JPH05133952A

JPH05133952A - イムノグロブリン類のイムノアツセイ

Info

Publication number: JPH05133952A
Application number: JP12532892A
Authority: JP
Inventors: John J Rejman; ジエイ．レジマンジヨン; Litai Weng; ウエングリタイ; Sae H Choo; エイチ．チヨーサエ
Original assignee: Syntex USA LLC
Current assignee: Syntex USA LLC
Priority date: 1991-04-03
Filing date: 1992-04-02
Publication date: 1993-05-28
Also published as: EP0507586A3; EP0507586A2; CA2064953A1

Abstract

(57)【要約】【目的】イムノグロブリンのイムノアッセイ方法およ
び試薬を提供する。【構成】該方法において、イムノグロブリンを含むと
考えられる試料および興味あるイムノグロブリンの検出
に有用な試薬は、水性媒体中に一工程で合される。一方
の試薬は、該イムノグロブリンに結合可能な第１の抗原
に結合される小分子を含み、他方の試薬は、該イムノグ
ロブリンに結合可能な第２の抗原に結合される信号発生
手段を含んでなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景１．発明の分野イムノグロブリン類は、抗体として機能し、生体に対し
て外来性である分子の存在に対する応答において免疫的
に有態な生体（すなわち完全な免疫系を有する生体）の
特定の細胞（β−リンパ球）により産生される蛋白質の
類である。

【０００２】それらの化学構造および免疫系においては
たす異なった機能に基づいて、５つの分類のイムノグロ
ブリン（Ｉｇ）：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよ
びＩｇＭがある。通常はそれらの存在は感染を示すもの
であることから、イムノグロブリンの存在を同定するイ
ムノアッセイは、感染の初期診断に有用である。

【０００３】肝炎は、イムノグロブリン検出に基づくイ
ムノアッセイが有用となる感染症である。このようなア
ッセイは、純粋に診断のための道具のみならず、血液の
輸血前スクリーニングおよび可能な提供者のスクリーニ
ングのためにも有用である。Ｂ型肝炎または血清肝炎
は、世界的に発生しており、一般に共用する皮下注射針
を介して疾患の伝染が行なわれる薬剤使用者に見られ
る。Ｂ型肝炎は、通常はウイルス抗原の存在確認により
診断される。Ｂ型肝炎表面抗原、核抗原およびこれらの
抗原に向けられた抗体用のアッセイキットは、商業的に
入手可能である。表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は、発症以前
で、疾患の攻撃開始から数ヶ月まで血清中に検出可能で
あることから、ＨＢｓＡｇのアッセイが好ましい。ＨＢ
ｓＡｇは、出現する最初のウイルスマーカである。

【０００４】２．関連技術の記述米国特許第４，２９２，４０３号は、Ｉｇイムノアッセ
イに関し、ここにおいては、結合抗−Ｉｇを試料と共に
インキュベートし、次いでＩｇに結合可な抗原と共にイ
ンキュベートし、最後に標識抗−抗原断片と共にインキ
ュベートする。各インキュベーションに引続いて洗浄工
程が行なわれ、また抗体は固体担体に対して共有結合ま
たは吸着により結合される。

【０００５】米国特許第４，２７３，７５６号は、Ｉｇ
アッセイを記述しており、ここにおいては結合抗−Ｉｇ
を試験試料に接触せしめ、洗浄し、次いでＩｇに結合可
能な標識抗原と反応させる。米国特許第４，０２０，１
５１号は、Ｉｇアッセイに関するもので、ここにおいて
は、第一に試料中のＩｇに非免疫学的表面に直接吸着さ
れ、引続いて標識抗−Ｉｇと反応させる。米国特許第
４，８３７，１６７号は、高親和性モノクローナル抗−
Ｉｇを用いて多重−決定因子抗原を測定する同時サンド
イッチアッセイを記述している。

【０００６】Ｂｒａｄｌｅｙらの、Ｊｏｕｒｎａｌｏ
ｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ５
（５）：５２１−５３０（１９７７）は、ＨＡＶウイル
ス関連ＩｇＭ類イムノグロブリンを記述するもので、こ
れにおいては、ＨＡＶおよび放射標識ＩｇＧ抗−ＨＡＶ
が、ＩｇＭを含むと考えられる患者の血清により被覆さ
れた試験管に加えられる。米国特許第４，４７４，８７
８号は、肝炎抗原に対するサンドイッチ酵素イムノアッ
セイに関するもので、これにおいては試料を結合抗体と
共にインキュベートし、次いで酵素標識抗体と共にイン
キュベートする。

【０００７】米国特許第４，８１８，６８８号は、Ｂ型
肝炎核抗原（ＨＢｃＡｇ）に対する抗体のアッセイを記
述するもので、これにおいては標識抗体が、固定化ＨＢ
ｃＡｇへの結合について試料中の抗体と競合する。米国
特許第４，０９８，８７６号は、肝炎関連抗原に対する
逆サンドイッチアッセイに関するもので、試料が標識抗
体と共にインキュベートされ、引続いて固定化抗体とイ
ンキュベートされる。Ｂｕｓｓｉａｎらの、Ｃｌｉｎｉ
ｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ３４（６）：１３１５（１
９８８）は、ＨＡＶに対するＩｇＭ抗体のアッセイが記
述され、試料がビオチン化抗−ＩｇＭ、次いでストレプ
トアビジン被覆固相と共にインキュベートされ、複合体
が洗浄され、次いでＨＡＶと混合され、新たな複合体が
洗浄され、次いで標識抗−ＨＡＶと混合される。

【０００８】米国特許第４，２７１，１４０号は、二重
レセプタ複合体におけるビオチンおよびアビジンの使用
に関し、これにおいては、ビオチンおよびアビジンは非
免疫的、可逆的結合系を形成する。米国特許第４，２９
８，６８５号は、アビジン被覆固相に結合するビオチン
化抗体の使用を記述するもので、これにおいては、試料
中に存在する分析対象物が抗体との結合について非標識
分析対象物と競合する。米国特許第４，９３５，３３９
号は、一工程イムノアッセイに関し、これにおいては、
ビオチン化第１免疫的結合相手、試験試料、標識第２免
疫的結合相手および担体に結合されたビオチン−結合蛋
白質の全てが合される。

【０００９】米国特許第４，３４３，８９６号は、同一
抗原に対して生成される異なった動物種由来の２種類の
抗体を使用するアッセイを記述するもので、これにおい
ては、一方の抗体が標識され、他方の抗体が第３の抗体
により不溶化される。米国特許出願番号０７／３８９，
６５９号（ヨーロッパ特許発行番号第４１１，９４５
号、日本国特許出願番号２０６６２８／９０およびカナ
ダ特許出願番号２，０２２，５１７−３に対応）は、特
異的結合対に結合される小分子および第２の特異的結合
対に結合される第２の小分子を使用するイムノアッセイ
に関し、これにおいて、両結合対の構成体は、分析対象
物に結合可能である。該アッセイは、また、支持体に結
合される第１の小分子に対するレセプタ、および標識に
結合される第２の小分子に対するレセプタの使用も含
む。

【００１０】発明の要約特定のイムノグロブリン類に対する定性的イムノアッセ
イの実施方法が提供され、ここにおいて、下記の成分が
先行するインキュベーションなしに水性媒体中に合せら
れ、インキュベートされる。成分は、興味あるイムノグ
ロブリンを含有すると考えられる試料、該イムノグロブ
リンに結合可能な第１の抗原に結合される小分子（抗原
−小分子接合体）、該イムノグロブリンに結合可能な第
２の抗原に結合される信号発生手段（抗原−信号発生手
段接合体）、および該小分子に対するレセプタが結合さ
れる支持体である。第１および第２の抗原は、同一であ
ることができ、差異は、単に、一部の抗原が抗原−小分
子接合体において小分子に結合され、また抗原−信号発
生手段接合体において該信号発生手段に結合されること
である。次いで媒体が支持体から分離される。該媒体ま
たは支持体を、該信号発生手段の存在または量について
測定し、その存在または量が、試料中のイムノグロブリ
ンの存在または量に関連付けられる。

【００１１】本発明の他の実施態様は、ＩｇＧ−型イム
ノグロブリンのノムノアッセイの実施方法を記述するも
ので、以下の成分、すなわちＩｇＧを含むと考えられる
試料、ＩｇＧに結合可能なビオチン化第１抗体、ＩｇＧ
に結合可能な第２の抗原に結合される信号発生手段、お
よび支持体に結合されたビオチンに対するレセプタを水
性媒体に合せ、インキュベートする。次いで、該媒体を
支持体から分離する。該媒体または支持体について、該
信号発生手段の存在または量の測定を行ない、その存在
または量が、試料中のＩｇＧの存在または量に関連す
る。

【００１２】本発明の更に他の実施態様は、試料中に存
在すると考えられるＩｇＧ−型イムノグロブリン検出の
ためのアッセイを記述するもので、複合体が試料中に存
在するＩｇＧの量に直接関連して形成され、複合体は：標識−Ａｇ_２：ＩｇＧ：Ａｇ_１−Ｘ：Ｙ−支持体式中、Ａｇ_１−ＸはＩｇＧに結合可能な第１の抗原（Ａ
ｇ_１）に結合する小分子（Ｘ）であり、標識−Ａｇ_２は
ＩｇＧに結合可能な第２の抗原（Ａｇ_２）に結合する標
識であり、およびＹ−支持体は、支持体に結合される小
分子に対するレセプタである、である。

【００１３】本発明の別の実施態様は、イムノグロブリ
ンに結合するビオチン化抗原、およびイムノグロブリン
に結合する標識抗原の接合体からなる物質の組成物を記
述するものである。

【００１４】本発明の更に別の実施態様は、標識−Ａｇ_２：ＩｇＧ：Ａｇ_１−Ｘ：Ｙ−支持体式中、ＩｇＧはＩｇＧ−型イムノグロブリンであり、Ａ
ｇ_１−ＸはＩｇＧに結合可能な第１の抗原（Ａｇ_１）に
結合する小分子（Ｘ）であり、標識−Ａｇ_２はＩｇＧに
結合可能な第２の抗原（Ａｇ_２）に結合する標識であ
り、ならびにＹ−支持体は、支持体に結合された小分子
である、である物質の組成物を記述する。

【００１５】本発明の他の実施態様において、イムノグ
ロブリンのイムノアッセイ実施のためのキットが記述さ
れ、これは包装形態において、小分子とイムノグロブリ
ンに結合可能な第１の抗体との接合体、および標識とイ
ムノグロブリンに結合可能な第２の抗原との接合体、な
らびに小分子に対するレセプタが結合される表面を有す
る支持体を含んでなる。

【００１６】発明の詳細な記述本発明は、特定のイムノグロブリン（Ｉｇ）、好ましく
はＩｇＧ類、特にはＢ型肝炎表面抗原に対するＩｇＧ
（ＨＢｓＡｇ）の一工程同時イムノアッセイを提供す
る。複合体は、Ｉｇ分析対象物、抗原−小分子接合体お
よび抗原−信号発生手段接合体の間に形成される。該小
分子は、支持体に結合される小分子に対するレセプタに
よって、該複合体を不溶化することができる。すべての
試薬がいっしょに混合され、次いでインキュベートされ
る。この単一のインキュベーションは、洗浄工程に引継
がれ、次いで信号発生手段の残る構成分の添加が行なわ
れる。

【００１７】本発明には、いくつかの優位点がある。一
つの優位点は、従来技術においては通常に見られる多く
のインキュベーションおよび洗浄工程の削減である。こ
れらの工程のいくつかの削除は、労力がより少なくてす
むアッセイ様式を提供する。ある例においては、この発
明は若干多くの試薬類を使用することもあるが、このこ
とは省力の利点のためにより重要である。他の優位点
は、数工程のインキュベーションおよび洗浄の必要性を
削除することによるもので、本発明はより短時間のアッ
セイを提供する。驚くべきことに、この分野のアッセイ
技術で見られる多くのインキュベーションおよび洗浄工
程の削減によって、分析対象物の検出を可能とする適切
な信号が得られ、かつ分析対象物への結合における第１
および第２の抗原間に起こる干渉が最小になった。本発
明の特定の実施態様の記述に進む前に、多くの用語を定
義しておく。

【００１８】「イムノグロブリン」は、試料中の測定さ
れるべき化合物であって、興味ある物質、すなわち分析
対象物である。試料は、好ましくは血清または血漿であ
る。該イムノグロブリン（Ｉｇ）は、疾患状態の原因物
質に対して向けられたものであってよい。イムノグロブ
リンは、一般に約１６０，０００から約１０^６まで変化
する分子量を有するＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧお
よびＩｇＧ等の分類特異的なものであってよい。ここに
おいて使用されているように、「イムノグロブリン」は
分析対象物をさし、また「抗体」は試薬を示す際に使用
される。「抗原」は、興味あるイムノグロブリンに結合
可能な任意の化合物を意味し、また抗体が生成される化
合物を意味している。例えば、抗体は、Ｂ型肝炎表面抗
原であり得る。

【００１９】「リガンド」は、それに対してレセプタが
天然に存在するか、または調製され得る任意の有機化合
物を意味する。「レセプタ」は、分子の特定の空間的ま
たは極性機構、例えばエピトープ性または決定因子部位
を認識可能な任意の化合物または組成物を意味する。例
示的なレセプタは、チロキシン結合性グロブリン、抗体
類、酵素類、Ｆａｂ断片、レクチン類、蛋白質Ａ、Ｃ_１
ｑの相補成分、アビジン、ストレプトアビジン等の天然
に生じるレセプタ類を含む。好ましくは、小分子がビオ
チンである場合には、ビオチンに対するレセプタはアヒ
ジンまたはストレプトアビジンであってよい。

【００２０】「支持体」は、任意の非多孔性または多孔
性表面を意味する。典型的な支持体表面は、ガラスまた
はプラスチックビーズ、ラテックスまたはセルロース粒
子、ガラスまたはセルロースろ紙、ニトロセルロース
膜、ポリスチレンプレート、磁性粒子、プラスチック試
験管または容器等を含む。支持体は、レセプタが非拡散
的に結合され、かつ水性媒体に溶解あるいは非可逆的に
反応しない任意の都合良い材料であってよい。通常、支
持体は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアクリ
ル、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、テフロン等のプラ
スチックであるか、または鋼、ニッケル、銅、金または
二酸化クロム等の金属性、あるいは好ましくは石英、ガ
ラス等を含むセラミクスである。支持体がビーズ担体で
ある場合には、該ビーズは、ほぼ均質な好ましくは０．
２−２．５ｍｍの大きさで定義されるものであり、粗ま
たは平滑な表面、好ましくは平滑な表面を有する。好ま
しくは該ビーズは、円形または長円形であり、通常ほぼ
球形であって非特異的結合を最小とする表面特性を有す
るものである。本発明のイムノアッセイにおいて使用さ
れているように、該支持体は、レセプタ等の物質、例え
ば抗体、アビジン、アポ酵素、リプレッサ蛋白質、内部
因子等が結合される。

【００２１】該支持体または表面への物質の結合は、通
常に文献中から入手できる周知技術によって達成でき
る。例えば、“ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＥｎｚｙｍｅ
ｓ”，ＩｃｈｉｒｏＣｈｉｂａｔａ，Ｈａｌｓｔｅｄ
Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９７８）およびＣ
ｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
４５：３０５９（１９７０）参照。表面は、薄片、棒
状、ビーズを含む粒子等、多くの形状のいずれであって
もよい。

【００２２】表面は、通常多官能性または多官能化可能
であり、あるいは特異的または非特異的な共有または非
共有的相互作用を介してレセプタを結合可能である。種
々の官能基が利用可能であり、または導入可能である。
官能基は、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ
基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基等を含
む。種々の化合物を粒子に結合する方法は周知であり、
文献中に広く例示されている。例えばＣｕａｔｒｅｃａ
ｓａｓのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５：３０５９
（１９７０）参照。連結基の結合される物質までの長さ
は、連結される物質の性質、連結される物質と粒子との
間の距離の配列のハイブリダイゼーションに対する効果
等に依存して広範囲に変化する。連結される物質は、実
質的に粒子の外部表面に結合される。

【００２３】表面として採用される粒子は、直接に、あ
るいは常法により粒子に結合される螢光性化合物または
螢光剤によって螢光性であり得る。螢光剤は、粒子に対
して溶解されるか、または共有的もしくは非共有的に結
合され、しばしば粒子を通して実質的に均一に結合され
る。螢光化ラテックス粒子は、米国特許第３，８５３，
９８７号に教示されている。

【００２４】「小分子」は、分子量１００−２０００、
好ましくは１５０−１０００を有する有機性または有機
金属性の基であり、通常レセプタまたは支持体に結合さ
れ、またそれに対してレセプタが存在するか、または調
製され得る。本発明において有用な小分子の例は、ビオ
チン、リセルグ酸、ブルシン、フルオレセイン、ビタミ
ンＢ_１２、および一般にアッセイされる試料中に高濃度
では見出されない分子の誘導体を含む。生物学的試料に
ついては、高度に毒性の分子、および薬剤以外の合成的
に誘導された分子がしばしば好ましい。

【００２５】「信号発生手段」は、試料中のイムノグロ
ブリンの存在または量に関連して信号を発生する少なく
とも一成分が標識される一以上の成分を意味する。該信
号発生手段は、測定可能な信号を生成するために必要な
すべての試薬を含む。該標識は、同位体または非同位体
であってよく、通常は、酵素等の触媒、螢光剤、染料ま
たは化学発光剤、金属性粒子等を含む非同位体性のもの
である。該標識は、抗原に対するレセプタに直接に接合
され得、あるいは、該標識は、小分子に対するレセプタ
に接合され得、ここにおいて該小分子は抗原に対するレ
セプタに結合される。信号発生手段の成分は、化学発光
剤、放射活性物質、補酵素、酵素生成物と反応する物
質、酵素、および触媒、固体粒子、螢光剤、色素、金粒
子等であってもよい。信号発生手段は、外的手段、好ま
しくは粒子の凝集度の測定または電磁輻射の使用、望ま
しくは視覚的試験により検出可能な信号を供給する。多
くの場合において、信号発生手段は、発色性物質および
酵素を含み、発色性物質が酵素的に変換されて紫外また
は可視領域で光を吸収する染料となるか、あるいは、リ
ン光性物質、螢光性物質または化学発光性物質、放射性
原子、電気的活性基等を含む。

【００２６】本発明による方法において、イムノグロブ
リンを含むと考えられるアッセイ媒体は、該イムノグロ
ブリンに結合可能な第１の抗原に結合する小分子、該イ
ムノグロブリンに結合可能な第２の抗原に結合する信号
発生手段、および前記小分子に対するレセプタが結合さ
れる支持体を含んでもよい。信号発生手段は、好ましく
は酵素、螢光物質、化学発光物質および金属性粒子から
なる群から選択される標識であり、最も好ましくは、前
記標識はパーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウ
レアーゼ、アルカリホスファターゼおよびＱ−ベータ−
レプリカーゼからなる群から選択される酵素であり；ま
た該信号発生手段は、前記第２の抗原に結合される第２
の小分子、ならびに酵素、螢光物質、化学発光物質およ
び金属性粒子からなる群から選択される標識に結合され
る前記第２の小分子に対するレセプタを含んでもよく、
好ましくは、前記分子がフルオレセイン誘導体であり、
前記レセプタが抗体であり、また前記酵素がパーオキシ
ダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリ
フォスファターゼおよびＱ−ベータ−レプリカーゼから
なる群から選択される酵素である。

【請求項２７】また、本発明によるＩｇＧ−型イムノグ
ロブリンに対するイムノアッセイ方法においては、前記
ＩｇＧに結合可能なビオチン化された第１の抗体、前記
ＩｇＧに結合可能な第２の抗原に結合される信号発生手
段、および支持体に結合されたビオチンに対するレセプ
タを含んでなり、該信号発生手段は、酵素、螢光物質、
化学発光物質、および金属性粒子からなる群から選択さ
れる標識であってよく、好ましくは前記標識は、パーオ
キシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アル
カリホスファターゼおよびＱ−ベータ−レプリカーゼか
らなる群から選択される酵素であり；該信号発生手段
は、第２の抗原に結合される第２の小分子、ならびに酵
素、螢光物質、化学発光物質および金属性粒子からなる
群から選択される標識に結合される第２の小分子に対す
るレセプタを含んでもよく、好ましくは、前記分子がフ
ルオレセイン誘導体であり、前記レセプタが抗体であ
り、また前記酵素がパーオキシダーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、ウレアーゼ、アルカリフォスファターゼおよび
Ｑ−ベータ−レプリカーゼからなる群から選択される酵
素である。

【００２８】該信号発生手段は、少なくとも１種類の触
媒、通常は酵素、および少なくとも１種類の基質を含む
ことができ、また２種類以上の触媒および複数の基質を
含んでもよく、更に、ある酵素の基質が他の酵素の産生
物であるような酵素の組合せを含んでもよい。該信号発
生系の操作は、試料中のイムノグロブリンの量に関連し
て検出可能な信号を供給する生産物を産生するためであ
る。

【００２９】信号発生手段において有用な多くの酵素お
よび補酵素が、米国特許第４，２７５，１４９号の第１
９欄〜２３欄、米国特許第４，３１８，９８０号の第１
０欄〜１４欄、および米国特許第４，８６８，１０４号
の第７欄に示されている。多くの酵素の組合せが、米国
特許第４，２７５，１４９号第２３欄〜第２８欄に示さ
れており、その組合せは、本発明の主題において用途が
見出されるであろう。

【００３０】特に興味あるものは、過酸化水素の生成に
関与する酵素、および過酸化水素を染料前駆体の染料へ
の酸化に使用することである。特定の組合せは、例えば
グルコースおよびガラクトースオキシダーゼ等のサッカ
ライドオキシダーゼ、またはウレアーゼおよびキサンタ
ンオキシダーゼ等の複素環性オキシダーゼと組合される
過酸化水素を染料前駆体の酸化に利用する酵素、すなわ
ち西洋ワサビパーオキシダーゼ、ラクトパーオキシダー
ゼ、またはミクロパーオキシダーゼ等のパーオキシダー
ゼを含む。更なる酵素の組合せは、上述した特許参考資
料中に見出されるであろう。単一の酵素が標識として使
用される場合には、他の酵素はアルカリホスファターゼ
およびβ−ガラクトシダーゼ等のハイドロラーゼとして
の利用が見出されるであろう。別法として、ホタルルシ
フェラーゼおよび細菌性ルシフェラーゼ等のルシフェラ
ーゼが使用できる。

【００３１】用途が見出される例示的な補酵素は、ＮＡ
Ｄ〔Ｈ〕；ＮＡＤＰ〔Ｈ〕、ピリドキサルホスフェー
ト、ＦＡＤ〔Ｈ〕；ＦＭＮ〔Ｈ〕等を含み、通常周期反
応に関与する補酵素である。特に、米国特許第４，３１
８，９８０号参照。酵素反応の生成物は、通常、染料ま
たは螢光物質である。米国特許第４，２７５，１４９号
には、多くの例示的な螢光物質が示されている。該信号
発生系は、１種以上の粒子を含むことができ、これは少
なくとも約５０ｎｍ以上で約５０ミクロンを越えず、通
常は少なくとも約１００ｎｍかつ約２５ミクロン未満、
好ましくは約０．２−５ミクロンの直径を有する不溶性
の粒子である。該粒子は、有機性または無機性であり、
多孔性または非多孔性であり、好ましくは水に近似した
密度、一般的には約０．７−約１．５ｇ／ｍｌであり、
透明、半透明または不透明材料からなるものであってよ
い。

【００３２】該有機性粒子は、通常、ポリマー類、付加
または縮合ポリマーのいずれであってもよく、これはア
ッセイ媒体中に容易に分散するものである。粒子の表面
は、吸着性であるか、または直接もしくは間接にオリゴ
ヌクレオチドもしくはｓｂｐ構成物を結合するために官
能化できるものである。粒子の性質は上述されている。
興味ある螢光物質は、一般に３５０ｎｍ以上、通常４０
０ｎｍ以上、好ましくは４５０ｎｍ以上の波長の光を放
射する。望ましくは、該螢光物質は高い量子収率、大き
いストークスシフトを有し、かつ接合および使用条件下
において化学的に安定である。螢光物質との用語は、電
磁輻射または化学的活性化により光を放射する物質、な
らびに螢光性およびリン光性物質、シンチレータ類およ
び化学発光性物質を含むことを意図するものである。

【００３３】興味ある螢光物質は、ある主要な官能基を
有する種々の分類中に入れられる。これらの主要な官能
基は、１−および２−アミノナフタレン、ｐ，ｐ−ジア
ミノスチルベン類、ピレン類、四級フェナントリジン塩
類、９−アミノアクリジン類、ｐ，ｐ′−ジアミノスチ
ルベンイミン類、アントラセン類、オキサカルボキシ
アニン、メロシアニン、３−アミノエキレニン、ペリレ
ン、ビス−ベンゾキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾリル
ベンゼン、１，２−ベンゾフェナンジン、レチナール、
ビス−３−アミノピリジニウム塩類、ヘレブリゲニン、
テトラサイクリン、ステロフェノール、ベンズイミダゾ
リルフェニルアミン、２−オキソ−３−クロメン、イン
ドール、キサンテン、７−ヒドロキシクマリン、４，５
−ベンズイミダゾール類、フェノキサジン、サリシレー
ト、ストロファンチジン、ポリフィリン類、トリアリル
メタン類、フラビンおよび希土類キレート酸化物または
塩を含む。例示的螢光物質は、米国特許第４，３１８，
７０７号の７欄および８欄に列挙されている。

【００３４】加うるに、エネルギー吸収または消去性の
粒子を使用することができ、これは少なくとも約５０ｎ
ｍの直径を有する固体の不溶性粒子であり、プローブと
ポリヌクレオチド分析対象物とのハイブリダイゼーショ
ンまたは特異的結合構成体の間の特異的結合に由来する
距離の範囲内で螢光性粒子の螢光を消去可能である。該
消去性粒子は、螢光性粒子と同一であるか異なるもの
で、通常は異なる。普通にる。

【００３５】光放射を変調するために多くの型の粒子が
使用されうる。特に興味あるものは、チャコール、す
す、グラファイト、コロイド状炭素等の炭素粒子であ
る。炭素粒子以外では、金属ゾルが使用でき、特には
金、銀および白金等の貴金属のものである。他の金属誘
導粒子は、金属の硫化物、例えば鉛、銀または銅硫化
物、あるいは鉄もしくは銅酸化物等の金属酸化物であ
る。

【００３６】検出可能な信号としての別の光源は、化学
発光源である。該化学発光源は、化学反応により電子的
に励起され、次いで検出可能な信号として作用する光を
放射するか、または蛍光性受容体にエネルギを与える化
合物を含む。

【００３７】多くの種類の化合物が、種々の条件下で化
学発光性を与えることが見出されている。化合物の一分
類は、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンで
ある。最も一般的な化合物は、上記化合物の５−アミノ
類似体であるルミノールである。この分類の他の構成物
は、５−アミノ−６，７，８−トリメトキシおよびジメ
チルアミン−〔Ｃａ〕ベンズ類似体である。これらの化
合物は、アルカリ性過酸化水素、またはカルシウムハイ
ポクロライトおよび塩基を用いて発光性とされ得る。化
合物の他の分類は、２，４，５−トリフェニルイミダゾ
ール類であり、親化合物について慣用名称ロフィンを有
する。化学発光性類似体は、パラ−ジメチルアミノ−お
よびパラーメトキシ−置換体を含む。化学発光性は、オ
キサレート類、通常オキサリル、活性エステル類、例え
ばｐ−ニトロフェニルおよび過酸化物、例えば過酸化水
素を用いて塩基性条件下でも得られる。別法として、ル
シフェリン類は、ルシフェラーゼまたはルシゲニンと組
合せて使用してもよい。

【００３８】「補助物質」は、本発明のアッセイ方法に
おいて使用される種々の付加的な材料を意味する。例え
ば、緩衝剤は、普通にアッセイ媒体中に、アッセイ媒体
の安定剤およびアッセイ成分と共に存在するであろう。
これらの添加物に加え、アルブミン等の付加的な蛋白質
を含んでもよく、また界面活性剤、特には非イオン性界
面活性剤、結合増強剤、例えばポリアルケングリコール
類を含んでもよい。

【００３９】「全体的または部分的に連続的」とは、本
発明において使用される試料および種々の試薬が付随的
（同時的）でなく合される場合、１種以上が残る試薬の
１種以上と合せられて準組合せを形成することである。
各々の準組せは、次いで合せられ、本方法に付される。

【００４０】前述したように、本発明の一面は、特定の
イムノグロブリンのイムノアッセイ実施方法に関し、こ
こにおいて次の成分：イムノグロブリンを含むと考えら
れる試料、該イムノグロブリンに結合可能な第１の抗原
に結合される小分子、該イムノグロブリンに結合可能な
第２の抗原に結合される信号発生手段、および該小分子
に対するレセプタが結合される支持体が、水性アッセイ
媒体中に合せられる。該第１および第２の抗原は、同一
抗原であってもよく、差異は、ある抗原は該小分子に結
合され、またある抗原は該信号発生手段に結合されるこ
とのみである。次いで、媒体が支持体から分離される。
該媒体または支持体は、信号発生手段の存在または量に
ついて測定され、その存在または量は試料中のイムノグ
ロブリンの存在または量に関連付けられる。本発明の好
ましい実施形態において、固体支持体はビーズ担体であ
る。

【００４１】本発明のイムノアッセイにおいて使用され
る試薬は、本発明の設計において特に重要である。設計
されたように、該方法論は、多くの分析対象に対して一
般的なある種の試薬を含み、これによってイムノアッセ
イ系における自動化および試薬安定性の制御をより容易
なものとする。典型的には、本発明は、興味あるイムノ
グロブリンのアッセイにおいて以下の試薬を使用する：
（１）該イムノグロブリンに結合可能な第１の抗原に結
合される小分子、（２）該イムノグロブリンに結合可能
な第２の抗原に結合される信号発生手段、および（３）
小分子に対するレセプタが結合される支持体。同一の小
分子がすべてのアッセイにおいて使用される場合、レセ
プタに結合される支持体は、分析対象物が何であろうと
関係なく使用できる共通の試薬である。該信号発生手段
は、第２の抗原に対するレセプタに結合される第２の小
分子を、該第２の小分子に対する標識レセプタと共に有
して成ることもできる。再度、同一の第２の小分子がす
べてのアッセイに使用される場合には、該第２の小分子
に対する標識レセプタも共通試薬である。

【００４２】本発明の一実施形態において、試料中のイ
ムノグロブリンの検出に対する方法論が与えられた。こ
のアッセイの方法論は、次の試薬類を使用する：興味あ
るイムノグロブリン（Ｉｇ）を含むと考えられる試料；
Ｉｇに結合可能な第１の抗原に結合される小分子、例え
ば抗原に結合されるビオチン；Ｉｇに結合可能な第２の
抗原に結合される信号発生手段、例えば抗原に結合され
る標識；および小分子に対するレセプタ、例えばアビジ
ンが結合される支持体。別の実施態様において、該信号
発生手段は、小分子に対するレセプタに結合される標識
であり得、ここにおいて、小分子は第２の抗原に結合さ
れ、例えば、酵素標識抗−フルオレセインおよびフルオ
レセイン標識抗原である。

【００４３】固体支持体に結合されるであろう信号発生
手段の量は、試料中に存在するイムノグロブリンの量に
直接に関連するであろう。特に、Ｉｇの存在において、
信号発生手段に結合される抗原は、Ｉｇに結合するであ
ろう。一方において、小分子が結合された抗原は、Ｉｇ
に結合し、該小分子は、該小分子に対するレセプタに結
合し、これが支持体に結合される。このことは、支持体
に結合された興味ある複合体を生じる。

【００４４】試薬類および試料は、同時に、または全体
的もしくは部分的に連続して互いに、および固体支持体
と共に合される。一方法において、すべての試薬類、試
料および固体支持体はいっしょに混合される。これは、
非結合試薬を洗浄により除去した後に、一回のインキュ
ベーションに続く。ＩｇＧ−型イムノグロブリンの検出
に適用された本発明のイムノアッセイで形成される複合
体の模式的な代表例は次のとおりである：標識−Ａｇ_２：ＩｇＧ：Ａｇ_１−Ｘ：Ｙ−支持体式中、Ａｇ_１−ＸはＩｇＧに結合可能な第１の抗原（Ａ
ｇ_１）に結合される小分子（Ｘ）であり；標識−Ａｇ_２
は、ＩｇＧに結合可能な第２の抗原（Ａｇ_２）に結合さ
れた標識であり；およびＹ−支持体は、支持体に結合さ
れる小分子に対するレセブタである。好ましい実施態様
において、第１および第２の抗原は、Ｂ型肝炎表面抗原
である。Ｘは、ビオチン、Ｙはアビジンであり得る。

【００４５】本発明の一実施態様において、例えば酵素
である標識は、抗原に対して直接結合される。すると、
酵素活性の程度は、試料中のＩｇＧの濃度と相関関係を
有する。このようなアッセイの変法においては、フルオ
レセイン等の小分子が抗原に結合される。次いで、標識
が抗−フルオレセイン抗体に結合される。

【００４６】アッセイ系の設計は、共通の試薬の使用、
すなわち興味ある分析対象物が何であろうと関係なく任
意のアッセイ系において使用することを可能とする。前
述の例で明らかなように、各アッセイは、支持体に結合
される小分子に対するレセプタを使用する。

【００４７】アッセイを実施するに際して、より便利な
工程の特定の順列があり、従って採用すべき特定の順列
の選択は、アッセイの実施者の要求に依存する。一般に
は、試料、すべての試薬および支持体は、水性媒体中に
合せられ、普通には添加の順序に関係がない。典型的に
は、試料、試薬および支持体は、基本的に同時に合せら
れる。次いで、試料、試薬および支持体を含む水性媒体
は、１時間まで、あるいはそれ以上インキュベートされ
る。次いで支持体に結合されるか、または媒体中に残留
する信号発生手段の量を直接に測定するが、通常は媒体
を支持体から分離した後に測定される。

【００４８】本発明のアッセイにおいては、いずれの慣
用の標識を使用してもよい。標識は、普通には抗原に対
して共有的に結合される。しかしながら、この発明は、
抗原に結合される小分子を有する場合、および小分子に
対するレセプタ、通常は抗体に対して共有的に結合され
る標識を有する場合も意図するものである。結合は化学
反応により達成され、結果として標識の水素原子が抗体
に対する結合に置換されるか、または標識と抗原との間
の連結基を含むことになる。連結基は、任意の大きさで
あってよいが、好ましくは標識に結合される抗原に対す
るイムノグロブリンの自由な結合を許容するに必要な程
度、および標識による信号発生を許容するに必要な程度
を越えない。一般的には、連結基は結合であるか、また
は１〜１００原子、通常１〜１５原子からなる基であ
る。連結基は、標識またはレセプタに付加のために導入
され得る。付加のための官能基、例えばカルボン酸、ヒ
ドロキシル、チオ、アミノ、アルデヒド性、アミド、マ
レイミド等の活性化エチレンズ、スルホン酸等が、標識
またはレセプタに官能基が本来存在しない場合に導入さ
れ得る。接合の方法は、この分野で周知である。例えば
米国特許第３，８１７，８３７号参照。

【００４９】抗原が小分子に結合される本発明の接合体
は、天然にレセプタが存在するか、または調製が可能で
ある小分子を含む。該小分子は、通常高度に親水性でな
いか、または高度に疎水性ではなく、また好ましくは試
料中に存在すると思われる物質に構造的に類似していな
いものである。小分子と、複数の決定部位を有する抗原
との接合体は、通常共有的に結合された少なくとも１
個、しばしば２−２０個の小分子を有するであろう。標
識−抗原化学反応について上述したように、抗原に対す
る小分子の結合は、小分子の水素原子を抗原に対する結
合に置換することにより達成されてもよく、また好まし
くは、接合体における小分子に対するレセプタおよび抗
原に対するイムノグロブリンの、接合体に対する結合を
許容するために必要とされる以上に大きくはない任意の
大きさの連結基を含んでもよい。

【００５０】この発明における支持体は、普通にはビー
ズ、リポソーム類、細胞、ゾル等の粒状物；多孔性膜、
セルロース紙、ガラス紙、およびニトロセルロース膜等
の吸収性材料；ガラス、プラスチック、セラミクス等の
非多孔性材料であってよい。該レセプタは、これに相補
的な小分子を含む接合体の容易な結合が可能なるような
形態で、支持体の表面に共有的に、または非共有的に結
合される。レセプタの表面に対する結合は、表面をレセ
プタと共にインキュベートすることにより達成され、こ
こにおいて該表面は、ポリリジン等の多価陽イオン；カ
ルボジイミド類；シリル化剤；カルボニルジイミダゾー
ル等の２官能性交差結合剤；パーアイオデート；および
類似する活性化剤等の結合増強用試薬により、あらかじ
め処理されていてもよい。別法として、該レセプタは、
まず該支持体をレセプタに対するリガンドまたはレセプ
タに対する抗体等のレセプタに相補的な化合物が、既に
表面に結合されるように調製することにより、間接的に
支持体に結合され得る。次いで、該レセプタとこのよう
な表面とのインキュベーションは、レセプタの非共有結
合をもたらす。この結合方法が、レセプタに対するリガ
ンドが表面上に最初から存在する場合に使用される場合
には、該レセプタは普通少なくとも２個のリガンドに対
する結合部位を有するであろう。

【００５１】ここに記述される発明において、固体支持
体がビーズ担体である場合に、該ビーズは、通常非多孔
性のガラスまたはラテックスであり、通常０．２−２．
５ｍｍの平均直径である。最も好ましくは該ビーズは、
０．５−２ｍｍの平均直径である。該ビーズは、通常ほ
ぼ球状であって、粗または平滑面を有する。

【００５２】ビーズの大きい表面積のため、背景の非特
異的結合が低くなるように表面の特性に注意をはらわね
ばならない。アビジンが、ビーズに結合されるレセプタ
として使用される場合、非特異的結合は、アヒジンをビ
ーズに結合させた後にショ糖の存在下にガラス粒子を乾
燥させることによって低減される。有用であることが見
出された糖類に加えての被覆の例は、ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）、ポリ（ビニルアルコール）、カゼインお
よび脱脂乳である。

【００５３】いかなる型の固体支持体を用いる場合に
も、小分子に対して特異的に結合するレセプタがその表
面に結合されるように処理されなければならない。本発
明の好ましい実施において、該支持体には、種々の異な
ったアッセイについて使用することが許容されるリガン
ドまたはレセプタが結合される。例えば、アビジンが
０．５−１．５ｍｍの球形ガラスビーズに共有的に結合
され得る。これらのビーズ担体は、水性媒体中におい
て、イムノグロブリンに結合可能なビオチン標識抗原、
イムノグロブリンを含む試料、およびイムノグロブリン
に結合可能な標識抗原と混合される。ビーズがビオチン
に結合し、またはビオチンが任意の抗原に結合されるた
め、同じビーズをほとんどの抗原−イムノグロブリン対
について使用し得る。標識抗原、イムノグロブリン、ビ
オチン化抗原の結合、ならびに後者のビーズへの結合を
許容するに充分なインキュベーション後、該溶液を例え
ば吸引によりビーズから分離する。次いで、洗浄溶液を
加え、液体を再度除去する。洗浄サイクルの反復後、標
識が検出され、標識の量が、試料中のＩｇ量に関連付け
られる。例えば、標識が酵素である場合に、基質が添加
され、適当なインキュベーション時間後、酵素生成物の
量が光分析的に測定され、Ｉｇの既知量を含む試料を用
いて与えられる生成物の量と比較される。

【００５４】本発明の実施において、液体、通常は水性
媒体が使用される。他の極性溶媒も使用することがで
き、通常１〜６個、より一般的には１〜４個の炭素原子
の酸素化有機溶媒であってアルコール類、エーテル類を
含む。一般に、これらの共溶媒は、約４０重量％未満、
更に一般的には約２０重量％未満で存在する。一般に、
５−１０のｐＨ範囲、更に普通には、６−９の範囲が使
用される。アッセイｐＨに関する一考察は、信号発生の
至適化において、有意な結合水準を維持することであ
る。ある場合には、これらの考慮の間で妥協もなされる
であろう。所望のｐＨを達成し、測定の間ｐＨを維持す
るために、種々の緩衝溶液が使用され得る。例示的な緩
衝溶液は、ホウ酸、リン酸、炭酸、トリス、バルビター
ル等を含む。使用される特定の緩衝溶液は、本発明に対
して臨界的なものではないが、個々の分離、または個々
のアッセイにおいては、ある緩衝溶液が、他のものより
好ましいことはあり得る。

【００５５】中程度の、通常は一定の温度が、アッセイ
実施のために一般に使用される。該アッセイ、特にイム
ノアッセイに関しては、温度は一般に約０〜５０℃、更
に一般的には１５〜４０℃の範囲である。

【００５６】種々の試薬濃度は、一般には液体媒体中の
抗原の濃度範囲、またはアッセイにおけるイムノグロブ
リンの濃度範囲により決定されるが、各試薬の最終濃度
は、普通には興味ある範囲において分離またはアッセイ
の感度および特異性を至適化するように経験的に決定さ
れる。

【００５７】本発明のイムノアッセイにおいて、水性媒
体は１種以上の信号発生手段の構成体を含むこともでき
る。該信号発生手段の種々の構成体の濃度は、イムノグ
ロブリンの興味ある濃度範囲、および関与する測定また
はアッセイの型式に依存し、またそれによって変化す
る。一般的な点として、信号発生手段の種々の構成体の
濃度は、イムノグロブリンの興味ある濃度範囲にてアッ
セイの感度を至適化するように選択されるであろう。

【００５８】アッセイ結果を測定するために、標識され
た固相反応生成物、例えば：標識−Ａｇ_２：ＩｇＧ：Ａｇ_１−Ｘ：Ｙ−支持体は、好ましくは過剰量存在して未反応となる遊離の試薬
類を含む水性媒体から分離される。反応生成物は、支持
体により不溶化された固相であるため、それは、沈降、
または遠心分離、あるいはこの分野で確立された他の方
法により容易に分離され得る。

【００５９】便宜的に、アッセイを行なうための試薬類
は、イムノグロブリン（Ｉｇ）アッセイに使用するため
にあらかじめ定めた量をもって包装された組合せのキッ
トとして供給することができる。該キットは、（ａ）小
分子とＩｇに結合可能な第１の抗原との接合体、（ｂ）
標識とＩｇに結合可能な第２の抗原との接合体、および
（ｃ）該小分子に対するレセプタが結合された表面を有
する支持体を含んでなる。該キットは、試料中のＩｇの
量に関連して信号を生成するための他の試薬類、例え
ば、標識のための基質を含むこともできる。付随的な試
薬を必要に応じて含むこともできる。

【００６０】本発明の方法の使用は、イムノグロブリン
に対する任意の異種的結合アッセイに適用可能である。
特定のアッセイは、例えばＢ型肝炎表面抗原に対するＩ
ｇＧ抗体のアッセイを含む。このような任意の系におい
て、該イムノグロブリンに結合可能なビオチン化抗原が
使用される。アビジン（ストレプトアビジンを含む）以
外のレセプタ類、例えば抗体類、蛋白質Ａ、内部因子、
蛋白質Ｇ、Ｃ_１ｑ、レクチン類、アポ酵素等をビーズに
固定してもよく、その場合、抗原に接合するそれぞれに
相補的な小分子が使用される。

【００６１】本発明のある種の好ましい実施態様は、標
準的なＥＬＩＳＡ化学に対して以下のような有意な利点
を有する：１）レセプタ結合支持体が、すべてのアッ
セイに共通である；２）液相でのイムノグロブリンに
対する抗原の結合は、固体表面に固定化された抗原につ
いて達成されるものと比べて極めて速い動力学が得られ
る；３）別個のインキュベーションおよび別個の洗浄
の必要性をなくしたことで、最少の操作工程をもった効
率的なアッセイが提供される。ビオチンまたはフルオレ
セイン等の小分子を抗原またはレセプタと連結するため
の化学は、単純かつ効率的である（例えば、Ｄ．Ｍ．Ｂ
ｏｏｒｓｍａのＩｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ２：１５５（１９８３）参照）。該小分子接合体の
安定性は、接合体に使用される抗体と同程度に良好であ
ろう。

【実施例】

【００６２】例以下の例は、例示的なものであって、本発明を限定する
ものではない。別途示さない限り、試薬類は商業的な供
給元から入手され、適用可能な場合には製造者の指示書
に従って使用した。

【００６３】以下の略号をこの例を通して使用する。抗−Ｆ抗−フルオレセイン抗体抗−ＨＢｓＡｇ抗−Ｂ型肝炎表面抗原抗体ＢＳＡウシ血清アルブミンＤＭＦジメチルホルムアミドＤＭＳＯジメチルスルホキシドＥＤＡＣ１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＥＤＴＡエチレンジアミンテトラ酢酸、４ナトリウム塩ＦフルオレセインＧＢガラスビーズＨＢｓＡｇＢ型肝炎表面抗原ＩｇＧイムノグロブリンＧＨＲＰ西洋ワサビパーオキシダーゼＬＣ３，３′−ジアミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミンＭＥＳ２−〔Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホン酸ＮＨＳＮ−ヒドロキシスクシンイミドＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンスクシンイミジル６−（ビオチンアミド）ヘキサノエートＰＢＳリン酸緩衝食塩水ＳＡＭＳＡＳ−アセチルメルカプトスクシン酸ＳＭＣＣスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン１−カルボキシレートＴＢＭ３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン−２塩酸

【００６４】例１Ｂ型肝炎表面抗原に対するイムノグロブリンＧ検出のた
めの不均一酵素ベースイムノアッセイ材料の調製Ａ．ビオチン−ＨＢｓＡｇの調製出発材料であるＨＢｓＡｇは、Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓＬａｂ．Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔｅｅ，ＣＡ）から９８
％純度のものを購入した。反応に先立って、１．０ｍｇ
／ｍｌのＨＢｓＡｇを、ｐＨ８．２のＮａＨＣＯ_３緩衝
溶液に対し、４℃にて一夜透析した。ＮＨＳ−ＬＣ−ビ
オチンをＤＭＳＯ中に１５ｍＭで溶解させ、ＨＢｓＡｇ
（約１．０ｍｇ／ｍｌ）中に攪拌しつつ滴々加えた。次
いでこの混合物を室温にて１．５時間インキュベートし
た。非結合ビオチン化試薬を、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録
商標）Ｇ−２５カラム（アルカリ条件下にてエピクロロ
ヒドリンを用いて交差結合により調製したビーズ化ゲ
ル）によるか、あるいはｐＨ７．５のＰＢＳに透析する
ことにより除去した。ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンに対する
ＨＢｓＡｇのモル比は、１：５であった。計算に使用し
たＨＢｓＡｇの分子量は、２５，０００ダルトンで、こ
れは該抗原の主要ポリペプチドのひとつの分子量であ
る。該接合体を、４℃にて保存した。

【００６５】Ｂ．ＨＢｓＡｇ−Ｆの調製ＨＢｓＡｇ−ＦをＳＭＣＣ／ＳＡＭＳＡ化学を使用して
調製した。最初に、カルボキシフルオレセインをＮＨＳ
／ＥＤＡＣ化学を使用して活性化し、次いでオキシビス
（エチルアミン）に結合させた。得られたフルオレセイ
ン化アミンを、次いでＳＭＣＣによって処理し、Ｆ−Ｓ
ＭＣＣを得た。

【００６６】ｐＨ９．５の１００ｍＭ炭酸緩衝溶液中の
１．０ｍｇ／ｍｌのＨＢｓＡｇを、１００ｍＭにてＤＭ
Ｆ中に溶解させた１２倍の過剰モル量のＳＡＭＳＡと反
応させた。次いで、得られた誘導ＨＢｓＡｇを５００ｍ
ＭのＮＨ_２ＯＨで脱アセチル化し、ＨＢｓＡｇ−ＳＨを
得た。この反応は、アルゴンを充填した反応容器中で１
時間で行なった。過剰なＮＨ_２ＯＨを、ｐＨ７．０のＰ
ＢＳに対する透析にて除去した。

【００６７】ＨＢｓＡｇ−ＳＨおよびＦ−ＳＭＣＣをモ
ル比１：１０にて混合し、室温にて１時間反応させた。
反応後、該混合物をＳＥＰＨＤＥＸＧ−２５カラムを
通すか、あるいはｐＨ７．５にてＰＢＳに透析した。調
製された接合体は、暗室中で４℃にて保存した。

【００６８】Ｃ．抗−Ｆ−ＨＲＰの調製抗−Ｆ−ＨＲＰ接合体を、スルホ−ＳＭＣＣ／ＳＡＭＳ
Ａ化学を使用してチオール化抗−Ｆとマレイミデート化
ＨＲＰとを反応させることにより調製した。接合に先立
って、蛋白質Ａカラムを用いて精製した抗−Ｆを、ＳＡ
ＭＳＡによりチオール化した。ＨＲＰを、スルホ−ＳＭ
ＣＣによりマレイミデート化した。

【００６９】ｐＨ７．６の５０ｍＭホウ酸緩衝溶液中の
９．６ｍｇ／ｍｌのＨＲＰを、１０倍過剰量のスルホ−
ＳＭＣＣと反応させた。該反応を２５℃にて２時間進行
させた。反応後、該混合物をＳＥＰＨＡＤＥＸＧ−２
５カラムに通し、５ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝溶
液（１００ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４および１００ｍＭＮ
ａＣｌ、ｐＨ７．５）に対して透析した。

【００７０】ｐＨ９．５の５０ｍＭ重炭酸緩衝溶液中の
１７．９ｍｇ／ｍｌの抗−Ｆを、１００ｍＭＤＭＦに溶
解した２０倍過剰量のＳＡＭＳＡと反応させた。ＳＡＭ
ＳＡの添加を攪拌しつつ滴々行ない、４℃にて１．５時
間反応させた。過剰量の試薬は、ＳＥＰＨＡＤＥＸＧ
−２５カラムおよびｐＨ７．５のリン酸緩衝溶液に対す
る透析により除去した。

【００７１】次いで誘導された抗−Ｆを、１ＭＮＨ_２
ＯＨにて処理することにより脱アシル化した。リン酸緩
衝溶液中のＮＨ_２ＯＨを攪拌しつつゆっくりと、ＮＨ_２
ＯＨの最終濃度が１００ｍＭに達するまで添加した。該
反応混合物を、窒素下で２５℃にて１時間インキュベー
トした。過剰量のＮＨ_２ＯＨを、ＳＥＰＨＡＤＥＸＧ−
２５カラムにより除去した。

【００７２】最終的に、得られた抗−Ｆ−ＳＨを、１２
倍過剰量のマレイミデート化ＨＲＰと反応させ、室温に
て３時間攪拌した。該反応を、２−メルカプト酢酸（最
終濃度１ｍＭ）の添加により停止させ、１５分間撹拌し
た。ヨウ化酢酸を、過剰量の２−メルカプト酢酸を消去
するために加え（最終濃度２ｍＭ）、５分間反応させ
た。最終生成物を、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（登録商標）Ｓ
−２００カラムにより精製した。接合体濃度は、６．２
のＨＲＰをＩｇＧあたりに有し、１．４ｍｇ／ｍｌであ
った。

【００７３】Ｄ．ＧＢ−アビジンの調製直径約１ｍｍのガラスビーズ（ＧｌｅｎＭｉｌｌｓ，
Ｉｎｃ．，Ｍａｙｗｏｏｄ，ＮＪ）を最初に５％硝酸中
で１時間沸騰させることにより洗浄し、次いで洗浄液が
中性のｐＨとなるまで脱イオン水により洗浄した。該ビ
ーズを、真空下で室温にて乾燥させた。

【００７４】１ｋｇの酸洗浄ビーズに、３００ｍＬのエ
チルアセテート中の１ｍＬのアミノプロピルトリエトキ
シシランを添加した。該混合物を、ロータリアスピレー
タに入れ、溶媒を除去しつつビーズをアミノシラン試薬
の薄膜で被覆した。次いで該ビーズを、ステンレスの反
応容器に移し、オーブン中窒素／アルゴン雰囲気下で１
３０℃にて一夜加熱した。冷却後、該ビーズを次の工程
に直接に使用した。

【００７５】傾斜組織培養フラスコ中の５００ｇのアミ
ン化ビーズに１７０ｍＬの０．１Ｍホウ酸ナトリウムｐ
Ｈ９．０を１０分間で加えた。２ｍＬのＭＥＳ中のＥＤ
ＡＣのスクシン酸無水物（ｍｇ）の溶液を一度に加え、
５分間手動で振とうした。アスピレータにて液体を除去
し、アヒジン（２０ｍｇ）およびＢＳＡ（４０ｍｇ）の
２０ｍＬＭＥＳ溶液を一度に加えた。該ビーズを手動
で混合し、更にＭＥＳ緩衝溶液をちょうどビーズが覆わ
れるまで加えた。最後に、該培養フラスコを内容物と共
に軌道攪拌機上に４℃にて一夜設置した。

【００７６】ビーズの更なる調製は、該ビーズの１Ｎ
ＮａＣｌ（２００ｍＬ×４）およびそれに続く脱イオン
水（２００ｍＬ×４）による洗浄を含む。各洗浄の前後
において、液体を完全に除去した。次いで、該ビーズ
を、０．１％ＢＳＡおよび２．５％ショ糖を含むリン酸
−塩緩衝溶液（２０ｍＭリン酸，１４０ｍＭＮａＣ１，
０．０２％ＮａＮ_３，ｐＨ７．４）（１５０ｍＬ×３）
により処理した。過剰の液体を除去し、湿潤ビーズを真
空デシケータ中の容器に移した。

【００７７】最終的に米国標準試験用ふるい１６番また
は２０番を通した後、保存中、相互に固着するのを防ぐ
ために該ビーズにカゼイン粉末をまぶした。^３Ｈ−ビオ
チンの結合試験は、こうして調製したビーズが２−１１
ｍｇの活性アビジンガラスビーズを取込んでいることを
示した。

【００７８】アッセイプロトコール一工程抗−ＨＢｓＡｇアッセイは、２つの主要部からな
っている：１）すべてのアッセイ成分（ＧＢ−アビジ
ン、ビオチン−ＨＢｓＡｇ、試料由来の抗−ＨＢｓＡ
ｇ、ＨＢｓＡｇ−Ｆおよび抗−Ｆ−ＨＲＰ）の同時イン
キュベーション；ならびに２）色生成のための基質添
加。すべての反応は、１２×７５ｍｍ試験管中で行なわ
れた。

【００７９】最初に、１００ｍｌの未知血清試料（また
は標準）、５０ｍｌのビオチン−ＨＢｓＡｇ（５０ｍｇ
／試験）、および５０ｍｌの酵素接合体混合物（２００
ｍｇのＦ−ＨＢｓＡｇおよび１００ｍｇの抗−Ｆ−ＨＲ
Ｐを含む）を、０．６５ｇのＧＢ−アビジンを入れた試
験管に加えた。この反応混合物を、３７℃にて３０分間
インキュベートした。

【００８０】第２に、非結合試薬を、１ｍｌの１０ｍＭ
リン酸緩衝溶液、ｐＨ７．４によって４回洗浄して除去
した。洗浄後、２５０ｍｌのＨＲＰ基質（ＴＭＢ／尿素
Ｈ_２Ｏ_２）を加えて３７℃にて５分間で発色させた。最
後に、基質展開反応を、７５０ｍｌの１ＮＨ_２ＳＯ_４
の添加により停止させた。光学密度を４５０ｎＭにて測
定した。

【００８１】結果正（８００ｍＩＵ／ｍｌ）および負の抗−ＨＢｓＡｇ血
清対照を一工程プロトコールにより走らせた。結果は次
のとおりである：対照ＯＤ４５０ｎＭにおける信号正２．３１負１．０３従って、非特異的信号に対する特異信号の比は１．２
（１．２８／１．０３）であった。更に、接合体の負
荷、および接合体ＨＢｓＡｇ−Ｆおよび抗−Ｆ−ＨＲＰ
の直接接合体ＨＢｓＡｇ−ＨＲＰによる置換を含むプロ
トコールの最適化は、非特異的な信号を低減してアッセ
イ遂行性を改善するであろう。

【００８２】上記の議論は、本発明に関連する機構につ
いて、ある種の理論を含んでいる。本発明が上記の結果
を達成することが例示されたのであるから、これらの理
論は、いかなる方法によっても本発明を限定するものと
解釈されるべきでない。本発明は、上記実施態様を特に
参照して詳細に記述された。しかしながら、変更および
修飾を、本発明の精神および範囲内で行ない得ることが
理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者リタイウエングアメリカ合衆国カリフオルニア州パロアルト，エヌ．カリフオルニアアベニユー 995 (72)発明者サエエイチ．チヨーアメリカ合衆国カリフオルニア州クパーチノ，メリツトドライブ 20043

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】特定のイムノグロブリンのイムノアッセ
イに際し、（ａ）水性媒体中に（ｉ）イムノグロブリンを含有す
ると考えられる試料、（ｉｉ）前記イムノグロブリンに
結合可能な第１の抗原に結合される小分子、（ｉｉｉ）
前記イムノグロブリンに結合可能な第２の抗原に結合さ
れる信号発生手段、および（ｉＶ）前記小分子に対する
レセプタが結合される支持体を組合せとして供給し；（ｂ）前記組合せをインキュベートし；（ｃ）前記媒体と前記支持体とを分離し；ならびに、（ｄ）前記媒体または前記支持体について、信号の存
在または量を測定し、その存在または量が前記試料中の
前記イムノグロブリンの存在または量に関連する工程を
含んでなるイムノアッセイの実施方法。
【請求項２】前記イムノグロブリンが疾患状態の原因
物質に向けられたものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記イムノグロブリンがＩｇＧ抗体であ
る請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記第１および第２の抗原が、Ｂ型肝炎
表面抗原である請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記信号発生手段が、酵素類、螢光物
質、化学発光物質および金属粒子からなる群から選択さ
れる標識であり、好ましくは前記標識は、パーオキシダ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホ
スファターゼおよびＱ−ベータ−レプリカーゼからなる
群から選択される酵素である請求項１に記載の方法
【請求項６】前記信号発生手段が、前記第２の抗原に
結合される第２の小分子、ならびに酵素類、螢光物質、
化学発光物質および金属粒子からなる群から選択される
標識に結合される第２の小分子に対するレセプタを含ん
でなり、好ましくは、前記分子はフルオレセイン誘導体
であり、前記レセプタは抗体であり、前記標識は、パー
オキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびＱ−ベー
タ−レプリカーゼからなる群から選択される酵素である
請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記小分子がビオチンであり、前記小分
子に対するレセプタが、アビジンおよびストレプトアピ
ジンからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記支持体が、ガラスビーズである請求
項１に記載の方法。
【請求項９】ＩｇＧ−型イムノグロブリンのイムノア
ッセイに際し、（ａ）アッセイ媒体中に、（ｉ）ＩｇＧを含むと考え
られる試料、（ｉｉ）前記ＩｇＧに結合可能なビオチン
化された第１の抗原、（ｉｉｉ）前記ＩｇＧに結合可能
な第２の抗原に結合された信号発生手段、および（ｉ
Ｖ）支持体に結合されたビオチンに対するレセプタを供
給し；（ｂ）前記媒体をインキュベートし；（ｃ）前記媒体と前記支持体とを分離し；ならびに、（ｄ）前記媒体または支持体について信号の存在また
は量の測定を行ない、該存在または量が、前記試料中の
ＩｇＧの存在または量に関連する工程を含んでなるイム
ノアッセイの実施方法。
【請求項１０】試料中のＩｇＧの量に直接関連して、
複合体、標識−Ａｇ_２：ＩｇＧ：Ａｇ_１−Ｘ：Ｙ−支持体式中、Ａｇ_１−Ｘは、前記ＩｇＧに結合可能な第１のＢ
型肝炎表面抗原（Ａｇ_１）に結合された小分子（Ｘ）で
あり；標識−Ａｇ_２は、前記ＩｇＧに結合可能な第２の
Ｂ型肝炎表面抗原（Ａｇ_２）に結合された標識であり；
およびＹ−支持体は、支持体に結合された前記小分子に
対するレセプタである、を形成する工程を含んでなる試
料中に存在すると考えられるＩｇＧ−型イムノグロブリ
ン検出のためのアッセイ。
【請求項１１】イムノグロブリンに結合されたビオチ
ン化第１抗原と前記イムノグロブリンに結合された標識
第２抗原との接合体からなる物質の組成物。
【請求項１２】前記ビオチン化抗原が、更にビオチン
に対するレセプタを保持する支持体に結合され、前記レ
セプタが、アビジンおよびストレプトアビジンからなる
群から選択される請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】物質：標識−Ａｇ_２：ＩｇＧ：Ａｇ_１−Ｘ：Ｙ−支持体式中、ＩｇＧは、ＩｇＧ−型イムノグロブリンであり；
Ａｇ_１−Ｘは、ＩｇＧに結合可能な第１のＢ型肝炎表面
抗原に結合された小分子（Ｘ）であり；標識−Ａｇ
_２は、ＩｇＧに結合可能な第２のＢ型肝炎表面抗原に結
合された標識であり；およびＹ−支持体は、支持体に結
合された小分子である、を有してなる組成物。
【請求項１４】包装体の形態において、（ａ）小分子
とイムノグロブリンに結合可能な第１の抗原との接合
体；（ｂ）標識と前記イムノグロブリンに結合可能な第
２の抗原との接合体；ならびに（ｃ）前記小分子に対す
るレセプタが結合された表面を有してなる支持体を含ん
でなるイムノグロブリンのイムノアッセイ実施のための
キット。