン類に対する定性的イムノアッセ
イの実施方法が提供され、ここにおいて、下記の成分が
先行するインキュベーションなしに水性媒体中に合せら
れ、インキュベートされる。成分は、興味あるイムノグ
ロブリンを含有すると考えられる試料、該イムノグロブ
リンに結合可能な第1の抗原に結合される小分子(抗原
−小分子接合体)、該イムノグロブリンに結合可能な第
2の抗原に結合される信号発生手段(抗原−信号発生手
段接合体)、および該小分子に対するレセプタが結合さ
れる支持体である。第1および第2の抗原は、同一であ
ることができ、差異は、単に、一部の抗原が抗原−小分
子接合体において小分子に結合され、また抗原−信号発
生手段接合体において該信号発生手段に結合されること
である。次いで媒体が支持体から分離される。該媒体ま
たは支持体を、該信号発生手段の存在または量について
測定し、その存在または量が、試料中のイムノグロブリ
ンの存在または量に関連付けられる。
イの実施方法が提供され、ここにおいて、下記の成分が
先行するインキュベーションなしに水性媒体中に合せら
れ、インキュベートされる。成分は、興味あるイムノグ
ロブリンを含有すると考えられる試料、該イムノグロブ
リンに結合可能な第1の抗原に結合される小分子(抗原
−小分子接合体)、該イムノグロブリンに結合可能な第
2の抗原に結合される信号発生手段(抗原−信号発生手
段接合体)、および該小分子に対するレセプタが結合さ
れる支持体である。第1および第2の抗原は、同一であ
ることができ、差異は、単に、一部の抗原が抗原−小分
子接合体において小分子に結合され、また抗原−信号発
生手段接合体において該信号発生手段に結合されること
である。次いで媒体が支持体から分離される。該媒体ま
たは支持体を、該信号発生手段の存在または量について
測定し、その存在または量が、試料中のイムノグロブリ
ンの存在または量に関連付けられる。
【0011】本発明の他の実施態様は、IgG−型イム
ノグロブリンのノムノアッセイの実施方法を記述するも
ので、以下の成分、すなわちIgGを含むと考えられる
試料、IgGに結合可能なビオチン化第1抗体、IgG
に結合可能な第2の抗原に結合される信号発生手段、お
よび支持体に結合されたビオチンに対するレセプタを水
性媒体に合せ、インキュベートする。次いで、該媒体を
支持体から分離する。該媒体または支持体について、該
信号発生手段の存在または量の測定を行ない、その存在
または量が、試料中のIgGの存在または量に関連す
る。
ノグロブリンのノムノアッセイの実施方法を記述するも
ので、以下の成分、すなわちIgGを含むと考えられる
試料、IgGに結合可能なビオチン化第1抗体、IgG
に結合可能な第2の抗原に結合される信号発生手段、お
よび支持体に結合されたビオチンに対するレセプタを水
性媒体に合せ、インキュベートする。次いで、該媒体を
支持体から分離する。該媒体または支持体について、該
信号発生手段の存在または量の測定を行ない、その存在
または量が、試料中のIgGの存在または量に関連す
る。
【0012】本発明の更に他の実施態様は、試料中に存
在すると考えられるIgG−型イムノグロブリン検出の
ためのアッセイを記述するもので、複合体が試料中に存
在するIgGの量に直接関連して形成され、複合体は: 標識−Ag2:IgG:Ag1−X:Y−支持体 式中、Ag1−XはIgGに結合可能な第1の抗原(A
g1)に結合する小分子(X)であり、標識−Ag2は
IgGに結合可能な第2の抗原(Ag2)に結合する標
識であり、およびY−支持体は、支持体に結合される小
分子に対するレセプタである、である。
在すると考えられるIgG−型イムノグロブリン検出の
ためのアッセイを記述するもので、複合体が試料中に存
在するIgGの量に直接関連して形成され、複合体は: 標識−Ag2:IgG:Ag1−X:Y−支持体 式中、Ag1−XはIgGに結合可能な第1の抗原(A
g1)に結合する小分子(X)であり、標識−Ag2は
IgGに結合可能な第2の抗原(Ag2)に結合する標
識であり、およびY−支持体は、支持体に結合される小
分子に対するレセプタである、である。
【0013】本発明の別の実施態様は、イムノグロブリ
ンに結合するビオチン化抗原、およびイムノグロブリン
に結合する標識抗原の接合体からなる物質の組成物を記
述するものである。
ンに結合するビオチン化抗原、およびイムノグロブリン
に結合する標識抗原の接合体からなる物質の組成物を記
述するものである。
【0014】本発明の更に別の実施態様は、 標識−Ag2:IgG:Ag1−X:Y−支持体 式中、IgGはIgG−型イムノグロブリンであり、A
g1−XはIgGに結合可能な第1の抗原(Ag1)に
結合する小分子(X)であり、標識−Ag2はIgGに
結合可能な第2の抗原(Ag2)に結合する標識であ
り、ならびにY−支持体は、支持体に結合された小分子
である、である物質の組成物を記述する。
g1−XはIgGに結合可能な第1の抗原(Ag1)に
結合する小分子(X)であり、標識−Ag2はIgGに
結合可能な第2の抗原(Ag2)に結合する標識であ
り、ならびにY−支持体は、支持体に結合された小分子
である、である物質の組成物を記述する。
【0015】本発明の他の実施態様において、イムノグ
ロブリンのイムノアッセイ実施のためのキットが記述さ
れ、これは包装形態において、小分子とイムノグロブリ
ンに結合可能な第1の抗体との接合体、および標識とイ
ムノグロブリンに結合可能な第2の抗原との接合体、な
らびに小分子に対するレセプタが結合される表面を有す
る支持体を含んでなる。
ロブリンのイムノアッセイ実施のためのキットが記述さ
れ、これは包装形態において、小分子とイムノグロブリ
ンに結合可能な第1の抗体との接合体、および標識とイ
ムノグロブリンに結合可能な第2の抗原との接合体、な
らびに小分子に対するレセプタが結合される表面を有す
る支持体を含んでなる。
【0016】発明の詳細な記述 本発明は、特定のイムノグロブリン(Ig)、好ましく
はIgG類、特にはB型肝炎表面抗原に対するIgG
(HBsAg)の一工程同時イムノアッセイを提供す
る。複合体は、Ig分析対象物、抗原−小分子接合体お
よび抗原−信号発生手段接合体の間に形成される。該小
分子は、支持体に結合される小分子に対するレセプタに
よって、該複合体を不溶化することができる。すべての
試薬がいっしょに混合され、次いでインキュベートされ
る。この単一のインキュベーションは、洗浄工程に引継
がれ、次いで信号発生手段の残る構成分の添加が行なわ
れる。
はIgG類、特にはB型肝炎表面抗原に対するIgG
(HBsAg)の一工程同時イムノアッセイを提供す
る。複合体は、Ig分析対象物、抗原−小分子接合体お
よび抗原−信号発生手段接合体の間に形成される。該小
分子は、支持体に結合される小分子に対するレセプタに
よって、該複合体を不溶化することができる。すべての
試薬がいっしょに混合され、次いでインキュベートされ
る。この単一のインキュベーションは、洗浄工程に引継
がれ、次いで信号発生手段の残る構成分の添加が行なわ
れる。
【0017】本発明には、いくつかの優位点がある。一
つの優位点は、従来技術においては通常に見られる多く
のインキュベーションおよび洗浄工程の削減である。こ
れらの工程のいくつかの削除は、労力がより少なくてす
むアッセイ様式を提供する。ある例においては、この発
明は若干多くの試薬類を使用することもあるが、このこ
とは省力の利点のためにより重要である。他の優位点
は、数工程のインキュベーションおよび洗浄の必要性を
削除することによるもので、本発明はより短時間のアッ
セイを提供する。驚くべきことに、この分野のアッセイ
技術で見られる多くのインキュベーションおよび洗浄工
程の削減によって、分析対象物の検出を可能とする適切
な信号が得られ、かつ分析対象物への結合における第1
および第2の抗原間に起こる干渉が最小になった。本発
明の特定の実施態様の記述に進む前に、多くの用語を定
義しておく。
つの優位点は、従来技術においては通常に見られる多く
のインキュベーションおよび洗浄工程の削減である。こ
れらの工程のいくつかの削除は、労力がより少なくてす
むアッセイ様式を提供する。ある例においては、この発
明は若干多くの試薬類を使用することもあるが、このこ
とは省力の利点のためにより重要である。他の優位点
は、数工程のインキュベーションおよび洗浄の必要性を
削除することによるもので、本発明はより短時間のアッ
セイを提供する。驚くべきことに、この分野のアッセイ
技術で見られる多くのインキュベーションおよび洗浄工
程の削減によって、分析対象物の検出を可能とする適切
な信号が得られ、かつ分析対象物への結合における第1
および第2の抗原間に起こる干渉が最小になった。本発
明の特定の実施態様の記述に進む前に、多くの用語を定
義しておく。
【0018】「イムノグロブリン」は、試料中の測定さ
れるべき化合物であって、興味ある物質、すなわち分析
対象物である。試料は、好ましくは血清または血漿であ
る。該イムノグロブリン(Ig)は、疾患状態の原因物
質に対して向けられたものであってよい。イムノグロブ
リンは、一般に約160,000から約106まで変化
する分子量を有するIgA、IgD、IgE、IgGお
よびIgG等の分類特異的なものであってよい。ここに
おいて使用されているように、「イムノグロブリン」は
分析対象物をさし、また「抗体」は試薬を示す際に使用
される。「抗原」は、興味あるイムノグロブリンに結合
可能な任意の化合物を意味し、また抗体が生成される化
合物を意味している。例えば、抗体は、B型肝炎表面抗
原であり得る。
れるべき化合物であって、興味ある物質、すなわち分析
対象物である。試料は、好ましくは血清または血漿であ
る。該イムノグロブリン(Ig)は、疾患状態の原因物
質に対して向けられたものであってよい。イムノグロブ
リンは、一般に約160,000から約106まで変化
する分子量を有するIgA、IgD、IgE、IgGお
よびIgG等の分類特異的なものであってよい。ここに
おいて使用されているように、「イムノグロブリン」は
分析対象物をさし、また「抗体」は試薬を示す際に使用
される。「抗原」は、興味あるイムノグロブリンに結合
可能な任意の化合物を意味し、また抗体が生成される化
合物を意味している。例えば、抗体は、B型肝炎表面抗
原であり得る。
【0019】「リガンド」は、それに対してレセプタが
天然に存在するか、または調製され得る任意の有機化合
物を意味する。「レセプタ」は、分子の特定の空間的ま
たは極性機構、例えばエピトープ性または決定因子部位
を認識可能な任意の化合物または組成物を意味する。例
示的なレセプタは、チロキシン結合性グロブリン、抗体
類、酵素類、Fab断片、レクチン類、蛋白質A、C1
qの相補成分、アビジン、ストレプトアビジン等の天然
に生じるレセプタ類を含む。好ましくは、小分子がビオ
チンである場合には、ビオチンに対するレセプタはアヒ
ジンまたはストレプトアビジンであってよい。
天然に存在するか、または調製され得る任意の有機化合
物を意味する。「レセプタ」は、分子の特定の空間的ま
たは極性機構、例えばエピトープ性または決定因子部位
を認識可能な任意の化合物または組成物を意味する。例
示的なレセプタは、チロキシン結合性グロブリン、抗体
類、酵素類、Fab断片、レクチン類、蛋白質A、C1
qの相補成分、アビジン、ストレプトアビジン等の天然
に生じるレセプタ類を含む。好ましくは、小分子がビオ
チンである場合には、ビオチンに対するレセプタはアヒ
ジンまたはストレプトアビジンであってよい。
【0020】「支持体」は、任意の非多孔性または多孔
性表面を意味する。典型的な支持体表面は、ガラスまた
はプラスチックビーズ、ラテックスまたはセルロース粒
子、ガラスまたはセルロースろ紙、ニトロセルロース
膜、ポリスチレンプレート、磁性粒子、プラスチック試
験管または容器等を含む。支持体は、レセプタが非拡散
的に結合され、かつ水性媒体に溶解あるいは非可逆的に
反応しない任意の都合良い材料であってよい。通常、支
持体は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアクリ
ル、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、テフロン等のプラ
スチックであるか、または鋼、ニッケル、銅、金または
二酸化クロム等の金属性、あるいは好ましくは石英、ガ
ラス等を含むセラミクスである。支持体がビーズ担体で
ある場合には、該ビーズは、ほぼ均質な好ましくは0.
2−2.5mmの大きさで定義されるものであり、粗ま
たは平滑な表面、好ましくは平滑な表面を有する。好ま
しくは該ビーズは、円形または長円形であり、通常ほぼ
球形であって非特異的結合を最小とする表面特性を有す
るものである。本発明のイムノアッセイにおいて使用さ
れているように、該支持体は、レセプタ等の物質、例え
ば抗体、アビジン、アポ酵素、リプレッサ蛋白質、内部
因子等が結合される。
性表面を意味する。典型的な支持体表面は、ガラスまた
はプラスチックビーズ、ラテックスまたはセルロース粒
子、ガラスまたはセルロースろ紙、ニトロセルロース
膜、ポリスチレンプレート、磁性粒子、プラスチック試
験管または容器等を含む。支持体は、レセプタが非拡散
的に結合され、かつ水性媒体に溶解あるいは非可逆的に
反応しない任意の都合良い材料であってよい。通常、支
持体は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアクリ
ル、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、テフロン等のプラ
スチックであるか、または鋼、ニッケル、銅、金または
二酸化クロム等の金属性、あるいは好ましくは石英、ガ
ラス等を含むセラミクスである。支持体がビーズ担体で
ある場合には、該ビーズは、ほぼ均質な好ましくは0.
2−2.5mmの大きさで定義されるものであり、粗ま
たは平滑な表面、好ましくは平滑な表面を有する。好ま
しくは該ビーズは、円形または長円形であり、通常ほぼ
球形であって非特異的結合を最小とする表面特性を有す
るものである。本発明のイムノアッセイにおいて使用さ
れているように、該支持体は、レセプタ等の物質、例え
ば抗体、アビジン、アポ酵素、リプレッサ蛋白質、内部
因子等が結合される。
【0021】該支持体または表面への物質の結合は、通
常に文献中から入手できる周知技術によって達成でき
る。例えば、“Immobilized Enzyme
s”,Ichiro Chibata,Halsted
Press,New York(1978)およびC
uatrecasas,J.Biol.Chem.,2
45:3059(1970)参照。表面は、薄片、棒
状、ビーズを含む粒子等、多くの形状のいずれであって
もよい。
常に文献中から入手できる周知技術によって達成でき
る。例えば、“Immobilized Enzyme
s”,Ichiro Chibata,Halsted
Press,New York(1978)およびC
uatrecasas,J.Biol.Chem.,2
45:3059(1970)参照。表面は、薄片、棒
状、ビーズを含む粒子等、多くの形状のいずれであって
もよい。
【0022】表面は、通常多官能性または多官能化可能
であり、あるいは特異的または非特異的な共有または非
共有的相互作用を介してレセプタを結合可能である。種
々の官能基が利用可能であり、または導入可能である。
官能基は、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ
基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基等を含
む。種々の化合物を粒子に結合する方法は周知であり、
文献中に広く例示されている。例えばCuatreca
sasのJ.Biol.Chem.245:3059
(1970)参照。連結基の結合される物質までの長さ
は、連結される物質の性質、連結される物質と粒子との
間の距離の配列のハイブリダイゼーションに対する効果
等に依存して広範囲に変化する。連結される物質は、実
質的に粒子の外部表面に結合される。
であり、あるいは特異的または非特異的な共有または非
共有的相互作用を介してレセプタを結合可能である。種
々の官能基が利用可能であり、または導入可能である。
官能基は、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ
基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基等を含
む。種々の化合物を粒子に結合する方法は周知であり、
文献中に広く例示されている。例えばCuatreca
sasのJ.Biol.Chem.245:3059
(1970)参照。連結基の結合される物質までの長さ
は、連結される物質の性質、連結される物質と粒子との
間の距離の配列のハイブリダイゼーションに対する効果
等に依存して広範囲に変化する。連結される物質は、実
質的に粒子の外部表面に結合される。
【0023】表面として採用される粒子は、直接に、あ
るいは常法により粒子に結合される螢光性化合物または
螢光剤によって螢光性であり得る。螢光剤は、粒子に対
して溶解されるか、または共有的もしくは非共有的に結
合され、しばしば粒子を通して実質的に均一に結合され
る。螢光化ラテックス粒子は、米国特許第3,853,
987号に教示されている。
るいは常法により粒子に結合される螢光性化合物または
螢光剤によって螢光性であり得る。螢光剤は、粒子に対
して溶解されるか、または共有的もしくは非共有的に結
合され、しばしば粒子を通して実質的に均一に結合され
る。螢光化ラテックス粒子は、米国特許第3,853,
987号に教示されている。
【0024】「小分子」は、分子量100−2000、
好ましくは150−1000を有する有機性または有機
金属性の基であり、通常レセプタまたは支持体に結合さ
れ、またそれに対してレセプタが存在するか、または調
製され得る。本発明において有用な小分子の例は、ビオ
チン、リセルグ酸、ブルシン、フルオレセイン、ビタミ
ンB12、および一般にアッセイされる試料中に高濃度
では見出されない分子の誘導体を含む。生物学的試料に
ついては、高度に毒性の分子、および薬剤以外の合成的
に誘導された分子がしばしば好ましい。
好ましくは150−1000を有する有機性または有機
金属性の基であり、通常レセプタまたは支持体に結合さ
れ、またそれに対してレセプタが存在するか、または調
製され得る。本発明において有用な小分子の例は、ビオ
チン、リセルグ酸、ブルシン、フルオレセイン、ビタミ
ンB12、および一般にアッセイされる試料中に高濃度
では見出されない分子の誘導体を含む。生物学的試料に
ついては、高度に毒性の分子、および薬剤以外の合成的
に誘導された分子がしばしば好ましい。
【0025】「信号発生手段」は、試料中のイムノグロ
ブリンの存在または量に関連して信号を発生する少なく
とも一成分が標識される一以上の成分を意味する。該信
号発生手段は、測定可能な信号を生成するために必要な
すべての試薬を含む。該標識は、同位体または非同位体
であってよく、通常は、酵素等の触媒、螢光剤、染料ま
たは化学発光剤、金属性粒子等を含む非同位体性のもの
である。該標識は、抗原に対するレセプタに直接に接合
され得、あるいは、該標識は、小分子に対するレセプタ
に接合され得、ここにおいて該小分子は抗原に対するレ
セプタに結合される。信号発生手段の成分は、化学発光
剤、放射活性物質、補酵素、酵素生成物と反応する物
質、酵素、および触媒、固体粒子、螢光剤、色素、金粒
子等であってもよい。信号発生手段は、外的手段、好ま
しくは粒子の凝集度の測定または電磁輻射の使用、望ま
しくは視覚的試験により検出可能な信号を供給する。多
くの場合において、信号発生手段は、発色性物質および
酵素を含み、発色性物質が酵素的に変換されて紫外また
は可視領域で光を吸収する染料となるか、あるいは、リ
ン光性物質、螢光性物質または化学発光性物質、放射性
原子、電気的活性基等を含む。
ブリンの存在または量に関連して信号を発生する少なく
とも一成分が標識される一以上の成分を意味する。該信
号発生手段は、測定可能な信号を生成するために必要な
すべての試薬を含む。該標識は、同位体または非同位体
であってよく、通常は、酵素等の触媒、螢光剤、染料ま
たは化学発光剤、金属性粒子等を含む非同位体性のもの
である。該標識は、抗原に対するレセプタに直接に接合
され得、あるいは、該標識は、小分子に対するレセプタ
に接合され得、ここにおいて該小分子は抗原に対するレ
セプタに結合される。信号発生手段の成分は、化学発光
剤、放射活性物質、補酵素、酵素生成物と反応する物
質、酵素、および触媒、固体粒子、螢光剤、色素、金粒
子等であってもよい。信号発生手段は、外的手段、好ま
しくは粒子の凝集度の測定または電磁輻射の使用、望ま
しくは視覚的試験により検出可能な信号を供給する。多
くの場合において、信号発生手段は、発色性物質および
酵素を含み、発色性物質が酵素的に変換されて紫外また
は可視領域で光を吸収する染料となるか、あるいは、リ
ン光性物質、螢光性物質または化学発光性物質、放射性
原子、電気的活性基等を含む。
【0026】本発明による方法において、イムノグロブ
リンを含むと考えられるアッセイ媒体は、該イムノグロ
ブリンに結合可能な第1の抗原に結合する小分子、該イ
ムノグロブリンに結合可能な第2の抗原に結合する信号
発生手段、および前記小分子に対するレセプタが結合さ
れる支持体を含んでもよい。信号発生手段は、好ましく
は酵素、螢光物質、化学発光物質および金属性粒子から
なる群から選択される標識であり、最も好ましくは、前
記標識はパーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウ
レアーゼ、アルカリホスファターゼおよびQ−ベータ−
レプリカーゼからなる群から選択される酵素であり;ま
た該信号発生手段は、前記第2の抗原に結合される第2
の小分子、ならびに酵素、螢光物質、化学発光物質およ
び金属性粒子からなる群から選択される標識に結合され
る前記第2の小分子に対するレセプタを含んでもよく、
好ましくは、前記分子がフルオレセイン誘導体であり、
前記レセプタが抗体であり、また前記酵素がパーオキシ
ダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリ
フォスファターゼおよびQ−ベータ−レプリカーゼから
なる群から選択される酵素である。
リンを含むと考えられるアッセイ媒体は、該イムノグロ
ブリンに結合可能な第1の抗原に結合する小分子、該イ
ムノグロブリンに結合可能な第2の抗原に結合する信号
発生手段、および前記小分子に対するレセプタが結合さ
れる支持体を含んでもよい。信号発生手段は、好ましく
は酵素、螢光物質、化学発光物質および金属性粒子から
なる群から選択される標識であり、最も好ましくは、前
記標識はパーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウ
レアーゼ、アルカリホスファターゼおよびQ−ベータ−
レプリカーゼからなる群から選択される酵素であり;ま
た該信号発生手段は、前記第2の抗原に結合される第2
の小分子、ならびに酵素、螢光物質、化学発光物質およ
び金属性粒子からなる群から選択される標識に結合され
る前記第2の小分子に対するレセプタを含んでもよく、
好ましくは、前記分子がフルオレセイン誘導体であり、
前記レセプタが抗体であり、また前記酵素がパーオキシ
ダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリ
フォスファターゼおよびQ−ベータ−レプリカーゼから
なる群から選択される酵素である。
【請求項27】また、本発明によるIgG−型イムノグ
ロブリンに対するイムノアッセイ方法においては、前記
IgGに結合可能なビオチン化された第1の抗体、前記
IgGに結合可能な第2の抗原に結合される信号発生手
段、および支持体に結合されたビオチンに対するレセプ
タを含んでなり、該信号発生手段は、酵素、螢光物質、
化学発光物質、および金属性粒子からなる群から選択さ
れる標識であってよく、好ましくは前記標識は、パーオ
キシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アル
カリホスファターゼおよびQ−ベータ−レプリカーゼか
らなる群から選択される酵素であり;該信号発生手段
は、第2の抗原に結合される第2の小分子、ならびに酵
素、螢光物質、化学発光物質および金属性粒子からなる
群から選択される標識に結合される第2の小分子に対す
るレセプタを含んでもよく、好ましくは、前記分子がフ
ルオレセイン誘導体であり、前記レセプタが抗体であ
り、また前記酵素がパーオキシダーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、ウレアーゼ、アルカリフォスファターゼおよび
Q−ベータ−レプリカーゼからなる群から選択される酵
素である。
ロブリンに対するイムノアッセイ方法においては、前記
IgGに結合可能なビオチン化された第1の抗体、前記
IgGに結合可能な第2の抗原に結合される信号発生手
段、および支持体に結合されたビオチンに対するレセプ
タを含んでなり、該信号発生手段は、酵素、螢光物質、
化学発光物質、および金属性粒子からなる群から選択さ
れる標識であってよく、好ましくは前記標識は、パーオ
キシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アル
カリホスファターゼおよびQ−ベータ−レプリカーゼか
らなる群から選択される酵素であり;該信号発生手段
は、第2の抗原に結合される第2の小分子、ならびに酵
素、螢光物質、化学発光物質および金属性粒子からなる
群から選択される標識に結合される第2の小分子に対す
るレセプタを含んでもよく、好ましくは、前記分子がフ
ルオレセイン誘導体であり、前記レセプタが抗体であ
り、また前記酵素がパーオキシダーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、ウレアーゼ、アルカリフォスファターゼおよび
Q−ベータ−レプリカーゼからなる群から選択される酵
素である。
【0028】該信号発生手段は、少なくとも1種類の触
媒、通常は酵素、および少なくとも1種類の基質を含む
ことができ、また2種類以上の触媒および複数の基質を
含んでもよく、更に、ある酵素の基質が他の酵素の産生
物であるような酵素の組合せを含んでもよい。該信号発
生系の操作は、試料中のイムノグロブリンの量に関連し
て検出可能な信号を供給する生産物を産生するためであ
る。
媒、通常は酵素、および少なくとも1種類の基質を含む
ことができ、また2種類以上の触媒および複数の基質を
含んでもよく、更に、ある酵素の基質が他の酵素の産生
物であるような酵素の組合せを含んでもよい。該信号発
生系の操作は、試料中のイムノグロブリンの量に関連し
て検出可能な信号を供給する生産物を産生するためであ
る。
【0029】信号発生手段において有用な多くの酵素お
よび補酵素が、米国特許第4,275,149号の第1
9欄〜23欄、米国特許第4,318,980号の第1
0欄〜14欄、および米国特許第4,868,104号
の第7欄に示されている。多くの酵素の組合せが、米国
特許第4,275,149号第23欄〜第28欄に示さ
れており、その組合せは、本発明の主題において用途が
見出されるであろう。
よび補酵素が、米国特許第4,275,149号の第1
9欄〜23欄、米国特許第4,318,980号の第1
0欄〜14欄、および米国特許第4,868,104号
の第7欄に示されている。多くの酵素の組合せが、米国
特許第4,275,149号第23欄〜第28欄に示さ
れており、その組合せは、本発明の主題において用途が
見出されるであろう。
【0030】特に興味あるものは、過酸化水素の生成に
関与する酵素、および過酸化水素を染料前駆体の染料へ
の酸化に使用することである。特定の組合せは、例えば
グルコースおよびガラクトースオキシダーゼ等のサッカ
ライドオキシダーゼ、またはウレアーゼおよびキサンタ
ンオキシダーゼ等の複素環性オキシダーゼと組合される
過酸化水素を染料前駆体の酸化に利用する酵素、すなわ
ち西洋ワサビパーオキシダーゼ、ラクトパーオキシダー
ゼ、またはミクロパーオキシダーゼ等のパーオキシダー
ゼを含む。更なる酵素の組合せは、上述した特許参考資
料中に見出されるであろう。単一の酵素が標識として使
用される場合には、他の酵素はアルカリホスファターゼ
およびβ−ガラクトシダーゼ等のハイドロラーゼとして
の利用が見出されるであろう。別法として、ホタルルシ
フェラーゼおよび細菌性ルシフェラーゼ等のルシフェラ
ーゼが使用できる。
関与する酵素、および過酸化水素を染料前駆体の染料へ
の酸化に使用することである。特定の組合せは、例えば
グルコースおよびガラクトースオキシダーゼ等のサッカ
ライドオキシダーゼ、またはウレアーゼおよびキサンタ
ンオキシダーゼ等の複素環性オキシダーゼと組合される
過酸化水素を染料前駆体の酸化に利用する酵素、すなわ
ち西洋ワサビパーオキシダーゼ、ラクトパーオキシダー
ゼ、またはミクロパーオキシダーゼ等のパーオキシダー
ゼを含む。更なる酵素の組合せは、上述した特許参考資
料中に見出されるであろう。単一の酵素が標識として使
用される場合には、他の酵素はアルカリホスファターゼ
およびβ−ガラクトシダーゼ等のハイドロラーゼとして
の利用が見出されるであろう。別法として、ホタルルシ
フェラーゼおよび細菌性ルシフェラーゼ等のルシフェラ
ーゼが使用できる。
【0031】用途が見出される例示的な補酵素は、NA
D〔H〕;NADP〔H〕、ピリドキサルホスフェー
ト、FAD〔H〕;FMN〔H〕等を含み、通常周期反
応に関与する補酵素である。特に、米国特許第4,31
8,980号参照。酵素反応の生成物は、通常、染料ま
たは螢光物質である。米国特許第4,275,149号
には、多くの例示的な螢光物質が示されている。該信号
発生系は、1種以上の粒子を含むことができ、これは少
なくとも約50nm以上で約50ミクロンを越えず、通
常は少なくとも約100nmかつ約25ミクロン未満、
好ましくは約0.2−5ミクロンの直径を有する不溶性
の粒子である。該粒子は、有機性または無機性であり、
多孔性または非多孔性であり、好ましくは水に近似した
密度、一般的には約0.7−約1.5g/mlであり、
透明、半透明または不透明材料からなるものであってよ
い。
D〔H〕;NADP〔H〕、ピリドキサルホスフェー
ト、FAD〔H〕;FMN〔H〕等を含み、通常周期反
応に関与する補酵素である。特に、米国特許第4,31
8,980号参照。酵素反応の生成物は、通常、染料ま
たは螢光物質である。米国特許第4,275,149号
には、多くの例示的な螢光物質が示されている。該信号
発生系は、1種以上の粒子を含むことができ、これは少
なくとも約50nm以上で約50ミクロンを越えず、通
常は少なくとも約100nmかつ約25ミクロン未満、
好ましくは約0.2−5ミクロンの直径を有する不溶性
の粒子である。該粒子は、有機性または無機性であり、
多孔性または非多孔性であり、好ましくは水に近似した
密度、一般的には約0.7−約1.5g/mlであり、
透明、半透明または不透明材料からなるものであってよ
い。
【0032】該有機性粒子は、通常、ポリマー類、付加
または縮合ポリマーのいずれであってもよく、これはア
ッセイ媒体中に容易に分散するものである。粒子の表面
は、吸着性であるか、または直接もしくは間接にオリゴ
ヌクレオチドもしくはsbp構成物を結合するために官
能化できるものである。粒子の性質は上述されている。
興味ある螢光物質は、一般に350nm以上、通常40
0nm以上、好ましくは450nm以上の波長の光を放
射する。望ましくは、該螢光物質は高い量子収率、大き
いストークスシフトを有し、かつ接合および使用条件下
において化学的に安定である。螢光物質との用語は、電
磁輻射または化学的活性化により光を放射する物質、な
らびに螢光性およびリン光性物質、シンチレータ類およ
び化学発光性物質を含むことを意図するものである。
または縮合ポリマーのいずれであってもよく、これはア
ッセイ媒体中に容易に分散するものである。粒子の表面
は、吸着性であるか、または直接もしくは間接にオリゴ
ヌクレオチドもしくはsbp構成物を結合するために官
能化できるものである。粒子の性質は上述されている。
興味ある螢光物質は、一般に350nm以上、通常40
0nm以上、好ましくは450nm以上の波長の光を放
射する。望ましくは、該螢光物質は高い量子収率、大き
いストークスシフトを有し、かつ接合および使用条件下
において化学的に安定である。螢光物質との用語は、電
磁輻射または化学的活性化により光を放射する物質、な
らびに螢光性およびリン光性物質、シンチレータ類およ
び化学発光性物質を含むことを意図するものである。
【0033】興味ある螢光物質は、ある主要な官能基を
有する種々の分類中に入れられる。これらの主要な官能
基は、1−および2−アミノナフタレン、p,p−ジア
ミノスチルベン類、ピレン類、四級フェナントリジン塩
類、9−アミノアクリジン類、p,p′−ジアミノスチ
ルベン イミン類、アントラセン類、オキサカルボキシ
アニン、メロシアニン、3−アミノエキレニン、ペリレ
ン、ビス−ベンゾキサゾール、ビス−p−オキサゾリル
ベンゼン、1,2−ベンゾフェナンジン、レチナール、
ビス−3−アミノピリジニウム塩類、ヘレブリゲニン、
テトラサイクリン、ステロフェノール、ベンズイミダゾ
リルフェニルアミン、2−オキソ−3−クロメン、イン
ドール、キサンテン、7−ヒドロキシクマリン、4,5
−ベンズイミダゾール類、フェノキサジン、サリシレー
ト、ストロファンチジン、ポリフィリン類、トリアリル
メタン類、フラビンおよび希土類キレート酸化物または
塩を含む。例示的螢光物質は、米国特許第4,318,
707号の7欄および8欄に列挙されている。
有する種々の分類中に入れられる。これらの主要な官能
基は、1−および2−アミノナフタレン、p,p−ジア
ミノスチルベン類、ピレン類、四級フェナントリジン塩
類、9−アミノアクリジン類、p,p′−ジアミノスチ
ルベン イミン類、アントラセン類、オキサカルボキシ
アニン、メロシアニン、3−アミノエキレニン、ペリレ
ン、ビス−ベンゾキサゾール、ビス−p−オキサゾリル
ベンゼン、1,2−ベンゾフェナンジン、レチナール、
ビス−3−アミノピリジニウム塩類、ヘレブリゲニン、
テトラサイクリン、ステロフェノール、ベンズイミダゾ
リルフェニルアミン、2−オキソ−3−クロメン、イン
ドール、キサンテン、7−ヒドロキシクマリン、4,5
−ベンズイミダゾール類、フェノキサジン、サリシレー
ト、ストロファンチジン、ポリフィリン類、トリアリル
メタン類、フラビンおよび希土類キレート酸化物または
塩を含む。例示的螢光物質は、米国特許第4,318,
707号の7欄および8欄に列挙されている。
【0034】加うるに、エネルギー吸収または消去性の
粒子を使用することができ、これは少なくとも約50n
mの直径を有する固体の不溶性粒子であり、プローブと
ポリヌクレオチド分析対象物とのハイブリダイゼーショ
ンまたは特異的結合構成体の間の特異的結合に由来する
距離の範囲内で螢光性粒子の螢光を消去可能である。該
消去性粒子は、螢光性粒子と同一であるか異なるもの
で、通常は異なる。普通に る。
粒子を使用することができ、これは少なくとも約50n
mの直径を有する固体の不溶性粒子であり、プローブと
ポリヌクレオチド分析対象物とのハイブリダイゼーショ
ンまたは特異的結合構成体の間の特異的結合に由来する
距離の範囲内で螢光性粒子の螢光を消去可能である。該
消去性粒子は、螢光性粒子と同一であるか異なるもの
で、通常は異なる。普通に る。
【0035】光放射を変調するために多くの型の粒子が
使用されうる。特に興味あるものは、チャコール、す
す、グラファイト、コロイド状炭素等の炭素粒子であ
る。炭素粒子以外では、金属ゾルが使用でき、特には
金、銀および白金等の貴金属のものである。他の金属誘
導粒子は、金属の硫化物、例えば鉛、銀または銅硫化
物、あるいは鉄もしくは銅酸化物等の金属酸化物であ
る。
使用されうる。特に興味あるものは、チャコール、す
す、グラファイト、コロイド状炭素等の炭素粒子であ
る。炭素粒子以外では、金属ゾルが使用でき、特には
金、銀および白金等の貴金属のものである。他の金属誘
導粒子は、金属の硫化物、例えば鉛、銀または銅硫化
物、あるいは鉄もしくは銅酸化物等の金属酸化物であ
る。
【0036】検出可能な信号としての別の光源は、化学
発光源である。該化学発光源は、化学反応により電子的
に励起され、次いで検出可能な信号として作用する光を
放射するか、または蛍光性受容体にエネルギを与える化
合物を含む。
発光源である。該化学発光源は、化学反応により電子的
に励起され、次いで検出可能な信号として作用する光を
放射するか、または蛍光性受容体にエネルギを与える化
合物を含む。
【0037】多くの種類の化合物が、種々の条件下で化
学発光性を与えることが見出されている。化合物の一分
類は、2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオンで
ある。最も一般的な化合物は、上記化合物の5−アミノ
類似体であるルミノールである。この分類の他の構成物
は、5−アミノ−6,7,8−トリメトキシおよびジメ
チルアミン−〔Ca〕ベンズ類似体である。これらの化
合物は、アルカリ性過酸化水素、またはカルシウムハイ
ポクロライトおよび塩基を用いて発光性とされ得る。化
合物の他の分類は、2,4,5−トリフェニルイミダゾ
ール類であり、親化合物について慣用名称ロフィンを有
する。化学発光性類似体は、パラ−ジメチルアミノ−お
よびパラーメトキシ−置換体を含む。化学発光性は、オ
キサレート類、通常オキサリル、活性エステル類、例え
ばp−ニトロフェニルおよび過酸化物、例えば過酸化水
素を用いて塩基性条件下でも得られる。別法として、ル
シフェリン類は、ルシフェラーゼまたはルシゲニンと組
合せて使用してもよい。
学発光性を与えることが見出されている。化合物の一分
類は、2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオンで
ある。最も一般的な化合物は、上記化合物の5−アミノ
類似体であるルミノールである。この分類の他の構成物
は、5−アミノ−6,7,8−トリメトキシおよびジメ
チルアミン−〔Ca〕ベンズ類似体である。これらの化
合物は、アルカリ性過酸化水素、またはカルシウムハイ
ポクロライトおよび塩基を用いて発光性とされ得る。化
合物の他の分類は、2,4,5−トリフェニルイミダゾ
ール類であり、親化合物について慣用名称ロフィンを有
する。化学発光性類似体は、パラ−ジメチルアミノ−お
よびパラーメトキシ−置換体を含む。化学発光性は、オ
キサレート類、通常オキサリル、活性エステル類、例え
ばp−ニトロフェニルおよび過酸化物、例えば過酸化水
素を用いて塩基性条件下でも得られる。別法として、ル
シフェリン類は、ルシフェラーゼまたはルシゲニンと組
合せて使用してもよい。
【0038】「補助物質」は、本発明のアッセイ方法に
おいて使用される種々の付加的な材料を意味する。例え
ば、緩衝剤は、普通にアッセイ媒体中に、アッセイ媒体
の安定剤およびアッセイ成分と共に存在するであろう。
これらの添加物に加え、アルブミン等の付加的な蛋白質
を含んでもよく、また界面活性剤、特には非イオン性界
面活性剤、結合増強剤、例えばポリアルケングリコール
類を含んでもよい。
おいて使用される種々の付加的な材料を意味する。例え
ば、緩衝剤は、普通にアッセイ媒体中に、アッセイ媒体
の安定剤およびアッセイ成分と共に存在するであろう。
これらの添加物に加え、アルブミン等の付加的な蛋白質
を含んでもよく、また界面活性剤、特には非イオン性界
面活性剤、結合増強剤、例えばポリアルケングリコール
類を含んでもよい。
【0039】「全体的または部分的に連続的」とは、本
発明において使用される試料および種々の試薬が付随的
(同時的)でなく合される場合、1種以上が残る試薬の
1種以上と合せられて準組合せを形成することである。
各々の準組せは、次いで合せられ、本方法に付される。
発明において使用される試料および種々の試薬が付随的
(同時的)でなく合される場合、1種以上が残る試薬の
1種以上と合せられて準組合せを形成することである。
各々の準組せは、次いで合せられ、本方法に付される。
【0040】前述したように、本発明の一面は、特定の
イムノグロブリンのイムノアッセイ実施方法に関し、こ
こにおいて次の成分:イムノグロブリンを含むと考えら
れる試料、該イムノグロブリンに結合可能な第1の抗原
に結合される小分子、該イムノグロブリンに結合可能な
第2の抗原に結合される信号発生手段、および該小分子
に対するレセプタが結合される支持体が、水性アッセイ
媒体中に合せられる。該第1および第2の抗原は、同一
抗原であってもよく、差異は、ある抗原は該小分子に結
合され、またある抗原は該信号発生手段に結合されるこ
とのみである。次いで、媒体が支持体から分離される。
該媒体または支持体は、信号発生手段の存在または量に
ついて測定され、その存在または量は試料中のイムノグ
ロブリンの存在または量に関連付けられる。本発明の好
ましい実施形態において、固体支持体はビーズ担体であ
る。
イムノグロブリンのイムノアッセイ実施方法に関し、こ
こにおいて次の成分:イムノグロブリンを含むと考えら
れる試料、該イムノグロブリンに結合可能な第1の抗原
に結合される小分子、該イムノグロブリンに結合可能な
第2の抗原に結合される信号発生手段、および該小分子
に対するレセプタが結合される支持体が、水性アッセイ
媒体中に合せられる。該第1および第2の抗原は、同一
抗原であってもよく、差異は、ある抗原は該小分子に結
合され、またある抗原は該信号発生手段に結合されるこ
とのみである。次いで、媒体が支持体から分離される。
該媒体または支持体は、信号発生手段の存在または量に
ついて測定され、その存在または量は試料中のイムノグ
ロブリンの存在または量に関連付けられる。本発明の好
ましい実施形態において、固体支持体はビーズ担体であ
る。
【0041】本発明のイムノアッセイにおいて使用され
る試薬は、本発明の設計において特に重要である。設計
されたように、該方法論は、多くの分析対象に対して一
般的なある種の試薬を含み、これによってイムノアッセ
イ系における自動化および試薬安定性の制御をより容易
なものとする。典型的には、本発明は、興味あるイムノ
グロブリンのアッセイにおいて以下の試薬を使用する:
(1)該イムノグロブリンに結合可能な第1の抗原に結
合される小分子、(2)該イムノグロブリンに結合可能
な第2の抗原に結合される信号発生手段、および(3)
小分子に対するレセプタが結合される支持体。同一の小
分子がすべてのアッセイにおいて使用される場合、レセ
プタに結合される支持体は、分析対象物が何であろうと
関係なく使用できる共通の試薬である。該信号発生手段
は、第2の抗原に対するレセプタに結合される第2の小
分子を、該第2の小分子に対する標識レセプタと共に有
して成ることもできる。再度、同一の第2の小分子がす
べてのアッセイに使用される場合には、該第2の小分子
に対する標識レセプタも共通試薬である。
る試薬は、本発明の設計において特に重要である。設計
されたように、該方法論は、多くの分析対象に対して一
般的なある種の試薬を含み、これによってイムノアッセ
イ系における自動化および試薬安定性の制御をより容易
なものとする。典型的には、本発明は、興味あるイムノ
グロブリンのアッセイにおいて以下の試薬を使用する:
(1)該イムノグロブリンに結合可能な第1の抗原に結
合される小分子、(2)該イムノグロブリンに結合可能
な第2の抗原に結合される信号発生手段、および(3)
小分子に対するレセプタが結合される支持体。同一の小
分子がすべてのアッセイにおいて使用される場合、レセ
プタに結合される支持体は、分析対象物が何であろうと
関係なく使用できる共通の試薬である。該信号発生手段
は、第2の抗原に対するレセプタに結合される第2の小
分子を、該第2の小分子に対する標識レセプタと共に有
して成ることもできる。再度、同一の第2の小分子がす
べてのアッセイに使用される場合には、該第2の小分子
に対する標識レセプタも共通試薬である。
【0042】本発明の一実施形態において、試料中のイ
ムノグロブリンの検出に対する方法論が与えられた。こ
のアッセイの方法論は、次の試薬類を使用する:興味あ
るイムノグロブリン(Ig)を含むと考えられる試料;
Igに結合可能な第1の抗原に結合される小分子、例え
ば抗原に結合されるビオチン;Igに結合可能な第2の
抗原に結合される信号発生手段、例えば抗原に結合され
る標識;および小分子に対するレセプタ、例えばアビジ
ンが結合される支持体。別の実施態様において、該信号
発生手段は、小分子に対するレセプタに結合される標識
であり得、ここにおいて、小分子は第2の抗原に結合さ
れ、例えば、酵素標識抗−フルオレセインおよびフルオ
レセイン標識抗原である。
ムノグロブリンの検出に対する方法論が与えられた。こ
のアッセイの方法論は、次の試薬類を使用する:興味あ
るイムノグロブリン(Ig)を含むと考えられる試料;
Igに結合可能な第1の抗原に結合される小分子、例え
ば抗原に結合されるビオチン;Igに結合可能な第2の
抗原に結合される信号発生手段、例えば抗原に結合され
る標識;および小分子に対するレセプタ、例えばアビジ
ンが結合される支持体。別の実施態様において、該信号
発生手段は、小分子に対するレセプタに結合される標識
であり得、ここにおいて、小分子は第2の抗原に結合さ
れ、例えば、酵素標識抗−フルオレセインおよびフルオ
レセイン標識抗原である。
【0043】固体支持体に結合されるであろう信号発生
手段の量は、試料中に存在するイムノグロブリンの量に
直接に関連するであろう。特に、Igの存在において、
信号発生手段に結合される抗原は、Igに結合するであ
ろう。一方において、小分子が結合された抗原は、Ig
に結合し、該小分子は、該小分子に対するレセプタに結
合し、これが支持体に結合される。このことは、支持体
に結合された興味ある複合体を生じる。
手段の量は、試料中に存在するイムノグロブリンの量に
直接に関連するであろう。特に、Igの存在において、
信号発生手段に結合される抗原は、Igに結合するであ
ろう。一方において、小分子が結合された抗原は、Ig
に結合し、該小分子は、該小分子に対するレセプタに結
合し、これが支持体に結合される。このことは、支持体
に結合された興味ある複合体を生じる。
【0044】試薬類および試料は、同時に、または全体
的もしくは部分的に連続して互いに、および固体支持体
と共に合される。一方法において、すべての試薬類、試
料および固体支持体はいっしょに混合される。これは、
非結合試薬を洗浄により除去した後に、一回のインキュ
ベーションに続く。IgG−型イムノグロブリンの検出
に適用された本発明のイムノアッセイで形成される複合
体の模式的な代表例は次のとおりである: 標識−Ag2:IgG:Ag1−X:Y−支持体 式中、Ag1−XはIgGに結合可能な第1の抗原(A
g1)に結合される小分子(X)であり;標識−Ag2
は、IgGに結合可能な第2の抗原(Ag2)に結合さ
れた標識であり;およびY−支持体は、支持体に結合さ
れる小分子に対するレセブタである。好ましい実施態様
において、第1および第2の抗原は、B型肝炎表面抗原
である。Xは、ビオチン、Yはアビジンであり得る。
的もしくは部分的に連続して互いに、および固体支持体
と共に合される。一方法において、すべての試薬類、試
料および固体支持体はいっしょに混合される。これは、
非結合試薬を洗浄により除去した後に、一回のインキュ
ベーションに続く。IgG−型イムノグロブリンの検出
に適用された本発明のイムノアッセイで形成される複合
体の模式的な代表例は次のとおりである: 標識−Ag2:IgG:Ag1−X:Y−支持体 式中、Ag1−XはIgGに結合可能な第1の抗原(A
g1)に結合される小分子(X)であり;標識−Ag2
は、IgGに結合可能な第2の抗原(Ag2)に結合さ
れた標識であり;およびY−支持体は、支持体に結合さ
れる小分子に対するレセブタである。好ましい実施態様
において、第1および第2の抗原は、B型肝炎表面抗原
である。Xは、ビオチン、Yはアビジンであり得る。
【0045】本発明の一実施態様において、例えば酵素
である標識は、抗原に対して直接結合される。すると、
酵素活性の程度は、試料中のIgGの濃度と相関関係を
有する。このようなアッセイの変法においては、フルオ
レセイン等の小分子が抗原に結合される。次いで、標識
が抗−フルオレセイン抗体に結合される。
である標識は、抗原に対して直接結合される。すると、
酵素活性の程度は、試料中のIgGの濃度と相関関係を
有する。このようなアッセイの変法においては、フルオ
レセイン等の小分子が抗原に結合される。次いで、標識
が抗−フルオレセイン抗体に結合される。
【0046】アッセイ系の設計は、共通の試薬の使用、
すなわち興味ある分析対象物が何であろうと関係なく任
意のアッセイ系において使用することを可能とする。前
述の例で明らかなように、各アッセイは、支持体に結合
される小分子に対するレセプタを使用する。
すなわち興味ある分析対象物が何であろうと関係なく任
意のアッセイ系において使用することを可能とする。前
述の例で明らかなように、各アッセイは、支持体に結合
される小分子に対するレセプタを使用する。
【0047】アッセイを実施するに際して、より便利な
工程の特定の順列があり、従って採用すべき特定の順列
の選択は、アッセイの実施者の要求に依存する。一般に
は、試料、すべての試薬および支持体は、水性媒体中に
合せられ、普通には添加の順序に関係がない。典型的に
は、試料、試薬および支持体は、基本的に同時に合せら
れる。次いで、試料、試薬および支持体を含む水性媒体
は、1時間まで、あるいはそれ以上インキュベートされ
る。次いで支持体に結合されるか、または媒体中に残留
する信号発生手段の量を直接に測定するが、通常は媒体
を支持体から分離した後に測定される。
工程の特定の順列があり、従って採用すべき特定の順列
の選択は、アッセイの実施者の要求に依存する。一般に
は、試料、すべての試薬および支持体は、水性媒体中に
合せられ、普通には添加の順序に関係がない。典型的に
は、試料、試薬および支持体は、基本的に同時に合せら
れる。次いで、試料、試薬および支持体を含む水性媒体
は、1時間まで、あるいはそれ以上インキュベートされ
る。次いで支持体に結合されるか、または媒体中に残留
する信号発生手段の量を直接に測定するが、通常は媒体
を支持体から分離した後に測定される。
【0048】本発明のアッセイにおいては、いずれの慣
用の標識を使用してもよい。標識は、普通には抗原に対
して共有的に結合される。しかしながら、この発明は、
抗原に結合される小分子を有する場合、および小分子に
対するレセプタ、通常は抗体に対して共有的に結合され
る標識を有する場合も意図するものである。結合は化学
反応により達成され、結果として標識の水素原子が抗体
に対する結合に置換されるか、または標識と抗原との間
の連結基を含むことになる。連結基は、任意の大きさで
あってよいが、好ましくは標識に結合される抗原に対す
るイムノグロブリンの自由な結合を許容するに必要な程
度、および標識による信号発生を許容するに必要な程度
を越えない。一般的には、連結基は結合であるか、また
は1〜100原子、通常1〜15原子からなる基であ
る。連結基は、標識またはレセプタに付加のために導入
され得る。付加のための官能基、例えばカルボン酸、ヒ
ドロキシル、チオ、アミノ、アルデヒド性、アミド、マ
レイミド等の活性化エチレンズ、スルホン酸等が、標識
またはレセプタに官能基が本来存在しない場合に導入さ
れ得る。接合の方法は、この分野で周知である。例えば
米国特許第3,817,837号参照。
用の標識を使用してもよい。標識は、普通には抗原に対
して共有的に結合される。しかしながら、この発明は、
抗原に結合される小分子を有する場合、および小分子に
対するレセプタ、通常は抗体に対して共有的に結合され
る標識を有する場合も意図するものである。結合は化学
反応により達成され、結果として標識の水素原子が抗体
に対する結合に置換されるか、または標識と抗原との間
の連結基を含むことになる。連結基は、任意の大きさで
あってよいが、好ましくは標識に結合される抗原に対す
るイムノグロブリンの自由な結合を許容するに必要な程
度、および標識による信号発生を許容するに必要な程度
を越えない。一般的には、連結基は結合であるか、また
は1〜100原子、通常1〜15原子からなる基であ
る。連結基は、標識またはレセプタに付加のために導入
され得る。付加のための官能基、例えばカルボン酸、ヒ
ドロキシル、チオ、アミノ、アルデヒド性、アミド、マ
レイミド等の活性化エチレンズ、スルホン酸等が、標識
またはレセプタに官能基が本来存在しない場合に導入さ
れ得る。接合の方法は、この分野で周知である。例えば
米国特許第3,817,837号参照。
【0049】抗原が小分子に結合される本発明の接合体
は、天然にレセプタが存在するか、または調製が可能で
ある小分子を含む。該小分子は、通常高度に親水性でな
いか、または高度に疎水性ではなく、また好ましくは試
料中に存在すると思われる物質に構造的に類似していな
いものである。小分子と、複数の決定部位を有する抗原
との接合体は、通常共有的に結合された少なくとも1
個、しばしば2−20個の小分子を有するであろう。標
識−抗原化学反応について上述したように、抗原に対す
る小分子の結合は、小分子の水素原子を抗原に対する結
合に置換することにより達成されてもよく、また好まし
くは、接合体における小分子に対するレセプタおよび抗
原に対するイムノグロブリンの、接合体に対する結合を
許容するために必要とされる以上に大きくはない任意の
大きさの連結基を含んでもよい。
は、天然にレセプタが存在するか、または調製が可能で
ある小分子を含む。該小分子は、通常高度に親水性でな
いか、または高度に疎水性ではなく、また好ましくは試
料中に存在すると思われる物質に構造的に類似していな
いものである。小分子と、複数の決定部位を有する抗原
との接合体は、通常共有的に結合された少なくとも1
個、しばしば2−20個の小分子を有するであろう。標
識−抗原化学反応について上述したように、抗原に対す
る小分子の結合は、小分子の水素原子を抗原に対する結
合に置換することにより達成されてもよく、また好まし
くは、接合体における小分子に対するレセプタおよび抗
原に対するイムノグロブリンの、接合体に対する結合を
許容するために必要とされる以上に大きくはない任意の
大きさの連結基を含んでもよい。
【0050】この発明における支持体は、普通にはビー
ズ、リポソーム類、細胞、ゾル等の粒状物;多孔性膜、
セルロース紙、ガラス紙、およびニトロセルロース膜等
の吸収性材料;ガラス、プラスチック、セラミクス等の
非多孔性材料であってよい。該レセプタは、これに相補
的な小分子を含む接合体の容易な結合が可能なるような
形態で、支持体の表面に共有的に、または非共有的に結
合される。レセプタの表面に対する結合は、表面をレセ
プタと共にインキュベートすることにより達成され、こ
こにおいて該表面は、ポリリジン等の多価陽イオン;カ
ルボジイミド類;シリル化剤;カルボニルジイミダゾー
ル等の2官能性交差結合剤;パーアイオデート;および
類似する活性化剤等の結合増強用試薬により、あらかじ
め処理されていてもよい。別法として、該レセプタは、
まず該支持体をレセプタに対するリガンドまたはレセプ
タに対する抗体等のレセプタに相補的な化合物が、既に
表面に結合されるように調製することにより、間接的に
支持体に結合され得る。次いで、該レセプタとこのよう
な表面とのインキュベーションは、レセプタの非共有結
合をもたらす。この結合方法が、レセプタに対するリガ
ンドが表面上に最初から存在する場合に使用される場合
には、該レセプタは普通少なくとも2個のリガンドに対
する結合部位を有するであろう。
ズ、リポソーム類、細胞、ゾル等の粒状物;多孔性膜、
セルロース紙、ガラス紙、およびニトロセルロース膜等
の吸収性材料;ガラス、プラスチック、セラミクス等の
非多孔性材料であってよい。該レセプタは、これに相補
的な小分子を含む接合体の容易な結合が可能なるような
形態で、支持体の表面に共有的に、または非共有的に結
合される。レセプタの表面に対する結合は、表面をレセ
プタと共にインキュベートすることにより達成され、こ
こにおいて該表面は、ポリリジン等の多価陽イオン;カ
ルボジイミド類;シリル化剤;カルボニルジイミダゾー
ル等の2官能性交差結合剤;パーアイオデート;および
類似する活性化剤等の結合増強用試薬により、あらかじ
め処理されていてもよい。別法として、該レセプタは、
まず該支持体をレセプタに対するリガンドまたはレセプ
タに対する抗体等のレセプタに相補的な化合物が、既に
表面に結合されるように調製することにより、間接的に
支持体に結合され得る。次いで、該レセプタとこのよう
な表面とのインキュベーションは、レセプタの非共有結
合をもたらす。この結合方法が、レセプタに対するリガ
ンドが表面上に最初から存在する場合に使用される場合
には、該レセプタは普通少なくとも2個のリガンドに対
する結合部位を有するであろう。
【0051】ここに記述される発明において、固体支持
体がビーズ担体である場合に、該ビーズは、通常非多孔
性のガラスまたはラテックスであり、通常0.2−2.
5mmの平均直径である。最も好ましくは該ビーズは、
0.5−2mmの平均直径である。該ビーズは、通常ほ
ぼ球状であって、粗または平滑面を有する。
体がビーズ担体である場合に、該ビーズは、通常非多孔
性のガラスまたはラテックスであり、通常0.2−2.
5mmの平均直径である。最も好ましくは該ビーズは、
0.5−2mmの平均直径である。該ビーズは、通常ほ
ぼ球状であって、粗または平滑面を有する。
【0052】ビーズの大きい表面積のため、背景の非特
異的結合が低くなるように表面の特性に注意をはらわね
ばならない。アビジンが、ビーズに結合されるレセプタ
として使用される場合、非特異的結合は、アヒジンをビ
ーズに結合させた後にショ糖の存在下にガラス粒子を乾
燥させることによって低減される。有用であることが見
出された糖類に加えての被覆の例は、ウシ血清アルブミ
ン(BSA)、ポリ(ビニルアルコール)、カゼインお
よび脱脂乳である。
異的結合が低くなるように表面の特性に注意をはらわね
ばならない。アビジンが、ビーズに結合されるレセプタ
として使用される場合、非特異的結合は、アヒジンをビ
ーズに結合させた後にショ糖の存在下にガラス粒子を乾
燥させることによって低減される。有用であることが見
出された糖類に加えての被覆の例は、ウシ血清アルブミ
ン(BSA)、ポリ(ビニルアルコール)、カゼインお
よび脱脂乳である。
【0053】いかなる型の固体支持体を用いる場合に
も、小分子に対して特異的に結合するレセプタがその表
面に結合されるように処理されなければならない。本発
明の好ましい実施において、該支持体には、種々の異な
ったアッセイについて使用することが許容されるリガン
ドまたはレセプタが結合される。例えば、アビジンが
0.5−1.5mmの球形ガラスビーズに共有的に結合
され得る。これらのビーズ担体は、水性媒体中におい
て、イムノグロブリンに結合可能なビオチン標識抗原、
イムノグロブリンを含む試料、およびイムノグロブリン
に結合可能な標識抗原と混合される。ビーズがビオチン
に結合し、またはビオチンが任意の抗原に結合されるた
め、同じビーズをほとんどの抗原−イムノグロブリン対
について使用し得る。標識抗原、イムノグロブリン、ビ
オチン化抗原の結合、ならびに後者のビーズへの結合を
許容するに充分なインキュベーション後、該溶液を例え
ば吸引によりビーズから分離する。次いで、洗浄溶液を
加え、液体を再度除去する。洗浄サイクルの反復後、標
識が検出され、標識の量が、試料中のIg量に関連付け
られる。例えば、標識が酵素である場合に、基質が添加
され、適当なインキュベーション時間後、酵素生成物の
量が光分析的に測定され、Igの既知量を含む試料を用
いて与えられる生成物の量と比較される。
も、小分子に対して特異的に結合するレセプタがその表
面に結合されるように処理されなければならない。本発
明の好ましい実施において、該支持体には、種々の異な
ったアッセイについて使用することが許容されるリガン
ドまたはレセプタが結合される。例えば、アビジンが
0.5−1.5mmの球形ガラスビーズに共有的に結合
され得る。これらのビーズ担体は、水性媒体中におい
て、イムノグロブリンに結合可能なビオチン標識抗原、
イムノグロブリンを含む試料、およびイムノグロブリン
に結合可能な標識抗原と混合される。ビーズがビオチン
に結合し、またはビオチンが任意の抗原に結合されるた
め、同じビーズをほとんどの抗原−イムノグロブリン対
について使用し得る。標識抗原、イムノグロブリン、ビ
オチン化抗原の結合、ならびに後者のビーズへの結合を
許容するに充分なインキュベーション後、該溶液を例え
ば吸引によりビーズから分離する。次いで、洗浄溶液を
加え、液体を再度除去する。洗浄サイクルの反復後、標
識が検出され、標識の量が、試料中のIg量に関連付け
られる。例えば、標識が酵素である場合に、基質が添加
され、適当なインキュベーション時間後、酵素生成物の
量が光分析的に測定され、Igの既知量を含む試料を用
いて与えられる生成物の量と比較される。
【0054】本発明の実施において、液体、通常は水性
媒体が使用される。他の極性溶媒も使用することがで
き、通常1〜6個、より一般的には1〜4個の炭素原子
の酸素化有機溶媒であってアルコール類、エーテル類を
含む。一般に、これらの共溶媒は、約40重量%未満、
更に一般的には約20重量%未満で存在する。一般に、
5−10のpH範囲、更に普通には、6−9の範囲が使
用される。アッセイpHに関する一考察は、信号発生の
至適化において、有意な結合水準を維持することであ
る。ある場合には、これらの考慮の間で妥協もなされる
であろう。所望のpHを達成し、測定の間pHを維持す
るために、種々の緩衝溶液が使用され得る。例示的な緩
衝溶液は、ホウ酸、リン酸、炭酸、トリス、バルビター
ル等を含む。使用される特定の緩衝溶液は、本発明に対
して臨界的なものではないが、個々の分離、または個々
のアッセイにおいては、ある緩衝溶液が、他のものより
好ましいことはあり得る。
媒体が使用される。他の極性溶媒も使用することがで
き、通常1〜6個、より一般的には1〜4個の炭素原子
の酸素化有機溶媒であってアルコール類、エーテル類を
含む。一般に、これらの共溶媒は、約40重量%未満、
更に一般的には約20重量%未満で存在する。一般に、
5−10のpH範囲、更に普通には、6−9の範囲が使
用される。アッセイpHに関する一考察は、信号発生の
至適化において、有意な結合水準を維持することであ
る。ある場合には、これらの考慮の間で妥協もなされる
であろう。所望のpHを達成し、測定の間pHを維持す
るために、種々の緩衝溶液が使用され得る。例示的な緩
衝溶液は、ホウ酸、リン酸、炭酸、トリス、バルビター
ル等を含む。使用される特定の緩衝溶液は、本発明に対
して臨界的なものではないが、個々の分離、または個々
のアッセイにおいては、ある緩衝溶液が、他のものより
好ましいことはあり得る。
【0055】中程度の、通常は一定の温度が、アッセイ
実施のために一般に使用される。該アッセイ、特にイム
ノアッセイに関しては、温度は一般に約0〜50℃、更
に一般的には15〜40℃の範囲である。
実施のために一般に使用される。該アッセイ、特にイム
ノアッセイに関しては、温度は一般に約0〜50℃、更
に一般的には15〜40℃の範囲である。
【0056】種々の試薬濃度は、一般には液体媒体中の
抗原の濃度範囲、またはアッセイにおけるイムノグロブ
リンの濃度範囲により決定されるが、各試薬の最終濃度
は、普通には興味ある範囲において分離またはアッセイ
の感度および特異性を至適化するように経験的に決定さ
れる。
抗原の濃度範囲、またはアッセイにおけるイムノグロブ
リンの濃度範囲により決定されるが、各試薬の最終濃度
は、普通には興味ある範囲において分離またはアッセイ
の感度および特異性を至適化するように経験的に決定さ
れる。
【0057】本発明のイムノアッセイにおいて、水性媒
体は1種以上の信号発生手段の構成体を含むこともでき
る。該信号発生手段の種々の構成体の濃度は、イムノグ
ロブリンの興味ある濃度範囲、および関与する測定また
はアッセイの型式に依存し、またそれによって変化す
る。一般的な点として、信号発生手段の種々の構成体の
濃度は、イムノグロブリンの興味ある濃度範囲にてアッ
セイの感度を至適化するように選択されるであろう。
体は1種以上の信号発生手段の構成体を含むこともでき
る。該信号発生手段の種々の構成体の濃度は、イムノグ
ロブリンの興味ある濃度範囲、および関与する測定また
はアッセイの型式に依存し、またそれによって変化す
る。一般的な点として、信号発生手段の種々の構成体の
濃度は、イムノグロブリンの興味ある濃度範囲にてアッ
セイの感度を至適化するように選択されるであろう。
【0058】アッセイ結果を測定するために、標識され
た固相反応生成物、例えば: 標識−Ag2:IgG:Ag1−X:Y−支持体 は、好ましくは過剰量存在して未反応となる遊離の試薬
類を含む水性媒体から分離される。反応生成物は、支持
体により不溶化された固相であるため、それは、沈降、
または遠心分離、あるいはこの分野で確立された他の方
法により容易に分離され得る。
た固相反応生成物、例えば: 標識−Ag2:IgG:Ag1−X:Y−支持体 は、好ましくは過剰量存在して未反応となる遊離の試薬
類を含む水性媒体から分離される。反応生成物は、支持
体により不溶化された固相であるため、それは、沈降、
または遠心分離、あるいはこの分野で確立された他の方
法により容易に分離され得る。
【0059】便宜的に、アッセイを行なうための試薬類
は、イムノグロブリン(Ig)アッセイに使用するため
にあらかじめ定めた量をもって包装された組合せのキッ
トとして供給することができる。該キットは、(a)小
分子とIgに結合可能な第1の抗原との接合体、(b)
標識とIgに結合可能な第2の抗原との接合体、および
(c)該小分子に対するレセプタが結合された表面を有
する支持体を含んでなる。該キットは、試料中のIgの
量に関連して信号を生成するための他の試薬類、例え
ば、標識のための基質を含むこともできる。付随的な試
薬を必要に応じて含むこともできる。
は、イムノグロブリン(Ig)アッセイに使用するため
にあらかじめ定めた量をもって包装された組合せのキッ
トとして供給することができる。該キットは、(a)小
分子とIgに結合可能な第1の抗原との接合体、(b)
標識とIgに結合可能な第2の抗原との接合体、および
(c)該小分子に対するレセプタが結合された表面を有
する支持体を含んでなる。該キットは、試料中のIgの
量に関連して信号を生成するための他の試薬類、例え
ば、標識のための基質を含むこともできる。付随的な試
薬を必要に応じて含むこともできる。
【0060】本発明の方法の使用は、イムノグロブリン
に対する任意の異種的結合アッセイに適用可能である。
特定のアッセイは、例えばB型肝炎表面抗原に対するI
gG抗体のアッセイを含む。このような任意の系におい
て、該イムノグロブリンに結合可能なビオチン化抗原が
使用される。アビジン(ストレプトアビジンを含む)以
外のレセプタ類、例えば抗体類、蛋白質A、内部因子、
蛋白質G、C1q、レクチン類、アポ酵素等をビーズに
固定してもよく、その場合、抗原に接合するそれぞれに
相補的な小分子が使用される。
に対する任意の異種的結合アッセイに適用可能である。
特定のアッセイは、例えばB型肝炎表面抗原に対するI
gG抗体のアッセイを含む。このような任意の系におい
て、該イムノグロブリンに結合可能なビオチン化抗原が
使用される。アビジン(ストレプトアビジンを含む)以
外のレセプタ類、例えば抗体類、蛋白質A、内部因子、
蛋白質G、C1q、レクチン類、アポ酵素等をビーズに
固定してもよく、その場合、抗原に接合するそれぞれに
相補的な小分子が使用される。
【0061】本発明のある種の好ましい実施態様は、標
準的なELISA化学に対して以下のような有意な利点
を有する: 1)レセプタ結合支持体が、すべてのアッ
セイに共通である; 2)液相でのイムノグロブリンに
対する抗原の結合は、固体表面に固定化された抗原につ
いて達成されるものと比べて極めて速い動力学が得られ
る; 3)別個のインキュベーションおよび別個の洗浄
の必要性をなくしたことで、最少の操作工程をもった効
率的なアッセイが提供される。ビオチンまたはフルオレ
セイン等の小分子を抗原またはレセプタと連結するため
の化学は、単純かつ効率的である(例えば、D.M.B
oorsmaのImmunocytochemistr
y 2:155(1983)参照)。該小分子接合体の
安定性は、接合体に使用される抗体と同程度に良好であ
ろう。
準的なELISA化学に対して以下のような有意な利点
を有する: 1)レセプタ結合支持体が、すべてのアッ
セイに共通である; 2)液相でのイムノグロブリンに
対する抗原の結合は、固体表面に固定化された抗原につ
いて達成されるものと比べて極めて速い動力学が得られ
る; 3)別個のインキュベーションおよび別個の洗浄
の必要性をなくしたことで、最少の操作工程をもった効
率的なアッセイが提供される。ビオチンまたはフルオレ
セイン等の小分子を抗原またはレセプタと連結するため
の化学は、単純かつ効率的である(例えば、D.M.B
oorsmaのImmunocytochemistr
y 2:155(1983)参照)。該小分子接合体の
安定性は、接合体に使用される抗体と同程度に良好であ
ろう。
【0062】例 以下の例は、例示的なものであって、本発明を限定する
ものではない。別途示さない限り、試薬類は商業的な供
給元から入手され、適用可能な場合には製造者の指示書
に従って使用した。
ものではない。別途示さない限り、試薬類は商業的な供
給元から入手され、適用可能な場合には製造者の指示書
に従って使用した。
【0063】以下の略号をこの例を通して使用する。 抗−F 抗−フルオレセイン抗体 抗−HBsAg 抗−B型肝炎表面抗原抗体 BSA ウシ血清アルブミン DMF ジメチルホルムアミド DMSO ジメチルスルホキシド EDAC 1−エチル−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボ ジイミド EDTA エチレンジアミンテトラ酢酸、4ナトリウム塩 F フルオレセイン GB ガラスビーズ HBsAg B型肝炎表面抗原 IgG イムノグロブリンG HRP 西洋ワサビパーオキシダーゼ LC 3,3′−ジアミノ−N−メチルジプロピルアミンM ES 2−〔N−モルホリノ〕エタンスルホン酸 NHS N−ヒドロキシスクシンイミド NHS−LC−ビオチン スクシンイミジル6−(ビオチンアミド)ヘキサノエ ート PBS リン酸緩衝食塩水 SAMSA S−アセチルメルカプトスクシン酸 SMCC スクシンイミジル4−(N−マレイミドメチルシクロ ヘキサン 1−カルボキシレート TBM 3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン−2塩 酸
【0064】例1 B型肝炎表面抗原に対するイムノグロブリンG検出のた
めの不均一酵素ベースイムノアッセイ 材料の調製 A.ビオチン−HBsAgの調製 出発材料であるHBsAgは、Scantibodie
s Lab.Inc.(Santee,CA)から98
%純度のものを購入した。反応に先立って、1.0mg
/mlのHBsAgを、pH8.2のNaHCO3緩衝
溶液に対し、4℃にて一夜透析した。NHS−LC−ビ
オチンをDMSO中に15mMで溶解させ、HBsAg
(約1.0mg/ml)中に攪拌しつつ滴々加えた。次
いでこの混合物を室温にて1.5時間インキュベートし
た。非結合ビオチン化試薬を、SEPHADEX(登録
商標)G−25カラム(アルカリ条件下にてエピクロロ
ヒドリンを用いて交差結合により調製したビーズ化ゲ
ル)によるか、あるいはpH7.5のPBSに透析する
ことにより除去した。NHS−LC−ビオチンに対する
HBsAgのモル比は、1:5であった。計算に使用し
たHBsAgの分子量は、25,000ダルトンで、こ
れは該抗原の主要ポリペプチドのひとつの分子量であ
る。該接合体を、4℃にて保存した。
めの不均一酵素ベースイムノアッセイ 材料の調製 A.ビオチン−HBsAgの調製 出発材料であるHBsAgは、Scantibodie
s Lab.Inc.(Santee,CA)から98
%純度のものを購入した。反応に先立って、1.0mg
/mlのHBsAgを、pH8.2のNaHCO3緩衝
溶液に対し、4℃にて一夜透析した。NHS−LC−ビ
オチンをDMSO中に15mMで溶解させ、HBsAg
(約1.0mg/ml)中に攪拌しつつ滴々加えた。次
いでこの混合物を室温にて1.5時間インキュベートし
た。非結合ビオチン化試薬を、SEPHADEX(登録
商標)G−25カラム(アルカリ条件下にてエピクロロ
ヒドリンを用いて交差結合により調製したビーズ化ゲ
ル)によるか、あるいはpH7.5のPBSに透析する
ことにより除去した。NHS−LC−ビオチンに対する
HBsAgのモル比は、1:5であった。計算に使用し
たHBsAgの分子量は、25,000ダルトンで、こ
れは該抗原の主要ポリペプチドのひとつの分子量であ
る。該接合体を、4℃にて保存した。
【0065】B.HBsAg−Fの調製 HBsAg−FをSMCC/SAMSA化学を使用して
調製した。最初に、カルボキシフルオレセインをNHS
/EDAC化学を使用して活性化し、次いでオキシビス
(エチルアミン)に結合させた。得られたフルオレセイ
ン化アミンを、次いでSMCCによって処理し、F−S
MCCを得た。
調製した。最初に、カルボキシフルオレセインをNHS
/EDAC化学を使用して活性化し、次いでオキシビス
(エチルアミン)に結合させた。得られたフルオレセイ
ン化アミンを、次いでSMCCによって処理し、F−S
MCCを得た。
【0066】pH9.5の100mM炭酸緩衝溶液中の
1.0mg/mlのHBsAgを、100mMにてDM
F中に溶解させた12倍の過剰モル量のSAMSAと反
応させた。次いで、得られた誘導HBsAgを500m
MのNH2OHで脱アセチル化し、HBsAg−SHを
得た。この反応は、アルゴンを充填した反応容器中で1
時間で行なった。過剰なNH2OHを、pH7.0のP
BSに対する透析にて除去した。
1.0mg/mlのHBsAgを、100mMにてDM
F中に溶解させた12倍の過剰モル量のSAMSAと反
応させた。次いで、得られた誘導HBsAgを500m
MのNH2OHで脱アセチル化し、HBsAg−SHを
得た。この反応は、アルゴンを充填した反応容器中で1
時間で行なった。過剰なNH2OHを、pH7.0のP
BSに対する透析にて除去した。
【0067】HBsAg−SHおよびF−SMCCをモ
ル比1:10にて混合し、室温にて1時間反応させた。
反応後、該混合物をSEPHDEX G−25カラムを
通すか、あるいはpH7.5にてPBSに透析した。調
製された接合体は、暗室中で4℃にて保存した。
ル比1:10にて混合し、室温にて1時間反応させた。
反応後、該混合物をSEPHDEX G−25カラムを
通すか、あるいはpH7.5にてPBSに透析した。調
製された接合体は、暗室中で4℃にて保存した。
【0068】C.抗−F−HRPの調製 抗−F−HRP接合体を、スルホ−SMCC/SAMS
A化学を使用してチオール化抗−Fとマレイミデート化
HRPとを反応させることにより調製した。接合に先立
って、蛋白質Aカラムを用いて精製した抗−Fを、SA
MSAによりチオール化した。HRPを、スルホ−SM
CCによりマレイミデート化した。
A化学を使用してチオール化抗−Fとマレイミデート化
HRPとを反応させることにより調製した。接合に先立
って、蛋白質Aカラムを用いて精製した抗−Fを、SA
MSAによりチオール化した。HRPを、スルホ−SM
CCによりマレイミデート化した。
【0069】pH7.6の50mMホウ酸緩衝溶液中の
9.6mg/mlのHRPを、10倍過剰量のスルホ−
SMCCと反応させた。該反応を25℃にて2時間進行
させた。反応後、該混合物をSEPHADEX G−2
5カラムに通し、5mMのEDTAを含むリン酸緩衝溶
液(100mM NaH2 PO4および100mMN
aCl、pH7.5)に対して透析した。
9.6mg/mlのHRPを、10倍過剰量のスルホ−
SMCCと反応させた。該反応を25℃にて2時間進行
させた。反応後、該混合物をSEPHADEX G−2
5カラムに通し、5mMのEDTAを含むリン酸緩衝溶
液(100mM NaH2 PO4および100mMN
aCl、pH7.5)に対して透析した。
【0070】pH9.5の50mM重炭酸緩衝溶液中の
17.9mg/mlの抗−Fを、100mMDMFに溶
解した20倍過剰量のSAMSAと反応させた。SAM
SAの添加を攪拌しつつ滴々行ない、4℃にて1.5時
間反応させた。過剰量の試薬は、SEPHADEX G
−25カラムおよびpH7.5のリン酸緩衝溶液に対す
る透析により除去した。
17.9mg/mlの抗−Fを、100mMDMFに溶
解した20倍過剰量のSAMSAと反応させた。SAM
SAの添加を攪拌しつつ滴々行ない、4℃にて1.5時
間反応させた。過剰量の試薬は、SEPHADEX G
−25カラムおよびpH7.5のリン酸緩衝溶液に対す
る透析により除去した。
【0071】次いで誘導された抗−Fを、1M NH2
OHにて処理することにより脱アシル化した。リン酸緩
衝溶液中のNH2OHを攪拌しつつゆっくりと、NH2
OHの最終濃度が100mMに達するまで添加した。該
反応混合物を、窒素下で25℃にて1時間インキュベー
トした。過剰量のNH2OHを、SEPHADEXG−
25カラムにより除去した。
OHにて処理することにより脱アシル化した。リン酸緩
衝溶液中のNH2OHを攪拌しつつゆっくりと、NH2
OHの最終濃度が100mMに達するまで添加した。該
反応混合物を、窒素下で25℃にて1時間インキュベー
トした。過剰量のNH2OHを、SEPHADEXG−
25カラムにより除去した。
【0072】最終的に、得られた抗−F−SHを、12
倍過剰量のマレイミデート化HRPと反応させ、室温に
て3時間攪拌した。該反応を、2−メルカプト酢酸(最
終濃度1mM)の添加により停止させ、15分間撹拌し
た。ヨウ化酢酸を、過剰量の2−メルカプト酢酸を消去
するために加え(最終濃度2mM)、5分間反応させ
た。最終生成物を、SEPHACRYL(登録商標)S
−200カラムにより精製した。接合体濃度は、6.2
のHRPをIgGあたりに有し、1.4mg/mlであ
った。
倍過剰量のマレイミデート化HRPと反応させ、室温に
て3時間攪拌した。該反応を、2−メルカプト酢酸(最
終濃度1mM)の添加により停止させ、15分間撹拌し
た。ヨウ化酢酸を、過剰量の2−メルカプト酢酸を消去
するために加え(最終濃度2mM)、5分間反応させ
た。最終生成物を、SEPHACRYL(登録商標)S
−200カラムにより精製した。接合体濃度は、6.2
のHRPをIgGあたりに有し、1.4mg/mlであ
った。
【0073】D.GB−アビジンの調製 直径約1mmのガラスビーズ(Glen Mills,
Inc.,Maywood,NJ)を最初に5%硝酸中
で1時間沸騰させることにより洗浄し、次いで洗浄液が
中性のpHとなるまで脱イオン水により洗浄した。該ビ
ーズを、真空下で室温にて乾燥させた。
Inc.,Maywood,NJ)を最初に5%硝酸中
で1時間沸騰させることにより洗浄し、次いで洗浄液が
中性のpHとなるまで脱イオン水により洗浄した。該ビ
ーズを、真空下で室温にて乾燥させた。
【0074】1kgの酸洗浄ビーズに、300mLのエ
チルアセテート中の1mLのアミノプロピルトリエトキ
シシランを添加した。該混合物を、ロータリアスピレー
タに入れ、溶媒を除去しつつビーズをアミノシラン試薬
の薄膜で被覆した。次いで該ビーズを、ステンレスの反
応容器に移し、オーブン中窒素/アルゴン雰囲気下で1
30℃にて一夜加熱した。冷却後、該ビーズを次の工程
に直接に使用した。
チルアセテート中の1mLのアミノプロピルトリエトキ
シシランを添加した。該混合物を、ロータリアスピレー
タに入れ、溶媒を除去しつつビーズをアミノシラン試薬
の薄膜で被覆した。次いで該ビーズを、ステンレスの反
応容器に移し、オーブン中窒素/アルゴン雰囲気下で1
30℃にて一夜加熱した。冷却後、該ビーズを次の工程
に直接に使用した。
【0075】傾斜組織培養フラスコ中の500gのアミ
ン化ビーズに170mLの0.1Mホウ酸ナトリウムp
H9.0を10分間で加えた。2mLのMES中のED
ACのスクシン酸無水物(mg)の溶液を一度に加え、
5分間手動で振とうした。アスピレータにて液体を除去
し、アヒジン(20mg)およびBSA(40mg)の
20mL MES溶液を一度に加えた。該ビーズを手動
で混合し、更にMES緩衝溶液をちょうどビーズが覆わ
れるまで加えた。最後に、該培養フラスコを内容物と共
に軌道攪拌機上に4℃にて一夜設置した。
ン化ビーズに170mLの0.1Mホウ酸ナトリウムp
H9.0を10分間で加えた。2mLのMES中のED
ACのスクシン酸無水物(mg)の溶液を一度に加え、
5分間手動で振とうした。アスピレータにて液体を除去
し、アヒジン(20mg)およびBSA(40mg)の
20mL MES溶液を一度に加えた。該ビーズを手動
で混合し、更にMES緩衝溶液をちょうどビーズが覆わ
れるまで加えた。最後に、該培養フラスコを内容物と共
に軌道攪拌機上に4℃にて一夜設置した。
【0076】ビーズの更なる調製は、該ビーズの1N
NaCl(200mL×4)およびそれに続く脱イオン
水(200mL×4)による洗浄を含む。各洗浄の前後
において、液体を完全に除去した。次いで、該ビーズ
を、0.1%BSAおよび2.5%ショ糖を含むリン酸
−塩緩衝溶液(20mMリン酸,140mMNaC1,
0.02%NaN3,pH7.4)(150mL×3)
により処理した。過剰の液体を除去し、湿潤ビーズを真
空デシケータ中の容器に移した。
NaCl(200mL×4)およびそれに続く脱イオン
水(200mL×4)による洗浄を含む。各洗浄の前後
において、液体を完全に除去した。次いで、該ビーズ
を、0.1%BSAおよび2.5%ショ糖を含むリン酸
−塩緩衝溶液(20mMリン酸,140mMNaC1,
0.02%NaN3,pH7.4)(150mL×3)
により処理した。過剰の液体を除去し、湿潤ビーズを真
空デシケータ中の容器に移した。
【0077】最終的に米国標準試験用ふるい16番また
は20番を通した後、保存中、相互に固着するのを防ぐ
ために該ビーズにカゼイン粉末をまぶした。3H−ビオ
チンの結合試験は、こうして調製したビーズが2−11
mgの活性アビジンガラスビーズを取込んでいることを
示した。
は20番を通した後、保存中、相互に固着するのを防ぐ
ために該ビーズにカゼイン粉末をまぶした。3H−ビオ
チンの結合試験は、こうして調製したビーズが2−11
mgの活性アビジンガラスビーズを取込んでいることを
示した。
【0078】アッセイプロトコール 一工程抗−HBsAgアッセイは、2つの主要部からな
っている:1)すべてのアッセイ成分(GB−アビジ
ン、ビオチン−HBsAg、試料由来の抗−HBsA
g、HBsAg−Fおよび抗−F−HRP)の同時イン
キュベーション;ならびに2)色生成のための基質添
加。すべての反応は、12×75mm試験管中で行なわ
れた。
っている:1)すべてのアッセイ成分(GB−アビジ
ン、ビオチン−HBsAg、試料由来の抗−HBsA
g、HBsAg−Fおよび抗−F−HRP)の同時イン
キュベーション;ならびに2)色生成のための基質添
加。すべての反応は、12×75mm試験管中で行なわ
れた。
【0079】最初に、100mlの未知血清試料(また
は標準)、50mlのビオチン−HBsAg(50mg
/試験)、および50mlの酵素接合体混合物(200
mgのF−HBsAgおよび100mgの抗−F−HR
Pを含む)を、0.65gのGB−アビジンを入れた試
験管に加えた。この反応混合物を、37℃にて30分間
インキュベートした。
は標準)、50mlのビオチン−HBsAg(50mg
/試験)、および50mlの酵素接合体混合物(200
mgのF−HBsAgおよび100mgの抗−F−HR
Pを含む)を、0.65gのGB−アビジンを入れた試
験管に加えた。この反応混合物を、37℃にて30分間
インキュベートした。
【0080】第2に、非結合試薬を、1mlの10mM
リン酸緩衝溶液、pH7.4によって4回洗浄して除去
した。洗浄後、250mlのHRP基質(TMB/尿素
H2O2)を加えて37℃にて5分間で発色させた。最
後に、基質展開反応を、750mlの1N H2SO4
の添加により停止させた。光学密度を450nMにて測
定した。
リン酸緩衝溶液、pH7.4によって4回洗浄して除去
した。洗浄後、250mlのHRP基質(TMB/尿素
H2O2)を加えて37℃にて5分間で発色させた。最
後に、基質展開反応を、750mlの1N H2SO4
の添加により停止させた。光学密度を450nMにて測
定した。
【0081】結果 正(800mIU/ml)および負の抗−HBsAg血
清対照を一工程プロトコールにより走らせた。結果は次
のとおりである:対照 OD450nMにおける信号 正 2.31 負 1.03 従って、非特異的信号に対する特異信号の比は1.2
(1.28/1.03)であった。更に、接合体の負
荷、および接合体HBsAg−Fおよび抗−F−HRP
の直接接合体HBsAg−HRPによる置換を含むプロ
トコールの最適化は、非特異的な信号を低減してアッセ
イ遂行性を改善するであろう。
清対照を一工程プロトコールにより走らせた。結果は次
のとおりである:対照 OD450nMにおける信号 正 2.31 負 1.03 従って、非特異的信号に対する特異信号の比は1.2
(1.28/1.03)であった。更に、接合体の負
荷、および接合体HBsAg−Fおよび抗−F−HRP
の直接接合体HBsAg−HRPによる置換を含むプロ
トコールの最適化は、非特異的な信号を低減してアッセ
イ遂行性を改善するであろう。
【0082】上記の議論は、本発明に関連する機構につ
いて、ある種の理論を含んでいる。本発明が上記の結果
を達成することが例示されたのであるから、これらの理
論は、いかなる方法によっても本発明を限定するものと
解釈されるべきでない。本発明は、上記実施態様を特に
参照して詳細に記述された。しかしながら、変更および
修飾を、本発明の精神および範囲内で行ない得ることが
理解されるであろう。
いて、ある種の理論を含んでいる。本発明が上記の結果
を達成することが例示されたのであるから、これらの理
論は、いかなる方法によっても本発明を限定するものと
解釈されるべきでない。本発明は、上記実施態様を特に
参照して詳細に記述された。しかしながら、変更および
修飾を、本発明の精神および範囲内で行ない得ることが
理解されるであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リタイ ウエング アメリカ合衆国カリフオルニア州パロ ア ルト,エヌ.カリフオルニア アベニユー 995 (72)発明者 サエ エイチ.チヨー アメリカ合衆国カリフオルニア州クパーチ ノ,メリツト ドライブ 20043
Claims (14)
- 【請求項1】 特定のイムノグロブリンのイムノアッセ
イに際し、 (a) 水性媒体中に(i)イムノグロブリンを含有す
ると考えられる試料、(ii)前記イムノグロブリンに
結合可能な第1の抗原に結合される小分子、(iii)
前記イムノグロブリンに結合可能な第2の抗原に結合さ
れる信号発生手段、および(iV)前記小分子に対する
レセプタが結合される支持体を組合せとして供給し; (b) 前記組合せをインキュベートし; (c) 前記媒体と前記支持体とを分離し;ならびに、 (d) 前記媒体または前記支持体について、信号の存
在または量を測定し、その存在または量が前記試料中の
前記イムノグロブリンの存在または量に関連する工程を
含んでなるイムノアッセイの実施方法。 - 【請求項2】 前記イムノグロブリンが疾患状態の原因
物質に向けられたものである請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記イムノグロブリンがIgG抗体であ
る請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 前記第1および第2の抗原が、B型肝炎
表面抗原である請求項1に記載の方法。 - 【請求項5】 前記信号発生手段が、酵素類、螢光物
質、化学発光物質および金属粒子からなる群から選択さ
れる標識であり、好ましくは前記標識は、パーオキシダ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホ
スファターゼおよびQ−ベータ−レプリカーゼからなる
群から選択される酵素である請求項1に記載の方法 - 【請求項6】 前記信号発生手段が、前記第2の抗原に
結合される第2の小分子、ならびに酵素類、螢光物質、
化学発光物質および金属粒子からなる群から選択される
標識に結合される第2の小分子に対するレセプタを含ん
でなり、好ましくは、前記分子はフルオレセイン誘導体
であり、前記レセプタは抗体であり、前記標識は、パー
オキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびQ−ベー
タ−レプリカーゼからなる群から選択される酵素である
請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】 前記小分子がビオチンであり、前記小分
子に対するレセプタが、アビジンおよびストレプトアピ
ジンからなる群から選択される請求項1に記載の方法。 - 【請求項8】 前記支持体が、ガラスビーズである請求
項1に記載の方法。 - 【請求項9】 IgG−型イムノグロブリンのイムノア
ッセイに際し、 (a) アッセイ媒体中に、(i)IgGを含むと考え
られる試料、(ii)前記IgGに結合可能なビオチン
化された第1の抗原、(iii)前記IgGに結合可能
な第2の抗原に結合された信号発生手段、および(i
V)支持体に結合されたビオチンに対するレセプタを供
給し; (b) 前記媒体をインキュベートし; (c) 前記媒体と前記支持体とを分離し;ならびに、 (d) 前記媒体または支持体について信号の存在また
は量の測定を行ない、該存在または量が、前記試料中の
IgGの存在または量に関連する工程を含んでなるイム
ノアッセイの実施方法。 - 【請求項10】 試料中のIgGの量に直接関連して、
複合体、 標識−Ag2:IgG:Ag1−X:Y−支持体 式中、Ag1−Xは、前記IgGに結合可能な第1のB
型肝炎表面抗原(Ag1)に結合された小分子(X)で
あり;標識−Ag2は、前記IgGに結合可能な第2の
B型肝炎表面抗原(Ag2)に結合された標識であり;
およびY−支持体は、支持体に結合された前記小分子に
対するレセプタである、を形成する工程を含んでなる試
料中に存在すると考えられるIgG−型イムノグロブリ
ン検出のためのアッセイ。 - 【請求項11】 イムノグロブリンに結合されたビオチ
ン化第1抗原と前記イムノグロブリンに結合された標識
第2抗原との接合体からなる物質の組成物。 - 【請求項12】 前記ビオチン化抗原が、更にビオチン
に対するレセプタを保持する支持体に結合され、前記レ
セプタが、アビジンおよびストレプトアビジンからなる
群から選択される請求項11に記載の組成物。 - 【請求項13】 物質: 標識−Ag2:IgG:Ag1−X:Y−支持体 式中、IgGは、IgG−型イムノグロブリンであり;
Ag1−Xは、IgGに結合可能な第1のB型肝炎表面
抗原に結合された小分子(X)であり;標識−Ag
2は、IgGに結合可能な第2のB型肝炎表面抗原に結
合された標識であり;およびY−支持体は、支持体に結
合された小分子である、を有してなる組成物。 - 【請求項14】 包装体の形態において、(a)小分子
とイムノグロブリンに結合可能な第1の抗原との接合
体;(b)標識と前記イムノグロブリンに結合可能な第
2の抗原との接合体;ならびに(c)前記小分子に対す
るレセプタが結合された表面を有してなる支持体を含ん
でなるイムノグロブリンのイムノアッセイ実施のための
キット。
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US679720 | 1991-04-03 |
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JP (1) | JPH05133952A (ja) |
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JP2021517641A (ja) * | 2018-03-13 | 2021-07-26 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 免疫アッセイにおける干渉の低減 |
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-
1992
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- 1992-04-02 EP EP19920302912 patent/EP0507586A3/en not_active Withdrawn
- 1992-04-02 CA CA 2064953 patent/CA2064953A1/en not_active Abandoned
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EP0507586A2 (en) | 1992-10-07 |
CA2064953A1 (en) | 1992-10-04 |
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