DE2537275C3

DE2537275C3 - Immunchemisches Verfahren zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten

Info

Publication number: DE2537275C3
Application number: DE19752537275
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: Watzek, Karl, 8120 Weilheim
Current assignee: Stiftung fur Diagnostische Forschung
Priority date: 1975-08-21
Filing date: 1975-08-21
Publication date: 1980-12-18
Also published as: DE2537275A1; DE2537275B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein immunchemisches Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Seit der klassischen Arbeit von Yalow und Berson über die radioimmunologische Bestimmung von Insulin im Jahre 1959 wurde die radioimmunologische Methodik weiter vervollständigt und sie erwies sich bald als eines der empfindlichsten und spezifischsten Analysenverfahren zur Bestimmung von Hormonkonzentrationen, da Hormone wegen ihrer niedrigen Konzentration mit anderen klinisch-chemischen Verfahren nicht oder nur sehr schwer zu erfassen sind. Inzwischen sind Radioimmunoassays für nahezu alle bekannten Peptidhormone ausgearbeitet worden. Durch Immunisierung von Tieren mit Hormonproteinkomplexen gelang es auch, Antiseren gegen Steroide, Schilddrüsenhormone und Pharmaka zu gewinnen und radioimmunologische Bestimmungsmethoden für diese Substanzen zu entwikkeln. Mit Hilfe der radioimmunologischen Methoden konnten in den letzten Jahren viele neue Erkenntnisse in Physiologie und Endokrinologie gewonnen werden und seit einiger Zeit finden sie auch z. B. in der Biochemie und Mikrobiologie sowie zur laufenden Kontrolle von Arzneimittel-Plasmakonzentrationen Anwendung.

Die neuen diagnostischen Möglichkeiten mit Radioimmunoassays bieten die Möglichkeit einer wirksamen Bekämpfung der sich permanent vermehrenden Zivilisationskrankheiten wie Bluthochdruck und Schilddrüsenerkrankungen, ζ. B. deren Früherkennung, doch sind diese Methoden nicht frei von Nachteilen.

So besteht z. B. nicht nur ein erhöhtes Umweltschutz-Risiko, sondern es müssen auch bestimmte zeit- und kostenaufwendige Voraussetzungen geschaffen werden, z, B. eine spezielle Ausstattung der Laborräume und eine spezielle Schulung, Ausbildung und Überwachung des Laborpersonals entsprechend den Auflagen der Strahlenschutzverordnung, eine Genehmigung zum Umgang mit radioaktiven Stoffen und eine Vorschriftsmäßige Beseitigung der radioaktiven Abfälle. Als nachteilig erweist sich ferner die mögliche Schädigung der Antigene durch Radiolyse, besonders bei den energiereichen Jod-Isotopen, sowie die Tatsache, daß aufgrund der Kurzlebigkeit der für die Markierung verwendeten Isotope (J¹³¹, J¹²⁵) bisher noch nicht die

Möglichkeit bestand, die Methoden nach § 12 des Arzneimittelgesetzes zu kontrollieren, standardisieren und registrieren.

Aus deir DE-OS 23 05 775 ist es bekannt, indikatorgruppenhaltige Propan- oder Butanderivate als Markierungssubstanzen für immunologische Bestimmungen einzusetzen, wobei allerdings in etwas umständlicher Weise diese Arbeitssubstanzen oxidativ aufgespalten werden müssen und aus dem indikatorgruppenhaltigen Bruchstück die Indikatorgruppe eliminiert werden muß.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein immunochemisches Verfahren anzugeben, das frei ist von den aufgezeigten Nachteilen der radioimmunologischen Methode, andererseits jedoch mindestens die gleiche Genauigkeit wie diese hat, und das sich in bezug auf das letztgenannte Verfahren, bei dem Arbeitssubstanzen, die nicht radioaktiv sind, zum Einsatz gelangen, durch einfachere Verfahrensdurchführung und größere Meßgenauigkeii auszeichnet.

Diese Aufgabe wird gemäß dein kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs 1 gelöst

Dieses Verfahren erlaubt die Bestimmung von Steroiden, Hormonen, virulenten und bakteriellen Antigenen, Tumorantigenen, Enzymantigenen, Bakteriolysinen, Allergenen, Pharmakas, Drogen, Metaboliten, Vitaminen, Antitoxinen, Agglutinien, Präzipitinen, botanischen Antigenen, Antigammaglobulinen und Antikörpern aller Art.

Die Arbeitssubstanz bzw. ein Bruchstück derselben sind einer exakten Messung leicht zugänglich und deren Menge steht in direktem Verhältnis zur Menge an gesuchtem Antigen bzw. über das Antigen zum sonstigen gesuchten Körper.

Bei der an der Messung beteiligten Reaktion handelt es sich um eine echte immunologische Reaktion, an der in an sich bekannter Weise Antikörper/Antigene beteiligt sind.

Die Messung erfolgt je nach Arbeitssubstanz nach verschiedenen, bekannten, klinisch-chemischen Methoden, vorzugsweise durch fluorometrische Meßmethoden.

Ein besonderer Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß abgesehen von der einfachen Durchführung die Sensitivität und Spezifität sehr hoch ist So ist z. B. eine Messung im einzelnen Nierenuklei möglich und die Meßgenauigkeit geht von

ng/mi( = l χ 10 ⁹ g)bis pg/ml(= 1 χ 10¹²g)
z. B. von 1 pg/ml — 0,1 pg/ml.

Die Antigene werden statt wie bisher mit verschiedenen radioaktiven Nukliden, wie Jod¹", H'. C¹⁴ oder Pⁱ², mit der nicht radioaktiven Arbeitssubstanz markiert, bei der es sich um Cumarinderivate, insbesondere Umbelliferon, 4-Methylumbelliferon, 3-Carboxymethylumbelliferon und 3-Acetylumbelliferon sowie λ- oder 0-Naphthol handelt. Als ganz besonders vorteilhaft zur Erzielung der empfindlichsten Meßdaten erweist sich der Bernsteinsäureester von 4-Methylumbelliferon und die Erfindung wird anhand dieser Verbindung erläutert. Im folgenden wird zur Erläuterung der Erfindung die Herstellung der bevorzugten Arbeitssubstanz sowie die Kupplung der Antigene mit der Arbeitssubstanz und eine Bestimmung der Antigenkonzentration in unbekannten Proben beispielsweise beschrieben.

HO

I) Herstellung der Arbeitssubstanz O O O

II/ \ll

C C

CH,

CH₁ CH₁

4-Methylumbelliferon
M. G. 176,17

Bernsteinsäureanhydrid M. G. 100,04

OH

Bernsteinsäure-4-methylumbelliferylester(MU), M. G. 276,21;
Ausbeute 50—80%

A) Reinigung der Arbeitssubstanz

Die Reinigung des 4-Methylumbelliferon von eventuell vorhandenem freien Phenol erfolgt durch Extraktion und Rekristallisation mit Äthylalkohol oder Diäthyläther. Es bilden sich weiße Kristallnadeln mit einem Schmelzpunkt von 185 —186° C (Pechmann und Duisberg; Ben 16 (1883) 2122).

B) Bildung des
Bernsteinsäure-4-methyiumbelliferylesters

5 mg 4-Methylumbelliferon (rekristallisiert) werden in 5 ml Pyridin gelöst und im stöchiometrischen Verhältnis mit Bernsteinsäureanhydrid zur Reaktion gebracht (Molverhältnis 4-Methylumbelliferon zu Bernsteinsäureanhydrid 1:1). Die Veresterung findet bei Raumtemperatur unter Rühren innerhalb einer halben Stunde statt Nach Abschluß der Reaktion wird das Pyridin bis zur vollständigen Trockene abgedampft (Raumtemperatur, Vakuum oder Aufblasen von Stickstoff), der Rückstand mit Diäthyläther (wasserfrei, frisch destilliert) rekristallisiert, abgesaugt, der Rückstand getrocknet und gewogen (die Ausbeute soll zwischen 50 und 80% liegen).

II) Kopplung der Aniigene mit
der Arbeitssubstanz

1 Mol Bernsteinsäure-4-methylumbelIiferyIester wird mit einem dem Antigen angepaßten Puffer (Phosphat-, Barbital- oder Trispuffer) mit einem pH-Wert von 6,0 — 6,8 gelöst und mit einem Mol Dicyclo.hexylcarbodiimid (M. G. 194) versetzt Dazu wird das zu markierende Antigen, dessen Menge sich nach der Struktur des Antigens (verfügbare Aminogruppen) und seinem Molekulargewicht richtet, gegeben.

Beispiel

Thyroxin oder Trijodthyronin = 1 Aminogruppe = 1 Mol

TSH = ca. 6 Aminogruppen = 0,16MoI

Die Kopplung erfolgt prinzipiell über die Carboxylgruppe des Bernsteinsäure-4-methyIumbelliferylesters an die verfügbaren A minogruppen des Antigens:

HO-C-(CH₂J₂-C-O

O + NH₂-Antigen

N=C=N
Carbodiimid

H H

Ν—C-N

H, O

Bei einigen Antigenen ist es notwendig, um die Kopplung der Arbeitssubstanz an die Aminogruppen nicht zu gefährden, andere reaktive Gruppen, wie Carboxylgruppen, durch Veresterungen oder andere chemische Substitutionen, zu blockieren, Zum Beispiel wird zur Kopplung der Schiiddrösenhormone Tj und T4 die Carboxylgruppe durch Veresterung mit Äthy!- oder Methylalkohol blockiert.

Il

CH₂-CH-C-OH + C₂H₃OH NH₂

HO

J J

T₄-Äthylester

Il

CH₂-CH-C-OC₂H₅ + H₂O

NH₂

Bei Antigenen, die keine Aminogruppen enthalten, wie z. B. Pharmaka oder Steroide, wird über eine Aminosäure, deren Carboxylgruppe verestert wird, gekoppelt.

östradiol

O 0 0

II/ \ll

C C

I I

CH₂ CH₂

östradiolhemisuccinut

OH

NH₂ (CH₂J₄

+ H₂N-CH₂

C-OC₂H₅

O Lysin-Äthylester

CH,

O O C=O

o-X

C=O

OH

Arbeitssubstanz

N=C=N

H H

Ν—C-N

Il ο

(CH₂J₂ NH-C-(CH₂)₂-C-0

C=O (C¹H₂I₂

ι ι

NH -CH₂

C-OC₂H₅
O

+ 2Η,0

Die Reinigung der markierten Antigene erfolgt zweckmäßigerweise über Dünnschicht- oder Säulenchromatografie.

III) Bestimmung der Antigenkonzentration in unbekannten Proben

Wird eine bestimmte Menge Antigen, mit der Arbeitssubstanz markiert (die einzusetzende Menge ergibt sich aus dem Antikörpertiter; Freisetzung von 50-70% 4-MethyIumbelliferon), mit dem Untersuchungsmaterial und mit einer bestimmten Menge Antikörper versetzt, dann erfolgt durch die Einstellung des Äquiliüriums der immunologischen Reaktion zwisehen dem markierten Antigen, Probenantigen und dem spezifischen Antikörper eine Freisetzung von 4-Methylumbelliferon, da der zur Markierung benutzte Bernsteinsäure-4-methylumbelliferylestef in wäßriger Lösung ebenfalls dem Massenwirkungsgesetz unterliegt. Durch die Entfernung des Antigens, an das der Ester durch eine irreversible Peptidkopplungsreaktion gebunden ist, wird vom Bernsteinsäure-4-methylumbelIiferyI-ester 4-Methylumbelliferon freigesetzt Der aritigenspezifische Antikörper verschiebt also das Ester-Gleichgewicht nach dem Massenwirkungsgesetz zugunsten von 4-Methylumbe!liferon.

1.

O O C=O

I-

(CH₂J₂
C=O
Antigen—NH

(AgMLT)

CH₃

+ H₂O

pH 6,0—6,8

(AgMU) + H₂O

OH

C=O
(CH₂), + HO
C=O

CH₃

Antigen—NH
(Ag)

(Ag) + (MU)

(MU)

(Ag) (MLT)
(AgMLJ)

= K

AgMU
Ag(Probe)

-f Antikörper

pH 6,0—6,8

FAeAk]
[AgAkJ

AsMU + MU

ίο

H₂O

+ AntikäYper

pH 6,0—6,8

Antigen —NH

OH
C=O
(CH₂)
C=O
NH
Antigen

Antikörper

HO

Reaktion!:

Ester-Darstellung nach dem Massenwirkungsgesetz.

Reaktion 2:

Schematische Einstellung des immunologischen Äquilibriums bei Anwesenheit von Probenantigen und die dadurch bedingte Abspaltung von freiem 4-Methylumbelliferon (Reaktion i).

Reaktion 3:

Angriffspunkt des antigenspezifischen Antikörpers am markierten Antigen und damit die Eliminierungsreaktion eines Partners aus der Esterreaktion (Reaktion 1).

Bedingt durch die Freisetzung von 4-ivieihyiüiuueliiferon durch die immunologische Reaktion (Reaktionen 1 bis 3) erübrigt sich auch die Trennung des antikörpergebundenen vom freien Antigen, da die freigewordene 4-Methylumbelliferon-Menge ein zuverlässiger Parameter für den Antigen-Antikörper-Komplex ist. Eine Trennung des ebenfalls freiwerdenden markierten Antigens vom freien 4-Methylumbelliferon ist nicht notwendig, da bei Alkalisierung (pH = 10,3) der an das Antigen konjugierte Bernsteinsäure-4-Methylumbelliferylester bei einer anderen Wellenlänge (380 nm) fluoresziert als das durch die OH-Ionen gebildete 4-Methylumbelliferon-Phenolat-Ion (448 nm).

pH 10.3

OH

/F J

Λ EmQX + H₂O

PHENOUT-ION
FLUORESZENZ WB nm

PHENOUT

380nm 600nm

Die Antigenmarkierung mit dem Bernsteinsäure-4-methylumbelliferylester ermöglicht die Durchführung von qualitativen und quantitativen Antigennachweisen:

A) Quantitative Antigenbestimmung
in unbekannten Proben

Zu diesen Bestimmungen steht derzeit nur das mittlerweile bewährte radioimmunologische Verfahren zur Verfügung (L. Raith, Einführung in die radioimmunologischen Methoden, 1974).

Beim vorliegenden neuen Verfahren ändern sich die Mengenverhältnisse bei der fluorimetrischen Methode gegenüber dem bekannten RIA kaum. Auch die chemischen Zusammensetzungen der verwendeten Pufferlösungen bleiben unverändert, die einzige Abwandlung betrifft deren pH-Wert Die immunologische Reaktioii nach dem Verfahren der Fluoreszenzmarkierung m-iiß wegen der leichten Hydrolisierbarkeit des Antigen-Bernsteinsäure-4-methylumbelliferylesters im leicht alkalischen Milieu in den leicht sauren Bereich

(pH = 6,0 — 6,8) verschoben werden. Diese Maßnahme hat jedoch keinen Einfluß auf die immunologische Reaktion, Die beim RIA oft langwierige Und zeitraubende Separation zur Abtrennung der antikörpergebundeheii Phase von der freien Phase entfällt nach dem neuen Verfahren völlig. £ur Messung der Fluoreszenz wird nach der immunologischen Reaktion ein alkalischer Puffer (pH = 10,3)zugesetzt und die intensive weißblaue Fluoreszenz des «t-Methylumbelliferon-PhenolaMons,

das durch die immunologische Reaktion aus der Kopplung an das Antigen freigesetzt wurde, bei einer Wellenlänge von 448 nm in einem empfindlichen Fluorimeter oder Spektrofluorimeter gemessen. Die Standardisierung und Endauswertung der Meßergebnisse erfolgt nach den gleichen Kriterien wie beim Radioimmunoassay (Standardkurve, erhalten durch den Assay von bekannten Mengen unmarkierten Antigens und Berechnung der Konzentration nach der Eichreihe).

Beispiel

Zu 100-200 Mikroliter Untersuchungsmaterial (Serum, Plasma, Urin-Liquor, wäßrige Lösungen) werden 100 — 200 Mikroliter Antigen, das mit Arbeitssubstanz (z. B, Bernsteinsäure-4-Methylumbelliferylester = B-4-MU) markiert ist, und 100 Mikroliter des Antiserums gegeben und inkubiefu Die Verdünnungen der eingesetzten Reagentien Und die Inkubationszeit sind von Antigen zu Antigen unterschiedlich und müssen vor dem Bestimmungsansatz individuell ausgetestet werden.

Nach Abschluß der Inkubationszeit werden dem Ansatz 1-2 ml Puffer pH = 10,3 zugesetzt und die Fluoreszenz des freigewordenen 4-Methylumbelliferon-Phenolat-Ions bei 448 nm in einem empfindlichen Fluorimeter oder Spektrofluorimeter gemessen.

Durch die Mitführung von Standardproben (unmarkierte Antigene in verschiedenen Konzentrationen), die

_i_:_u -i.— τ τ—χ ι ι— ι—u~~,i,*u „_rn~A~~ ;»» _nr>

glCIU'lI UCl WlIlGl aUljIlUlIgapI \JU\* L/l*IiaiiUi<il VTViuwi, ιοί ιό möglich, nach dem Eintragen der gemessenen Emissionswerte in ein Koordinatensystem an der Eichkurve die Antigenkonzentration der unbekannten Proben zu ermitteln.

■ANTIGENKONZENTRATION

Bei einigen Antigenen besteht durchaus die Möglichkeit, daß ihre Affinität zum Antikörper zu gering ist, um aus der immunologischen Reaktion 4-MethyIumbelliferon freizusetzen. In diesem Fall kann man den Antikörper an Festkörper (Sephadex) oder an die Röhrchenwand (Polystyrolröhrchen) koppeln. Dies gilt auch für Antigene, falls der entsprechende Antikörper bestimmt werden soll.

Kopplung des Antikörpers an Polystyrolröhrchen

Zur Kopplung des Antikörpers an die Wände der Röhrchen (Polystyrol) wird das Antiserum zuerst mit Rivanol (Hoechst) behandelt 0,4 ml des Antiserums, in entsprechender Endverdünnung (Barbitalpuffer), wird in die Röhrchen gegeben und 18 Stunden bei 4⁰C oder für 3 Stunden bei 37° C inkubiert. Der pH-Wert des Barbitalpuffers soll zwischen 9,6 und 10,2 liegen. Danach werden die Röhrchen dreimal mit 0,1 m Phosphatpuffer (pH=7 bis 7,4) gespült Anschließend werden 0,6 ml zugesetzt Dann sind die Röhrchen bei 4° C für 2 bis 3 Wochen lagerfähig. Für den Assay wird der Phosphatpuffer entfernt und es werden die zur immunologischen Reaktion notwendigen Reagentien zugesetzt (siehe

so oben). Nach Abschluß der immunologischen Reaktion wird der Überstand abgekippt und der an die Röhrchenwand gekoppelte Antigen-Antikörper-Komplex mit einem geeigneten Lösungsmittel (Äthanol oder Methanol) eluiert, mit Puffer (10,3 pH) verseift und das freigewordene 4-MU-Phenolat-Ion fluorimetrisch gemessen.

Die quantitative TSH-Bestimmung

Vorgereinigtes, international standardisiertes TSH (Thyroid Stimulating Hormone) wird, wie eingangs beschrieben, an das 4-MethylumbeIliferon gebunden.

Zur quantitativen TSH-Bestimmung wird eine bekannte Menge Humanserum mit einer durch den Antikörpertiter genau definierten Menge (40 bis 60% Bindungskapazität) mit 4-MethylumbelIiferon markiertem TSH inkubiert Bei 37° C genügt eine Inkubationszeit von ca. 8 Stunden. Die Inkubationszeit kann variiert werden, besonders bei niedrigeren Temperaturen (z. B.

Zimmertemperatur) auf 24 Stunden erhöht werden.

Während der Inkubationszeit stellt sich das immunologiEshe Gleichgewicht nach dem Massenwil'kungsgesetz ein und es wird dabei eine der unbekannten TSH-Menge (Probe) proportional entsprechende Menge an 4-Methylumbelliferon aus der Bindung an das TSH verdrängt.

Da die 4-Methylumbelliferon-TSH-Verbindung keine fluoreszierenden Eigenschaften besitzt, kann das freigesetzte 4-Methylumbelliferon leicht und bequem ohne Trennungsverfahren direkt fluorometrisch gemessen werden.

Durch Erstellung einer Standardreihe, wie oben beschrieben, die durGh eine Verdünnung einer bekannten Menge von unmarkiertem TSH dargestellt wird, kann anhand einer Eichkurve der TSH-Gehalt der zu bestimmenden Proben direkt abgelesen werden.

5 Bei der Antigenmarkierung mit <x- oder ^-Naphthol zum Beispiel und nach dessen Freisetzung wird zweckmäßig eine colorimetrische oder photometrische Messung angewandt. Im folgenden ist ein immunchemischer Diagnose-Kit (IDK) für Bestimmungen in Blut,

ίο Plasma, Serum, Urin-Liquor oder wäßrigen Lösungen zusammengestellt. Ein solcher Kit wird zweckmäßig beispielsweise für jeweils 100 Bestimmungen ausgelegt.

Immunchemischer Diagnostika-Kit (IDK) für 100 Bestimmungen in Blut, Plasma, Serum, Urin-Liquor oder wäßrigen Lösungen

Reagens (Fläschchen)

Standard 0
(lyophilisiert)

Zusammensetzung

Phosphat-Puffer 7,4
Rinderserum-Albumin, krist.

Standard 1
(lyophilisiert)

Standard 2
(lyophilisiert)

Standard 3
(lyophilisiert)

Standard 4
(lyophilisiert)

Standard 5
(lyophilisiert)

Standard 6
(lyophilisiert)

Antiserum
(lyophilisiert)

Arbeitssubstanz/Antigen
(B - 4 - MU) lyophilisiert

Puffer
(lyophilisiert)

Objektträger
(lyophilisiert)

Phosphat-Puffer 7,4
Rir.derserum-Albumin, krist.
Antigen 0,5 ng

Phosphat-Puffer 7,4
Rinderserum-Albumin, krist.
Antigen 1,0 ng

Phosphat-Puffer 7,4
Rinderserum-Albumin, krist.
Antigen 2,0 ng

Phosphat-Puffer 7,4
Rinderserum-Albumin, krist.
Antigen 4,0 ng

Phosphat-Puffer 7,4
Rinderserum-Albumin, krist.
Antigen 0,8 ng

Phosphat-Puffer 7,4
Rinderserum-Albumin, krist.
Antigen 16 ng

Antiserum
Phosphat-Puffer 7,4
Arbeitsverdünnung 1: 4 000
Endverdünnung 1:12 000

B - 4 - MU

Antigen

Phosphat-Puffer 7,4 (Konzentr.: 40 ng/n) Phosphatpuffer pH 10,3/0,1 M

Antigen

Grundsätzlich enthält also ein solcher Kit

1. eine Standardreihe von Antigen (0—6) lyophilisiert,

2. ein Antiserum (lyophilisiert), wobei diese Substanzen normalerweise in Pufferlösung vorliegen,

3. ein mit Arbeitssubstanz markiertes und lyophilisiertes Antigen, üblicherweise ebenfalls in Pufferlösung, wobei eine bestimmte Konzentration an Antigen eingestellt ist,

4. eine weitere Pufferlösung (lyophilisiert), normalerweise Phosphatpuffer, pH = 10,3/0,1 m, sowie

5. Objektträger, die mit lyophilisiertem Antigen versehen sind, und zwar zweckmäßig auf unter-60 schiedliche Gebrauchsdichten eingestellt

B) Qualitative Antigenbestimmung in unbekannten Proben

65 Völlig neue diagnostische Möglichkeiten eröffnen sich unter Anwendung des beschriebenen Verfahrens durch die Kopplung der Antikörper auf Objektträger, Papier- oder Kunststoffstreifen. Bei dieser Methode

werden die Antikörper auf einem Objektträger fixiert (z. B. durch Polyvinylpyrrolidon) oder an einen Papieroder Kunststoffstreifen adsorbiert (reaktivierte Nylonstreifen). Dem Untersuchungsmaterial wird unter entsprechenden Verhältnissen (Puffer, pH-Wert) eine Lösung des Dicyclohexylcarbodiimid und der Arbeitssubstanz zugesetzt, worauf die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen wird. Dadurch werden sämtliche im Untersuchungsmaterial vorhandenen Antigene, die eine Aminogruppe enthalten, markiert. Das so präparierte Untersuchungsmaterial wird nun auf den gebundenen oder fixierten Antikörper aufgebracht jßd inkubiert Nach Beendigung der Inkubationszeit wird der Objektträger, Papier- oder Nylonstreifen mit einem Puffer gespült, getrocknet und unter einem Fluoreszenzmikroskop oder nur mit einer UV-Lampe beobachtet Läßt sich eine Fluoreszenz feststellen, ist dies ein Beweis dafür, daß in der Untersuchungsprobe das zum spezifischen Antikörper passende Antigen vorhanden ist Dies ist beSünders wichtig zum Nachweis von bakteriellen, virulenten und mikrobiologischen Antigenen.

Ein schnelles und sicheres diagnostisches Verfahren für Screening-Untersuchungen und Notfälle ergibt sich nach der oben beschriebenen Methode (Objektträger-, Papier- oder Nylonstreifenbeschichtung mit Antikörpern) und Bereitstellung von zwei Standardproben, die den oberen und unteren Normalbereich charakterisieren und die gleich der zu untersuchenden Probe mit

ίο Dicyclohexylcarbodiimid und Arbeitssubstanz markiert werden. Nach dem Aufbringen auf den Antikörper und dem Ablauf der immunologischen Reaktion kann die Fluoreszenz der Untersuchungsprobe mit der der Standardproben verglichen werden oder zu deren

^5 quantitativem Nachweis mit organischen Lösungsmitteln extrahiert, alkalisiert und gemessen werden. Der Fluoreszenzvergleich bietet dann eine sichere und schnelle Aussage über einen eventuellen phathologischen Wert im Untersuchungsmaterial.

030 251/203

Claims

25 δι ; Patentansprüche:

1. Immunchemisches Verfahren zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten unter Verwendung einer durch Bindung an eine Arbeitssubstanz markierten Form des Antigens, Freisetzung der Arbeitssubstanz oder eines Bruchstücks davon und direkte Messung der freigesetzten Arbeitssubstanz bzw. ihres Bruchstücks, dadurch gekennzeichnet, daß als Arbeitssubstanz Cumarinderivate oder «- oder ^-Naphthol verwendet werden, und daß die Arbeitssubstanz oder das Bruchstück davon durch die immunologische Reaktion selbst freigesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Arbeitssubstanz 4-Methylumbelliferon, 3-Carboxymethylumbelliferon, 3-Acetylumbelliferon oder Umbelliferon verwendet und fluorometrisch gemessen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Bernsteinsäureester von 4-Methylumbelliferon verwendet wird.