JPS6147381B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、少なくとも１種類の分析的に指示可
能な基で標識されかつその存在下に生物特異的親
和反応が実施されるところの液体中に可溶性であ
る成分（）を、（）に対し生物特異的親和性
を有する対応因子（）および場合によりさらに
前記成分（）または（）に対して生物特異的
親和性を示す少なくとも１種類の付加的な対応因
子との反応に使用し、そして標識された成分
（）がとり込まれておりしかそも液相から分離
される不液性接合体を形成させ、次に前記不溶性
接合体中の分析的に指示可能な基を分析すること
からなる生物特異的親和反応を包含する分析法を
実施するに当り、共有結合の性質を有する開裂可
能な結合が ａ 分析的に指示可能な基の成分（）への結
合、および ｂ その存在下に生物特異的親和反応が実施され
るところの液体中に不溶性である担体への前記
対応因子の１種類の結合 の少なくとも一方において用いられており、かつ
同じかまたは相異なりうる前記開裂可能な結合が
ここに用いられる分析法に実際上何ら妨害的な影
響を及ぼさない条件下に還元、酸化または交換反
応により開裂されうること、および不溶性接合体
が液体の存在下に前記開裂可能な結合または複数
の結合のところで開裂されて開裂が実施される液
体中に可溶性でありしかも分析的に指示可能な基
を含有する断片を形成し、次にこの指示可能な基
が該液相中で分析されることを特徴とする方法に
関する。 本明細書中「免疫化学的成分」および「免疫化
学的対応因子」は免疫グロブリン（変性グロブリ
ンたとえば凝集されたものおよびフラグメント、
たとえばFab―またはFc―フラグメントを包含す
る）好ましくは抗体、抗原およびハプテンを意味
する。 互いに生物特異性親和力を示す成分（）およ
び対応因子（）の例としてはたとえば抗原（ま
たはハプテン）およびそれに対する特異抗体があ
げられる。他の例としてはたとえばａ）IgG―ク
ラスに属する免疫グロブリンのFc―部分を結合
しうるプロテインＡ（スタフイロコツカスアウレ
ウスから）およびそのフラグメント、ｂ）たとえ
ば熱凝集されたIgGに結合しうるClq、ｃ）たと
えばバイオポリマー中の特異的炭水化物構造に結
合しうるレクチン（たとえばコンカナバリン
（Concanavalin）Ａ）、ｄ）それらの酵素に結合
しうる酵素阻害剤、ｅ）対応する受容体に結合し
うる生理学上または製薬上活性な物質、ｆ）細胞
壁物質に結合しうるウイルス特にバクテリオフア
ージがあげられる。生化学分野内で互いに生物特
異性親和力を示す多くの他の対の物質の例があげ
られる。 その存在下において生物特異性親和反応が実施
される液体中（すなわち、一般に水中または水性
液体中）に可溶性の標識された成分（）に関す
る言及には前記特許請求の範囲および以下の記載
においてたとえば上記液体中にコロイド状で分散
するか、あるいは別の方法ではそれら自体を液体
中に懸濁状に保つのに充分小さい粒子の形態で存
在しうるということが包含れている。 主として免疫化学試験法に関する前記基本型の
多数の試験法が当業界において既知である。かか
る方法の１種によれば、抗体ままたは抗原が結合
されている水不溶性ポリマー物質、たとえばポリ
ペプチド含有抗原またはその他の相当する物質が
使用されている。すなわち、共有結合により抗体
または抗原が結合されている水不溶性ポリマー物
質を使用することはたとえばスエーデン特許第
343949号および341239号明細書およびBiochem.
Biophs.Acta 130（1966）第257頁および
Radioimmunoassoy Mathods（編集者：K.E.
Kirkhamおよびw.M.Hunter）第405〜412頁のL.
Wide氏の論文「Solid Phase Antigen Antibody
Systems」から知られている。さらに米国特許第
3645346号明細書にはプラスチツク試験管の内部
表面上に吸着された抗体が使用される免疫化学試
験法が教示さされている。 不溶性免液化学的接合体生成のさらに別の例と
してはいわゆる二重抗体法があげられる。 これらの免疫化学試験法の一つの型では前記ポ
リマー物質に結合された抗体が該試験法に包含さ
れそして前記ポリマー物質上の前記抗体に対して
免疫化学的に結合される抗原に対して指向されて
いる。ついで抗体に結合された抗原は多分溶解さ
れた抗体と反応しうる。これら方法の別の型によ
ればポリマー物質に結合された抗原はこの抗原に
対して指向された抗体と反応するか、あるいは前
記抗原はついでたとえば溶解された別の抗原と反
応しうるような抗体と反応した。 またこの免疫化学試験法を実施する際には、該
試験法に包含されそしてポリマーに直接結合され
ていない成分の１種が分析的に指示可能な原子ま
たは基、たとえば放射性の原子または基、螢光性
基、発光性基または発色性基あるいは酵素的に活
性な基で標識されるのが好ましいことも知られて
いる。 標識された抗原、標識されたハプテン、標識さ
れた抗体または標識されたプロテインＡのような
標識された成分が使用される前記の識験法の多く
の変法（免疫化学的成分および対応因子以外の、
互いに生物特異性親和力を有するその他の成分
〔〕および〔〕を利用する類似の方法を包含
する）は文献記載であることが見出される（たと
えば前記の参考書を参照されたい）。これに関
し、たとえば、ａ）ポリマーに結合された抗体は
試料中の抗原および標識された抗原と反応するこ
とができるか、またはｂ）ポリマーに結合された
抗体は試料中の抗原と、前記抗原がポリマーに結
合さされた前記抗体に結合されるような方法で反
応し、その後前記の結合された抗原に結合する標
識された抗体が加えられるか、またはｃ）ポリマ
ーに結合された抗原は試料中の抗体と、前記抗体
が前記抗原に結合するような方法で反応し、その
後結合された抗体に結合する標識された抗原が加
えられるか、またはｄ）ポリマーに結合された抗
原は試料中の抗体と、前記抗体が前記抗原に結合
するような方法で反応し、その後最初に記載の抗
体に対して指向され、しかもそれに結合している
標識された抗体が加えられる。またポリマーに結
合された抗体は抗原をこえて該ポリマーに結合さ
れそしてまたポリマーに結合された抗原もまた抗
体をこえてポリマーに結合されうる。前記の抗体
は１種またはそれ以上のイムノグロブリン群に属
しうる。また抗原および抗体を包含する試験法に
関して述べられたことはその他の成分（）およ
び対応因子（）を包含する類似の試験法にも適
用される。 また、かかる試験は水性液体たとえば適当なPH
およびイオン強度を有するバツアー溶液の存在下
で実施されるのが好ましいことも周知である。 成分（）たとえば抗原、抗体などを分析的に
指向されうる基で標識するためには、抗原、抗体
などを標識された基と共に直接化学的に結合させ
るか、あるいはその間に架橋を導入することが可
能である。この化学反応を達成するためには、た
とえば１反応成分中のアミノ基および別の反応成
分中におけるカルボキシル基が使用されうるか、
またはアミノ基が両反応成分中において使用され
うる。橋の補助で一緒に結合する（接合する）場
合にはたとえばグルタルジアルデヒド、臭化シア
ンおよびカルボジイミドのような試薬を使用する
ことが知られている。こうして生成された、抗
原、抗体またはいくつかの他の成分（）と分析
的に指示されうる基との間の共有結合は永久的で
あり、すなわち開裂されることは何ら意図されて
いない。 抗体、抗原またはもその他の対応因子が共有結
合によりそれに結合されている不溶性担体が使用
される場合にはこれらの結合もまた永久的であつ
た。この場合、担体は最初反応性基の導入により
活性化され、ついでその活性化された担体が抗
体、抗原などと反応する。すべての反応性基が抗
体、抗原などとの結合をつくることが期待れうる
のではなくそして残留反応性基をさらに不活性な
基に変換するためのその後の処理にもかかわら
ず、残留反応性基はおそらく成分、たとえば試料
中の抗原および抗体そしてまた担体に直接結合さ
れた標識された成分の非特異的結合の原因であ
り、この型の測定法により観察れた。標識された
成分はそれ自体非特異的に結合される以外に生物
特異性親和反応において非特異的に結合される成
分と反応することができそしてこのような非特異
的結合された成分は担体から洗去され得ない故、
測定結果は、特に試験されるべき成分が非常に小
濃度で存在する場合にはかなり偏る。 本発明によれば、なかんずく、生物特異性親和
力を有する、非特異的に結合された成分による前
述の妨害が減少されうる方法が提供される。 本発明による方法は、「共有結合の性質を有す
る開裂可能な結合が ａ 分析的に指示可能な基の成分（）への結
合、および ｂ その存在下に生物特異的親和反応が実施され
るところの液体中に不溶性である担体への前記
対応因子の１種類の結合 の少なくとも一方において用いられており、かつ
同じかまたは相異なりうる前記開裂可能な結合が
ここに用いられる分析法に実際上何ら妨害的な影
響を及ぼさない条件下に還元、酸化または交換反
応により開裂されうること、および不溶性接合体
が液体の存在下に前記開裂可能な結合または複数
の結合のところで開裂されて開裂が実施される液
体中に可溶性でありしかも分析的に指示可能な基
を含有する断片を形成し、次にこの指示可能な基
が該液相中で分析されることを特徴とする。 「使用される試験法に実際上悪影響を及ぼさな
い条件」とはたとえば分析的に指示可能な基の活
性のかなりの減少を生じない条件および分析的に
指示可能な基が試験操作中反応する試薬または使
用される測定系の他の部分を損わない条件を意味
する。 本発明による試薬は開裂性共有結合を含有する
結合を介して互いに結合されている複数個の分析
的に指示可能な基の多接合体からなる標識された
免疫化学成分からなり、前記指示可能な基を含有
する多接合体は好ましくは開裂可能な結合を含有
する結合により前記免疫化学的成分に結合されて
いることを特徴とする。開裂可能な結合はジスル
フイド架橋―Ｓ―Ｓ―からなるのが好ましい。 本発明による方法で得られる特別の利点は固形
接合体からの放射線吸収効果が避けられうる点に
あり、これはたとえば螢光性基または発光性基、
発色基または放射性基たとえばβ―放射性基が分
析的に指示可能な基として使用される場合特に有
利である。 これに関し、担体とそれに結合される対応因子
との間の結合を開裂させるよりもむしろ分析的に
指示可能な基と成分（）との間の結合を開裂さ
せるほうが著しく好ましい。その理由は後者の場
合には他の接合関与物質からの放射線吸収効果が
避けられるからである。 分析的に指示可能な基が酵素的に活性な基の場
合にも対応する条件があてはまる。すなわち、そ
の他の巨大分子に対して分析的に指示可能な基と
して接合されている酵素はしばしば対応するもと
の酵素よりも低い活性を示す。この活性の減少は
酵素が、結合の結果として、その基質に作用する
ことが立体的に妨げられるからである。ささらに
別の理由は酵素接合体に最も近い水層中でしばし
ば生ずる拡散抑制でありうる。酵素標識の放出に
より、その活性は液相中で測定されることがで
き、それにより最適酵素活性が得られる。これは
また酵素試験に対して水不溶性基質の使用を可能
にする。すなわち、本発明によれば、従来免疫化
学試験法において標識物質として使用されていた
酵素（たとえばヒドロラーゼ、オキシダーゼ、レ
ダクターゼなど）が標識物質として使用されうる
ばかりでなく、それがたとえ不溶性基質であつて
も、高分子量基質に対して作用する酵素もまた使
用されうる。酵素的に活性な基は接合体中におけ
る本発明により開裂可能な結合で結合された唯一
の部分であることが好ましい。 本発明方法はさらに測定技術の面においても有
利である。それは標識された物質を取扱いがより
容易でない固体形態ではなく液相として容器間を
移動させることができ、それにより分析の自動化
が容易にされるからである。開裂に使用される液
相は水性液体たとえば適当なPHおよびイオン強度
を有するバツフアー溶液であるのが好ましい。 多くの場合において、最も好ましい本発明の態
様は成分（）と分析的に指示可能な基との間の
結合のみが開裂されしかもその結合が試験と同時
に開裂される変法である 対応因子と不溶性担体との間の開裂性結合を包
含する態様は固相に対する標識された成分（）
の妨害的非特異吸着が起るような場合特に価値が
ある。この場合に前記開裂性結合が唯一の開裂性
結合であるかもしれないが、多くの場合、成分
（）を１個またはそれ以上の指示可能な基との
間の結合もまた開裂されうるのが特に有利であ
り、その場合対応因子と不溶性担体との間の結合
以外の別の型の開裂性結合が選択されるのが適当
であり、それにより２種の開裂が２個の異なる工
程中で実施されうるという顕著な利点が得られ
る。 開裂性結合はたとえば還元、酸化、または交換
反応により開裂されうる。ここで有利な結合は―
Ｓ―Ｓ―の架橋であり、これはたとえば還元また
はチオールジスフイド交換により開裂されうる。
これに関してさらに別の有利な結合は近接のジオ
ール構造を含有するものであり、それは過沃素酸
ナトリウムで酸化的に開裂されうる。 ―Ｓ―Ｓ―架橋は一緒に結合されるべき２種の
物質の一方に１個またはそれ以上のチオール基を
導入し（すでに存在していない場合）そして他の
分子中にチオールジスフイド交換のために活性化
された１個またはそれ以上のジスフイルド構造を
導入することにより確立されることができる。す
なわち、たとえばチオール基が標識物質中に導入
される場合には、生物特異性活性を示しそして標
識物質と一緒に結合されるべき物質はジスルフイ
ルド構造を与えられ、そしてこの逆もまた同様で
ある。ついで２種の変性された物質を互いに接触
させ、これらの物質はチオールジスルフイド交完
反応により―Ｓ―Ｓ―結合で互いに結合される。 ―Ｓ―Ｓ―架橋の両側に脂肪族基または芳香族
基の一部を形成する炭素原子が見出されるのが好
ましい。この炭素原子はついで少なくとも１個の
炭素原子に結合されるのが好ましい。最初に述べ
た炭素原子の残りの結合は水素原子で飽和される
のが好ましい。最初に述べた炭素原子はそれぞれ
たとえば基―CH2―および（または）〓Ｃ（ここ
で該炭素原子は芳香族環たとえばベンゼン環中に
存在するものである）中に包含されうる。したが
つてジスルフイド架橋は式
能な基で標識されかつその存在下に生物特異的親
和反応が実施されるところの液体中に可溶性であ
る成分（）を、（）に対し生物特異的親和性
を有する対応因子（）および場合によりさらに
前記成分（）または（）に対して生物特異的
親和性を示す少なくとも１種類の付加的な対応因
子との反応に使用し、そして標識された成分
（）がとり込まれておりしかそも液相から分離
される不液性接合体を形成させ、次に前記不溶性
接合体中の分析的に指示可能な基を分析すること
からなる生物特異的親和反応を包含する分析法を
実施するに当り、共有結合の性質を有する開裂可
能な結合が ａ 分析的に指示可能な基の成分（）への結
合、および ｂ その存在下に生物特異的親和反応が実施され
るところの液体中に不溶性である担体への前記
対応因子の１種類の結合 の少なくとも一方において用いられており、かつ
同じかまたは相異なりうる前記開裂可能な結合が
ここに用いられる分析法に実際上何ら妨害的な影
響を及ぼさない条件下に還元、酸化または交換反
応により開裂されうること、および不溶性接合体
が液体の存在下に前記開裂可能な結合または複数
の結合のところで開裂されて開裂が実施される液
体中に可溶性でありしかも分析的に指示可能な基
を含有する断片を形成し、次にこの指示可能な基
が該液相中で分析されることを特徴とする方法に
関する。 本明細書中「免疫化学的成分」および「免疫化
学的対応因子」は免疫グロブリン（変性グロブリ
ンたとえば凝集されたものおよびフラグメント、
たとえばFab―またはFc―フラグメントを包含す
る）好ましくは抗体、抗原およびハプテンを意味
する。 互いに生物特異性親和力を示す成分（）およ
び対応因子（）の例としてはたとえば抗原（ま
たはハプテン）およびそれに対する特異抗体があ
げられる。他の例としてはたとえばａ）IgG―ク
ラスに属する免疫グロブリンのFc―部分を結合
しうるプロテインＡ（スタフイロコツカスアウレ
ウスから）およびそのフラグメント、ｂ）たとえ
ば熱凝集されたIgGに結合しうるClq、ｃ）たと
えばバイオポリマー中の特異的炭水化物構造に結
合しうるレクチン（たとえばコンカナバリン
（Concanavalin）Ａ）、ｄ）それらの酵素に結合
しうる酵素阻害剤、ｅ）対応する受容体に結合し
うる生理学上または製薬上活性な物質、ｆ）細胞
壁物質に結合しうるウイルス特にバクテリオフア
ージがあげられる。生化学分野内で互いに生物特
異性親和力を示す多くの他の対の物質の例があげ
られる。 その存在下において生物特異性親和反応が実施
される液体中（すなわち、一般に水中または水性
液体中）に可溶性の標識された成分（）に関す
る言及には前記特許請求の範囲および以下の記載
においてたとえば上記液体中にコロイド状で分散
するか、あるいは別の方法ではそれら自体を液体
中に懸濁状に保つのに充分小さい粒子の形態で存
在しうるということが包含れている。 主として免疫化学試験法に関する前記基本型の
多数の試験法が当業界において既知である。かか
る方法の１種によれば、抗体ままたは抗原が結合
されている水不溶性ポリマー物質、たとえばポリ
ペプチド含有抗原またはその他の相当する物質が
使用されている。すなわち、共有結合により抗体
または抗原が結合されている水不溶性ポリマー物
質を使用することはたとえばスエーデン特許第
343949号および341239号明細書およびBiochem.
Biophs.Acta 130（1966）第257頁および
Radioimmunoassoy Mathods（編集者：K.E.
Kirkhamおよびw.M.Hunter）第405〜412頁のL.
Wide氏の論文「Solid Phase Antigen Antibody
Systems」から知られている。さらに米国特許第
3645346号明細書にはプラスチツク試験管の内部
表面上に吸着された抗体が使用される免疫化学試
験法が教示さされている。 不溶性免液化学的接合体生成のさらに別の例と
してはいわゆる二重抗体法があげられる。 これらの免疫化学試験法の一つの型では前記ポ
リマー物質に結合された抗体が該試験法に包含さ
れそして前記ポリマー物質上の前記抗体に対して
免疫化学的に結合される抗原に対して指向されて
いる。ついで抗体に結合された抗原は多分溶解さ
れた抗体と反応しうる。これら方法の別の型によ
ればポリマー物質に結合された抗原はこの抗原に
対して指向された抗体と反応するか、あるいは前
記抗原はついでたとえば溶解された別の抗原と反
応しうるような抗体と反応した。 またこの免疫化学試験法を実施する際には、該
試験法に包含されそしてポリマーに直接結合され
ていない成分の１種が分析的に指示可能な原子ま
たは基、たとえば放射性の原子または基、螢光性
基、発光性基または発色性基あるいは酵素的に活
性な基で標識されるのが好ましいことも知られて
いる。 標識された抗原、標識されたハプテン、標識さ
れた抗体または標識されたプロテインＡのような
標識された成分が使用される前記の識験法の多く
の変法（免疫化学的成分および対応因子以外の、
互いに生物特異性親和力を有するその他の成分
〔〕および〔〕を利用する類似の方法を包含
する）は文献記載であることが見出される（たと
えば前記の参考書を参照されたい）。これに関
し、たとえば、ａ）ポリマーに結合された抗体は
試料中の抗原および標識された抗原と反応するこ
とができるか、またはｂ）ポリマーに結合された
抗体は試料中の抗原と、前記抗原がポリマーに結
合さされた前記抗体に結合されるような方法で反
応し、その後前記の結合された抗原に結合する標
識された抗体が加えられるか、またはｃ）ポリマ
ーに結合された抗原は試料中の抗体と、前記抗体
が前記抗原に結合するような方法で反応し、その
後結合された抗体に結合する標識された抗原が加
えられるか、またはｄ）ポリマーに結合された抗
原は試料中の抗体と、前記抗体が前記抗原に結合
するような方法で反応し、その後最初に記載の抗
体に対して指向され、しかもそれに結合している
標識された抗体が加えられる。またポリマーに結
合された抗体は抗原をこえて該ポリマーに結合さ
れそしてまたポリマーに結合された抗原もまた抗
体をこえてポリマーに結合されうる。前記の抗体
は１種またはそれ以上のイムノグロブリン群に属
しうる。また抗原および抗体を包含する試験法に
関して述べられたことはその他の成分（）およ
び対応因子（）を包含する類似の試験法にも適
用される。 また、かかる試験は水性液体たとえば適当なPH
およびイオン強度を有するバツアー溶液の存在下
で実施されるのが好ましいことも周知である。 成分（）たとえば抗原、抗体などを分析的に
指向されうる基で標識するためには、抗原、抗体
などを標識された基と共に直接化学的に結合させ
るか、あるいはその間に架橋を導入することが可
能である。この化学反応を達成するためには、た
とえば１反応成分中のアミノ基および別の反応成
分中におけるカルボキシル基が使用されうるか、
またはアミノ基が両反応成分中において使用され
うる。橋の補助で一緒に結合する（接合する）場
合にはたとえばグルタルジアルデヒド、臭化シア
ンおよびカルボジイミドのような試薬を使用する
ことが知られている。こうして生成された、抗
原、抗体またはいくつかの他の成分（）と分析
的に指示されうる基との間の共有結合は永久的で
あり、すなわち開裂されることは何ら意図されて
いない。 抗体、抗原またはもその他の対応因子が共有結
合によりそれに結合されている不溶性担体が使用
される場合にはこれらの結合もまた永久的であつ
た。この場合、担体は最初反応性基の導入により
活性化され、ついでその活性化された担体が抗
体、抗原などと反応する。すべての反応性基が抗
体、抗原などとの結合をつくることが期待れうる
のではなくそして残留反応性基をさらに不活性な
基に変換するためのその後の処理にもかかわら
ず、残留反応性基はおそらく成分、たとえば試料
中の抗原および抗体そしてまた担体に直接結合さ
れた標識された成分の非特異的結合の原因であ
り、この型の測定法により観察れた。標識された
成分はそれ自体非特異的に結合される以外に生物
特異性親和反応において非特異的に結合される成
分と反応することができそしてこのような非特異
的結合された成分は担体から洗去され得ない故、
測定結果は、特に試験されるべき成分が非常に小
濃度で存在する場合にはかなり偏る。 本発明によれば、なかんずく、生物特異性親和
力を有する、非特異的に結合された成分による前
述の妨害が減少されうる方法が提供される。 本発明による方法は、「共有結合の性質を有す
る開裂可能な結合が ａ 分析的に指示可能な基の成分（）への結
合、および ｂ その存在下に生物特異的親和反応が実施され
るところの液体中に不溶性である担体への前記
対応因子の１種類の結合 の少なくとも一方において用いられており、かつ
同じかまたは相異なりうる前記開裂可能な結合が
ここに用いられる分析法に実際上何ら妨害的な影
響を及ぼさない条件下に還元、酸化または交換反
応により開裂されうること、および不溶性接合体
が液体の存在下に前記開裂可能な結合または複数
の結合のところで開裂されて開裂が実施される液
体中に可溶性でありしかも分析的に指示可能な基
を含有する断片を形成し、次にこの指示可能な基
が該液相中で分析されることを特徴とする。 「使用される試験法に実際上悪影響を及ぼさな
い条件」とはたとえば分析的に指示可能な基の活
性のかなりの減少を生じない条件および分析的に
指示可能な基が試験操作中反応する試薬または使
用される測定系の他の部分を損わない条件を意味
する。 本発明による試薬は開裂性共有結合を含有する
結合を介して互いに結合されている複数個の分析
的に指示可能な基の多接合体からなる標識された
免疫化学成分からなり、前記指示可能な基を含有
する多接合体は好ましくは開裂可能な結合を含有
する結合により前記免疫化学的成分に結合されて
いることを特徴とする。開裂可能な結合はジスル
フイド架橋―Ｓ―Ｓ―からなるのが好ましい。 本発明による方法で得られる特別の利点は固形
接合体からの放射線吸収効果が避けられうる点に
あり、これはたとえば螢光性基または発光性基、
発色基または放射性基たとえばβ―放射性基が分
析的に指示可能な基として使用される場合特に有
利である。 これに関し、担体とそれに結合される対応因子
との間の結合を開裂させるよりもむしろ分析的に
指示可能な基と成分（）との間の結合を開裂さ
せるほうが著しく好ましい。その理由は後者の場
合には他の接合関与物質からの放射線吸収効果が
避けられるからである。 分析的に指示可能な基が酵素的に活性な基の場
合にも対応する条件があてはまる。すなわち、そ
の他の巨大分子に対して分析的に指示可能な基と
して接合されている酵素はしばしば対応するもと
の酵素よりも低い活性を示す。この活性の減少は
酵素が、結合の結果として、その基質に作用する
ことが立体的に妨げられるからである。ささらに
別の理由は酵素接合体に最も近い水層中でしばし
ば生ずる拡散抑制でありうる。酵素標識の放出に
より、その活性は液相中で測定されることがで
き、それにより最適酵素活性が得られる。これは
また酵素試験に対して水不溶性基質の使用を可能
にする。すなわち、本発明によれば、従来免疫化
学試験法において標識物質として使用されていた
酵素（たとえばヒドロラーゼ、オキシダーゼ、レ
ダクターゼなど）が標識物質として使用されうる
ばかりでなく、それがたとえ不溶性基質であつて
も、高分子量基質に対して作用する酵素もまた使
用されうる。酵素的に活性な基は接合体中におけ
る本発明により開裂可能な結合で結合された唯一
の部分であることが好ましい。 本発明方法はさらに測定技術の面においても有
利である。それは標識された物質を取扱いがより
容易でない固体形態ではなく液相として容器間を
移動させることができ、それにより分析の自動化
が容易にされるからである。開裂に使用される液
相は水性液体たとえば適当なPHおよびイオン強度
を有するバツフアー溶液であるのが好ましい。 多くの場合において、最も好ましい本発明の態
様は成分（）と分析的に指示可能な基との間の
結合のみが開裂されしかもその結合が試験と同時
に開裂される変法である 対応因子と不溶性担体との間の開裂性結合を包
含する態様は固相に対する標識された成分（）
の妨害的非特異吸着が起るような場合特に価値が
ある。この場合に前記開裂性結合が唯一の開裂性
結合であるかもしれないが、多くの場合、成分
（）を１個またはそれ以上の指示可能な基との
間の結合もまた開裂されうるのが特に有利であ
り、その場合対応因子と不溶性担体との間の結合
以外の別の型の開裂性結合が選択されるのが適当
であり、それにより２種の開裂が２個の異なる工
程中で実施されうるという顕著な利点が得られ
る。 開裂性結合はたとえば還元、酸化、または交換
反応により開裂されうる。ここで有利な結合は―
Ｓ―Ｓ―の架橋であり、これはたとえば還元また
はチオールジスフイド交換により開裂されうる。
これに関してさらに別の有利な結合は近接のジオ
ール構造を含有するものであり、それは過沃素酸
ナトリウムで酸化的に開裂されうる。 ―Ｓ―Ｓ―架橋は一緒に結合されるべき２種の
物質の一方に１個またはそれ以上のチオール基を
導入し（すでに存在していない場合）そして他の
分子中にチオールジスフイド交換のために活性化
された１個またはそれ以上のジスフイルド構造を
導入することにより確立されることができる。す
なわち、たとえばチオール基が標識物質中に導入
される場合には、生物特異性活性を示しそして標
識物質と一緒に結合されるべき物質はジスルフイ
ルド構造を与えられ、そしてこの逆もまた同様で
ある。ついで２種の変性された物質を互いに接触
させ、これらの物質はチオールジスルフイド交完
反応により―Ｓ―Ｓ―結合で互いに結合される。 ―Ｓ―Ｓ―架橋の両側に脂肪族基または芳香族
基の一部を形成する炭素原子が見出されるのが好
ましい。この炭素原子はついで少なくとも１個の
炭素原子に結合されるのが好ましい。最初に述べ
た炭素原子の残りの結合は水素原子で飽和される
のが好ましい。最初に述べた炭素原子はそれぞれ
たとえば基―CH2―および（または）〓Ｃ（ここ
で該炭素原子は芳香族環たとえばベンゼン環中に
存在するものである）中に包含されうる。したが
つてジスルフイド架橋は式
【式】（式
中各炭素原子の残りの結合の１個は別の炭素原子
に結合しそして各炭素原子の残りの結合は水素お
よび（または）炭素に結合する）で表わされる基
中に存在するのが好ましい。 チオール基導入のためにはたとえば式 （式中Ｒはメチルまたはエテルでありそしてｎ
は１〜10好ましくは２〜４の整数である）で表わ
されるチオールイミデートあるいはＮ―アセチル
ホモシステインチオラクトンのような既知のチオ
ール化剤が使用されうる。 反応は非常に過剰のチオール化剤を用いて15〜
30℃の温度において僅かにアルカリ性（PH７〜
９）の水溶液中で実施される。 チオールジスルフイド交換のために活性化され
たジスルフイド構造を導入するためには、たとえ
ば対応する還元された形態が共鳴安定化またはチ
オールーチオン互変異性による低いＳ―求核性を
有しそしてチオール基含有物質と反応しうる既知
のジスルフイドが使用されうる。かかるジスルフ
イドの例としてはたとえば２，2′―ジピリジル―
ジスルフイド、４，4′―ジピリジル―ジスルフイ
ドおよび、ピリジル基において置換されている対
応する化合物であつて、これらの化合物中置換基
はそれによりチオールチオン互変異性が妨害され
ないような種類のものであり且つそのような位置
にあるもので、たとえば５―位置にニトロ基また
はカルボキシル基を有するものがあげられる。 チオール含有物質と前記の型のジスルフイドと
の反応は非常に過剰のジスルフイドにより15〜30
℃の温度においてPH２〜９の水溶液中において実
施される。 しかしながら、チオール化および活性化された
ジスルフイド構造の導入の両方のためには式 R1―Ｓ―Ｓ―Ａ―Ｚ ……() 〔式中R1は２―ピリジル、５―ニトロ―２―
ピリジルまたは４―ピリジルであり、Ａは１〜10
個好ましくは１〜６個の炭素原子を有する炭化水
素残基でありそしてＺは基
に結合しそして各炭素原子の残りの結合は水素お
よび（または）炭素に結合する）で表わされる基
中に存在するのが好ましい。 チオール基導入のためにはたとえば式 （式中Ｒはメチルまたはエテルでありそしてｎ
は１〜10好ましくは２〜４の整数である）で表わ
されるチオールイミデートあるいはＮ―アセチル
ホモシステインチオラクトンのような既知のチオ
ール化剤が使用されうる。 反応は非常に過剰のチオール化剤を用いて15〜
30℃の温度において僅かにアルカリ性（PH７〜
９）の水溶液中で実施される。 チオールジスルフイド交換のために活性化され
たジスルフイド構造を導入するためには、たとえ
ば対応する還元された形態が共鳴安定化またはチ
オールーチオン互変異性による低いＳ―求核性を
有しそしてチオール基含有物質と反応しうる既知
のジスルフイドが使用されうる。かかるジスルフ
イドの例としてはたとえば２，2′―ジピリジル―
ジスルフイド、４，4′―ジピリジル―ジスルフイ
ドおよび、ピリジル基において置換されている対
応する化合物であつて、これらの化合物中置換基
はそれによりチオールチオン互変異性が妨害され
ないような種類のものであり且つそのような位置
にあるもので、たとえば５―位置にニトロ基また
はカルボキシル基を有するものがあげられる。 チオール含有物質と前記の型のジスルフイドと
の反応は非常に過剰のジスルフイドにより15〜30
℃の温度においてPH２〜９の水溶液中において実
施される。 しかしながら、チオール化および活性化された
ジスルフイド構造の導入の両方のためには式 R1―Ｓ―Ｓ―Ａ―Ｚ ……() 〔式中R1は２―ピリジル、５―ニトロ―２―
ピリジルまたは４―ピリジルであり、Ａは１〜10
個好ましくは１〜６個の炭素原子を有する炭化水
素残基でありそしてＺは基
【式】または
【式】
（式中ｎは２または３であり、R1は前記R1と
同一の定義を有しそしてR2はメチルまたはエチ
ルである）または最後に記載の基の酸付加塩であ
る〕で表わされるヘテロ二官能性試薬が使用され
るのが好ましい。 式で表わされる化合物は多くの異なつた方法
で製造されうる。今日好ましいとされている方法
は以下のとおりである。 式においてＺが基 である化合物は式 R1―Ｓ―Ｓ―Ａ―COOH ………() （式中R1およびＡはいずれも前述の定義を有
する）で表わされるジスルフイドを、ｎが２の場
合には、Ｎ―ヒドロキシスクシンイミドと（ある
いはｎが３である化合物が所望される場合にはｎ
が３である類縁化合物と）縮合剤の存在下で反応
させることにより製造される。 この反応は10〜30℃の温度において有機溶媒中
で行なわれる。適当な溶媒の例としてはたとえば
メチレンクロライド、酢酸エチルおよびジオキサ
ンがあげられる。反応時間は反応成分および反応
温度の選択により変わる。 使用される縮合剤はエステル化反応で普通に使
用されるもの、たとえばＮ，N′―ジシクロヘキ
シルカルボジイミドであることができる。 式で表わされる出発化合物は式 HS―Ａ―COOH ……() で表わされるメルカプトアルキルカルボン酸を式 R1―Ｓ―Ｓ―R1 （式中ＡおよびR1は共に前述の定義を有す
る）で表わされるジピリジルジスルフイドと反応
させることにより製造されうる。 この反応は10〜30℃の温度で有機溶媒中におい
て行なわれる。適当な溶媒の例としてはたとえば
エタノール、酢酸エチルおよびジオキサンがあげ
られる。反応時間は反応成分および反応温度の選
択により変わる。 式においてＺが基 である化合物は前記式で表わされるジスルフイ
ドを有機溶媒中縮合剤の存在下で対応するチオピ
リドンと最初低温たとえば―20℃において約１〜
２時間ついで周囲温度（たとえば20℃）において
反応させることにより製造される。ここでの適当
な溶媒の例としてはメチレンクロライド、酢酸エ
チルおよびジオキサンがあげられる。使用する縮
合剤はＮ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミ
ドが好ましい。 使用される出発物質は式で表わされる化合物
を式で表わされる化合物と反応させることによ
り得られる混合物であるのが好ましい。 式においてＺが基 である化合物は有機溶媒中において式 （式中R2およびびＡは共に前述の定義を有す
る）で表わされるチオールイミデートを式R1―
Ｓ―Ｓ―R1（式中R1は前述の定義を有する）で
表わされるピリジルジスルフイドと反応させるこ
とにより製造される。溶媒としてはたとえば約10
％の氷酢酸を含有するメタノールがあげられる。 これら反応成分の使用は以下の反応表により説
明されうるが、ここではＮ―スクシンイミジル―
３―（２―ピリジルジチオ）プロピオネートが適
当な二官能性反応成分の例として選択された。 前記記式において―NH2は対応因子（）に
対して生物特異性親和力を有する免疫化学反応成
分（）またはその他の成分（）の例を示し、
そして―NH2は指示可能な基の例たとえば酵素
または１個またはそれ以上の放射性原子を含有す
る基を示す。前記の工程Ｃにおける還元では
DTT（ジチオトレイトール）を使用することが
可能である。この還元剤を用いれば、プロテイン
中に場合により存在する本来のジスルフイド架橋
を同様に還元することなく、たとえばプロテイン
―結合ピリジルジスルフイド構造を還元すること
ができる。これは過剰のDTTを用いる場合には
PH約３〜５において、あるいはより少ない過剰量
あるいは等モル量のDTTを用いる場合にはより
高いPHにおいて還元を行なうことにより達成され
る。 たとえばプロテイン中におけるチオール基また
はジスルフイド基の置換度はこの誘導
（derivatisation）法（前記反応式Ｂ）では試薬の
モル過剰を変えるかまたは５〜８の間でPHを変え
ることにより比較的容易に調節されうる。 たとえば、１個の酵素分子（指示可能な基とし
て）および、生物特異性親和力を有する１個の他
のプロテイン分子（たとえば抗体）を含有する２
分子接合体はそれぞれの分子中に１個のチオール
基および１個のジスルフイド構造を導入しついで
その変性された分子をチオールジスルフイド交換
により反応させることにより製造されうる。チオ
ールジスルフイド交換反応はチオールおよび反応
性ジスルフイド構造を必要としそしてこれらの基
のうちの一方だけが各分子中に見出される故、一
方の型の分子だけからなる接合体の生成は避けら
れうる。オリゴ分子またはポリ分子の接合体を同
様の方法で得ることができる。 指示可能な基としては開裂性ジスルフイド架橋
生成のために使用される少なくとも１個の本来的
なHS―基を含有する酵素を選択するのが特に有
利である。その理由はこの場合には誘導が避けら
れそしてジスルフイド架橋の還元後に酵素が完全
な活性を有する本来の形態で得られるからであ
る。 指示可能な基と成分（）との間の開裂性結合
により、他の指示可能な基を有するその他の標識
された成分（）が同様の方法で得られることは
当然である。また対応因子は同様の方法により開
裂性結合を介して不溶性担体に結合されうる。 前記のチオールジスルフイド交換反応は15〜30
℃の温度でPH２〜８の水性環境中において実施さ
れうる。 ある場合には、生物特異性親和力を有する成分
に対する分析的に指示可能な基の直接的接合を避
けることが望ましい。たとえば、２種の分子はた
とえば疎水性相互作用および（または）充電効果
により互いの活性に対して有害に作用する場合が
ある。かかる場合には、分析的に指示可能な基お
よび生物特異性親和力を有する成分（）の両方
に対して可溶性担体を使用することが適当であ
り、前記の基および成分は各々ついで―Ｓ―Ｓ―
基からなるかまたはこれを含有する前述の型の架
橋を介して前記記可溶性担体に結合され、これに
よりそれらは互いに分離される。前記のような接
合体に基づく試験の感度は生物特異性親和力を有
する成分（）の11分子のみあるいは数分子が結
合されている可溶性担体に多数の分析的に指示可
能な基を付着させることにより増大されうる。 前述の可溶性担体の例としてたとえばデキスト
ラン、デキストラン誘導体系において不活性のバ
イオポリマーおよび、その存在下に生物特異性親
和反応が実施される液体に可溶性のその他のポリ
マーがあげられる。（この場合には、可溶性担体
中の結合は開裂性結合たとえばグリコシド結合か
らなることができ、該グリコシド結合はグリコシ
ダーゼたとえば、可溶性担体がデキストランから
なる場合には、テキストラナーゼにより開裂され
る。） カツプリングはたとえば担体中にジスルフイド
構造をそして標識中および成分（）中にHS―
基を導入し、ついでこれをチオールジスルフイド
交換反応によりポリマーに結合させることにより
実施される。成分（）または標識のいずれかを
水溶性担体にカツプリングさせるためには、これ
らの物質を担体へカツプリングさせるその他の既
知の方法もまた適用されうる。それはこれらの物
質はいずれも水溶性担体から分裂可能である必要
はないからである。 ジスルフイド架橋―Ｓ―Ｓ―は還元剤としての
たとえばDTTの助けにより穏和な条件下で、指
示可能な基が液相中に放出されそこで試験分析さ
れうるような方法で容易に開裂されることができ
る。したがつて―Ｓ―Ｓ―架橋は開裂性結合とし
て特に適当である。 以上の分析において特に高い感度が望まれる場
合には、本発明の価値ある態様にしたがつて、開
裂性共有結合（たとえばジスルフイド架橋―Ｓ―
Ｓ―）を含有する結合を介して互いに結合された
複数個の分析的に指示可能な基の多接合体からな
り、前記指示可能な基の多接合体は好ましく開裂
性結合（たとえばジスルフイド架橋―Ｓ―Ｓ―）
を含有する結合を介して成分（）に結合されて
いる、標識された成分（）が使用されうる。 隣接ジオール構造
同一の定義を有しそしてR2はメチルまたはエチ
ルである）または最後に記載の基の酸付加塩であ
る〕で表わされるヘテロ二官能性試薬が使用され
るのが好ましい。 式で表わされる化合物は多くの異なつた方法
で製造されうる。今日好ましいとされている方法
は以下のとおりである。 式においてＺが基 である化合物は式 R1―Ｓ―Ｓ―Ａ―COOH ………() （式中R1およびＡはいずれも前述の定義を有
する）で表わされるジスルフイドを、ｎが２の場
合には、Ｎ―ヒドロキシスクシンイミドと（ある
いはｎが３である化合物が所望される場合にはｎ
が３である類縁化合物と）縮合剤の存在下で反応
させることにより製造される。 この反応は10〜30℃の温度において有機溶媒中
で行なわれる。適当な溶媒の例としてはたとえば
メチレンクロライド、酢酸エチルおよびジオキサ
ンがあげられる。反応時間は反応成分および反応
温度の選択により変わる。 使用される縮合剤はエステル化反応で普通に使
用されるもの、たとえばＮ，N′―ジシクロヘキ
シルカルボジイミドであることができる。 式で表わされる出発化合物は式 HS―Ａ―COOH ……() で表わされるメルカプトアルキルカルボン酸を式 R1―Ｓ―Ｓ―R1 （式中ＡおよびR1は共に前述の定義を有す
る）で表わされるジピリジルジスルフイドと反応
させることにより製造されうる。 この反応は10〜30℃の温度で有機溶媒中におい
て行なわれる。適当な溶媒の例としてはたとえば
エタノール、酢酸エチルおよびジオキサンがあげ
られる。反応時間は反応成分および反応温度の選
択により変わる。 式においてＺが基 である化合物は前記式で表わされるジスルフイ
ドを有機溶媒中縮合剤の存在下で対応するチオピ
リドンと最初低温たとえば―20℃において約１〜
２時間ついで周囲温度（たとえば20℃）において
反応させることにより製造される。ここでの適当
な溶媒の例としてはメチレンクロライド、酢酸エ
チルおよびジオキサンがあげられる。使用する縮
合剤はＮ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミ
ドが好ましい。 使用される出発物質は式で表わされる化合物
を式で表わされる化合物と反応させることによ
り得られる混合物であるのが好ましい。 式においてＺが基 である化合物は有機溶媒中において式 （式中R2およびびＡは共に前述の定義を有す
る）で表わされるチオールイミデートを式R1―
Ｓ―Ｓ―R1（式中R1は前述の定義を有する）で
表わされるピリジルジスルフイドと反応させるこ
とにより製造される。溶媒としてはたとえば約10
％の氷酢酸を含有するメタノールがあげられる。 これら反応成分の使用は以下の反応表により説
明されうるが、ここではＮ―スクシンイミジル―
３―（２―ピリジルジチオ）プロピオネートが適
当な二官能性反応成分の例として選択された。 前記記式において―NH2は対応因子（）に
対して生物特異性親和力を有する免疫化学反応成
分（）またはその他の成分（）の例を示し、
そして―NH2は指示可能な基の例たとえば酵素
または１個またはそれ以上の放射性原子を含有す
る基を示す。前記の工程Ｃにおける還元では
DTT（ジチオトレイトール）を使用することが
可能である。この還元剤を用いれば、プロテイン
中に場合により存在する本来のジスルフイド架橋
を同様に還元することなく、たとえばプロテイン
―結合ピリジルジスルフイド構造を還元すること
ができる。これは過剰のDTTを用いる場合には
PH約３〜５において、あるいはより少ない過剰量
あるいは等モル量のDTTを用いる場合にはより
高いPHにおいて還元を行なうことにより達成され
る。 たとえばプロテイン中におけるチオール基また
はジスルフイド基の置換度はこの誘導
（derivatisation）法（前記反応式Ｂ）では試薬の
モル過剰を変えるかまたは５〜８の間でPHを変え
ることにより比較的容易に調節されうる。 たとえば、１個の酵素分子（指示可能な基とし
て）および、生物特異性親和力を有する１個の他
のプロテイン分子（たとえば抗体）を含有する２
分子接合体はそれぞれの分子中に１個のチオール
基および１個のジスルフイド構造を導入しついで
その変性された分子をチオールジスルフイド交換
により反応させることにより製造されうる。チオ
ールジスルフイド交換反応はチオールおよび反応
性ジスルフイド構造を必要としそしてこれらの基
のうちの一方だけが各分子中に見出される故、一
方の型の分子だけからなる接合体の生成は避けら
れうる。オリゴ分子またはポリ分子の接合体を同
様の方法で得ることができる。 指示可能な基としては開裂性ジスルフイド架橋
生成のために使用される少なくとも１個の本来的
なHS―基を含有する酵素を選択するのが特に有
利である。その理由はこの場合には誘導が避けら
れそしてジスルフイド架橋の還元後に酵素が完全
な活性を有する本来の形態で得られるからであ
る。 指示可能な基と成分（）との間の開裂性結合
により、他の指示可能な基を有するその他の標識
された成分（）が同様の方法で得られることは
当然である。また対応因子は同様の方法により開
裂性結合を介して不溶性担体に結合されうる。 前記のチオールジスルフイド交換反応は15〜30
℃の温度でPH２〜８の水性環境中において実施さ
れうる。 ある場合には、生物特異性親和力を有する成分
に対する分析的に指示可能な基の直接的接合を避
けることが望ましい。たとえば、２種の分子はた
とえば疎水性相互作用および（または）充電効果
により互いの活性に対して有害に作用する場合が
ある。かかる場合には、分析的に指示可能な基お
よび生物特異性親和力を有する成分（）の両方
に対して可溶性担体を使用することが適当であ
り、前記の基および成分は各々ついで―Ｓ―Ｓ―
基からなるかまたはこれを含有する前述の型の架
橋を介して前記記可溶性担体に結合され、これに
よりそれらは互いに分離される。前記のような接
合体に基づく試験の感度は生物特異性親和力を有
する成分（）の11分子のみあるいは数分子が結
合されている可溶性担体に多数の分析的に指示可
能な基を付着させることにより増大されうる。 前述の可溶性担体の例としてたとえばデキスト
ラン、デキストラン誘導体系において不活性のバ
イオポリマーおよび、その存在下に生物特異性親
和反応が実施される液体に可溶性のその他のポリ
マーがあげられる。（この場合には、可溶性担体
中の結合は開裂性結合たとえばグリコシド結合か
らなることができ、該グリコシド結合はグリコシ
ダーゼたとえば、可溶性担体がデキストランから
なる場合には、テキストラナーゼにより開裂され
る。） カツプリングはたとえば担体中にジスルフイド
構造をそして標識中および成分（）中にHS―
基を導入し、ついでこれをチオールジスルフイド
交換反応によりポリマーに結合させることにより
実施される。成分（）または標識のいずれかを
水溶性担体にカツプリングさせるためには、これ
らの物質を担体へカツプリングさせるその他の既
知の方法もまた適用されうる。それはこれらの物
質はいずれも水溶性担体から分裂可能である必要
はないからである。 ジスルフイド架橋―Ｓ―Ｓ―は還元剤としての
たとえばDTTの助けにより穏和な条件下で、指
示可能な基が液相中に放出されそこで試験分析さ
れうるような方法で容易に開裂されることができ
る。したがつて―Ｓ―Ｓ―架橋は開裂性結合とし
て特に適当である。 以上の分析において特に高い感度が望まれる場
合には、本発明の価値ある態様にしたがつて、開
裂性共有結合（たとえばジスルフイド架橋―Ｓ―
Ｓ―）を含有する結合を介して互いに結合された
複数個の分析的に指示可能な基の多接合体からな
り、前記指示可能な基の多接合体は好ましく開裂
性結合（たとえばジスルフイド架橋―Ｓ―Ｓ―）
を含有する結合を介して成分（）に結合されて
いる、標識された成分（）が使用されうる。 隣接ジオール構造
【式】を含有する結
合はたとえば以下の型
または
の二官能性剤の作用により得ることができる。
前述の親和反応に関与する成分の１種がその存
在下において前記反応が行なわれる液体中に不液
性の担体に結合される場合には、前記の担体は主
として前述の型の既知の方法に関連して知られて
いる任意の担体物質からなるものでありうる。か
かる担体の例としてはたとえば不溶性の有機また
は部分的に無機のポリマーたとえばセルロース、
交叉結合デキストラン、アガロース、交叉結合ポ
リアクリルアミド、交叉結合ポリスチレンおよび
ガラス誘導体があげられる。この担体とこれに結
合された成分との間の結合が本発明にしたがつて
開裂され得ないと考えられる場合には、その結合
は常套の結合であり得ることができ、すなわちそ
れは常套の型の共有結合すなわちいわゆる疎水性
結合からなりうる。相当する方法において、分析
的に指示可能な基と成分（）との間の結合は対
応因子と固形担体との間に本発明による開裂しう
る結合が存在し、しかも最初に述べた結合を開裂
させることが必要と見なされない場合には慣用の
結合でありうる。 次に本発明を多くの実施例に関して詳記する。 実施例 １ ラビツト―抗ヒトFcγ―α―アミラーゼ接合
体による人の血清中のサルモネラ抗体の定量分
析 ａ ラビツト―抗ヒトFcγ―α―アミラーゼ接
合体の調製 DEAE―セフアデツクス（登録商標）
Pharmacia Fine Chemicals AB社製、エピクロ
ロヒドリンで交叉結合されたジエチルアミノエチ
ル含有デキストランのビーズ）上でのイオン交換
クロマトグラフイーにより精製されたα―アミラ
ーゼ（シグマ社のバクテリア型Ａ）を２mlの
0.1Mりん酸ナトリウムバツフアー中に溶解し
た。（振盪させた後）＋23℃で60分間反応を継続さ
せた。ついで過剰の試薬および他の望ましくない
低分子量成分をセフアデツクスＧ―25
（Pharmacia Fine Chemicals AB社製、エピクロ
ロヒドリンで交叉結合されたデキストランのビー
ズ）上でのゲル過により除去した（使用媒体は
前記と同じホスフエートバツフアーであつた）。 2.5mlの0.1Mりん酸ナトリウムバツフアー（PH
7.5）中における4.8mgのラビツト―抗ヒトFcγ―
抗体（免疫吸収精製によりラビツト血清から製造
された）を＋23℃で60分間13μのＮ―スクシン
イミジル―３（２―ピリジルジチオ）プロピオネ
ート（99.5％EtOH中11mM）と反応させた。過
剰の試薬をセフアデツクスＧ―25上でのゲル過
により除去した（使用媒体はPH5.0である0.1M酢
酸ナトリウム―0.3MNaClであつた）。変性抗体含
有の孔容積相当物質（ゲル過カラムの孔容積に
相当する容量の液で溶離される物質）を20分間
0.2mlの50mMジチオトレイトール（DTT）（PH
5.0）で還元した。過剰のDTTをセフアデツクス
Ｇ―25上でのゲル過により除去した（使用媒体
は0.3M NaClであつた）。 ３mlの0.3M NaCl中におけるこうしてチオール
化された抗体約2.1mgを前述の方法で製造された
α―アミラーゼ―２―ピリジルジスルフイド誘導
体（PH7.5である1.5mlの0.1Mりん酸ナトリウム―
0.3M NaCl中における約10mg）と混合した。＋４
℃で48時間反応を継続させついで望ましくない低
分子量成分をセフアデツクスＧ―25上でのゲル
過により除去した（使用媒体は0.3M NaClであつ
た）。 Ｎ―スクシンイミジル―３（２―ピリジルジチ
オ）プロピオネートは以下の方法で製造される。 1.9ｇ（8.5ミリモル）の２，2′―ジピリジルジ
スルフイドを10mlの酢酸エチル中に溶解する。10
mlの酢酸エチル中における0.9ｇ（8.6ミリモル）
の３―メルカプトプロピオン酸の溶液を撹拌しな
がら15分間滴加し、同時に0.5mg（２滴）の三弗
化ほう素エーテラートを反応混合物に加える。室
温で20時間振盪させた後反応混合物を蒸発させ
（回転蒸発器、＜40℃）そして固体の黄色残留物を
10mlの冷（＋４℃）酢酸エチル中でスラリーにし
ついで過する。0.68ｇ（５ミリモル）のＮ―ヒ
ドロキシスクシンイミドを液に加えついで10ml
の乾燥酢酸エチル中に溶解した1.03ｇ（５ミリモ
ル）のジシクロヘキシルカルボジイミドを室温で
撹拌しながら15分間滴加する。室温で５時間振盪
下で反応を継続させ、その間に反応混合物を＋４
℃に冷却しついで沈殿したジシクロヘキシルカル
バミドを去する。わずかに黄色の溶液を蒸発さ
せそして油状物をエタノール中に溶解しついで―
20℃で晶出させる。収率は45％でありそして融点
は78.5〜80.5℃であることが見出される。 ｂ ラビツト―抗ヒトFcγ―α―アミラーゼ接
合体による人血清中のサルモネラ抗体の定量分
析 Ｄ型のサルモネラＯ―抗原（9.12）をPH9.6で
ある冷0.1M炭酸ナトリウムバツフアー中0.02％
NaN3で希釈して５μｇ／mlにした。１mlの抗原
溶液を使い捨て可能なポリスチレン管中に注い
だ。これらの管を16時間＋４℃でインキユベート
した。 人の血清〔ゼロ型DOのサルモネラバクテリア
で感染された患者からとられた血清での系列およ
び人の正常血清（HNS）の系列〕をPBS〔PH7.2
の0.015Mりん酸ナトリウム、0.05％トウイーン
20（トウイーン20／ソルビタンモノ―オレアート
ポリオキシエチレン）、0.02％NaN3、0.9％
NaCl〕で100倍から100000倍に希釈した。前記に
したがつて調製された多数の管を0.9％Nacl―
0.05％トウイーン20で洗浄した。洗浄液のみたさ
れた管を１分間または２分間放置しついで水吸引
で空にした。これを２回繰り返した。 １mlの希釈された血清を各管中に注いだ（二重
試験）。ついでこれらの管を＋23℃で４時間イン
キユベートした。このインキユベーシヨン期中サ
ルモネラ抗原に対するあらゆる抗体が抗原で被覆
された管壁の部分に結合する。ついですべての他
の血清成分を除去するために管を再び洗浄した。 PBSで100倍に希釈された前記(a)により製造さ
れた接合体を管に加ええた（各管に対して１
ml）。ついで管を16時間インキユベートした。つ
いで過剰の接合体を前述で使用したのと同じ洗浄
操作を使用して洗浄し去つた。 α―アミラーゼは各管に１mlのジチオトレイト
ール（PBS中5mM）を加えることにより管壁に
結合された抗原―抗体の免疫化学的錯体（抗体―
酵素接合体）から放出された。ついで23℃で20分
間インキユベートし、１mlの水および「フアデバ
ス（Phadebas）」アミラーゼ試験用錠剤
（Pharmacia Diagnostics AB社製、非水溶性の交
叉結合された錠剤形態における青色殿粉）の半分
を加えた。管を激しく振盪し、ついで37℃で１時
間放置しその後100μｌの5MNaOHを加えること
により反応を中断させた。過により未溶解殿粉
ポリマーを除去後青色液の消光値が放出アミラ
ーゼの測定値として620nmにおいて測定された。
在下において前記反応が行なわれる液体中に不液
性の担体に結合される場合には、前記の担体は主
として前述の型の既知の方法に関連して知られて
いる任意の担体物質からなるものでありうる。か
かる担体の例としてはたとえば不溶性の有機また
は部分的に無機のポリマーたとえばセルロース、
交叉結合デキストラン、アガロース、交叉結合ポ
リアクリルアミド、交叉結合ポリスチレンおよび
ガラス誘導体があげられる。この担体とこれに結
合された成分との間の結合が本発明にしたがつて
開裂され得ないと考えられる場合には、その結合
は常套の結合であり得ることができ、すなわちそ
れは常套の型の共有結合すなわちいわゆる疎水性
結合からなりうる。相当する方法において、分析
的に指示可能な基と成分（）との間の結合は対
応因子と固形担体との間に本発明による開裂しう
る結合が存在し、しかも最初に述べた結合を開裂
させることが必要と見なされない場合には慣用の
結合でありうる。 次に本発明を多くの実施例に関して詳記する。 実施例 １ ラビツト―抗ヒトFcγ―α―アミラーゼ接合
体による人の血清中のサルモネラ抗体の定量分
析 ａ ラビツト―抗ヒトFcγ―α―アミラーゼ接
合体の調製 DEAE―セフアデツクス（登録商標）
Pharmacia Fine Chemicals AB社製、エピクロ
ロヒドリンで交叉結合されたジエチルアミノエチ
ル含有デキストランのビーズ）上でのイオン交換
クロマトグラフイーにより精製されたα―アミラ
ーゼ（シグマ社のバクテリア型Ａ）を２mlの
0.1Mりん酸ナトリウムバツフアー中に溶解し
た。（振盪させた後）＋23℃で60分間反応を継続さ
せた。ついで過剰の試薬および他の望ましくない
低分子量成分をセフアデツクスＧ―25
（Pharmacia Fine Chemicals AB社製、エピクロ
ロヒドリンで交叉結合されたデキストランのビー
ズ）上でのゲル過により除去した（使用媒体は
前記と同じホスフエートバツフアーであつた）。 2.5mlの0.1Mりん酸ナトリウムバツフアー（PH
7.5）中における4.8mgのラビツト―抗ヒトFcγ―
抗体（免疫吸収精製によりラビツト血清から製造
された）を＋23℃で60分間13μのＮ―スクシン
イミジル―３（２―ピリジルジチオ）プロピオネ
ート（99.5％EtOH中11mM）と反応させた。過
剰の試薬をセフアデツクスＧ―25上でのゲル過
により除去した（使用媒体はPH5.0である0.1M酢
酸ナトリウム―0.3MNaClであつた）。変性抗体含
有の孔容積相当物質（ゲル過カラムの孔容積に
相当する容量の液で溶離される物質）を20分間
0.2mlの50mMジチオトレイトール（DTT）（PH
5.0）で還元した。過剰のDTTをセフアデツクス
Ｇ―25上でのゲル過により除去した（使用媒体
は0.3M NaClであつた）。 ３mlの0.3M NaCl中におけるこうしてチオール
化された抗体約2.1mgを前述の方法で製造された
α―アミラーゼ―２―ピリジルジスルフイド誘導
体（PH7.5である1.5mlの0.1Mりん酸ナトリウム―
0.3M NaCl中における約10mg）と混合した。＋４
℃で48時間反応を継続させついで望ましくない低
分子量成分をセフアデツクスＧ―25上でのゲル
過により除去した（使用媒体は0.3M NaClであつ
た）。 Ｎ―スクシンイミジル―３（２―ピリジルジチ
オ）プロピオネートは以下の方法で製造される。 1.9ｇ（8.5ミリモル）の２，2′―ジピリジルジ
スルフイドを10mlの酢酸エチル中に溶解する。10
mlの酢酸エチル中における0.9ｇ（8.6ミリモル）
の３―メルカプトプロピオン酸の溶液を撹拌しな
がら15分間滴加し、同時に0.5mg（２滴）の三弗
化ほう素エーテラートを反応混合物に加える。室
温で20時間振盪させた後反応混合物を蒸発させ
（回転蒸発器、＜40℃）そして固体の黄色残留物を
10mlの冷（＋４℃）酢酸エチル中でスラリーにし
ついで過する。0.68ｇ（５ミリモル）のＮ―ヒ
ドロキシスクシンイミドを液に加えついで10ml
の乾燥酢酸エチル中に溶解した1.03ｇ（５ミリモ
ル）のジシクロヘキシルカルボジイミドを室温で
撹拌しながら15分間滴加する。室温で５時間振盪
下で反応を継続させ、その間に反応混合物を＋４
℃に冷却しついで沈殿したジシクロヘキシルカル
バミドを去する。わずかに黄色の溶液を蒸発さ
せそして油状物をエタノール中に溶解しついで―
20℃で晶出させる。収率は45％でありそして融点
は78.5〜80.5℃であることが見出される。 ｂ ラビツト―抗ヒトFcγ―α―アミラーゼ接
合体による人血清中のサルモネラ抗体の定量分
析 Ｄ型のサルモネラＯ―抗原（9.12）をPH9.6で
ある冷0.1M炭酸ナトリウムバツフアー中0.02％
NaN3で希釈して５μｇ／mlにした。１mlの抗原
溶液を使い捨て可能なポリスチレン管中に注い
だ。これらの管を16時間＋４℃でインキユベート
した。 人の血清〔ゼロ型DOのサルモネラバクテリア
で感染された患者からとられた血清での系列およ
び人の正常血清（HNS）の系列〕をPBS〔PH7.2
の0.015Mりん酸ナトリウム、0.05％トウイーン
20（トウイーン20／ソルビタンモノ―オレアート
ポリオキシエチレン）、0.02％NaN3、0.9％
NaCl〕で100倍から100000倍に希釈した。前記に
したがつて調製された多数の管を0.9％Nacl―
0.05％トウイーン20で洗浄した。洗浄液のみたさ
れた管を１分間または２分間放置しついで水吸引
で空にした。これを２回繰り返した。 １mlの希釈された血清を各管中に注いだ（二重
試験）。ついでこれらの管を＋23℃で４時間イン
キユベートした。このインキユベーシヨン期中サ
ルモネラ抗原に対するあらゆる抗体が抗原で被覆
された管壁の部分に結合する。ついですべての他
の血清成分を除去するために管を再び洗浄した。 PBSで100倍に希釈された前記(a)により製造さ
れた接合体を管に加ええた（各管に対して１
ml）。ついで管を16時間インキユベートした。つ
いで過剰の接合体を前述で使用したのと同じ洗浄
操作を使用して洗浄し去つた。 α―アミラーゼは各管に１mlのジチオトレイト
ール（PBS中5mM）を加えることにより管壁に
結合された抗原―抗体の免疫化学的錯体（抗体―
酵素接合体）から放出された。ついで23℃で20分
間インキユベートし、１mlの水および「フアデバ
ス（Phadebas）」アミラーゼ試験用錠剤
（Pharmacia Diagnostics AB社製、非水溶性の交
叉結合された錠剤形態における青色殿粉）の半分
を加えた。管を激しく振盪し、ついで37℃で１時
間放置しその後100μｌの5MNaOHを加えること
により反応を中断させた。過により未溶解殿粉
ポリマーを除去後青色液の消光値が放出アミラ
ーゼの測定値として620nmにおいて測定された。
【表】
こうして抗体が105倍に希釈された患者の血清
中に検出され得た。盲試験は非常に低い消光値を
与えた。管壁上に吸収された免疫鎖体からのα―
アミラーゼの還元分裂が除外された対応する試験
は（A620／時間）0.01の消光値を与えた。 実施例 ２ ラビツト―抗ヒトFcγ―α―アミラーゼ接合
体による人の血清中におけるサルモネラ抗体の
定量分析 酵素活性が可溶性殿粉を使用して試験された以
外は実施例１を繰り返した。さらにα―アミラー
ゼの還元分裂をせずに対応する試験が実施され
た。 錠剤粉を用いるフエデバスアミラーゼ試験のか
わりにこの試験における各管に１mlの殿粉（PBS
中の２％）を加えた。37℃で60分間インキユベー
トした後0.5mlの３，５―ニトロサリチル酸溶液
（１ｇの３，５―ジニトロサリチル酸を40ml
NaOH＋30mlH2O中に溶解しついで30ｇの酒石酸
カリウムナトリウムを加えそしてその溶液をH2O
で100mlに希釈することにより製造された）を加
えた。各管を沸騰水浴中で５分間加熱しそして各
管からの５mlを５ml蒸留水を含有する管に移し
た。生成溶液の消光値はλ＝500nmにおいて10分
後に測定された。 結果は以下の表に示されている。
中に検出され得た。盲試験は非常に低い消光値を
与えた。管壁上に吸収された免疫鎖体からのα―
アミラーゼの還元分裂が除外された対応する試験
は（A620／時間）0.01の消光値を与えた。 実施例 ２ ラビツト―抗ヒトFcγ―α―アミラーゼ接合
体による人の血清中におけるサルモネラ抗体の
定量分析 酵素活性が可溶性殿粉を使用して試験された以
外は実施例１を繰り返した。さらにα―アミラー
ゼの還元分裂をせずに対応する試験が実施され
た。 錠剤粉を用いるフエデバスアミラーゼ試験のか
わりにこの試験における各管に１mlの殿粉（PBS
中の２％）を加えた。37℃で60分間インキユベー
トした後0.5mlの３，５―ニトロサリチル酸溶液
（１ｇの３，５―ジニトロサリチル酸を40ml
NaOH＋30mlH2O中に溶解しついで30ｇの酒石酸
カリウムナトリウムを加えそしてその溶液をH2O
で100mlに希釈することにより製造された）を加
えた。各管を沸騰水浴中で５分間加熱しそして各
管からの５mlを５ml蒸留水を含有する管に移し
た。生成溶液の消光値はλ＝500nmにおいて10分
後に測定された。 結果は以下の表に示されている。
【表】
(注) 上記消光値はジチオトレイトール
の効果に関して修正された値である。
実施例 ３ 人の血清アルブミン―α―アミラーゼ接合体に
よるラビツト―抗ヒト血清アルブミン―抗体の
分析 ａ アルブミン―α―アミラーゼ接合体の調製 PH7.5である１mlの0.1Mりん酸ナトリウムバツ
フアー中における８mgの人の血清アルブミンを12
μｌのＮ―スクシンイミジル―３（２―ピリジル
ジチオ）プロピオネート（99.5％エタノール中
40mM）と混合した。＋23℃で40分間反応させた
後反応混合物をセフアデツクスＧ―25カラム上で
ゲル過した（使用媒体は前述と同じホスフエー
トバツフアーであつた）。孔容積相当物質的２ml
はアルブミン―２―ピリジルジスルフイド誘導体
を含有していた。誘導体還元後に遊離された２―
チオピリドンの量の分光測分析では2.5モルチオ
ール／モルアルプミンの置換度が示された。 20mlのα―アミラーゼをPH7.5である1.5mlの
0.1Mりん酸ナトリウムバツフアー中に溶解し
た。150μｌのＮ―スクシンイミジル―３（２―
ピリジルジチオ）―プロピオネート（99.5％エタ
ノール中40mM）を加えそして反応を＋23℃60分
間継続させた。過剰試薬および他の望ましくない
低分子量成分をセアデツクスＧ―25上でのゲル
過により除去した（使用媒体は前述と同じホスフ
エートバツフアーであつた）。 ついで生成されたα―アミラーゼ―２―ピリジ
ルジスルフイド誘導体（約2.5ml中20mg）を20分
間＋23℃において10mgのジチオトレイトールで還
元した。ついで過剰のジチオトレイトールをセフ
アデツクスＧ―25上でのゲル過により除去した
（使用媒体は0.3M NaClであつた）。 3.5mlの0.3M NaCl中におけるチオール化され
たα―アミラーゼ（約0.7モルSH／モル蛋白質を
含有する約20mg）をPH7.5である1.4mlの0.1Mりん
酸ナトリウムバツフアー中における5.6mgのアル
ブミン―２―ピリジルジスルフイド誘導体と混合
した。＋４℃で18時間反応を継続させた。ついで
反応混合物をセフアデツクスＧ―200上で分離さ
せた（使用媒体は0.3M NaClであつた）。種々の
フラクシヨン分析の際、天然アミラーゼよりも大
きい分子量を有するα―アミラーゼ活性物質が見
出された。測定された分子量は１個のアルブミン
分子および１〜２個のα―アミラーゼ分子からな
るオリゴマーに相当した。 接合体を含有したフラクシヨンを一緒にし、こ
れを＋４℃で0.3M NaCl中に貯蔵した（約10mg蛋
白質／ml）。 ｂ 人の血清アルブミン―α―アミラーゼ接合体
によるラビツト―抗ヒト血清アルブミン―抗体
の分析 100μｇ人の血清アルブミン（HSA）／mlを含
有するPH７の１mlの0.05Mりん酸Naバツフアーを
使い捨て用ポリスチレン試験管に加えた。各管を
３時間37℃でインキユベートした。ついで管を
0.3％デキストラン、0.9％NaClおよび0.5％トウ
イーンを含有する0.05Mりん酸ナトリウム含有バ
ツフアー（PH7.4）（PDT―バツフアー）３×２ml
で洗浄した。ラビツト―抗HSA―血清をPDT―
バツフアーで10〜104倍に希釈した。各希釈液の
0.5mlを前述にしたがつて処理された管中に注い
だ。同数の盲試験が同一方法で希釈さされた0.5
mlのラビツト―正常血清（RNS）を用いて準備
された。各管を＋23℃で３時間放置した。ついで
管を３×２mlのPDT―バツフアーで洗浄し、こ
れに前記(a)からのHSA―α―アミラーゼ接合体
0.5mlを加えた。過剰の接合体を３×１mlのPDT
―バツフアーで洗浄除去した。PH７である0.05M
りん酸ナトリウムバツフアー中における0.5mlの
10mMジチオトレイトール（DTT）をこれらの管
に加えた。15分後、管中の液相を、フエデバスα
―アミラーゼ試験用錠剤1/4を含有する0.5ml蒸留
水をその中に有する管に移した。振盪後これらの
管を37℃で２時間インキユベートし、ついで未溶
解殿粉基質を遠心分離しそして上澄み液の消光を
620nmにおいて測定した。 結果は使用血清に関するラビツト―抗HSA―
抗体が104倍に希釈された血清中に検出され得、
他方RNSに関する盲試験が試料血清中A620―値
10％という実測値を与えたということを示した。
管壁上に吸収された免疫錯体からのα―アミラー
ゼの還元分裂を省いた比較試験では（A620）
0.02の消光値が得られた。 実施例 ４ ヒツジ―抗ラビツトIgG―抗体―デキストラン
―α―アミラーゼ接合体によるラビツト―抗ヒ
ト血清アルブミン―抗体の分析 ａ ヒツジ―抗ラビツトIgG―抗体―デキストラ
ン―α―アミラーゼ接合体の調製 １ｇのブロモヒドロキシプロピルデキストラン
を12.5mlの蒸留水中に溶解し、これに3.8ｇの
Na2S2O3×7H2Oを加えた。100℃で３時間反応を
継続させた。ついで混合物をH2O（24時間は２×
２そして６時間は１×10）に対して透析し
た。 透析袋の内容物を凍結乾燥させ、以下これをブ
ンテ塩デキストランと称する。分析によりデキス
トラン誘導体は2.1ミリモルＳ／ｇ乾燥誘導体を
含有していることが示された。１ｇのブンテ塩デ
キストランを10mlの50％エタノール―50％0.1N
りん酸ナトリウムバツフアー（PH8.3）中に溶解
した。0.7ｇの２，2′―ジピリジルジスルフイド
を加えそして混合物を60℃に加熱し、この温度で
24時間維持した。ついで反応混合物を50％エタノ
ール３×３（６時間の各透析）および蒸留水３
×３（２時間の各透析）に対して透析した。 2.6mgのヒツジ―抗ラビツトIgG―抗体
（Na2SO4沈殿によりヒツジの血清から製造され
た）を１mlの0.1Mりん酸ナトリウムバツフアー
（PH7.5）中に溶解した。120μのＮ―スクシン
イミジル―３（２―ピリジルジチオ）プロピオネ
ート（99.5％エタノール中1.6mM）を加えついで
振盪させた後＋23℃で30分間反応を継続させた。
ついで反応混合物をセフアデツクスＧ―25上でゲ
ル過した（使用媒体はPH5.0の0.1M酢酸ナトリ
ウムバツフアーであつた）。孔容積相当物質（2.5
ml）（２―ピリジルジスルフイドヒツジ―抗ラビ
ツトIgG―抗体誘導体）を64μの50mMジチオ
トレイレールで還元した。＋23℃で15分経た後過
剰のジチオトレイトールをセフアデツクスＧ―25
上でのゲル過により除去した（使用媒体は
0.3M NaClであつた）。3.5mlの孔容量が得られ
た。（1.5ml中における）2.4mgのチオール化され
たα―アミーゼ（実施例１に記載の方法で製造さ
れた）および3.5ml中における2.6mgのチオール化
されたヒツジ―抗ラビツトIgG―抗体（前述参
照）をPH7.5において１mlの0.1Mりん酸ナトリウ
ムバツフアー中における1.6mgの２―ピリジルジ
スルフイドデキストランと混合した。振盪後、混
合物を10分間放置しついで媒体として0.3M NaCl
を用いてセフアローズ6B（Pharmacia Fine
Chemicals AB社製、アガロースのビーズ）上で
ゲル過した。接合体含有フラクシヨンを一緒に
した。 ｂ ヒツジ―抗ラビツトIgG―抗体―デキストラ
ン―α―アミラーゼ接合体によるラビツト―抗
ヒト血清アルブミン抗体の分析 50個のデイスク状ナイロンネツト（直径８mm、
重量1.5mg／ネツト）を＋23℃で30分間50mlの3M
HCl中において部分的に加水分解しついでこれを
J.Immunol.第113巻（1974）第517頁の記載にし
たがつて0.1％グルタルジアルデヒドで活性化し
た。活性化されたナイロンネツトをPH７の0.05M
りん酸ナトリウムバツフアーで洗浄しついで人の
血清アルブミン（HSA）（0.5mg／ml）を含有する
20mlの0.9％NaClに移した。＋23℃で60分経た後
移動されたHSAを0.9％HaClで洗浄除去しそして
結合れたHSAを有するナイロンネツトを30分間
23℃で50mlのNaBH4（0.4mg／ml）で処理して
HSAとナイロンマトリツクスとの間に安定な共
有結合を生成させた。最後にナイロンネツトを
PDT―バツフアーで洗浄した。ラビツト―抗
HSA―血清をPDTバツフアーで10〜104倍に希釈
した。200μの各希釈液を３時間23℃において
試験管中で１個のナイロンネツトと共にインキユ
ベートした。同じ方法で希釈された200μのラ
ビツトの正常血清（RNS）を用いて同数の盲試
験が準備さされた。ついでナイロンネツトを３×
２mlPDTバツフアーで洗浄した。 前記(a)からの抗体―デキストラン―α―アミラ
ーゼ接合体を10倍に希釈しそしてこうして得られ
た溶液の20μを＋23℃で16時間ナイロンネツト
（前述にしたがつて製造された）でインキユベー
トした。過剰の接合体を傾瀉除去しついでナイロ
ンネツトを３×２mlPDTバツフアーで洗浄し
た。 α―アミラーゼ活性（α―アミラーゼを分裂さ
せたものおよびこれを分裂させなかつたもの）は
実施例１に記載のと同様の方法で測定された。 使用血清を用いれば10〜104倍に希釈されるラ
ビツト―抗ヒト血清アルブミン抗体を観察するこ
とが可能であつた。RNSに関する盲試験では前
記範囲内に相当する希釈度で得られた測定値の
10％のα―アミラーゼ活性を得た。 実施例 ５ ヒト血清アルブミン―グルタチオン―フルオレ
セイン接合体によるラビツト―抗ヒト血清アル
ブミン抗体の分析 ａ アルブミン―グルタチオン―フルオレセイン
接合体の調製 100mgのフルオレセインイソチオシアネートを
４mlの蒸留水中において35mgの酸化グルタチオン
と反応させた。90分間一定のPH値（PH９）で反応
を継続させた。反応混合物を100mlのセフアデツ
クスＧ―25カラム上でゲル過した（使用媒体は
0.3M NaClであつた）、全容量に相当するフラク
シヨンをスラリーにした（A493＝41.2を有する
10.3ml）。PHをほう酸ナトリウムバツフアーで９
に調整した。次いで容液をPH９の0.1Mほう酸ナ
トリウムバツフアーで平衡に保たれた、2.2mlの
メルカプトヒドロキシプロピルアガロース
〔Acta Chem.Scand、第B29巻（1975）第471―
474頁にしたがつてアガロースのビーズセフアロ
ース6B）から製造、660μモルSH／ｇ乾燥ゲル
を含有するゲルとして使用された〕を含有するカ
ラムにポンプで通過させた。流れは10ml／時間で
あつた。溶離物をPH４の1M酢酸ナトリウム中で
スラリーにしてそのフルオレセインおよびチオー
ル含有量を測定した。以下の試験では1.19nMチ
オール濃度および0.60mMフルオレセイン濃度を
有するフラクシヨン（３ml）が使用された。 20mgのヒト血清アルブミンを１mlの0.1Mりん
酸ナトリウムバツフアー（PH7.5）中に溶解し、
これに150μの40mM Ｎ―スクシンイミジル―
３―（２―ピリジルジチオ）プロピオネート
（99.5％エタノール中）を加えた。振盪後、混合
物を＋23℃で40分間放置した。ついで過剰の試薬
をセフアデツクスＧ―25上でのゲル過により除
去した（使用媒体はPH7.5の0.1Mりん酸ナトリウ
ムバツフアであつた）。３mlの孔容積相当物質
（19mgの２―ピリジルジスルフイドアルブミン）
を３mlのグルタチオン―フルオレセインと混合し
た。混合物を室温で30分放置しついで媒体として
0.9％NaClを用いてセフアデツクスＧ―25上でゲ
ル過した。分析により孔容積相当物質（９ml）
はアルブミン１モル当り約3.5ミリモルのフルオ
レセインを有していて17.1mgのアルブミンを含有
していることが示された。 ｂ ヒト血清アルブミン―グルタチオン―フルオ
レセイン接合体によるラビツト―抗ヒト血清ア
ルブミン―抗体の分析 実施例３に記載と同じ方法で管壁をHSAで被
覆しそしてラビツト―抗HSA―血清でインキユ
ベートした。 こうして得られた管に(a)により製造された0.5
mlの操合体（1.9ml接合体／ml）を加えた。各管
を23℃で16時間インキユベートし、ついで過剰の
接体を傾瀉しそして３×２mlのPDTバツフアー
で洗浄除去した。 これらの管に１mlのジチオトレイトール（蒸留
水中25mM、PH７）を加えた。15分後、液相を螢
光測定のためセルに移しそして螢光強度を消光用
波長としての473nmおよび放射波長としての
530nmにおいて測定した。 使用された血清を用いれば１〜50倍希釈の血清
中において螢光を検出することが可能であつた。
RNSで得られた螢光強度はそれぞれの対応する
試験値の10％であつた。 上記試験が実施された方法（すなわち管壁に結
合させて行なう）のために、勿論螢光ラベルを分
裂させずに測定を行なうことは不可能であつた。
しかしながら、接合体のみ上で行なわれた螢光測
定は接合体分裂後に比較的強い螢光強度が得られ
るということを示した。 実施例 ６ セフアデツクス―イヌ血清アルブミン接合体お
よび125I―ラベルされたラビツト―抗ヒトIgE
―抗体によるイヌ―血清アルブミン特異性IgE
の分析 ａ セフアデツクス―イヌ血清アルブミン接合体
の調製 36ｇのセフアデツクスＧ―15（Pharmacia
Fine Chemicala AB社製、エピロクロロヒドリ
ンで交鎖結合されたデキストランのビーズ）を
200mlの0.5M NaOH中に懸濁させた。17mlの１―
クロロ―２，３―エポキシプロパンを23℃で５分
間に滴加した。ついで温度を60℃に上昇させそし
て２時間反応を継続させた。ついで生成物を水お
よび0.5Mりん酸ナトリウムバツフアー（PH6.5）
で洗浄しそして200mlのこのバツフアー中に懸濁
した。100ｇのNa2S2O3×7H2Oを加えて２時間反
応を行なわせ、ついでブフナー斗上で水洗し
た。生成物を全量200mlの0.1M NaHCO3（PH
8.3）中における2.8ｇのジチオトレイトール
（DTT）で処理した。60分間反応させた後、生成
物を1mM酢酸ついで50％アセトンを含有する
0.05M NaHCO3―1mMEDTAで洗浄した。生成
物を40mlの後記溶液中に懸濁し、これに２，2′―
ジピリジルジスルフイドを0.15M濃度まで溶解し
た。23℃で60分間反応を継続させた。ついで600
mlの水を加え、さらに60分間反応を継続させその
後生成物を水洗し、アセトンで収縮しついで青色
ゲル上で乾燥させた。こうして得られた生成物は
乾燥誘導体１ｇ当たり約40μモルの２―ピリジル
ジスルフイド構造を有していることが見出され
た。 20mgのイヌ血清アルブミンを２mlの0.1Mりん
酸ナトリウムバツフアー（PH7.5）中に溶解した
が、これはメルカプトエタノールに関して25mM
であつた。60分後、過剰のメルカプトエタノール
をセフアデツクスＧ―25上でのゲル過により除
去した（使用媒体はPH7.5である0.1Mりん酸ナト
リウムバツフアーであつた）。 １ｇのセフアデツクス誘導体（前記参照）を膨
潤させそして0.1Mりん酸ナトリウムバツフアー
（PH7.5）中で洗浄しついでこのバツフアー２ml中
に懸濁した。この懸濁液に前述にしたがつて処理
されたアルブミン（3.5ml）を加えた。23℃で36
時間密閉容器中において懸濁液を回転させること
により振盪下で反応を実施した。ついでこうして
得られたセフアデツクス―アブミン接合体をガラ
スフイルター斗上においてPH5.0である0.1酢酸
ナトリウム―0.3M NaClで洗浄しついで10mlのこ
の溶液中に懸濁し、その後40mgのグルタチオンを
加えて反応されないピリジルジスルフイド構造を
除去した。23℃で３時間反応させた後生成物を
0.9％NaClで洗浄しそして0.9％NaCl中の懸濁液
形態で貯蔵した。 ｂ セフアデツクス―イヌ血清アルブミン接合体
および125I―ラベルされたラビツト―抗ヒト
IgE―抗体によるイヌ血清アルブミン特異性
IgEの分析 前記(a)からの懸濁液を遠心分離し、ついで上澄
み液を吸引により除去した。セフアデツクス―ア
ルブミン接合体を10mlのPDT―バツフアーで洗
浄し、ついで10mlのPDTバツフアー中に再懸濁
させた。200μの懸濁液をエレルマン管に詰め
た。容量をPDT―バツフアーで400μに調整
し、ついでイヌ血清アルブミンに対する特異性
IgEを含有する100μのヒト血清を加えた。こ
うして得られた懸濁液を23℃で３時間回転下でイ
ンキユベートした。遠心分離で３回洗浄し、吸引
により除去しそしてPDTを添加してから125I―抗
IgE（15ng、94200cpm、Pharmacia Diagnostics
AB社製「Phadebas」（登録商標）RASTアイソ
トープ試薬）を加えた。各管を23℃で一夜インキ
ユベートした。前述のように３回洗浄した後セフ
アデツクス接合体に結合体に結合された放射能を
γ―カウンターを用いて慣用手段で分析した。つ
いで125I―含有免疫錯体をPH7.5の0.1Mりん酸ナ
トリウムバツフアー―0.3M NaCl中における
20mM DTT 0.5mlを加えることにより担体から
分裂させた（撹拌しながら室温で３時間反応）。
生成物を遠心分離した後200μの上澄み液を除
去しそして放出された放射能を測定した。 セフアデツクス―接合体上において125I―含有
免疫錯体の分裂前に測定の場合には29149cpmの
測定結果が得られそして上記の免疫錯体分裂の後
には6248cpm（200μ上澄み液中）の測定値が
得られたが、このことは活性の78％が分裂により
液相中において移動されたことを意味している。 実施例 ７ ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―α―アミラーゼ―
多錯体接合体によるヒトγ―グロプリンの分析 ａ ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―α―アミラーゼ
―多錯体接合体の調製 30mgのα―アミラーゼ（実施例１におけるのと
同じ型で同じ前処理をしたもの）をPH7.5である
4.5mlの0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M NaCl中に
溶解した。無水EtOH中における100μの50mM
Ｎ―スクシンイミジル―３（２―ピリジルジチ
オ）プロピオネートを５分間隔で25μずつ加え
た。＋25℃で40分経た後反応混合物をセフアデツ
クスＧ―25上でゲル過し（使用媒体はPH7.5で
ある0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M NaClであつ
た）、過剰の反応成分および低分子反応生成物を
除去した。変性α―アミラーゼ（２―ピリジル―
ジスルフイド―α―アラミラーゼ）は８mlであつ
た。２―ピリジルジスルフイド基に関する置換度
は3.7μモルの２―ピリジルジスフイド基／50mg
のα―アミラーゼであることが見出された。 無水EtOH中における400μの50mM Ｎ―ス
クシンイミジル―３（２―ピリジルジチオ）プロ
ピオネートを５分間隔で100μずつ加える以外
は前述のようにして別の２―ピリジルジスルフイ
ド―α―アミラーゼ誘導体が製造された。この誘
導体の置換度は7.5μモルの２―ピリジルジスル
フイド基／50mgのα―アミラーゼであることが見
出された。 PH7.5である0.75mlの0.1Mりん酸ナトリウム―
0.3M NaCl中におけるα―アミラーゼ50mg当たり
3.7μモルの２―ピリジルジスルフイド基を含有
する2.5mgの２―ピリジルジスルフイド―α―ア
ミラーゼを50μの50mMジチオトレイトールと
混合しついで＋25℃で10分間還元した。過剰のジ
チオトレイトールおよび低分子反応生成物をセフ
アデツクスＧ―25上でのゲル過により除去した
（使用媒体は0.3M NaClであつた）。 2.3mgのチオール―α―アミラーゼを含有する
孔容積相当物質2.5mlを0.75mlの0.1Mりん酸ナト
リウム―0.3M NaCl中におけるα―アミラーゼ50
mg当たり7.5μモルの２―ピリジルジスルフイド
基を含有する1.5mgの２―ピリジルジスルフイド
―α―アミラーゼと混合した。＋25℃で60分間反
応させた後無水EtOH中における50μの
20mM2，2′―ジピリジルジスルフイドの添加に
より反応を中断した。１滴のトウイーン20を加え
そして混合物をセフアロース6Bのカラム上でク
ロマトグラフイーにかけた（80mlの全容量）（使
用媒体は0.3M NaCl―0.5％トウイーン20であつ
た）。2.4μモルの２―ピリジルジスルフイド基を
含有するml当たり約0.19mgのα―アミラーゼ凝集
体を含有する孔容積相当物質（約15ml）が得ら
れ、これを＋４℃で貯蔵した。 PH6.0を有する2.4mlの0.1Mりん酸ナトリウム―
0.3M NaCl中における６mgのヒツジ―抗ヒトIgG
―抗体〔ヒトの電気泳動精製されたγ―グロブリ
ンをCNBr―活性化セフアロース4Bに結合させる
ことにより製造されたγ―グロブリン―アガロー
ス収着剤で精製された免疫収着剤〕を無水EtOH
中における20μの50mM Ｎ―スクシンイミジ
ル―３（２―ピリジルジチオ）プロピオネートと
混合した。＋25℃で20分経た後、過剰の試薬をセ
フアデツクスＧ―25における反応混合物のゲル
過により除去した（使用媒体はPH5.0である0.1M
酢酸ナトリウム―0.3M NaClであつた）。約5.5mg
の２―ピリジルジスルフイド抗体を含有する孔容
積相当物質約3.0mlが得られ、これれを蒸留水中
0.2mlの50mMジチオトレイトールと反応させ
た。25分間反応させた後、過剰のジチオトレイト
ールをセフアデツクスＧ―25上における反応混合
物のゲル過により除去した（使用媒体は0.3M
NaClであつたた）。160mgの蛋白質当たり約２μ
モルSH基の置換度を有する約５mgの変性抗体を
含有する孔容積相当物質5.0mlが得られた。 0.2mlの0.3M NaCl中におけるこうしてチオー
ル化された約0.2mgの抗体を2.0mlの0.1Mりん酸ナ
トリウム―0.3M NaCl―0.5％トウイーン20中に
おける0.4mgのα―アミラーゼ凝集体（前述参
照）を混合した。ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―α
―アミラーゼ多錯接合体を含有する反応混合物を
＋４℃で貯蔵した。 ｂ ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―α―アミラーゼ
多錯接合体を使用してのγ―グロブリンの分析 約400ngの抗体を含有する約50ngのアガロース
―ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体誘導体（乾燥誘導
体）（CNBr―活性化セフアロース4Bに免疫収着
剤で精製されたヒツジ―抗ヒトIgG―抗体を結合
させることにより製造）を300μの0.3M NaCl
―0.5％トウイーン20中に懸濁し、これを100μ
の0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M NaCl―0.5％ト
ウイーン20（PH7.4）中に溶解された種々の量
（１〜500ng）のヒトγ―グロブリンを含有する
一連のポリスチレン管の各管（３ml）に加える。
バツフアーのみを含有する多数の管およびアミノ
エチル―アガロース（CNBr―活性化セフアロー
ス4Bにエタノールアミンを結合させることによ
り製造）を含有する多数の管がブランクとして使
用された。 各管を注意深く振盪させながら＋25℃で約18時
間インキベートした。ついで各管のアガロースゲ
ルを６×２mlの0.3M NaCl―0.5％トウイーンを
用いて遠心分離―傾瀉操作を繰り返すことにより
洗浄した。 最後の洗浄後、上澄み液を吸引除去して0.3ml
にしてそして各管にヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―
α―アミラーゼ―多錯接合体（抗体に関して約
400ng）を含有する前記実施例７(a)からの反応混
合物の100μを加えついでこれを＋25℃で４時
間注意深く振盪させながらインキユベートした。
各管の固体物質を６×２mlの0.3M NaCl―0.5％
トウイーン20で前述のように再び洗浄した。 PH８である0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M
NaCl中における1.0mlの10mMジチオトレイトー
ルを各管（0.3ml懸濁液）に加えた。60分間還元
後（この間にα―アミラーゼ―多錯体は固定され
た免疫錯体から遊離されそして分裂されてより小
さな単位になつた）、フアデパスアミラーゼ試験
用懸濁液（１錠剤／４ml）1.0mlを加えそして各
管を＋25℃で60分間再びインキユベートしついで
0.5mlの0.5M NaOHの添加により反応を停止し
た。溶解されなかつた澱粉ポリマーを過により
除去後、青色液の消光を620nmにおいて測定し
た。消光値は遊離されたα―アミラーゼ活性に比
例し、これは結合された接合体の量に比例し、つ
いでこれは結合されたγ―グロブリンの量に比例
しそしてこのようにして試験溶液のγ―グロブリ
ン濃度の測定値が得られる、ヒトγ―グロブリン
がこのようにして＜1ng／mlの濃度まで検出され
得た。 実施例 ８ ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―β―ガラクトシダ
ーゼ接合体によるヒトガンマーグロブリンの分
析 ａ ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―β―ガラクトシ
ダーゼ接合体の調製 20μの8mM Ｎ―スクシンイミジル―３（２
―ピリジルジチオ）プロピオネート（99.5％
EtOH中の）を＋25℃で60分間撹拌しながら0.6ml
の0.1Mりん酸ナトリウム―1mM MgCl2（PH
7.0）中における２mgのヒツジ―抗ヒトIgG―抗体
〔CNBr―活性化セフアロース4Bにヒトの電気泳
動精製されたガンマーグロブリンを結合させるこ
とにより製造、アガロース―ヒトγグロブリン収
着剤で精製された免疫収着剤〕に徐々に加えた。
ついで反応混合物をセフアデツクスＧ―25のカラ
ム上でゲル過し（使用媒体は前述と同じホスフ
エートバツフアーであつた）そして約1.8mgの２
―ピリジルジスルフイド置換抗体を含有する孔容
量相当物質（1.5ml）を得た。 PH7.0である0.5mlの0.1Mりん酸ナトリウム―
1mM MgCl2中における1.3mgのβ―ガラクトシダ
ーゼ（Bochringer Mannheim、GmbH製）をセ
フアデツクスＧ―25のカラム上でゲル過した。
1.5ml中における約1.2mgの孔容量相当物質を1.5ml
の0.1Mりん酸ナトリウム―1mM MgCl2中におけ
る1.8mgの２―ピリジルジスルフイド含有抗体
（前述参照）と混合した。ついで＋４℃で約48時
間反応を行なわせ、その後反応混合物をセフアロ
ース6Bのカラム上でゲル過した使用媒体は
0.3M NaClであつた）。650000〜800000の分子量
を有するβ―ガラクトシダーゼ―抗体オリゴマー
を含有する各フラクシヨンを得た。こうして得ら
れた物質を＋４℃で貯蔵した。 ｂ ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―β―ガラクトシ
ダーゼ接合体によるヒトガンマーグロブリン分
析 分析はいわゆるサンドイツチ法を使用して実施
された。１mlの懸濁液当たり約0.45mgの抗体を含
有するアガロース―ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体誘
導体〔CNBr―活性化セフアロース4Bに免疫収着
剤で精製されたヒツジ―抗ヒトIgG―抗体を結合
させることにより製造〕の50μ懸濁液をPH7.5
である100μの0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M
NaCl―0.5％トウイーン中に溶解された種々の量
のヒトガンマーグロブリン（0.1〜250ng）を有す
る一連の試験管の各々に加えた。バツフアーだけ
の多数の管およびアミノエチルアガロース
〔CNBr―活性化セフアロース4Bにエタノールア
ミンを結合させることにより製造〕を含有する多
数の管がブランクとして使用された。各管を注意
深く振盪させながら＋25℃で18時間インキユベー
トした。ついで各管のアガロースゲルを実施例７
に記載のように洗浄した。 ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―β―ガラクトシダ
ーゼ接合体（前述のように製造されたオリゴマー
接合体）を含有する２μの0.3M NaClを洗浄さ
れたアガロース懸濁液（約0.3ml／管）を含有す
る各管に加ええた。ついで各管を注意深く振振盪
させながら＋25℃で４時間インキユベートした。
ついで各管のアガロースゲルを実施例７に記載の
ように洗浄した。0.1mlの1Mβ―メルカプトエタ
ノールを各アガロース懸濁液に加えた。＋25℃で
30分間還元を行なわせしめた。この還元によりア
ガロース誘導体上に固定された免疫錯体から天然
形態におけるβ―ガラクトシダーゼを単離させ
た。 ついでPH7.0である0.1Mりん酸ナトリウム―
1mM MgCl2中における0.2mlのｏ―ニトロフエニ
ル―β―Ｄ―ガラクトシド（10.5mg／ml）を加え
ついで単位時間当たりに生成されたｏ―ニトロフ
エノラートの量の分光測光（420nmにおいて）に
より単離されたβ―ガラクトシダーゼ活性を測定
した。単離されたβ―ガラクトシダーゼ活性は結
合された接合体の量に比例し、ついでこれは結合
されたガンマーグロブリンの量に比例しそしてこ
のようにして試験溶液のガンマーグロブリン濃度
の測定値が得られる。このようにしてヒトガンマ
ーグロブリンが＜1ng／mlの濃度まで検出され得
た。 実施例 ９ アガロースコンカナバリンを包含する競合系に
おける２―ピリジルジスルフイドデキストラン
誘導体によるデキストラン分析 100μの一定のアガロース―コンカナバリン
〔ConA―セフアロース4B、Pharmacia Fine
Chemicals AB製〕およびPH7.5である200μの
0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M NaClを８個のエ
レルマン管の各々に加えた。ついで500μの蒸
留水中における0.2mgの２―ピリジルジスルフイ
ドデキストラン（実施例４にしたがつて製造）を
各管に加えた。ついで各管を注意深く撹拌しなが
ら＋25℃で20分間インキユベートし、その後種々
の量のデキストラン（デキストランＴ―40、
Pharmacia Fine Chemicals AB製）を含有する
PH7.5である100μの0.3M NaCl―0.1Mりん酸ナ
トリウムを管の６個に加えた。残りの２個の管に
は100μの上記バツフアーのみを加えた。つい
で各管を注意深く振盪させながら＋25℃で60分間
インキユベートし、ついで３×２mlの上記バツフ
アーを用いて遠心分離および傾瀉を繰り返すこと
により洗浄した。 ついですべての管の懸濁液を上記バツフアーで
２mlの容量に希釈した。0.1mlの50mMジチオト
レイトールを加えそして各管を＋25℃で10分間振
盪した。ついで各管のアガロースゲルを遠心分離
により分離しそして上澄み液の２―チオピリドン
濃度を343nmにおいて分光光度計で測定した。単
離された２―チオピリドンの量はアガロース―コ
ンカナバリンに結合された２―ピリジルジスルフ
イドデキストランの量に比例しそして試験溶液の
デキストラン濃度に逆比例する。デキストラン濃
度はこのようにして0.03〜100mg／mlの濃度で検
出され得た。 実施例 10 分裂性ヒトIgG―ガラス―誘導体含有の125I―
ラベルされたヒツジ―抗ヒトIgG―抗体による
ヒトガンマーグロブリンの分析 ａ ヒトIgG―ガラス誘導体の調製 50mgのチオールガラス（コーニングCPG550、
Corning Glass社製）を30mMジチオトレイトー
ルを含有する５mlの0.1Mりん酸ナトリウム―
0.3M NaCl（PH7.5）中で還元した。この還元さ
れたガラスを0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M
NaClで完全に洗浄しそして１mlの上記バツフア
ー中に懸濁し、ついでこれに20μの１，２―
３，４―ジエポキシブタンを加えた。60分間反応
させた後ガラスビーズをPH7.5である0.1Mりん酸
ナトリウム―0.3M NaClで洗浄した。ついでこう
して得られたガラス誘導体をPH9.5である0.5mlの
0.2M炭酸ナトリウムバツフアー中に懸濁させそ
して0.5mgの電気泳動精製されたヒトIgGを0.5ml
の0.2M炭酸ナトリウムバツフアー（PH9.5）中に
溶解した。反応混合物＋25℃で18時間注意深く撹
拌しついで未反応エポキシ基を除去するために50
μの110％エタノールアミン（PH値はHClで9.5
に調整）を加えた。＋25℃で120分経た後、ガラス
誘導体を0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M、NaCl
（PH7.5）で洗浄した。ついでガラスビーズを0.5
％トウイーン20を含有する20mlの0.1Mりん酸ナ
トリウム―0.3M NaCl（PH7.5）中に懸濁した。
分析により抗体濃度は懸濁液１ml当たり約16μｇ
であることが示された。 ｂ 沃素―125によるヒツジ―抗ヒトIgG―抗体
の置換 ガラス試験管が氷浴中に置かれた。10μの
0.3M NaCl中に溶解した45μｇのヒツジ―抗ヒト
IgG―抗体〔BrCN―活性化セフアロース4Bに電
気泳動精製されたヒトIgGを結合させることによ
り製造されてそしてアガロース―ヒトIgG誘導体
で精製された免疫収着剤〕を管に加えた。PH7.0
である40μの0.2Mりん酸ナトリウムバツフア
ー（0.02％NaN3）、100μのクロルアミン―Ｔ
（1.5mM）および0.7μのNa125I（0.36Ci）を加
えた。２分後、20μの0.1M Na2S2O3および50
μの0.1M KIの添加により反応を中断した。あ
らかじめ１mlの１％ウシ血清アルブミンで調整さ
れそして0.05％トウイーン20、0.02％NaN3および
0.05M Na2S2O3を含有するPH7.4である0.05Mりん
酸ナトリウムバツフアーで平衡に保たれたセフア
デツクスＧ―25のカラム上で反応混合物をクロマ
トグラフイーにかけた。孔容積相当フラクシヨン
を集め、これをPH7.0である0.05Mりん酸ナトリ
ウムで５倍に希釈した。分析によりそれ（10ml）
は１ml当たり約４μｇのラベルされたヒツジー抗
ヒトIgG―抗体を含有していることが示された。 ｃ 分裂性ヒトIgG―ガラス―誘導体を含有する
競争系における125I―ラベルされたヒツジ―抗
ヒトIgG―抗体によるヒトγグロブリンの分析 それぞれガラス―ヒトIgG（前述による100μ
の懸濁液）および125I―置換されたヒツジ―抗
ヒトIgG―抗体（前述溶液をPH7.5である0.1Mり
ん酸ナトリウム―0.3M NaCl―0.5％トウイーン
20中で10倍に希釈することにより得られた100μ
の溶液）を含有する一連のエレルマン管が調製
された。ついでこれらの管に100μの0.1Mりん
酸ナトリウム―0.3M NaCl―0.5％トウイーン20
（PH7.5）中に溶解した種々の量のヒトγ―グロブ
リンを加えた。各管を振盪テーブル上において25
℃で４時間振盪し、ついでガラスビーズを４×２
mlの0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M NaCl―0.5％
トウイーン20（PH7.5）で洗浄した。ついでガラ
スビーズを20mMの過沃素酸ナトリウムを含有す
る上記ホスフエートバツフアー0.5ml中に懸濁し
た。これによりヒトIgGをガラスに結合させてい
る近接ジオール構造が分裂されそして免疫錯体
〔ヒトIgG―（125I―ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体）
―錯体〕が溶液中に入る。振盪テーブル上で＋25
℃において60分間反応を行なわせしめついで上澄
み液中の遊離された放射能をガンマカウンターで
測定した。遊離放射能の量はガラス誘導体に結合
された125I―ラベルされたヒツジ―抗ヒトIgG―
抗体の量に比例しそして試験溶液のガンマグロブ
リン濃度に逆比例する。 125I―ラベルされた抗体のガラスビーズに対す
る非特異吸収による背景効果はこの操作により減
少され得た。 本実施例において用いられている125I―ラベル
されたヒツジ―抗ヒトIgG―抗体を実施例７記載
のヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―α―アラミラーゼ
多錯体接合体と置換して操作することもできる。
その場合実施例10(c)項の記載と同様にして、ヒト
IgGをガラスに結合させているビシナルジオール
構造を開裂させ、次にラベルされた免疫複合体を
含有する溶液をガラスビードから分離しそして実
施例７(b)項の記載に従いジスルフイツド結合をジ
チオトレイトールにより開裂させてジスルフイツ
ドアミラーゼ―多錯体を免疫複合体かから遊離さ
せてこれをより小さなユニツトに分解させ、そし
てα―アミラーゼ活性を分析することによりヒト
γ―グロブリンを検出する。 実施例 11 アガロース―トリプシンを包含する競合系にお
ける２―ピリジルジスルフイド置換のダイズト
リブシン抑制剤によるダイズトリプシン抑制剤
の分析 ａ アガロース―トリプシン誘導体の調整法 20mgのトリプシン（凍結乾燥されたトリプシ
ン、Worthington Biochem社製）を２mlの0.1M
NaHCO3中における２ｇ（乾燥吸収された）の
CNBr―活性化セフアロース4B（Pharmacia
Fine Chemicals AB製のシアノゲンブロマイド
活性化アガロース）懸濁液と混合した。反応混合
物を24時間＋４℃で撹拌した。ついで生成された
ゲル誘導体を0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M
NaCl（PH7.5）（200ml）、0.1M酢酸ナトリウム―
0.3M、NaCl（PH4.0）（200ml）、0.1M NaHCO3―
10mMエタノールアミン（200ml）そして最後に
0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M NaCl（PH7.5）
（200ml）で洗浄した。ゲルを＋４℃で上記の最後
の溶液中に懸濁させて貯蔵した。 ｂ ダイズトリプシン抑制剤の２―ピリジルジス
ルフイド誘導体の調製 18mgのダイズトリプシン抑制剤（Sigma
Chem.社製の凍結乾燥されたトリプシン抑制剤型
Ｉ―Ｓ）をPH7.5である0.1mlの0.1Mりん酸ナトリ
ウム―0.3M NaCl中に溶解した。溶液をセフアデ
ツクスＧ―25のカラム上でゲル過した（使用媒
体は前述のバツフアーであつた）。150μの
50mM Ｎ―スクシンイミジル―３（２―ピリジ
ルジチオ）プロピオネートを５分毎50μずつで
孔容積相当物質（約16mgの蛋白質を含有する2.0
ml）に加た。＋25℃で30分間反応させた後反応混
合物をセフアデツクスＧ―25のカラム上でゲル
過した（使用媒体はPH7.5である0.1Mりん酸ナト
リウム―0.3M NaClであつた）。20mgの蛋白質当
たり4.3μモルの２―ピリジルジスルフイド基の
置換度を有し、ダイズトリプシン抑制剤―２―ピ
リジルジスルフイド誘導体4.8mg／mlを含有した
孔容積相当物質3.0mlを＋４℃で貯蔵した。 ｃ ２―ピリジルジスルフイド置換のダイズトリ
プシン抑制剤によるダイズトリプシン抑制剤の
分析 試験分析はいわゆる競合法で実施された。100
mgの乾燥吸引されたアガロース―トリプシン誘導
体（約１mgトリプシンに相当する）（前述参照）
および0.3mlの0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M
Nacl（PH7.5）中における1.4mgのダイズトリプシ
ン抑制剤―２―ピリジルージスルフイド誘導体
（前述参照）を一連の試験管の各々に加えた。つ
いで種々の濃度の0.3mlのダイズトリプシン抑制
剤溶液を各管に加え、その後各管を＋25℃で60分
間注意深く振盪した。ついでアガロースゲルを
0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M Nacl（PH7.5）で
洗浄しそして２mlのこのバツフアー中に懸濁し、
ついでこれに0.2mlの50mMジチオトレイトール
を加えた。＋25℃で10分間各管を振盪した後各管
のアガロースゲルを遠心分離により分離しそして
上澄み液の遊離２―チオピリドンの量を343nmに
おいて分光光度計で測定した。遊離された２―チ
オピリドンの量はアガロースートリプシンに結合
されたダイズトリプシン抑制剤の２―ピリジルジ
スルフイド誘導体の量に比例しそして試験溶液の
天然ダイズトリブシン抑制剤濃度に逆比例する。
約0.1〜10mgダイズトリプシン抑制剤／mlを含有
する溶液が試験で使用された。 実施例 12 固定された免疫錯体からα―アミラーゼを遊離
させるためのデキストラナーゼを包含するサン
ドイツチ法におけるヒツジ―抗ヒトIgG―抗体
―デキストラン―α―アミラーゼ接合体による
ヒトカンマグロブリンの分析 ａ ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―デストラン―α
―アミラーゼ接合体の調製 13mgのα―アミラーゼ（実施例１参照）を1.1
mlの0.05Mりん酸ナトリウムバツフアー―0.3M
Nacl（PH7.5）中に溶解し、これに110μｌの
5mMN―スクシンイミジル―３（２―ピリジルジ
チオ）プロピオネート（99.5％EtoH中の）を加
えた。溶液を激しく振盪しついで15分間放置し、
その後100μｌの50mMジチオトレイトールを加
えた。さらに15分間放置後、反応混合物をセフア
デツクスＧ―25のカラム上でゲル過した（使用
媒体は0.3M Naclであつた）。0.9モルHS―基／モ
ル蛋白質の置換度を有し、１ml当たり4.70mgのチ
オール化α―アミラーゼを含有する孔容積相当物
質2.5mlを集めた。 こうしてチオール化されたα―アミラーゼ
（2.5ml中約12mg）をPH7.5である1.5mlの0.1Mりん
酸ナトリウム―0.3MNacl中に溶解された12mgの
２―ピリジルジスルフイドデキストラン（実施例
４にしたがつて製造）と混合した。＋25℃で24時
間注意深く撹拌しながら反応を行なわせてテキス
トラン―α―アミラーゼ誘導体を生成した。 0.3mlの0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M Nacl
（PH7.5）中における0.8mgのヒツジ―抗ヒトIgG―
抗体（実施例10）のように精製された免疫収着
剤）を無水エタノール中における25μｌの5mM
Ｎ―スクシンイミジル―３（２―ピリジルジチ
オ）プロピオネートと混合した。＋25℃で反応を
行なわせしめついで反応混合物をセフアデツクス
Ｇ―25のカラム上でゲル過した（使用媒体はPH
5.0である0.1M酢酸ナトリウムであつた）。孔容
積相当物質（0.7ml中0.7mg）を30分間5mMジチオ
トレイトールで還元し、ついで過剰の還元剤をセ
フアデツクスＧ―25上でのさらに別のゲル過に
より除去した（使用媒体は0.3MNaclであつた）。
こうして得られたチオール化抗体〔孔容積相当物
質、蛋白質モル当りHS2モルを含有する蛋白質
0.55mg（1.0ml）〕を0.1mlのデキストラン―α―ア
ミラーゼ誘導体（前述参照）と混合しそして撹拌
しながら＋４℃で24時間反応を行なわせしめた。
ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―デキストラン―α―
アミラーゼ接合体を含有する反応混合物を＋４℃
で貯蔵した。 ｂ 固定された免疫錯体からα―アミラーゼを遊
離させるためのデキストラナーゼを包含するサ
ンドイツチ法におけるヒツジ―抗ヒトIgG―抗
体―デキストラン―α―アミラーゼ接合体によ
るヒトガンマグロブリンの分析 懸濁液１ml当たり約50μｌの抗体を含有する
100μｌのアガロース―ヒツジ―抗ヒトIgG―抗
体誘導体〔実施例7b）と同様に製造された〕の
懸濁液を100μｌの0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M
Nacl―0.5％トウイーン20（PH7.5）中に溶解され
た種々の量（0.5〜300ng）のヒトガンマグロブリ
ンを有する一連の試験管の各各に加えた。バツフ
アーのみを含有する多数の管およびアミノエチル
アガロース〔実施例7b）に記載のように製造〕
を含有する多数の管がブランクとして利用され
た。各管を注意深く振盪させながら＋25℃で18時
間インキユベートした。ついで各管のアガロース
ゲルを実施例7b）に記載のように洗浄した。ヒ
ツジ―抗ヒトIgG―抗体―デキストラン―α―ア
ミラーゼ接合体（前述参照）含有の反応混合物を
100倍に希釈し100μｌを洗浄されたアガロース懸
濁液を含有する（約0.3ml／管）各管に加えた。
ついでこれらの管を注意深く振盪させながら＋25
℃で18時間インキユベートし、その後各管のアガ
ロースゲルを実施例7b）に記載のように洗浄し
た。ついで0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M Nacl
（PH7.5）中における1.0mlのデキストラナーゼ
（Worthington Biochemical社製、DEX0.5mg／
ml）をすべての管に加えそして＋25℃で60分間イ
ンキユベートした。デキストラナーゼは担体デキ
ストランを崩壊し、α―アミラーゼが接合体およ
び固定された免疫錯体から遊離されて溶液中に入
る。ついで遊離されたα―アミラーゼ活性を実施
例7b）に記載のように測定した。 遊離されたα―アミラーゼ活性はアガロース―
免疫錯体誘導体に結合された抗体―デキストラン
―α―アミラーゼ接合体の量に比例しそしてこれ
はついでアガロー抗体誘導体に結合されたガンマ
ーグロブリンの量に比例し、こうして試験溶液の
ガンマグロブリン濃度の側定値が得られる。この
ようにしてヒトガンマグロブリンが約1ng／mlの
濃度まで検出され得た。
の効果に関して修正された値である。
実施例 ３ 人の血清アルブミン―α―アミラーゼ接合体に
よるラビツト―抗ヒト血清アルブミン―抗体の
分析 ａ アルブミン―α―アミラーゼ接合体の調製 PH7.5である１mlの0.1Mりん酸ナトリウムバツ
フアー中における８mgの人の血清アルブミンを12
μｌのＮ―スクシンイミジル―３（２―ピリジル
ジチオ）プロピオネート（99.5％エタノール中
40mM）と混合した。＋23℃で40分間反応させた
後反応混合物をセフアデツクスＧ―25カラム上で
ゲル過した（使用媒体は前述と同じホスフエー
トバツフアーであつた）。孔容積相当物質的２ml
はアルブミン―２―ピリジルジスルフイド誘導体
を含有していた。誘導体還元後に遊離された２―
チオピリドンの量の分光測分析では2.5モルチオ
ール／モルアルプミンの置換度が示された。 20mlのα―アミラーゼをPH7.5である1.5mlの
0.1Mりん酸ナトリウムバツフアー中に溶解し
た。150μｌのＮ―スクシンイミジル―３（２―
ピリジルジチオ）―プロピオネート（99.5％エタ
ノール中40mM）を加えそして反応を＋23℃60分
間継続させた。過剰試薬および他の望ましくない
低分子量成分をセアデツクスＧ―25上でのゲル
過により除去した（使用媒体は前述と同じホスフ
エートバツフアーであつた）。 ついで生成されたα―アミラーゼ―２―ピリジ
ルジスルフイド誘導体（約2.5ml中20mg）を20分
間＋23℃において10mgのジチオトレイトールで還
元した。ついで過剰のジチオトレイトールをセフ
アデツクスＧ―25上でのゲル過により除去した
（使用媒体は0.3M NaClであつた）。 3.5mlの0.3M NaCl中におけるチオール化され
たα―アミラーゼ（約0.7モルSH／モル蛋白質を
含有する約20mg）をPH7.5である1.4mlの0.1Mりん
酸ナトリウムバツフアー中における5.6mgのアル
ブミン―２―ピリジルジスルフイド誘導体と混合
した。＋４℃で18時間反応を継続させた。ついで
反応混合物をセフアデツクスＧ―200上で分離さ
せた（使用媒体は0.3M NaClであつた）。種々の
フラクシヨン分析の際、天然アミラーゼよりも大
きい分子量を有するα―アミラーゼ活性物質が見
出された。測定された分子量は１個のアルブミン
分子および１〜２個のα―アミラーゼ分子からな
るオリゴマーに相当した。 接合体を含有したフラクシヨンを一緒にし、こ
れを＋４℃で0.3M NaCl中に貯蔵した（約10mg蛋
白質／ml）。 ｂ 人の血清アルブミン―α―アミラーゼ接合体
によるラビツト―抗ヒト血清アルブミン―抗体
の分析 100μｇ人の血清アルブミン（HSA）／mlを含
有するPH７の１mlの0.05Mりん酸Naバツフアーを
使い捨て用ポリスチレン試験管に加えた。各管を
３時間37℃でインキユベートした。ついで管を
0.3％デキストラン、0.9％NaClおよび0.5％トウ
イーンを含有する0.05Mりん酸ナトリウム含有バ
ツフアー（PH7.4）（PDT―バツフアー）３×２ml
で洗浄した。ラビツト―抗HSA―血清をPDT―
バツフアーで10〜104倍に希釈した。各希釈液の
0.5mlを前述にしたがつて処理された管中に注い
だ。同数の盲試験が同一方法で希釈さされた0.5
mlのラビツト―正常血清（RNS）を用いて準備
された。各管を＋23℃で３時間放置した。ついで
管を３×２mlのPDT―バツフアーで洗浄し、こ
れに前記(a)からのHSA―α―アミラーゼ接合体
0.5mlを加えた。過剰の接合体を３×１mlのPDT
―バツフアーで洗浄除去した。PH７である0.05M
りん酸ナトリウムバツフアー中における0.5mlの
10mMジチオトレイトール（DTT）をこれらの管
に加えた。15分後、管中の液相を、フエデバスα
―アミラーゼ試験用錠剤1/4を含有する0.5ml蒸留
水をその中に有する管に移した。振盪後これらの
管を37℃で２時間インキユベートし、ついで未溶
解殿粉基質を遠心分離しそして上澄み液の消光を
620nmにおいて測定した。 結果は使用血清に関するラビツト―抗HSA―
抗体が104倍に希釈された血清中に検出され得、
他方RNSに関する盲試験が試料血清中A620―値
10％という実測値を与えたということを示した。
管壁上に吸収された免疫錯体からのα―アミラー
ゼの還元分裂を省いた比較試験では（A620）
0.02の消光値が得られた。 実施例 ４ ヒツジ―抗ラビツトIgG―抗体―デキストラン
―α―アミラーゼ接合体によるラビツト―抗ヒ
ト血清アルブミン―抗体の分析 ａ ヒツジ―抗ラビツトIgG―抗体―デキストラ
ン―α―アミラーゼ接合体の調製 １ｇのブロモヒドロキシプロピルデキストラン
を12.5mlの蒸留水中に溶解し、これに3.8ｇの
Na2S2O3×7H2Oを加えた。100℃で３時間反応を
継続させた。ついで混合物をH2O（24時間は２×
２そして６時間は１×10）に対して透析し
た。 透析袋の内容物を凍結乾燥させ、以下これをブ
ンテ塩デキストランと称する。分析によりデキス
トラン誘導体は2.1ミリモルＳ／ｇ乾燥誘導体を
含有していることが示された。１ｇのブンテ塩デ
キストランを10mlの50％エタノール―50％0.1N
りん酸ナトリウムバツフアー（PH8.3）中に溶解
した。0.7ｇの２，2′―ジピリジルジスルフイド
を加えそして混合物を60℃に加熱し、この温度で
24時間維持した。ついで反応混合物を50％エタノ
ール３×３（６時間の各透析）および蒸留水３
×３（２時間の各透析）に対して透析した。 2.6mgのヒツジ―抗ラビツトIgG―抗体
（Na2SO4沈殿によりヒツジの血清から製造され
た）を１mlの0.1Mりん酸ナトリウムバツフアー
（PH7.5）中に溶解した。120μのＮ―スクシン
イミジル―３（２―ピリジルジチオ）プロピオネ
ート（99.5％エタノール中1.6mM）を加えついで
振盪させた後＋23℃で30分間反応を継続させた。
ついで反応混合物をセフアデツクスＧ―25上でゲ
ル過した（使用媒体はPH5.0の0.1M酢酸ナトリ
ウムバツフアーであつた）。孔容積相当物質（2.5
ml）（２―ピリジルジスルフイドヒツジ―抗ラビ
ツトIgG―抗体誘導体）を64μの50mMジチオ
トレイレールで還元した。＋23℃で15分経た後過
剰のジチオトレイトールをセフアデツクスＧ―25
上でのゲル過により除去した（使用媒体は
0.3M NaClであつた）。3.5mlの孔容量が得られ
た。（1.5ml中における）2.4mgのチオール化され
たα―アミーゼ（実施例１に記載の方法で製造さ
れた）および3.5ml中における2.6mgのチオール化
されたヒツジ―抗ラビツトIgG―抗体（前述参
照）をPH7.5において１mlの0.1Mりん酸ナトリウ
ムバツフアー中における1.6mgの２―ピリジルジ
スルフイドデキストランと混合した。振盪後、混
合物を10分間放置しついで媒体として0.3M NaCl
を用いてセフアローズ6B（Pharmacia Fine
Chemicals AB社製、アガロースのビーズ）上で
ゲル過した。接合体含有フラクシヨンを一緒に
した。 ｂ ヒツジ―抗ラビツトIgG―抗体―デキストラ
ン―α―アミラーゼ接合体によるラビツト―抗
ヒト血清アルブミン抗体の分析 50個のデイスク状ナイロンネツト（直径８mm、
重量1.5mg／ネツト）を＋23℃で30分間50mlの3M
HCl中において部分的に加水分解しついでこれを
J.Immunol.第113巻（1974）第517頁の記載にし
たがつて0.1％グルタルジアルデヒドで活性化し
た。活性化されたナイロンネツトをPH７の0.05M
りん酸ナトリウムバツフアーで洗浄しついで人の
血清アルブミン（HSA）（0.5mg／ml）を含有する
20mlの0.9％NaClに移した。＋23℃で60分経た後
移動されたHSAを0.9％HaClで洗浄除去しそして
結合れたHSAを有するナイロンネツトを30分間
23℃で50mlのNaBH4（0.4mg／ml）で処理して
HSAとナイロンマトリツクスとの間に安定な共
有結合を生成させた。最後にナイロンネツトを
PDT―バツフアーで洗浄した。ラビツト―抗
HSA―血清をPDTバツフアーで10〜104倍に希釈
した。200μの各希釈液を３時間23℃において
試験管中で１個のナイロンネツトと共にインキユ
ベートした。同じ方法で希釈された200μのラ
ビツトの正常血清（RNS）を用いて同数の盲試
験が準備さされた。ついでナイロンネツトを３×
２mlPDTバツフアーで洗浄した。 前記(a)からの抗体―デキストラン―α―アミラ
ーゼ接合体を10倍に希釈しそしてこうして得られ
た溶液の20μを＋23℃で16時間ナイロンネツト
（前述にしたがつて製造された）でインキユベー
トした。過剰の接合体を傾瀉除去しついでナイロ
ンネツトを３×２mlPDTバツフアーで洗浄し
た。 α―アミラーゼ活性（α―アミラーゼを分裂さ
せたものおよびこれを分裂させなかつたもの）は
実施例１に記載のと同様の方法で測定された。 使用血清を用いれば10〜104倍に希釈されるラ
ビツト―抗ヒト血清アルブミン抗体を観察するこ
とが可能であつた。RNSに関する盲試験では前
記範囲内に相当する希釈度で得られた測定値の
10％のα―アミラーゼ活性を得た。 実施例 ５ ヒト血清アルブミン―グルタチオン―フルオレ
セイン接合体によるラビツト―抗ヒト血清アル
ブミン抗体の分析 ａ アルブミン―グルタチオン―フルオレセイン
接合体の調製 100mgのフルオレセインイソチオシアネートを
４mlの蒸留水中において35mgの酸化グルタチオン
と反応させた。90分間一定のPH値（PH９）で反応
を継続させた。反応混合物を100mlのセフアデツ
クスＧ―25カラム上でゲル過した（使用媒体は
0.3M NaClであつた）、全容量に相当するフラク
シヨンをスラリーにした（A493＝41.2を有する
10.3ml）。PHをほう酸ナトリウムバツフアーで９
に調整した。次いで容液をPH９の0.1Mほう酸ナ
トリウムバツフアーで平衡に保たれた、2.2mlの
メルカプトヒドロキシプロピルアガロース
〔Acta Chem.Scand、第B29巻（1975）第471―
474頁にしたがつてアガロースのビーズセフアロ
ース6B）から製造、660μモルSH／ｇ乾燥ゲル
を含有するゲルとして使用された〕を含有するカ
ラムにポンプで通過させた。流れは10ml／時間で
あつた。溶離物をPH４の1M酢酸ナトリウム中で
スラリーにしてそのフルオレセインおよびチオー
ル含有量を測定した。以下の試験では1.19nMチ
オール濃度および0.60mMフルオレセイン濃度を
有するフラクシヨン（３ml）が使用された。 20mgのヒト血清アルブミンを１mlの0.1Mりん
酸ナトリウムバツフアー（PH7.5）中に溶解し、
これに150μの40mM Ｎ―スクシンイミジル―
３―（２―ピリジルジチオ）プロピオネート
（99.5％エタノール中）を加えた。振盪後、混合
物を＋23℃で40分間放置した。ついで過剰の試薬
をセフアデツクスＧ―25上でのゲル過により除
去した（使用媒体はPH7.5の0.1Mりん酸ナトリウ
ムバツフアであつた）。３mlの孔容積相当物質
（19mgの２―ピリジルジスルフイドアルブミン）
を３mlのグルタチオン―フルオレセインと混合し
た。混合物を室温で30分放置しついで媒体として
0.9％NaClを用いてセフアデツクスＧ―25上でゲ
ル過した。分析により孔容積相当物質（９ml）
はアルブミン１モル当り約3.5ミリモルのフルオ
レセインを有していて17.1mgのアルブミンを含有
していることが示された。 ｂ ヒト血清アルブミン―グルタチオン―フルオ
レセイン接合体によるラビツト―抗ヒト血清ア
ルブミン―抗体の分析 実施例３に記載と同じ方法で管壁をHSAで被
覆しそしてラビツト―抗HSA―血清でインキユ
ベートした。 こうして得られた管に(a)により製造された0.5
mlの操合体（1.9ml接合体／ml）を加えた。各管
を23℃で16時間インキユベートし、ついで過剰の
接体を傾瀉しそして３×２mlのPDTバツフアー
で洗浄除去した。 これらの管に１mlのジチオトレイトール（蒸留
水中25mM、PH７）を加えた。15分後、液相を螢
光測定のためセルに移しそして螢光強度を消光用
波長としての473nmおよび放射波長としての
530nmにおいて測定した。 使用された血清を用いれば１〜50倍希釈の血清
中において螢光を検出することが可能であつた。
RNSで得られた螢光強度はそれぞれの対応する
試験値の10％であつた。 上記試験が実施された方法（すなわち管壁に結
合させて行なう）のために、勿論螢光ラベルを分
裂させずに測定を行なうことは不可能であつた。
しかしながら、接合体のみ上で行なわれた螢光測
定は接合体分裂後に比較的強い螢光強度が得られ
るということを示した。 実施例 ６ セフアデツクス―イヌ血清アルブミン接合体お
よび125I―ラベルされたラビツト―抗ヒトIgE
―抗体によるイヌ―血清アルブミン特異性IgE
の分析 ａ セフアデツクス―イヌ血清アルブミン接合体
の調製 36ｇのセフアデツクスＧ―15（Pharmacia
Fine Chemicala AB社製、エピロクロロヒドリ
ンで交鎖結合されたデキストランのビーズ）を
200mlの0.5M NaOH中に懸濁させた。17mlの１―
クロロ―２，３―エポキシプロパンを23℃で５分
間に滴加した。ついで温度を60℃に上昇させそし
て２時間反応を継続させた。ついで生成物を水お
よび0.5Mりん酸ナトリウムバツフアー（PH6.5）
で洗浄しそして200mlのこのバツフアー中に懸濁
した。100ｇのNa2S2O3×7H2Oを加えて２時間反
応を行なわせ、ついでブフナー斗上で水洗し
た。生成物を全量200mlの0.1M NaHCO3（PH
8.3）中における2.8ｇのジチオトレイトール
（DTT）で処理した。60分間反応させた後、生成
物を1mM酢酸ついで50％アセトンを含有する
0.05M NaHCO3―1mMEDTAで洗浄した。生成
物を40mlの後記溶液中に懸濁し、これに２，2′―
ジピリジルジスルフイドを0.15M濃度まで溶解し
た。23℃で60分間反応を継続させた。ついで600
mlの水を加え、さらに60分間反応を継続させその
後生成物を水洗し、アセトンで収縮しついで青色
ゲル上で乾燥させた。こうして得られた生成物は
乾燥誘導体１ｇ当たり約40μモルの２―ピリジル
ジスルフイド構造を有していることが見出され
た。 20mgのイヌ血清アルブミンを２mlの0.1Mりん
酸ナトリウムバツフアー（PH7.5）中に溶解した
が、これはメルカプトエタノールに関して25mM
であつた。60分後、過剰のメルカプトエタノール
をセフアデツクスＧ―25上でのゲル過により除
去した（使用媒体はPH7.5である0.1Mりん酸ナト
リウムバツフアーであつた）。 １ｇのセフアデツクス誘導体（前記参照）を膨
潤させそして0.1Mりん酸ナトリウムバツフアー
（PH7.5）中で洗浄しついでこのバツフアー２ml中
に懸濁した。この懸濁液に前述にしたがつて処理
されたアルブミン（3.5ml）を加えた。23℃で36
時間密閉容器中において懸濁液を回転させること
により振盪下で反応を実施した。ついでこうして
得られたセフアデツクス―アブミン接合体をガラ
スフイルター斗上においてPH5.0である0.1酢酸
ナトリウム―0.3M NaClで洗浄しついで10mlのこ
の溶液中に懸濁し、その後40mgのグルタチオンを
加えて反応されないピリジルジスルフイド構造を
除去した。23℃で３時間反応させた後生成物を
0.9％NaClで洗浄しそして0.9％NaCl中の懸濁液
形態で貯蔵した。 ｂ セフアデツクス―イヌ血清アルブミン接合体
および125I―ラベルされたラビツト―抗ヒト
IgE―抗体によるイヌ血清アルブミン特異性
IgEの分析 前記(a)からの懸濁液を遠心分離し、ついで上澄
み液を吸引により除去した。セフアデツクス―ア
ルブミン接合体を10mlのPDT―バツフアーで洗
浄し、ついで10mlのPDTバツフアー中に再懸濁
させた。200μの懸濁液をエレルマン管に詰め
た。容量をPDT―バツフアーで400μに調整
し、ついでイヌ血清アルブミンに対する特異性
IgEを含有する100μのヒト血清を加えた。こ
うして得られた懸濁液を23℃で３時間回転下でイ
ンキユベートした。遠心分離で３回洗浄し、吸引
により除去しそしてPDTを添加してから125I―抗
IgE（15ng、94200cpm、Pharmacia Diagnostics
AB社製「Phadebas」（登録商標）RASTアイソ
トープ試薬）を加えた。各管を23℃で一夜インキ
ユベートした。前述のように３回洗浄した後セフ
アデツクス接合体に結合体に結合された放射能を
γ―カウンターを用いて慣用手段で分析した。つ
いで125I―含有免疫錯体をPH7.5の0.1Mりん酸ナ
トリウムバツフアー―0.3M NaCl中における
20mM DTT 0.5mlを加えることにより担体から
分裂させた（撹拌しながら室温で３時間反応）。
生成物を遠心分離した後200μの上澄み液を除
去しそして放出された放射能を測定した。 セフアデツクス―接合体上において125I―含有
免疫錯体の分裂前に測定の場合には29149cpmの
測定結果が得られそして上記の免疫錯体分裂の後
には6248cpm（200μ上澄み液中）の測定値が
得られたが、このことは活性の78％が分裂により
液相中において移動されたことを意味している。 実施例 ７ ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―α―アミラーゼ―
多錯体接合体によるヒトγ―グロプリンの分析 ａ ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―α―アミラーゼ
―多錯体接合体の調製 30mgのα―アミラーゼ（実施例１におけるのと
同じ型で同じ前処理をしたもの）をPH7.5である
4.5mlの0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M NaCl中に
溶解した。無水EtOH中における100μの50mM
Ｎ―スクシンイミジル―３（２―ピリジルジチ
オ）プロピオネートを５分間隔で25μずつ加え
た。＋25℃で40分経た後反応混合物をセフアデツ
クスＧ―25上でゲル過し（使用媒体はPH7.5で
ある0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M NaClであつ
た）、過剰の反応成分および低分子反応生成物を
除去した。変性α―アミラーゼ（２―ピリジル―
ジスルフイド―α―アラミラーゼ）は８mlであつ
た。２―ピリジルジスルフイド基に関する置換度
は3.7μモルの２―ピリジルジスフイド基／50mg
のα―アミラーゼであることが見出された。 無水EtOH中における400μの50mM Ｎ―ス
クシンイミジル―３（２―ピリジルジチオ）プロ
ピオネートを５分間隔で100μずつ加える以外
は前述のようにして別の２―ピリジルジスルフイ
ド―α―アミラーゼ誘導体が製造された。この誘
導体の置換度は7.5μモルの２―ピリジルジスル
フイド基／50mgのα―アミラーゼであることが見
出された。 PH7.5である0.75mlの0.1Mりん酸ナトリウム―
0.3M NaCl中におけるα―アミラーゼ50mg当たり
3.7μモルの２―ピリジルジスルフイド基を含有
する2.5mgの２―ピリジルジスルフイド―α―ア
ミラーゼを50μの50mMジチオトレイトールと
混合しついで＋25℃で10分間還元した。過剰のジ
チオトレイトールおよび低分子反応生成物をセフ
アデツクスＧ―25上でのゲル過により除去した
（使用媒体は0.3M NaClであつた）。 2.3mgのチオール―α―アミラーゼを含有する
孔容積相当物質2.5mlを0.75mlの0.1Mりん酸ナト
リウム―0.3M NaCl中におけるα―アミラーゼ50
mg当たり7.5μモルの２―ピリジルジスルフイド
基を含有する1.5mgの２―ピリジルジスルフイド
―α―アミラーゼと混合した。＋25℃で60分間反
応させた後無水EtOH中における50μの
20mM2，2′―ジピリジルジスルフイドの添加に
より反応を中断した。１滴のトウイーン20を加え
そして混合物をセフアロース6Bのカラム上でク
ロマトグラフイーにかけた（80mlの全容量）（使
用媒体は0.3M NaCl―0.5％トウイーン20であつ
た）。2.4μモルの２―ピリジルジスルフイド基を
含有するml当たり約0.19mgのα―アミラーゼ凝集
体を含有する孔容積相当物質（約15ml）が得ら
れ、これを＋４℃で貯蔵した。 PH6.0を有する2.4mlの0.1Mりん酸ナトリウム―
0.3M NaCl中における６mgのヒツジ―抗ヒトIgG
―抗体〔ヒトの電気泳動精製されたγ―グロブリ
ンをCNBr―活性化セフアロース4Bに結合させる
ことにより製造されたγ―グロブリン―アガロー
ス収着剤で精製された免疫収着剤〕を無水EtOH
中における20μの50mM Ｎ―スクシンイミジ
ル―３（２―ピリジルジチオ）プロピオネートと
混合した。＋25℃で20分経た後、過剰の試薬をセ
フアデツクスＧ―25における反応混合物のゲル
過により除去した（使用媒体はPH5.0である0.1M
酢酸ナトリウム―0.3M NaClであつた）。約5.5mg
の２―ピリジルジスルフイド抗体を含有する孔容
積相当物質約3.0mlが得られ、これれを蒸留水中
0.2mlの50mMジチオトレイトールと反応させ
た。25分間反応させた後、過剰のジチオトレイト
ールをセフアデツクスＧ―25上における反応混合
物のゲル過により除去した（使用媒体は0.3M
NaClであつたた）。160mgの蛋白質当たり約２μ
モルSH基の置換度を有する約５mgの変性抗体を
含有する孔容積相当物質5.0mlが得られた。 0.2mlの0.3M NaCl中におけるこうしてチオー
ル化された約0.2mgの抗体を2.0mlの0.1Mりん酸ナ
トリウム―0.3M NaCl―0.5％トウイーン20中に
おける0.4mgのα―アミラーゼ凝集体（前述参
照）を混合した。ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―α
―アミラーゼ多錯接合体を含有する反応混合物を
＋４℃で貯蔵した。 ｂ ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―α―アミラーゼ
多錯接合体を使用してのγ―グロブリンの分析 約400ngの抗体を含有する約50ngのアガロース
―ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体誘導体（乾燥誘導
体）（CNBr―活性化セフアロース4Bに免疫収着
剤で精製されたヒツジ―抗ヒトIgG―抗体を結合
させることにより製造）を300μの0.3M NaCl
―0.5％トウイーン20中に懸濁し、これを100μ
の0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M NaCl―0.5％ト
ウイーン20（PH7.4）中に溶解された種々の量
（１〜500ng）のヒトγ―グロブリンを含有する
一連のポリスチレン管の各管（３ml）に加える。
バツフアーのみを含有する多数の管およびアミノ
エチル―アガロース（CNBr―活性化セフアロー
ス4Bにエタノールアミンを結合させることによ
り製造）を含有する多数の管がブランクとして使
用された。 各管を注意深く振盪させながら＋25℃で約18時
間インキベートした。ついで各管のアガロースゲ
ルを６×２mlの0.3M NaCl―0.5％トウイーンを
用いて遠心分離―傾瀉操作を繰り返すことにより
洗浄した。 最後の洗浄後、上澄み液を吸引除去して0.3ml
にしてそして各管にヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―
α―アミラーゼ―多錯接合体（抗体に関して約
400ng）を含有する前記実施例７(a)からの反応混
合物の100μを加えついでこれを＋25℃で４時
間注意深く振盪させながらインキユベートした。
各管の固体物質を６×２mlの0.3M NaCl―0.5％
トウイーン20で前述のように再び洗浄した。 PH８である0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M
NaCl中における1.0mlの10mMジチオトレイトー
ルを各管（0.3ml懸濁液）に加えた。60分間還元
後（この間にα―アミラーゼ―多錯体は固定され
た免疫錯体から遊離されそして分裂されてより小
さな単位になつた）、フアデパスアミラーゼ試験
用懸濁液（１錠剤／４ml）1.0mlを加えそして各
管を＋25℃で60分間再びインキユベートしついで
0.5mlの0.5M NaOHの添加により反応を停止し
た。溶解されなかつた澱粉ポリマーを過により
除去後、青色液の消光を620nmにおいて測定し
た。消光値は遊離されたα―アミラーゼ活性に比
例し、これは結合された接合体の量に比例し、つ
いでこれは結合されたγ―グロブリンの量に比例
しそしてこのようにして試験溶液のγ―グロブリ
ン濃度の測定値が得られる、ヒトγ―グロブリン
がこのようにして＜1ng／mlの濃度まで検出され
得た。 実施例 ８ ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―β―ガラクトシダ
ーゼ接合体によるヒトガンマーグロブリンの分
析 ａ ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―β―ガラクトシ
ダーゼ接合体の調製 20μの8mM Ｎ―スクシンイミジル―３（２
―ピリジルジチオ）プロピオネート（99.5％
EtOH中の）を＋25℃で60分間撹拌しながら0.6ml
の0.1Mりん酸ナトリウム―1mM MgCl2（PH
7.0）中における２mgのヒツジ―抗ヒトIgG―抗体
〔CNBr―活性化セフアロース4Bにヒトの電気泳
動精製されたガンマーグロブリンを結合させるこ
とにより製造、アガロース―ヒトγグロブリン収
着剤で精製された免疫収着剤〕に徐々に加えた。
ついで反応混合物をセフアデツクスＧ―25のカラ
ム上でゲル過し（使用媒体は前述と同じホスフ
エートバツフアーであつた）そして約1.8mgの２
―ピリジルジスルフイド置換抗体を含有する孔容
量相当物質（1.5ml）を得た。 PH7.0である0.5mlの0.1Mりん酸ナトリウム―
1mM MgCl2中における1.3mgのβ―ガラクトシダ
ーゼ（Bochringer Mannheim、GmbH製）をセ
フアデツクスＧ―25のカラム上でゲル過した。
1.5ml中における約1.2mgの孔容量相当物質を1.5ml
の0.1Mりん酸ナトリウム―1mM MgCl2中におけ
る1.8mgの２―ピリジルジスルフイド含有抗体
（前述参照）と混合した。ついで＋４℃で約48時
間反応を行なわせ、その後反応混合物をセフアロ
ース6Bのカラム上でゲル過した使用媒体は
0.3M NaClであつた）。650000〜800000の分子量
を有するβ―ガラクトシダーゼ―抗体オリゴマー
を含有する各フラクシヨンを得た。こうして得ら
れた物質を＋４℃で貯蔵した。 ｂ ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―β―ガラクトシ
ダーゼ接合体によるヒトガンマーグロブリン分
析 分析はいわゆるサンドイツチ法を使用して実施
された。１mlの懸濁液当たり約0.45mgの抗体を含
有するアガロース―ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体誘
導体〔CNBr―活性化セフアロース4Bに免疫収着
剤で精製されたヒツジ―抗ヒトIgG―抗体を結合
させることにより製造〕の50μ懸濁液をPH7.5
である100μの0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M
NaCl―0.5％トウイーン中に溶解された種々の量
のヒトガンマーグロブリン（0.1〜250ng）を有す
る一連の試験管の各々に加えた。バツフアーだけ
の多数の管およびアミノエチルアガロース
〔CNBr―活性化セフアロース4Bにエタノールア
ミンを結合させることにより製造〕を含有する多
数の管がブランクとして使用された。各管を注意
深く振盪させながら＋25℃で18時間インキユベー
トした。ついで各管のアガロースゲルを実施例７
に記載のように洗浄した。 ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―β―ガラクトシダ
ーゼ接合体（前述のように製造されたオリゴマー
接合体）を含有する２μの0.3M NaClを洗浄さ
れたアガロース懸濁液（約0.3ml／管）を含有す
る各管に加ええた。ついで各管を注意深く振振盪
させながら＋25℃で４時間インキユベートした。
ついで各管のアガロースゲルを実施例７に記載の
ように洗浄した。0.1mlの1Mβ―メルカプトエタ
ノールを各アガロース懸濁液に加えた。＋25℃で
30分間還元を行なわせしめた。この還元によりア
ガロース誘導体上に固定された免疫錯体から天然
形態におけるβ―ガラクトシダーゼを単離させ
た。 ついでPH7.0である0.1Mりん酸ナトリウム―
1mM MgCl2中における0.2mlのｏ―ニトロフエニ
ル―β―Ｄ―ガラクトシド（10.5mg／ml）を加え
ついで単位時間当たりに生成されたｏ―ニトロフ
エノラートの量の分光測光（420nmにおいて）に
より単離されたβ―ガラクトシダーゼ活性を測定
した。単離されたβ―ガラクトシダーゼ活性は結
合された接合体の量に比例し、ついでこれは結合
されたガンマーグロブリンの量に比例しそしてこ
のようにして試験溶液のガンマーグロブリン濃度
の測定値が得られる。このようにしてヒトガンマ
ーグロブリンが＜1ng／mlの濃度まで検出され得
た。 実施例 ９ アガロースコンカナバリンを包含する競合系に
おける２―ピリジルジスルフイドデキストラン
誘導体によるデキストラン分析 100μの一定のアガロース―コンカナバリン
〔ConA―セフアロース4B、Pharmacia Fine
Chemicals AB製〕およびPH7.5である200μの
0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M NaClを８個のエ
レルマン管の各々に加えた。ついで500μの蒸
留水中における0.2mgの２―ピリジルジスルフイ
ドデキストラン（実施例４にしたがつて製造）を
各管に加えた。ついで各管を注意深く撹拌しなが
ら＋25℃で20分間インキユベートし、その後種々
の量のデキストラン（デキストランＴ―40、
Pharmacia Fine Chemicals AB製）を含有する
PH7.5である100μの0.3M NaCl―0.1Mりん酸ナ
トリウムを管の６個に加えた。残りの２個の管に
は100μの上記バツフアーのみを加えた。つい
で各管を注意深く振盪させながら＋25℃で60分間
インキユベートし、ついで３×２mlの上記バツフ
アーを用いて遠心分離および傾瀉を繰り返すこと
により洗浄した。 ついですべての管の懸濁液を上記バツフアーで
２mlの容量に希釈した。0.1mlの50mMジチオト
レイトールを加えそして各管を＋25℃で10分間振
盪した。ついで各管のアガロースゲルを遠心分離
により分離しそして上澄み液の２―チオピリドン
濃度を343nmにおいて分光光度計で測定した。単
離された２―チオピリドンの量はアガロース―コ
ンカナバリンに結合された２―ピリジルジスルフ
イドデキストランの量に比例しそして試験溶液の
デキストラン濃度に逆比例する。デキストラン濃
度はこのようにして0.03〜100mg／mlの濃度で検
出され得た。 実施例 10 分裂性ヒトIgG―ガラス―誘導体含有の125I―
ラベルされたヒツジ―抗ヒトIgG―抗体による
ヒトガンマーグロブリンの分析 ａ ヒトIgG―ガラス誘導体の調製 50mgのチオールガラス（コーニングCPG550、
Corning Glass社製）を30mMジチオトレイトー
ルを含有する５mlの0.1Mりん酸ナトリウム―
0.3M NaCl（PH7.5）中で還元した。この還元さ
れたガラスを0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M
NaClで完全に洗浄しそして１mlの上記バツフア
ー中に懸濁し、ついでこれに20μの１，２―
３，４―ジエポキシブタンを加えた。60分間反応
させた後ガラスビーズをPH7.5である0.1Mりん酸
ナトリウム―0.3M NaClで洗浄した。ついでこう
して得られたガラス誘導体をPH9.5である0.5mlの
0.2M炭酸ナトリウムバツフアー中に懸濁させそ
して0.5mgの電気泳動精製されたヒトIgGを0.5ml
の0.2M炭酸ナトリウムバツフアー（PH9.5）中に
溶解した。反応混合物＋25℃で18時間注意深く撹
拌しついで未反応エポキシ基を除去するために50
μの110％エタノールアミン（PH値はHClで9.5
に調整）を加えた。＋25℃で120分経た後、ガラス
誘導体を0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M、NaCl
（PH7.5）で洗浄した。ついでガラスビーズを0.5
％トウイーン20を含有する20mlの0.1Mりん酸ナ
トリウム―0.3M NaCl（PH7.5）中に懸濁した。
分析により抗体濃度は懸濁液１ml当たり約16μｇ
であることが示された。 ｂ 沃素―125によるヒツジ―抗ヒトIgG―抗体
の置換 ガラス試験管が氷浴中に置かれた。10μの
0.3M NaCl中に溶解した45μｇのヒツジ―抗ヒト
IgG―抗体〔BrCN―活性化セフアロース4Bに電
気泳動精製されたヒトIgGを結合させることによ
り製造されてそしてアガロース―ヒトIgG誘導体
で精製された免疫収着剤〕を管に加えた。PH7.0
である40μの0.2Mりん酸ナトリウムバツフア
ー（0.02％NaN3）、100μのクロルアミン―Ｔ
（1.5mM）および0.7μのNa125I（0.36Ci）を加
えた。２分後、20μの0.1M Na2S2O3および50
μの0.1M KIの添加により反応を中断した。あ
らかじめ１mlの１％ウシ血清アルブミンで調整さ
れそして0.05％トウイーン20、0.02％NaN3および
0.05M Na2S2O3を含有するPH7.4である0.05Mりん
酸ナトリウムバツフアーで平衡に保たれたセフア
デツクスＧ―25のカラム上で反応混合物をクロマ
トグラフイーにかけた。孔容積相当フラクシヨン
を集め、これをPH7.0である0.05Mりん酸ナトリ
ウムで５倍に希釈した。分析によりそれ（10ml）
は１ml当たり約４μｇのラベルされたヒツジー抗
ヒトIgG―抗体を含有していることが示された。 ｃ 分裂性ヒトIgG―ガラス―誘導体を含有する
競争系における125I―ラベルされたヒツジ―抗
ヒトIgG―抗体によるヒトγグロブリンの分析 それぞれガラス―ヒトIgG（前述による100μ
の懸濁液）および125I―置換されたヒツジ―抗
ヒトIgG―抗体（前述溶液をPH7.5である0.1Mり
ん酸ナトリウム―0.3M NaCl―0.5％トウイーン
20中で10倍に希釈することにより得られた100μ
の溶液）を含有する一連のエレルマン管が調製
された。ついでこれらの管に100μの0.1Mりん
酸ナトリウム―0.3M NaCl―0.5％トウイーン20
（PH7.5）中に溶解した種々の量のヒトγ―グロブ
リンを加えた。各管を振盪テーブル上において25
℃で４時間振盪し、ついでガラスビーズを４×２
mlの0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M NaCl―0.5％
トウイーン20（PH7.5）で洗浄した。ついでガラ
スビーズを20mMの過沃素酸ナトリウムを含有す
る上記ホスフエートバツフアー0.5ml中に懸濁し
た。これによりヒトIgGをガラスに結合させてい
る近接ジオール構造が分裂されそして免疫錯体
〔ヒトIgG―（125I―ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体）
―錯体〕が溶液中に入る。振盪テーブル上で＋25
℃において60分間反応を行なわせしめついで上澄
み液中の遊離された放射能をガンマカウンターで
測定した。遊離放射能の量はガラス誘導体に結合
された125I―ラベルされたヒツジ―抗ヒトIgG―
抗体の量に比例しそして試験溶液のガンマグロブ
リン濃度に逆比例する。 125I―ラベルされた抗体のガラスビーズに対す
る非特異吸収による背景効果はこの操作により減
少され得た。 本実施例において用いられている125I―ラベル
されたヒツジ―抗ヒトIgG―抗体を実施例７記載
のヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―α―アラミラーゼ
多錯体接合体と置換して操作することもできる。
その場合実施例10(c)項の記載と同様にして、ヒト
IgGをガラスに結合させているビシナルジオール
構造を開裂させ、次にラベルされた免疫複合体を
含有する溶液をガラスビードから分離しそして実
施例７(b)項の記載に従いジスルフイツド結合をジ
チオトレイトールにより開裂させてジスルフイツ
ドアミラーゼ―多錯体を免疫複合体かから遊離さ
せてこれをより小さなユニツトに分解させ、そし
てα―アミラーゼ活性を分析することによりヒト
γ―グロブリンを検出する。 実施例 11 アガロース―トリプシンを包含する競合系にお
ける２―ピリジルジスルフイド置換のダイズト
リブシン抑制剤によるダイズトリプシン抑制剤
の分析 ａ アガロース―トリプシン誘導体の調整法 20mgのトリプシン（凍結乾燥されたトリプシ
ン、Worthington Biochem社製）を２mlの0.1M
NaHCO3中における２ｇ（乾燥吸収された）の
CNBr―活性化セフアロース4B（Pharmacia
Fine Chemicals AB製のシアノゲンブロマイド
活性化アガロース）懸濁液と混合した。反応混合
物を24時間＋４℃で撹拌した。ついで生成された
ゲル誘導体を0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M
NaCl（PH7.5）（200ml）、0.1M酢酸ナトリウム―
0.3M、NaCl（PH4.0）（200ml）、0.1M NaHCO3―
10mMエタノールアミン（200ml）そして最後に
0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M NaCl（PH7.5）
（200ml）で洗浄した。ゲルを＋４℃で上記の最後
の溶液中に懸濁させて貯蔵した。 ｂ ダイズトリプシン抑制剤の２―ピリジルジス
ルフイド誘導体の調製 18mgのダイズトリプシン抑制剤（Sigma
Chem.社製の凍結乾燥されたトリプシン抑制剤型
Ｉ―Ｓ）をPH7.5である0.1mlの0.1Mりん酸ナトリ
ウム―0.3M NaCl中に溶解した。溶液をセフアデ
ツクスＧ―25のカラム上でゲル過した（使用媒
体は前述のバツフアーであつた）。150μの
50mM Ｎ―スクシンイミジル―３（２―ピリジ
ルジチオ）プロピオネートを５分毎50μずつで
孔容積相当物質（約16mgの蛋白質を含有する2.0
ml）に加た。＋25℃で30分間反応させた後反応混
合物をセフアデツクスＧ―25のカラム上でゲル
過した（使用媒体はPH7.5である0.1Mりん酸ナト
リウム―0.3M NaClであつた）。20mgの蛋白質当
たり4.3μモルの２―ピリジルジスルフイド基の
置換度を有し、ダイズトリプシン抑制剤―２―ピ
リジルジスルフイド誘導体4.8mg／mlを含有した
孔容積相当物質3.0mlを＋４℃で貯蔵した。 ｃ ２―ピリジルジスルフイド置換のダイズトリ
プシン抑制剤によるダイズトリプシン抑制剤の
分析 試験分析はいわゆる競合法で実施された。100
mgの乾燥吸引されたアガロース―トリプシン誘導
体（約１mgトリプシンに相当する）（前述参照）
および0.3mlの0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M
Nacl（PH7.5）中における1.4mgのダイズトリプシ
ン抑制剤―２―ピリジルージスルフイド誘導体
（前述参照）を一連の試験管の各々に加えた。つ
いで種々の濃度の0.3mlのダイズトリプシン抑制
剤溶液を各管に加え、その後各管を＋25℃で60分
間注意深く振盪した。ついでアガロースゲルを
0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M Nacl（PH7.5）で
洗浄しそして２mlのこのバツフアー中に懸濁し、
ついでこれに0.2mlの50mMジチオトレイトール
を加えた。＋25℃で10分間各管を振盪した後各管
のアガロースゲルを遠心分離により分離しそして
上澄み液の遊離２―チオピリドンの量を343nmに
おいて分光光度計で測定した。遊離された２―チ
オピリドンの量はアガロースートリプシンに結合
されたダイズトリプシン抑制剤の２―ピリジルジ
スルフイド誘導体の量に比例しそして試験溶液の
天然ダイズトリブシン抑制剤濃度に逆比例する。
約0.1〜10mgダイズトリプシン抑制剤／mlを含有
する溶液が試験で使用された。 実施例 12 固定された免疫錯体からα―アミラーゼを遊離
させるためのデキストラナーゼを包含するサン
ドイツチ法におけるヒツジ―抗ヒトIgG―抗体
―デキストラン―α―アミラーゼ接合体による
ヒトカンマグロブリンの分析 ａ ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―デストラン―α
―アミラーゼ接合体の調製 13mgのα―アミラーゼ（実施例１参照）を1.1
mlの0.05Mりん酸ナトリウムバツフアー―0.3M
Nacl（PH7.5）中に溶解し、これに110μｌの
5mMN―スクシンイミジル―３（２―ピリジルジ
チオ）プロピオネート（99.5％EtoH中の）を加
えた。溶液を激しく振盪しついで15分間放置し、
その後100μｌの50mMジチオトレイトールを加
えた。さらに15分間放置後、反応混合物をセフア
デツクスＧ―25のカラム上でゲル過した（使用
媒体は0.3M Naclであつた）。0.9モルHS―基／モ
ル蛋白質の置換度を有し、１ml当たり4.70mgのチ
オール化α―アミラーゼを含有する孔容積相当物
質2.5mlを集めた。 こうしてチオール化されたα―アミラーゼ
（2.5ml中約12mg）をPH7.5である1.5mlの0.1Mりん
酸ナトリウム―0.3MNacl中に溶解された12mgの
２―ピリジルジスルフイドデキストラン（実施例
４にしたがつて製造）と混合した。＋25℃で24時
間注意深く撹拌しながら反応を行なわせてテキス
トラン―α―アミラーゼ誘導体を生成した。 0.3mlの0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M Nacl
（PH7.5）中における0.8mgのヒツジ―抗ヒトIgG―
抗体（実施例10）のように精製された免疫収着
剤）を無水エタノール中における25μｌの5mM
Ｎ―スクシンイミジル―３（２―ピリジルジチ
オ）プロピオネートと混合した。＋25℃で反応を
行なわせしめついで反応混合物をセフアデツクス
Ｇ―25のカラム上でゲル過した（使用媒体はPH
5.0である0.1M酢酸ナトリウムであつた）。孔容
積相当物質（0.7ml中0.7mg）を30分間5mMジチオ
トレイトールで還元し、ついで過剰の還元剤をセ
フアデツクスＧ―25上でのさらに別のゲル過に
より除去した（使用媒体は0.3MNaclであつた）。
こうして得られたチオール化抗体〔孔容積相当物
質、蛋白質モル当りHS2モルを含有する蛋白質
0.55mg（1.0ml）〕を0.1mlのデキストラン―α―ア
ミラーゼ誘導体（前述参照）と混合しそして撹拌
しながら＋４℃で24時間反応を行なわせしめた。
ヒツジ―抗ヒトIgG―抗体―デキストラン―α―
アミラーゼ接合体を含有する反応混合物を＋４℃
で貯蔵した。 ｂ 固定された免疫錯体からα―アミラーゼを遊
離させるためのデキストラナーゼを包含するサ
ンドイツチ法におけるヒツジ―抗ヒトIgG―抗
体―デキストラン―α―アミラーゼ接合体によ
るヒトガンマグロブリンの分析 懸濁液１ml当たり約50μｌの抗体を含有する
100μｌのアガロース―ヒツジ―抗ヒトIgG―抗
体誘導体〔実施例7b）と同様に製造された〕の
懸濁液を100μｌの0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M
Nacl―0.5％トウイーン20（PH7.5）中に溶解され
た種々の量（0.5〜300ng）のヒトガンマグロブリ
ンを有する一連の試験管の各各に加えた。バツフ
アーのみを含有する多数の管およびアミノエチル
アガロース〔実施例7b）に記載のように製造〕
を含有する多数の管がブランクとして利用され
た。各管を注意深く振盪させながら＋25℃で18時
間インキユベートした。ついで各管のアガロース
ゲルを実施例7b）に記載のように洗浄した。ヒ
ツジ―抗ヒトIgG―抗体―デキストラン―α―ア
ミラーゼ接合体（前述参照）含有の反応混合物を
100倍に希釈し100μｌを洗浄されたアガロース懸
濁液を含有する（約0.3ml／管）各管に加えた。
ついでこれらの管を注意深く振盪させながら＋25
℃で18時間インキユベートし、その後各管のアガ
ロースゲルを実施例7b）に記載のように洗浄し
た。ついで0.1Mりん酸ナトリウム―0.3M Nacl
（PH7.5）中における1.0mlのデキストラナーゼ
（Worthington Biochemical社製、DEX0.5mg／
ml）をすべての管に加えそして＋25℃で60分間イ
ンキユベートした。デキストラナーゼは担体デキ
ストランを崩壊し、α―アミラーゼが接合体およ
び固定された免疫錯体から遊離されて溶液中に入
る。ついで遊離されたα―アミラーゼ活性を実施
例7b）に記載のように測定した。 遊離されたα―アミラーゼ活性はアガロース―
免疫錯体誘導体に結合された抗体―デキストラン
―α―アミラーゼ接合体の量に比例しそしてこれ
はついでアガロー抗体誘導体に結合されたガンマ
ーグロブリンの量に比例し、こうして試験溶液の
ガンマグロブリン濃度の側定値が得られる。この
ようにしてヒトガンマグロブリンが約1ng／mlの
濃度まで検出され得た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも１種類の分析的に指示可能な基で
標識されかつその存在下に生物特異的親和反応が
実施されるところの液体中に可溶性である成分
（）を、（）に対し生物特異的親和性を有する
対応因子（）および場合によりさらに前記成分
（）または（）に対して生物特異的親和性を
示す少なくとも１種類の付加的な対応因子との反
応に使用し、そして標識された成分（）がとり
込まれておりしかも液相から分離される不溶性接
合体を形成させ、次に不溶性接合体中の分析的に
指示可能な基を分析することからなる生物特異的
親和反応を包含する分析法を実施するに当り、共
有結合の性質を有する開裂可能な結合が ａ 分析的に指示可能な基の成分（）への結
合、および ｂ その存在下に生物特異的親和反応が実施され
るところの液体中に不溶性である担体への前記
対応因子の１種類の結合 の少なくとも一方において用いられており、かつ
同じかまたは相異なりうる前記開裂可能な結合が
ここで用いられる分析法に実際上何ら妨害的な影
響を及ぼさない条件下に還元、酸化または交換反
応により開裂されうること、および不溶性接合体
が液体の存在下に前記開裂可能な結合または複数
の結合のところで開裂されて開裂が実施される液
体中に可溶性でありしかも分析的に指示可能な基
を含有する断片を形成し、次にこの指示可能な基
が該液相中で分析されることを特徴とする方法。 ２ 分析的に指示可能な基が酵素活性基であるこ
とを特徴とする前記特許請求の範囲第１項による
方法。 ３ 分析的に指示可能な基が酵素活性基または蛍
光性基であり、その基は接合体の開裂しうる結合
で結合された唯一の部分を構成することを特徴と
する前記特許請求の範囲第１項による方法。 ４ 開裂しうる基がジスルフイルド結合―Ｓ―Ｓ
―であることを特徴とする前記特許請求の範囲第
１〜３項のいずれか一項に記載の方法。 ５ 標識された成分（）が開裂しうる結合を含
有する結合を介して互いに結合されている複数個
の分析的に指示可能な基の多接合体からなり、そ
して前記指示可能な基の多接合体は好ましくは開
裂しうる結合により前記成分（）に結合されて
いることを特徴とする前記特許請求の範囲第１〜
４項のいずれか一項に記載の方法。
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