DE2537275B2 - Immunchemisches Verfahren zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten - Google Patents
Immunchemisches Verfahren zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in biologischen FlüssigkeitenInfo
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- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein immunchemisches Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.
Seit der klassischen Arbeit von Yalow und Berson
über die radioimmunologische Bestimmung von Insulin im Jahre 1959 wurde die radioimmunologische Methodik weiter vervollständigt und sie erwies sich bald als
eines der empfindlichsten und spezifischsten Analysenverfahren zur Bestimmung von Hormonkonzentrationen, da Hormone wegen ihrer niedrigen Konzentration
mit anderen klinisch-chemischen Verfahren nicht oder nur sehr schwer zu erfassen sind. Inzwischen sind
Radioimmunoassays für nahezu alle bekannten Peptidhormone ausgearbeitet worden. Durch Immunisierung
von Tieren mit Hormonproteinkomplexen gelang es auch, Antiseren gegen Steroide, Schilddrüsenhormone
und Pharmaka zu gewinnen und radioimmunologische Bestimmungsmethoden für diese Substanzen zu entwikkeln. Mit Hilfe der radioimmunologischen Methoden
konnten in den letzten Jahren viele neue Erkenntnisse in Physiologie und Endokrinologie gewonnen werden und
seit einiger Zeit finden sie auch z. B. in der Biochemie und Mikrobiologie sowie zur laufenden Kontrolle von
Arzneimittel-Plasmakonzentrationen Anwendung.
Die neuen diagnostischen Möglichkeiten mit Radioimmunoassays bieten die Möglichkeit einer wirksamen
Bekämpfung der sich permanent vermehrenden Zivilisationskrankheiten wie Bluthochdruck und Schilddrüsenerkrankungen, ζ. B. deren Früherkennung, doch sind
diese Methoden nicht frei von Nachteilen.
So besteht z. B. nicht nur ein erhöhtes Umweltschutz-Risiko, sondern es müssen auch bestimmte zeit- und
kostenaufwendige Voraussetzungen geschaffen werden, z. B. eine spezielle Ausstattung der Laborräume und
eine spezielle Schulung, Ausbildung und überwachung des Laborpersonals entsprechend den Auflagen der
Strahlenschutzverordnung, eine Genehmigung zum Umgang mit radioaktiven Stoffen und eine vorschriftsmäßige Beseitigung der radioaktiven Abfälle. Als
nachteilig erweist sich ferner die mögliche Schädigung
der Antigene durch Radiolyse, besonders bei den
energiereichen Jod-Isotopen, sowie die Tatsache, daß aufgrund der Kurzlebigkeit der für die Markierung
verwendeten Isotope (J131, J'25) bisher noch nicht die
Möglichkeit bestand, die Methoden nach § 12 des Arzneirnittelgesetzes zu kontrollieren, standardisieren
und registrieren.
Aus der DE-OS 23 05 775 ist es bekannt, indikatorgruppenhaltige Propan- oder Butanderivate als Markie-
rungssubstanzen für immunologische Bestimmungen einzusetzen, wobei allerdings in etwas umständlicher
Weise diese Arbeitssubstanzen oxidativ aufgespalten werden müssen und aus dem indikatorgmppenhaltigen
Bruchstück die Indikatorgruppe eliminiert werden muß.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein immunodiemisches
Verfahren anzugeben, das frei ist von deD aufgezeigten Nachteilen der radioimmunologischen Methode, andererseits jedoch mindestens die gleiche Genauigkeit
wie diese hat, und das sich in bezug auf das
2G letztgenannte Verfahren, bei dem Arbeitssubstanzen,
die nicht radioaktiv sind, zum Einsatz gelangen, durch einfachere Verfahrensdurchführung und größere Meßgenauigkeit auszeichnet
Diese Aufgabe wird gemäß dem kennzeichnenden
Dieses Verfahren erlaubt die Bestimmung von Steroiden, Hormonen, virulenten und bakteriellen
Antigenen, Tumorantigenen, Enzymantigenen, Bakteriolysinen, Allergenen, Pharmakas, Drogen, Metaboli-
ten, Vitaminen, Antitoxinen, Agglutinien, Präzipitinen, botanischen Antigenen, Antigammaglublinen und Antikörpern aller Art.
Die Arbeitssubstanz bzw. ein Bruchstück derselben sind einer exakten Messung leicht zugänglich und deren
Menge steht in direktem Verhältnis zur Menge an gesuchtem An ^en bzw. über das Antigen zum
sonstigen gesuchten Körper.
Bei der an der Messung beteiligten Reaktion handelt es sich um eine echte immunologische Reaktion, an der
in an sich bekannter Weise Antikörper/Antigene beteiligt sind.
Die Messung erfolgt je nach Arbeitssubstanz nach verschiedenen, bekannten, klinisch-chemischen Methoden, vorzugsweise durch fluorometrische Meßmetho-
4-> den.
Ein besonderer Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß abgesehen von der einfachen Durchführung die
Sensitivität und Spezifität sehr hoch ist. So ist z. B. eine Messung im einzelnen Nierenukler möglich und die
το Meßgenauigkeit geht von
ng/ml(=l χ IO "g)bis pg/ml (
z. B. von 1 pg/ml — 0,1 pg/ml.
1 χ IO
Die Antigene werden statt wie bisher mit verschiedenen radioaktiven Nukliden, wie Jod12"', H1, CH oder P",
mit der nicht radioaktiven Arbeitssubstanz markiert, bei der es sich um Cumarinderivate, insbesondere Umbelliferon, 4-Methylumbelliferon, 3-Carboxymethylumbelliferon und 3-Acetylumbelliferon sowie <%- oder 0-Naphthol handelt. Als ganz besonders vorteilhaft zur
Erzielung der empfindlichsten Meßdaten erweist sich der Bernsteinsäureester von 4-Methylumbelliferon und
die Erfindung wird anhand dieser Verbindung erläutert.
Im folgenden wird zur Erläuterung der Erfindung die
Herstellung der bevorzugten Arbeitssubstanz sowie die Kupplung der Antigene mit der Arbeitssubstanz und
eine Bestimmung der Antigenkonzentration in unbekannten Proben beispielsweise beschriebers.
HO
I) Herstellung der Arbeitssubstanz O O O
II/ \ll
L. ΓΙ2
4-Methylumbelliferon
M. G. 176,17
Bernsteinsäureanhydrid M-G. 100,04
Bernsteinsäurc-4-methyIumbelliferylester(MU), M. G. 276,21;
Ausbeute 50—80%
Die Reinigung des 4-Methylumbelliferon von eventuell vorhandenem freien Phenol erfolgt durch Extraktion
und Rekristallisation mit Äthylalkohol oder Diäthyläther. Es bilden sich weiße Kristallnadeln mit einem
Schmelzpunkt von 185-186°C (Pechmann und Duisberg;Ber. 16(18?3>2122).
5 mg 4-Methylumbelliferon (rekristallisiert) werden in 5 ml Pyridin gelöst und im stöchiometrischen Verhältnis
mit Bernsteinsäureanhydrid zur Reaktion gebracht. (Molverhältnis 4-Methylumbelliferon zu Bernsteinsäureanhydrid 1 : \\ Die Veresterung findet bei Raumtemperatur unter Rühren innerhalb einer halben Stunde
statt. Nach Abschluß der Reaktion wird das Pyridin bis zur vollständigen Trockene abgedampft (Raumtemperatur, Vakuum oder Aufblasen von Stickstoff), der
Rückstand mit Diäthyläther (wasserfrei, frisch destilliert) rekristallisiert, abgesaugt, der Rückstand getrocknet und gewogen (die Ausbeute soll zwischen 50 und
80% liegen).
II) Kopplung der Antigene mit
der Arbeitssubstanz
1 MoI Bernsteinsäure-4-methylumbelliferylester wird
6,0 — 63 gelöst und mit einem Mol Dicyclohexylcarbo
diimid (M. G. 194) versetzt Dazu wird das zu
markierende Antigen, dessen Menge sich nach der
-ij Struktur des Antigens (verfügbare Aminogruppen) und
seinem Molekulargewicht richtet, gegeben.
Thyroxin oder Trijodthyronin = I Aminogruppe = 1 Mol
Die Kopplung erfolgt prinzipiell über die Carboxylgruppe des Bernsteinsäure-4-methylumbelliferylesters
> an die verfügbaren Aminogruppen des Antigens:
O + NH2 Antigen
N--C= N
Carbodiimid
M H
N --C- N-
Il
ο
+ H2O
Bei einigen Antigenen ist es notwendig, um die Kopplung der Arbeitssubstanz an die Aminogruppen
nicht zu gefährden, andere reaktive Gruppen, wie Carboxylgruppen, durch Veresterungen oder andere
chemische Substitutionen, zu blockieren. Zum Beispiel wird zur Kopplung der Schilddrüsenhormone T3 und T4
die Carboxylgruppe durch Veresterung mit Äthyl- oder Methylalkohol blockiert
Il
CH2-CH-C-OH + C2H3OH
NH,
HO
T4-Äthylester
ί,—CH-C-OC2H5 + H2O
NH2
Bei Antigenen, die keine Aminogruppen enthalten, wie z. B. Pharmaka oder Steroide, wird über eine Aminosäure,
deren Carboxylgruppe verestert wird, gekoppelt.
OH
östradiol
O O O
Il / , Il
c c
I I
CH, CH,
OH
östradiolhemisuccinat
OH
NH2 (CH2I4
+ H2N-CH2
C-OC2H5
O
Lysin-Äthylestcr
O
O
C=O
\ ν. ι ii ti -j /
OH
Arbcitssubstan/
Arbcitssubstan/
N=C = N-
Il Il
N CN
Ii
O
O
"Η^ NH C (CH2J2 C
CH,
Die Reinigung der markierten Antigene erfolgt zweckmäßigerweise über Dünnschicht- oder Säulenchromatografie.
III) Bestimmung der Antigenkonzentration
in unbekannten Proben
in unbekannten Proben
Wird eine bestimmte Menge Antigen, mit der Arbeitssubstanz markiert (die einzusetzende Menge
ergibt sich aus dem Antikörpertiter; Freisetzung von 50-70% 4-Methylumbelliferon), mit dem Untersuchungsmaterial
und mit einer bestimmten Menge Antikömer versetzt, dann erfolgt durch die Einstellung
des Äquilibriums der immunologischen Reaktion zwi-
)<i sehen dem markierten Antigen, Probe.nantigen und dem
spezifischen Antikörper eine Freisetzung von 4-Methylumbelliferon,
da der zur Markierung benutzte Bernsteinsäure-4-methylumbelliferylester
in wäßriger Lösung ebenfalls dem Massenwirkungsgesetz unterliegt.
π Durch die Entfernung des Antigens, an das der Ester durch eine irreversible Peptidkopplungsreaktion gebunden
ist, wird vom Bernsteinsäure-4-methylumbelliferylester
4-Methylumbelliferon freigesetzt. Der antigenspezifische Antikörper verschiebt also das Ester-Gleichge-
·<η wicht nach dem Massenwirkungsgesetz zugunsten von
4-Methylumbelliferon.
CH.,
C = (J
(CH,)2
(CH,)2
C = O
Antigen—NH
(AgMU)
+ H2O
oh
C=O
CH,
ΙΟΙ I
pH 6,0—6,8 i /'λνΑθ'\
(CH2J2 +HO O
C=O
Antigen — NH
(Ag)
(Ag)
(AaMU) + H2O ,
(MU)
(Ag) + (MU) = K
(Ag) + (MU) = K
Ag(Probc,
AgAk
6,0-6,8
Ag
AgMU + MU
ίο
C=O
(CH2), l· Antikörper
I
( O
( O
Antigen NH
Reaktion 1:
Ester-Darstellung nach dem Massenwirkungsgesetz.
Reaktion 2:
Schematische Einstellung des immunologischen Äquilibriums bei Anwesenheit von Probenantigen
und die dadurch bedingte Abspaltung von freiem 4-Methylumbeiliferon (Reaktion I).
Reaktion 3:
Angriffspunkt des antigenspezifischen Antikörpers am markierten Antigen und damit die Eliminierungsreaktion
eines Partners aus der Esterreaktion (Reaktion 1).
H2O
pH 6.0 6.x OH
C = O
(CH2)
C O
C O
NH
Antigen f
Antikörper
CII,
HO
>n Bedingt durch die Freisetzung von 4 Methylumbelliferon
durch die immunologische Reaktion (Reaktionen 1 bis 3) erübrigt sich auch die Trennung des
antikörpergebundenen vom freien Antigen, da die freigewordene 4-Methylumbelliferon-Menge ein zuverlässiger
Parameter für den Antigen-Antikörper-Komplex ist. Eine Trennung des ebenfalls freiwerdenden
markierten Antigens vom freien 4-Methylumbelliferon ist nicht notwendig, da bei Alkalisierung (pH = 10,3) der
an das Antigen konjugierte Bernsteinsäure-4-Methylumbelliferylester
bei einer anderen Wellenlänge (380 nm) fluoresziert als das durch die OH-Ionen
gebildete 4-Methylumbelliferon-Phenolat-lon (448 nm).
pH 10.3
+ H2O
PHENOLAT-ION
FLUORESZENZ U8nm
PHENOUT
380nm
iWnm
600nm
Die Antigenmarkierung mit dem Bernsteinsäure-4-methylumbelliferylester ermöglicht die Durchführung
von qualitativen und quantitativen Antigennachweisen:
A) Quantitative Anligenbestimmung
in unbekannten Proben
Zu diesen Bestimmungen steht derzeit nur das mittlerweile bewährte radioimmunologische Verfahren
zur Verfugung (L Rcith, Einführung in die radioimmunologischen Methoden, 1974).
65
Beim vorliegenden neuen Verfahren ändern sich die
Mengenverhältnisse bei der fluorimetrischen Methode gegenüber dem bekannten RIA kaum. Auch die
chemischen Zusammensetzungen der verwendeten Pufferlösungen bleiben unverändert, die einzige Abwandlung betrifft deren pH-Wert Die immunologische
Reaktion nach dem Verfahren der Fluoreszenzmarkierung muß wegen der !eichten Hydrolisierbarkeit des
Antigen-Bemsteinsäure-4-methylumbeIliferylesters im
leicht alkalischen Milieu in den leicht sauren Bereich
(pH = 6,0—6,8) verschoben werden. Diese Maßnahme hat jedoch keinen Einfluß auf die immunologische
Reaktion. Die beim RIA oft langwierige und zeitraubende Separation zur Abtrennung der antikörpergebundenen Phase von der freien Phase entfällt nach dem neuen
Verfahren völlig Zur Messung der Fluoreszenz wird
nach der immunologischen Reaktion ein alkalischer Puffer (pH = 103) zugesetzt und die intensive weißblaue
Fluoreszenz des 4-Methylumbelliferon-Phenolat-Ions.
das durch die immunologische Reaktion aus der Kopplung an das Antigen freigesetzt wurde, bei einer
Wellenlänge von 448 nm in einem empfindlichen Fluorimeter oder Spektrofluorimeter gemessen. Die
Standardisierung und Endauswertung der Meßergebnisse erfolgt nach den gleichen Kriterien wie beim
Radioimmunoassay (Standardkurve, erhalten durch den Assay von bekannten Mengen unmarkierten Antigens
und Berechnung der Konzentration nach der Eichreihe).
Zu 100-200 Mikroliter Untersuchungsmaterial (Serum, Plasma, Urin-Liquor, wäßrige Lösungen) werden
100-200 Mikroliter Antigen, das mit Arbeitssubstanz (z. B. Bernsteinsäure-4-Methylumbelliferylester = B-4-fviü) markiert ist, und iöö rviikroiiter des Antiserums
gegeben und inkubiert. Die Verdünnungen der eingesetzten Reagentien und die Inkubationszeit sind von
Antigen zu Antigen unterschiedlich und müssen vor dem Bestimmungsansatz individuell ausgetestet werden.
Nach Abschluß der Inkubationszeit werden dem Ansatz I-2 ml Puffer pM = 10,3 zugesetzt und die
Fluoreszenz des freigewordenen 4-Methylumbelliferor.-Phenolat-Ions bei 448 nm in einem empfindlicher.
Fluorimeter oder Spektrofluorimeter gemessen.
Durch die Mitführung von Standardproben (unmarkierte Antigene in verschiedenen Konzentrationen), die
gleich der Untersuchungsprobe behandelt werden, ist es möglich, nach dem Eintragen der gemessenen Emissionswerte in ein Koordinatensystem an der Eichkurve
die Antigenkonzentration der unbekannten Proben zu ermitteln.
ΛΕ
8 —ANTIGENKONZENTRATION
Bei einigen Antigenen besteht durchaus die Möglichkeit, daß ihre Affinität zum Antikörper zu gering ist, um
aus der immunologischen Reaktion 4-Methylumbellife- >o
ron freizusetzen. In diesem Fall kann man den Antikörper an Festkörper (Sephadex) oder an die
Röhrchenwand (Polystyrolröhrchen) koppeln. Dies gilt auch für Antigene, falls der entsprechende Antikörper
bestimmt werden solL
Zur Kopplung des Antikörpers an die Wände der Röhrchen (Polystyrol) wird das Antiserum zuerst mit
Rivanol (Hoechst) behandelt 0,4 ml des Antiserums, in entsprechender Endverdünnung (Barbitalpuffer), wird
in die Röhrchen gegeben und 18 Stunden bei 4° C oder
für 3 Stunden bei 37°C inkubiert Der pH-Wert des Barbitalpuffers soll zwischen 9,6 und 10,2 liegen. Danach
werden die Röhrchen dreimal mit 0,1 m Phosptatpuffer
(pH=7 bis 7,4) gespült Anschließend werden 0,6 ml zugesetzt Dann sind die Röhrchen bei 4° C für 2 bis 3
Wochen lagerfähig. Für den Assay wird der Phosphatpuffer entfernt und es werden die zur immunologischen
Reaktion notwendigen Reagentien zugesetzt (siehe oben). Nach Abschluß der immunologischen Reaktion
wird der Überstand abgekippt und der an die Röhrchenwand gekoppelte Antigen-Antikörper-Komplex mit einem geeigneten Lösungsmittel (Äthanol oder
Methanol) eluiert, mit Puffer (103 pH) verseift und das
freigewordene 4-MU-Phenolat-Ion fluorimetrisch gemessen.
Vorgereinigtes, international standardisiertes TSH (Thyroid Stimulating Hormone) wird, wie eingangs
beschrieben, an das 4-MethylumbeIliferon gebunden.
Zur quantitativen TSH-Bestimmung wird eine bekannte Menge Humanserum mit einer durch den
Antikörpertiter genau definierten Menge (40 bis 60% Bindungskapazität) mit 4-MethyIumbelliferon markiertem TSH inkubiert Bei 37° C genügt eine Inkubationszeit von ca. 8 Stunden. Die Inkubationszeit kann variiert
werden, besonders bei niedrigeren Temperaturen (z. B.
Zimmertemperatur) auf 24 Stunden erhöht werden.
Während der Inkubationszeit stellt sich das immunologische Gleichgewicht nach dem Massenwirkungsgesetz
ein und es wird dabei eine der unbekannten TSH-Menge (Probe) proportional entsprechende Menge
an 4-Methylumbelliferon aus der Bindung an das TSH verdrängt.
Da die 4-Methylumbelliferon-TSH-Verbindung keine
fluoreszierenden Eigenschaften besitzt, kann das freigesetzte 4-Methylumbelliferon leicht und bequem ohne
Trennungsverfahren direkt fluorometrisch gemessen werden.
Durch Erstellung einer Standardreihe, wie oben beschrieben, die durch eine Verdünnung einer bekannten
Menge von unmarkiertem TSH dargestellt wird, kann anhand einer Eichkurve der TSH-Gehalt der zu
bestimmenden Proben direkt abgelesrη werden.
Bei der Antigenmarkierung mit <x- oder 0-Naphthol
zum Beispiel und nach dessen Freisetzung wird zweckmäßig eine colorimetrische oder photometrische
Messung angewandt. Im folgenden ist ein immunciiemischer
Diagnose-Kit (IDK) für Bestimmungen in Blut, Plasma, Serum, Urin-Liquor oder wäßrigen Lösungen
zusammengestellt. Ein solcher Kit wird zweckmäßig beispielsweise für jeweils 100 Bestimmungen ausgelegt.
Immunchemischer Diagnostika-Kit (IDK) für 100 Bestimmungen in Biut, Plasma,
Serum, Urin-Liquor oder wäßrigen Lösungen
Keagens (Häschcnen)
Standard 0
(lyophilisiert)
(lyophilisiert)
Zusammensetzung
Phosphal-PuiTer 7,4
Rinderserum-Albumin, krist.
Rinderserum-Albumin, krist.
Standard I
(lyophilisiert)
(lyophilisiert)
Standard 2
(lyophilisiert)
(lyophilisiert)
Standard 3
(lyophilisiert)
(lyophilisiert)
Standard 4
(lyophilisiert)
(lyophilisiert)
Standard 5
(lyophilisiert)
(lyophilisiert)
Standard 6
(lyophilisiert)
(lyophilisiert)
Antiserum
(lyophilisiert)
(lyophilisiert)
Arbeitssubstanz/Antigen
(B - 4 - MU) lyophilisiert
(B - 4 - MU) lyophilisiert
Puffer
(lyophilisiert)
(lyophilisiert)
Objektträger
(lyophilisiert)
(lyophilisiert)
Phosphat-Pufrer 7,4
Rinderserum-Albumin, krist.
Antigen 0,5 ng
Rinderserum-Albumin, krist.
Antigen 0,5 ng
Phosphat-Puffer 7,4
Rinderscrum-Albumin, krist.
Antigen 1,0 ng
Rinderscrum-Albumin, krist.
Antigen 1,0 ng
Phosphat-PufTer 7,4
Rinderserum-Albumin, krist.
Antigen 2,0 ng
Rinderserum-Albumin, krist.
Antigen 2,0 ng
Phosphat-Puffer 7,4
Rinderserum-Albumin, krist.
Antigen 4,0 ng
Rinderserum-Albumin, krist.
Antigen 4,0 ng
Phosphat-Puffer 7,4
Rinderserum-Albumin, krist.
Antigen 0,8 ng
Phosphat-Puffer 7,4
Rinderserum-Albumin, krist.
Antigen 16 ng
Rinderserum-Albumin, krist.
Antigen 0,8 ng
Phosphat-Puffer 7,4
Rinderserum-Albumin, krist.
Antigen 16 ng
Antiserum
Phosphat-Puffer 7,4
Arbeitsverdünnung 1: 4 000
Endverdünnung i: 12 000
Phosphat-Puffer 7,4
Arbeitsverdünnung 1: 4 000
Endverdünnung i: 12 000
B - 4 - MU
Antigen
Phosphat-Puffer 7,4 (Konzentr.: 40 ng/n) PhosphatpulTer pH 10,3/0,1 M
Antigen
Grundsätzlich enthält also ein solcher K;t
1. eine Standardreihe von Antigen (0 - 6) lyophilisiert,
2. ein Antiserum (lyophilisiert), wobei diese Substanzen normalerweise in Pufferlösung vorliegen,
3. ein mit Arbeitssubstanz markiertes und lyophilisiertes Antigen, üblicherweise ebenfalls in Pufferlösung,
wobei eine bestimmte Konzentration an Antigen eingestellt ist,
4. eine weitere Pufferlösung (lyophilisiert), normalerweise Phosphatpuffer, pH = 10,3/0,1 m, sowie
5. Objektträger, die mit lyophilisiertem Antigen versehen sind, und zwar zweckmäßig auf unter-60
schiedliche Gebrauchsdichten eingestellt
B) Qualitative Antigenbestimmung in unbekannten Proben
65 Völlig neue diagnostische Möglichkeiten eröffnen
sich unter Anwendung des beschriebenen Verfahrens durch die Kopplung der Antikörper auf Objektträger,
Papier- oder Kunststoffstreifen. Bei dieser Methode
werden die Antikörper auf einem Objektträger fixiert (z. B. durch Polyvinylpyrrolidon) oder an einen Papieroder
Kunststoffstreifen adsorbiert (reaktivierte Nylonstreifen). Dem Untersuchungsmaterial wird unter
entsprechenden Verhältnissen (Puffer, pH-Wert) eine Lösung des Dicyclohexylcarbodiimid und der Arbeitssubstanz zugesetzt, worauf die Mischung 30 Minuten bei
Raumtemperatur stehen gelassen wird. Dadurch werden sämtliche im Untersuchungsmaterial vorhandenen
Antigene, die eine Aminogruppe enthalten, markiert
Das so präparierte Untersuchungsmaterial wird nun auf den gebundenen oder fixierten Antikörper aufgebracht
und inkubiert Nach Beendigung der Inkubationszeit wird der Objektträger, Papier- oder Nylonstreifen mit
einem Puffer gespült, getrocknet und unter einem Fluoreszenzmikroskop oder nur mit einer UV-Lampe
beobachtet Läßt sich eine Fluoreszenz feststellen, ist dies ein Beweis dafür, daß in der Untersuchungsprobe
das zum spezifischen Antikörper passende Antigen vorhanden ist. Dies ist besonders wichtig zum Nachweis
von bakteriellen, virulenten und mikrobiologische! Antigenen.
Ein schnelles und sicheres diagnostisches Verfahrei
für Screening-Untersuchungen und Notfälle ergibt siel nach der oben beschriebenen Methode (Objektträger-Papier-
oder Nylonstreifenbeschichtung mit Antikör pern) und Bereitstellung von zwei Standardproben, dii
den oberen und unteren Normalbereich cherakterisie ren und die gleich der zu untersuchenden Probe mi
ίο Dicyclohexylcarbodiimid und Arbeitssubstanz markier
werden. Nach dem Aufbringen auf den Antikörper un< dem Ablauf der immunologischen Reaktion kann di<
Fluoreszenz der Untersuchungsprobe mit der de Standardproben verglichen werden oder zu derei
is quantitativem Nachweis mit organischen Lösungsmit
teln extrahiert alkalisiert und gemessen werden. De Fluoreszenzvergleich bietet dann eine sichere um
schnelle Aussage über einen eventuellen phathologi sehen Wert im Untersuchungsmaterial.
030 113/2
Claims (3)
1. Immunchemisches Verfahren zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in biologischen
Flüssigkeiten unter Verwendung einer durch Bindung an eine Arbeitssubstanz markierten Form des
Antigens, Freisetzung der Arbeitssubstanz oder eines Bruchstücks davon und direkte Messung der
freigesetzten Arbeitssubstanz bzw. ihres Bruchstücks, dadurch gekennzeichnet, daß als
Arbeitssubstanz Cumarinderivate oder cc- oder ^-Naphthol verwendet werden, und daß die
Arbeitssubstanz oder das Bruchstück davon durch die immunologische Reaktion selbst freigesetzt
werden.
2. Verfahren nach Anspruch I1 dadurch gekennzeichnet, daß als Arbeitssubstanz 4-Methylumbelliferon, 3-Carboxymethylumbelliferon, 3-AcetyIumbcüifcron oder Urnbcüifercn verwendet und fluorometrisch gemessen werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Bernsteinsäureester von 4-Methylumbelliferon verwendet wird.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DE19752537275 DE2537275C3 (de) | 1975-08-21 | 1975-08-21 | Immunchemisches Verfahren zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten |
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Publications (3)
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DE2537275A1 DE2537275A1 (de) | 1977-02-24 |
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ID=5954530
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE19752537275 Expired DE2537275C3 (de) | 1975-08-21 | 1975-08-21 | Immunchemisches Verfahren zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten |
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DE (1) | DE2537275C3 (de) |
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-
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- 1975-08-21 DE DE19752537275 patent/DE2537275C3/de not_active Expired
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