DE3790240C2

DE3790240C2 -

Info

Publication number: DE3790240C2
Application number: DE3790240A
Authority: DE
Inventors: Martin Lexington Mass. Us Koocher; Alan West Newton Mass. Us Burg
Original assignee: Crystal Diagnostics Inc
Current assignee: Crystal Diagnostics Inc
Priority date: 1986-05-12
Filing date: 1987-05-11
Publication date: 1990-09-27
Anticipated expiration: 2007-05-12
Also published as: JPS63501661A; WO1987007027A1; US4727024A; GB2199947B; DE3790240T; AU593112B2; GB8800545D0; GB2199947A; EP0267944A1; EP0267944A4; AU7433087A

Description

Die vorliegende Erfindung geht aus von einem Verfahren mit den im Oberbegriff des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen, die aus der US-PS 43 80 587 bekannt sind. Ferner betrifft die Erfindung ein Reagenz zur Durchführung eines solchen Verfahrens.

Die analytischen Nachweis- und Bestimmungsverfahren der hier interessierenden Art einschließlich aller biochemischer Assays und Immunoassays können in zwei generelle Assaytechniken eingeordnet werden: Homogene Assays, in denen die Reaktionspartner zu einer Reaktionsmischung vereinigt werden und die Identifizierung der jeweiligen Endprodukte ohne jede Trennung der chemischen Komponenten erfolgt, und heterogene Assays, bei denen die Reaktionspartner zu einer Reaktionsmischung vereinigt werden, die Reaktionsprodukte vor ihrer Identifizierung jedoch getrennt werden müssen. Von diesen beiden allgemeinen Klassen sind die heterogenen Assays für analytische Forschungszwecke und klinische/diagnostische Anwendungen mehr gebräuchlich geworden.

Ein besonders gut bekannter Typ der heterogenen Assays sind immunologische Assays, bei denen die Fähigkeit spezieller polyklonaler und monoklonaler Antikörper ausgenützt wird, selektiv mit Antigenen und Haptenen zu kombinieren. Die Verwendung solcher immunologischer Komponenten allein oder in Kombination mit anderen chemischen Verbindungen zur qualitativen und quantitativen Bestimmung ist inzwischen fest eingeführt. Das klassische und vielleicht am besten bekannte Beispiel einer heterogenen immunologischen Assaymethode ist das Radioimmunoassay (im folgenden "RIA"), der bewährte Verfahren für die Bestimmung einer großen Vielzahl von verschiedenen Proteinen, Polypeptiden, Hormonen, Pharmazeutika und anderer chemischer Verbindungen bietet. Alle RIA-Verfahren, unabhängig von der speziellen Variante, basieren auf der Technik, die ursprünglich von R. S. Yallow und S. A. Berson in J. Clin. Invest. 39 : 1157 (1960) beschrieben wurde. Obwohl eine enorme Anzahl verschiedener auf diesem Grundprinzip basierender Variationen entwickelt wurde, beruht dieses Verfahren im wesentlichen auf der Konkurrenz zwischen einem interessierenden Analyten und seinem mit einem Radionuklid markierten Analogen für eine begrenzte Anzahl spezieller Bindungsstellen an einem Antikörper. Unter diesen Testbedingungen ändert sich die Konzentration des Radionuklid-markierten Analogen invers zur Konzentration des interessierenden Analyten in der Probe bezüglich der Fähigkeit eine Bindung mit dem speziellen Antikörper einzugehen. Viele Variationen der konkurrierenden Bindungsassaytechniken, einschließlich Gleichgewichtstechniken, Verdrängungsanalyse und sequentieller Sättigung sind entwickelt worden um einer Vielzahl verschiedener Anwendungen Rechnung zu tragen; eine vollständige Beschreibung dieser verschiedenen Verfahren findet sich in Clinical Radioassay Procedures: A Compendium (Paige K. Besch, Herausgeber) The American Association of Clinical Chemists, Inc., 1975.

Da der RIA von Natur aus im Prinzip ein heterogenes Assayverfahren ist, muß eine Trennung der Reaktionsprodukte erfolgen, um aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten. Es ist daher eine Anzahl verschiedener Maßnahmen zur Trennung der individuellen chemischen Reaktionsprodukte entwickelt worden. In einigen Fällen hat man einen der Reaktanden chemisch an große, feste Träger, wie rote Blutkörperchen und dergleichen gebunden, welche in dem Reaktionsfluid suspendiert werden und radioaktiv markiert werden können; bei anderen Verfahren wird das radiomarkierte Analoge oder ein radiomarkierter Antikörper auf der Oberfläche eines festen Substrats immobilisiert. Demzufolge gibt es eine lange Entwicklungsgeschichte hinsichtlich einer direkten oder über "Kopplungsarme" ("linker-arms") erfolgenden Immobilisierung eines Reaktanden an Festkörpern, wie Kunststoff-Reagenzgläsern und -scheiben, Agarose und Kunststoffperlen, porösem Glas und Polyacrylamidgelen, siehe z. B. Methods In Enzymology, Academic Press, 1980; Updike, Antibiotics and Chemotherapeutics 26 : 67 (1979) sowie die US-PS 37 93 445, 39 70 429 und 41 38 474.

Im Anschluß an die Entwicklung der RIA ist eine große Vielfalt von anderen Markierungen ("labels") als Radionukliden in heterogenen Testsystemen für eine Vielzahl von Zwecken eingeführt worden. Übliche Beispiele solcher Nicht-Isotopen- Markierungen sind fluoreszierende Farbstoffe, Elektronenspinradikale, spezifisch bindende Proteinpaare (wie Avidin und Biotin) und eine Vielzahl verschiedener Enzyme, die in Verbindung mit ihren jeweiligen Co-Faktoren und spezifischen Substraten verwendet werden. Die letzten hiervon sind auf dem Gebiet des Immunoassays als Enzym-Immunoassay (enzymelinked immuno-sorbent assay) oder "ELISA" zweifellos am besten bekannt geworden.

Trotz aller dieser Verbesserungen der heterogenen Assays legen alle derzeit bekannten und verwendeten Assaymethoden dem Verwender unerwünschte Einschränkungen und Grenzen auf. Beispielsweise bietet nur die RIA-Technik eine Analyseempfindlichkeit im Pikogrammbereich (10^-12-Gramm-Bereich) auf, während die anderen Markierungsassayverfahren nur im Mikrogrammbereich (10^-6-Gramm-Bereich) reproduzierbare Ergebnisse liefern. Radionuklid-Marker müssen jedoch sehr sorgfältig behandelt werden und das Problem der Abfallbeseitigung hat eine fast unlösbare Dimension angenommen. Alle derzeit verwendeten Verfahren, die mit einer oder mehreren markierten Verbindungen arbeiten, erfordern für genaue Ergebnisse die Verwendung von gut ausgebildeten, fachkundigen Laboranten und aufwendigen Analysegeräten. Die derzeit bekannten Verfahren sind außerdem alle nicht besonders gut für die Verwendung im Feld geeignet und können nicht am Ort für einen qualitativen Nachweis oder eine quantitative Bestimmung verwendet werden. Es ist also offensichtlich, daß bei heterogenen Assayverfahren im allgemeinen und Immunoassays im besonderen ein wohlbekannter und ständiger Bedarf für neue "Marker" ("label") und neue Verfahren für den Nachweis und die Bestimmung eines Analyten besteht.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein schnelles, genaues und extrem empfindliches Verfahren für die Bestimmung eines interessierenden Analyten in einer Fluidprobe unter Verwendung direkter und indirekter Techniken anzugeben. Diese Aufgabe wird durch ein gattungsgemäßes Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruches 1 bzw. 3 gelöst. Die einfachste Verfahrensweise ist das direkte Verfahren, das die folgenden Verfahrensschritte enthält: Bereitstellen eines konjugierten Reaktanden enthaltend (a) einen Bindungspartner, der für den interessierenden Analyten spezifisch ist und mindestens eine für eine chemische Reaktion zur Verfügung stehende Amingruppe aufweist, (b) ein chelatierbares metallisches Kation und (c) eine freisetzbare Markierungssubstanz, welche mindestens eine für eine chemische Reaktion zur Verfügung stehende Carbonylgruppe aufweist, wobei aus diesen drei Bestandteilen ein stabilisierter Iminkomplex gebildet wird; Vereinigen der Fluidprobe mit einem Konjugat-Reaktanden derart, daß der interessierende Analyt an mindestens einen Teil des konjugierten Reaktanden unter Bildung eines Analyt-Komplexproduktes bindet; Trennen des Analyt-Komplexproduktes vom ungebundenen Teil des Konjugat-Reaktanden in individuelle Fraktionen; Freisetzen der Markierungssubstanz von mindestens einer der getrennten Fraktionen; Vereinigen der freigesetzten Markierungssubstanz mit einem immobilisierten Derivatisierungsmittel, derart, daß eine Mehrzahl von Kristall-Keimbildungsstellen in situ gebildet werden, wobei das Derivatisierungsmittel auf der Oberfläche eines festen Substrats fixiert ist; Behandeln der Keimbildungsstellen mit einer metastabilen übersättigten Lösung, derart, daß eine Mehrzahl von optisch wahrnehmbaren Kristallen gebildet wird; und optisches Bestimmen des Vorhandenseins der gebildeten Kristalle, welche ein Maß für den interessierenden Analyten in der Fluidprobe sind.

Bei einem bevorzugten konkurrierenden Bindungsassay wird ein Ligand, der dem interessierenden Analyten analog ist, für einen Nachweis und eine Bestimmung des interessierenden Analyten verwendet. Durch die Erfindung wird ferner ein Reagenz vorgesehen, das die Bequemlichkeit und Nützlichkeit des neuen Verfahrens als ganzes maximiert und es dem Verwender ermöglicht, die Assaymethode im Feld an Ort für eine Vielzahl verschiedener umweltlicher, biochemischer, immunologischer und klinisch/diagnostischer Anwendungen zu benutzen.

Die sich durch die vorliegende Erfindung ergebenden Vorteile sind sowohl beträchtlich als auch zahlreich: Das Verfahren zur Feststellung eines interessierenden Analyts in einer Fluidprobe ist schnell durchzuführen und effizient hinsichtlich seiner Anforderungen an die Testprobengröße und das Reaktandenvolumen; die Methodik, unabhängig davon ob sie in einem direkten oder indirekten kompetitiven Modus durchgeführt wird, liefert genaue und reproduzierbare Werte; die vorliegende Methodik stellt dem Benutzer eine Auswahl von qualitativen und/oder quantitativen Resultaten zur Verfügung, um seine speziellen Anforderungen oder Wünsche zu erfüllen; die Testergebnisse sind mit dem unbewaffneten Auge visuell erkennbar und mit unkomplizierten Meßgeräten verifizierbar; die einzigartige Methodik erfordert nicht viel Wissen oder Information auf der Seite des Benutzers, um genaue Ergebnisse zu erhalten, und erfordert nicht, daß der Benutzer hochgradig fachkundig oder technisch geübt ist; die Einrichtungen zur Durchführung der neuen Verfahrensweise sind in der Technik derzeit verfügbar und relativ preiswert erhältlich; das Verfahren kann im Feld genau und reproduzierbar durchgeführt werden, so daß die Notwendigkeit entfällt, spezielle Proben herzustellen und/oder an einen speziellen Ort zu liefern, wodurch die inhärenten Probleme hinsichtlich der Probenstabilität, des Transports und der Speicherung, die einer Übermittlung der Proben anhaften, entfallen; schließlich liefert die Empfindlichkeit der vorliegenden Methodik konsistent reproduzierbare Resultate im Nanogramm/Milliliter-Bereich.

Die Erfindung wird im folgenden in Verbindung mit den Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 ein schematisches Flußdiagramm, in dem das vorliegende Verfahren als Direkt-Assay-Protokoll dargestellt ist;

Fig. 2 ein schematisches Flußdiagramm, welches das vorliegende Verfahren als Kompetitives-Bindungs- Assay-Protokoll zeigt;

Fig. 3 ein schematisches Flußdiagramm, das das vorliegende Verfahren als alternatives Kompetitives- Bindungs-Assay-Protokoll zeigt;

Fig. 4 eine Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines Derivatisierungsmittels, welches auf der Oberfläche eines Festphasensubstrats fixiert ist;

Fig. 5 eine Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform des auf der Oberfläche eines festen Substrats in diskreten Blockzonen fixierten Derivatisierungsmittels;

Fig. 6 eine Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform des auf der Oberfläche eines festen Substrats als Dichtegradient immobilisierten Derviatisierungsmittels;

Fig. 7a-7e ein bevorzugtes Test-Kit zur Durchführung der Verfahren gemäß der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung ist generell eine heterogene Assaymethode, wie zum Nachweis und/oder zur Bestimmung eines interessierenden Analyten in einer Fluidprobe in qualitativer und/oder quantitativer Weise brauchbar ist. Das Verfahren arbeitet mit einem einzigartigen identifizierenden "Indikator" in Kombination mit Neuerungen bezüglich der Kristallzüchtungstechnologie um genaue und reproduzierbare Resultate zu erhalten. Das vorliegende Verfahren verwendet außerdem die gut eingeführten Eigenschaften und Brauchbarkeiten von chemischen Zusammensetzungen, welche dafür bekannt sind, daß sie die Fähigkeit haben, spezifisch Bindungen miteinander einzugehen und sie verwendet diese chemischen Zusammensetzungen paarweise zur Feststellung des Vorhandenseins und der Konzentration eines interessierenden Analyten. Aus diesen Gründen sind die Anwendungen der vorliegenden Verfahren nicht auf immundiagnostische Assays beschränkt sondern generell verwendbar in Umweltuntersuchungen, biochemischen Analysen und der generellen chemischen Analysetechnik zur Identifizierung eines interessierenden Analyten oder Stoffes.

Bei dem vorliegenden Verfahren kann eine Vielfalt von chemischen Komponenten und Reaktanden in einer Reihe von Manipulationsschritten, die das Wachsen optisch bestimmbarer Kristalle mit dem Vorhandensein des interessierenden Analyten in der zu untersuchenden Probe korrelieren verwendet werden. Die Zubereitung und Verwendung der chemischen Komponenten zur Feststellung (qualitativ und quantitativ) des Vorhandenseins eines speziellen interessierenden Analyten in einer Fluidprobe ist daher durch das Erscheinen von gewachsenen Kristallen charakterisiert, die mit dem unbewaffneten Auge feststellbar sind. Die wesentlichen chemischen Komponenten, die bei dem vorliegenden Verfahren verwendet werden, enthalten die folgenden: Einen Konjugat-Reaktanden, der alternativ einen spezifischen Bindungspartner, ein chelatierbares metallisches Kation und eine freisetzbare Markierungs- oder Indikatorsubstanz enthält oder einen Liganden, der dem interessierenden Analyten analog ist, ein chelatierbares metallisches Kation und eine freisetzbare Markierungssubstanz; Mittel zur Freisetzung der Markierungssubstanz; ein immobilisiertes Derivatisierungsmittel; und eine metastabile übersättigte (Entwickler-)Lösung. Die Manipulationsschritte zur Verwendung dieser chemischen Komponenten in einer Direkt-Assay-Prozedur und in zwei kompetitiven Assayprozeduren sind in einer schematischen Flußfolge in den Fig. 1, 2 und 3 dargestellt.

Bei dem in Fig. 1 dargestellten Direkt-Assay-Verfahren wird der interessierende Analyt in einer Fluidprobe mit einem Überschuß eines Konjugat-Reaktanden kombiniert, welcher einen spezifischen Bindungspartner für den interessierenden Analyten, ein metallisches Kation und eine freisetzbare Markierungssubstanz enthält. Die Wechselwirkung zwischen dem interessierenden Analyten und dem Konjugat- Reaktanden hängt gänzlich von der Fähigkeit der spezifischen Bindungspartnerkomponente des konjugierten Reaktanden ab, sich spezifisch an den interessierenden Analyten zu binden und eine Bindung mit anderen chemischen Spezien im Fluid zu vermeiden. Nachdem genügend Zeit für eine Kombination des ganzen Analyten mit der Überschußkonzentration des Konjugat- Reaktanden verstrichen ist, wird der Trennungsschritt durchgeführt, der bei allen heterogenen Assays erforderlich und getrennte und individuelle Fraktionen liefert: Eine Fraktion, welche das Analyt-Komplexprodukt enthält, in dem der interessierende Analyt fest an die spezifische Bindungspartnerkomponente des Konjugat-Reaktanden gebunden worden ist; und die Fraktion, die den Rest des ungebundenen Konjugat-Reaktanden enthält, der ursprünglich im Überschuß, jedoch in bekannter Menge oder Konzentration vorhanden war. In beiden Fällen ist die Folge der Manipulationsschritte, die an die Trennung der Reaktionsprodukte in die individuellen Fraktionen folgt, gleich.

Anschließend an die in Fig. 1 dargestellte Folge von Manipulationsschritten wird mindestens eine der getrennten Fraktionen verwendet und mit speziellen Mitteln zur Freisetzung der Markierungssubstanz kombiniert, wobei eine der Komponenten den Konjugat-Reaktanden enthält. Die Freisetzung dieser Markierungssubstanz ist das funktionelle Äquivalent des "identifizierenden Indikators" ("identifying label") bei den bisher bekannten Assayverfahren. Diese Freisetzung der Markierungssubstanz und ihre folgende Wechselwirkung mit dem Derivatisierungsmittel, was die Keimbildung direkt einleitet und das Wachstum optisch bestimmbarer Kristalle quantitativ steuert, umfaßt den Rest des Assayverfahrens. Die freigesetzte Markierungssubstanz wird dementsprechend in reaktiven Kontakt mit einem fixierten Derivatisierungsmittel gebracht, einer chemischen Zusammensetzung, welche vorher auf der Oberfläche eines festen Substrats immobilisiert worden war und welche in der Lage ist, mit der Markierungssubstanz chemisch zu reagieren um eine Mehrzahl von feinen Teilchen in situ zu erzeugen, die als Kristall-Keimbildungsstellen für das Kristallwachstum auf der Oberfläche des festen Körpers dienen. Anschließend wird den Keimbildungsstellen auf dem festen Substanz eine metastabile übersättigte (Entwickler-) Lösung zugesetzt. Die Kombination der Keimbildungsstellen und Entwicklerlösung bewirkt die Bildung und das Wachstum von optisch bestimmbaren Kristallen, die visuell als opaker Film sichtbar werden. Beim qualitativen Nachweis zeigt die mit dem unbewaffneten Auge mögliche Feststellung von Kristallen als opaker Film das Vorhandensein des interessierenden Analyten in der Fluidprobe an; bei quantitativen Assays wird eine Bestimmung der Totalopazität konsistent eine Bestimmung eines interessierenden Analyten im Nanogrammbereich und unter speziell kontrollierten Bedingungen im Pikogrammbereich ermöglichen.

Bevorzugte Ausführungsformen des vorliegenden Verfahrens, welches mit kompetitiven Bindungsreaktionen arbeitet, sind in den Fig. 2 und 3 dargestellt. Der wesentliche Unterschied in den Manipulationsschritten zwischen der Verfahrensweise gemäß Fig. 2 und der Verfahrensweise gemäß Fig. 3 ist die Zusammensetzung des Konjugat-Reaktanden, der mit begrenzter Konzentration verwendet wird. Es wird ersichtlich sein, daß der in Fig. 2 dargestellte Konjugat- Reaktand einen spezifischen Bindungspartner enthält, der fähig ist, sich spezifisch sowohl an einen Liganden, der dem interessierenden Analyten analog ist, als auch an den interessierenden Analyten selbst zu binden. Dieser spezfische Bindungspartner ist mit einem chelatierbaren metallischen Kation und einer freisetzbaren Markierungssubstanz kombiniert um ein Konjugat-Molekül zu bilden. Im Gegensatz hierzu ist der Konjugat-Reaktand (ebenfalls in begrenzter Konzentration), der aus Fig. 3 ersichtlich ist, von dem alternativen Typ und enthält einen Liganden, der dem interessierenden Analyten analog ist, ein chelatierbares metallisches Kation und eine freisetzbare Markierungssubstanz. Es dürfte ersichtlich sein, daß die chemische Zusammensetzung des metallischen Kations und der freisetzbaren Markierungssubstanz im Konjugat-Reaktanden des Typs 1, der den spezifischen Bindungspartner enthält, und den konjugierten Reaktanden des Typs 2, der das Liganden- Analogen enthält, gleich sind.

Man wird außerdem feststellen, daß die kompetitiven Assay- Verfahrensweisen, die in den Fig. 2 und 3 dargestellt sind, sich von der Direktassay-Verfahrensweise gemäß Fig. 1 darin unterscheiden, daß bei den kompetitiven Assay-Verfahren drei chemische Zusammensetzungen als Reaktionsmischung entweder gleichzeitig oder mit sequentieller Hinzufügung verwendet werden. Bei den kompetitiven Assay-Verfahrensweisen besteht also eine Konkurrenz zwischen dem interessierenden Analyten und dem Liganden analogen in der Reaktionsmischung für die Bindungsstellen an dem spezifischen Bindungspartner. Vorzugsweise sind die Quantität oder Konzentration des Konjugat- Reaktanden (sowohl des Typs 1 als auch des Typs 2) begrenzt und liegen in einem optimalen Verhältnis bezüglich der begrenzten Menge des Ligandenanalogen vor, so daß wenn in der Fluidprobe kein interessierender Analyt vorhanden ist, die ganze Menge des Ligandenanalogen an den ganzen spezifischen Bindungspartner gebunden werden und wenig oder kein Rest einer dieser Komponenten verbleibt; aus diesem Grunde wird, wenn der interessierende Analyt in der Fluidprobe vorhanden ist, dieser sich mit dem spezifischen Bindungspartner (der in begrenzter Konzentration vorhanden ist) verbinden und auf diese Weise eine spezifische Menge an Ligandenanalogen verdrängen, der dann im ungebundenen Zustand in der Reaktionsmischung zurückbleibt. Diese Reaktionsfolge wird eintreten, gleichgültig ob das Ligandenanaloge oder der spezifische Bindungspartner ein Bestandteil des Konjugat-Reaktanden sind oder nicht.

Wie Fig. 2 zeigt, wird der Konjugat-Reaktand des Typs 1, der den spezifischen Bindungspartner enthält, mit dem interessierenden Analyt und dem Ligandenanalogen vereinigt um eine Reaktionsmischung zu bilden, in der eine Konkurrenz zwischen dem interessierenden Analyten und dem Ligandenanalogen bezüglich der Bindungsstellen der spezifischen Bindungspartnerkomponente des Konjugat-Reaktanden besteht. Da sowohl das Ligandenanaloge als auch der Konjugat-Reaktand des Typs 1 vorzugsweise in einer begrenzten, ein optimales Verhältnis ergebenden Konzentration vorliegen, wird die Bindung des interessierenden Analyten mit dem spezifischen Bindungspartner eine äquivalente Menge des Ligandenanalogen verdrängen, die ungebunden und frei beweglich im Fluid der Reaktionsmischung zurückbleibt. Nachdem eine geeignete Reaktionszeit verstrichen ist, werden die jeweiligen individuellen Reaktionsprodukte - das Analytkomplexprodukt, das Ligandenkomplexprodukt und das ungebundene Ligandenanaloge - unter Verwendung konventioneller Geräte und Techniken in individuelle Fraktionen aufgetrennt. Nachdem dieser erforderliche Trennungsschritt durchgeführt worden ist, können zwei der drei getrennten individuellen Fraktionen dazu verwendet werden, aussagekräftige Daten zu gewinnen: Das Analysatkomplexprodukt bzw. das Ligandenkomplexprodukt. Unter Verwendung einer der genannten Fraktionen oder beider Fraktionen wird das getrennte gekomplexte Reaktionsprodukt mit diskreten Mitteln zur Freisetzung der Markierungssubstanz kombiniert. Nachdem die Markierungssubstanz (im Dampf- oder Fluidform) einmal freigesetzt worden ist, wird sie mit einem fixierten Derivatisierungsmittel kombiniert, welches auf der Oberfläche eines festen Substrats fixiert ist, vorzugsweise als Film von monodispersen Partikeln. Die Reaktion der Markierungssubstanz mit dem fixierten Derivatisierungsmittel bildet eine Vielzahl von Keimbildungsstellen in situ auf der Oberfläche des festen Substrats.

Anschließend wird eine metastabile übersättigte (Entwickler-) Lösung den Keimbildungsstellen auf dem festen Substrat zugesetzt, was die Bildung und das Wachsen von optisch feststellbaren Kristallen auf der Oberfläche des festen Körpers bewirkt. Wie Fig. 2 zeigt, ist es unwesentlich, ob das Analytkomplexprodukt oder das Ligandenkomplexprodukt für die Bildung und die Züchtung der optisch feststellbaren Kristalle verwendet wird; in beiden Fällen wird das Erscheinen von sichtbaren Kristallen mit feststellbaren optischen Eigenschaften, wie Opazität, das Vorhandensein des Analyten durch qualitative und/oder quantitative Messungen anzeigen.

Der mit einer kompetitiven Reaktion arbeitende Assay, der in Fig. 3 dargestellt ist, folgt der Sequenz der in Fig. 2 angegebenen Arbeitsschritte mit der Ausnahme, daß der mit begrenzter Konzentration verwendete Konjugat-Reaktand dem alternativen Typ angehört und einen dem interessierenden Analyt analogen Liganden zusätzlich zu dem chelatierbaren metallischen Kation und der freisetzbaren Markiersubstanz enthält. Bei dieser Verfahrensweise wird der konjugierte Reaktand des Typs 2 sequentiell oder gleichzeitig mit dem interessierenden Analyt in der Fluidprobe und mit einer begrenzten Konzentration eines spezifischen Bindungspartners (der die gezeigte charakteristische Fähigkeit hat, sich spezifisch sowohl an den interessierenden Analyten als auch die ligandenanaloge Komponente des Konjugat-Reaktanden zu binden) kombiniert. Diese werden dementsprechend als Reaktionsmischung kombiniert, in der ein Teil des spezifischen Bindungspartners eine Bindung mit dem interessierenden Analyten unter Bildung eines gebundenden Analyten eingeht; ein Teil des spezifischen Bindungspartners kombiniert mit dem Ligandenanalogen des Konjugat-Reaktanden des Typs 2 unter Bildung eines ligandengekomplexten Produktes; und ein anderer Teil des Konjugat-Reaktanden des Typs 2 verbleibt ungebunden in der Fluidmischung. Es dürfte jedoch anerkannt werden, daß bei den bevorzugten Ausführungsformen dieser Verfahrensweise die Menge des spezifischen Bindungspartners in begrenzter, optimaler Konzentration bezüglich des Konjugat- Reaktanden des Typs 2 verwendet wird, so daß wenn der interessierende Analyt in der Reaktionsmischung nicht vorhanden ist, der spezifische Bindungspartner ganz mit dem Konjugat-Reaktanden unter Bildung eines ligandengekomplexten Produktes reagiert; wenn dementsprechend der interessierende Reaktand in der Fluidprobe vorhanden ist, wird die betreffende Menge des Analyten mit dem spezifischen Bindungspartner konkurrieren und sich an diesen binden, wodurch sie eine proportionale Menge des Konjugat- Reaktanden des Typs 2 verdrängt, die dann ungebunden in der Reaktionsmischung verbleibt. Aus diesem Grunde wird, wenn die Raktionsprodukte in individuelle Fraktionen aufgetrennt werden, festgestellt werden, daß die Menge des ungebundenen Konjugat-Reaktanden des Typs 2 und/oder die Menge des Ligandenkomplexproduktes ein Maß für die Menge des gebundenen Analyten in der anderen Fraktion ist. Auf dieser Basis können daher eine dieser Fraktionen oder beide zur Bildung und Züchtung von optisch feststellbaren Kristallen verwendet werden.

Die Folge der Manipulationsschritte folgt also der Verfahrensweise, die vorher für Fig. 1 und 2 beschrieben wurde. Die ungebundene Konjugatreaktionsfraktion des Typs 2 und/oder die Ligandenkomplexproduktfraktion werden individuell mit spezifischen Mitteln zur Freisetzung der Markierungssubstanz vereinigt. Nachdem die Markierungssubstanz freigesetzt worden ist, wird sie mit einem fixierten Derivatisierungsmittel vereinigt, bei dem es sich vorzugsweise um einen monodispersen Partikelfilm auf der Oberfläche eines festen Substrats handelt. Die Reaktion der Markierungssubstanz mit dem fixierten Derivatisierungsmittel verursacht die Bildung einer Vielzahl von Kristall-Keimbildungsstellen auf der Oberfläche des festen Körpers. Anschließend wird eine metastabile übersättigte (Entwickler-) Lösung den Keimbildungsstellen zugesetzt, um die Bildung und das Wachstum von optisch bestimmbaren Kristallen auf der Oberfläche des festen Körpers zu bewirken. Die gezüchteten Kristalle sind mit dem unbewaffneten Auge visuell sichtbar und können optisch hinsichtlich spezifischer Eigenschaften, wie des diffusen Reflexionsvermögens und der Opazität gemessen werden. Auf diese Weise liefert das Vorhandensein der optisch feststellbaren Kristalle qualitative und/oder quantitative Daten für den interessierenden Analyten in der Fluidprobe.

Es dürfte einleuchten, daß in allen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Mittel zur Trennung der individuellen Reaktionsprodukte verwendet werden müssen, unabhängig von der speziellen Weise, in der das Verfahren durchgeführt wird. Die Mittel und Geräte zur Trennung der Reaktionsprodukte in individuelle Fraktionen sind diejenigen, die in der Technik konventionell bekannt und verfügbar sind, viele sind kommerziell käuflich erhältlich. Bei den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung erfolgt die Trennung in die individuellen Fraktionen durch Verfahren einschließlich Filtration, Dekantierung, Zentrifugieren und die Verwendung von festphasigen Substraten zur Immobilisierung einer oder mehrerer chemischer Komponenten. Beispielsweise können in Fällen, wo unlösliche Träger (wie rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen, spezielle Gewebe und dergleichen) zur Trägerung oder Präsentation des interessierenden Analyten auf ihren Oberflächen verwendet werden, diese unlöslichen Träger von der Reaktionsmischung durch Sedimentation, Filtration und Dekantieren getrennt werden. Die Verwendung solcher natürlich vorkommender Träger (Blutkörperchen und dergleichen) erlaubt dem Benutzer ferner den Assay in einem Direktverfahren durchzuführen, wie es in Fig. 1 dargestellt ist. Alternativ, wenn Assays mit kompetitiver Reaktion durchgeführt werden, wird bevorzugt, das Ligandenanalogen oder den spezifischen Bindungspartner direkt oder durch die Verwendung verlängerter Kopplungsarme ("linker-arms") an der Oberfläche eines festen Substrats zu fixieren; Verfahren zur Fixierung der spezifischen Bindungspartner und der Ligandenanaloga sind in der Technik bekannt und in einer Vielfalt verschiedener Reaktionen verfügbar, um den spezifischen Anforderungen individueller Zusammensetzungen Rechnung zu tragen. Zu den festen Substraten, die für die Fixierung brauchbar sind, gehören unlösliche Polymere oder Kunststoffe einschließlich Latexperlen, Betonitteilchen, Zellulose, vernetzte Dextrane und Perlen aus Agarose und Polyacrylamiden. Fluidlösliche Ligandenanaloga und spezifische Bindungspartner werden an diesen festen Substraten direkt über spezifische chemische Reaktionen zum Haften gebracht, die in der Technik gut eingeführt und beschrieben sind. Die Mittel zur Fixierung und Trennung der Reaktionsprodukte werden dementsprechend für die vorliegende Erfindung als ganzes als unwesentlich angesehen und sind weder einschränkend noch begrenzend für die Anwendungen und die Art und Weise, in der die vorliegende Erfindung als Folge von Manipulationsschritten durchgeführt wird.

Um den weiten Bereich von Anwendungen und Verwendungen, bei denen das vorliegende Verfahren benutzt werden kann, darzulegen, folgt nun eine ins einzelne gehende Beschreibung der Vielfalt von Analyten, die bestimmt werden können, und der verschiedenen chemischen Komponenten, die in den die Methodik bildenden Arbeitsschritten verwendet werden können. Es ist jedoch ausdrücklich beabsichtigt und wird explizit festgestellt, daß die chemischen Zusammensetzungen und Ansätze für jede beschriebene Komponente lediglich beispielhaft für den Bereich von Zusammensetzungen, die verwendet werden können, sind und Beispiele für die Zwecke und Ziele, die erreicht werden können, darstellen. In keiner Weise sollen die beschriebenen Ausführungsformen für die Erfindung als ganzes einschränkend oder begrenzend angesehen werden.

Der interessierende Analyt

Der interessierende Analyt ist die chemische Spezies, die durch das vorliegende Verfahren in einer Fluidtestprobe nachgewiesen oder bestimmt werden soll. Es gibt eine und nur eine wesentliche Bedingung: Die Existenz eines diskreten Bindungspartners, der spezifisch für den interessierenden Analyten in einem fluiden Medium ist und sich selektiv an diesen bindet. Es ist unwesentlich, ob der interessierende Analyt im Fluidmedium löslich oder unlöslich ist oder ob der interessierende Analyt ein chemischer Bestandteil, der einen Teil eines größeren Moleküls bildet, ist, solange wie der Analyt sich auf der Oberfläche des Moleküls befindet und für eine chemische Reaktion zur Verfügung steht. Die Existenz solcher Paare von spezifisch bindenden chemischen Species ist wohl bekannt und es gibt unter anderem folgenden: Polyklonale und monoklonale Antikörper, Fab-Fragmente, Fab′-Fragmente und ihre jeweiligen Antigene und/oder Haptene; spezielle Bindungspaare, wie Avidin und Biotin; Hormone und ihre zugehörigen Rezeptorstellen; Enzyme und ihre jeweiligen spezifischen Co-Faktoren und Inhibitoren; und spezifische Metallionen und Chelatisierungsmittel. Die tatsächliche chemische Zusammensetzung und/oder Formel des interessierenden Analyten ist unbedeutend und daher nicht wichtig. Der Analyt kann also enthalten: Proteine, Polypeptide, Lipoproteine, Aminosäuren, ionisierbare Metalle und Salze, enzymatische Co-Faktoren und Substrate und dergleichen. Bei den bevorzugten immunodiagnostischen Anwendungen wird erwartet, daß Antikörper und Antigene (oder Haptene) und irgendwelche Derivate hiervon unabhängig von ihrer Herkunft am meisten verwendet werden, der Grad der Spezifizität und Affinität des Antigens für seinen spezifischen Bindungspartner ist empirisch über eine große Vielfalt von nun verfügbaren Techniken demonstrierbar.

Die Ligandenanaloga des interessierenden Analyten

Ein Ligandenanalogon ist eine chemische Zusammensetzung, die mit dem interessierenden Analyten identisch oder diesem ähnlich ist. Es wird auf der Basis seiner Fähigkeit, sich ebenfalls selektiv an den für den interessierenden Analyten spezifischen Bindungspartner zu binden, gewählt. Das Ligandenanalogon ist in den Fig. 2 und 3 beispielsweise dargestellten kompetitiven Bindungsassays brauchbar. Das Ligandenanalogon wird der Reaktionsmischung in begrenzter Kombination für eine optimale Bindung mit dem spezifischen Bindungspartner zugesetzt und wird durch den in der Fluidprobe vorhandenen interessierenden Analyten verdrängt und an der Bindung gehindert. In den meisten Fällen wird angestrebt und erwartet, daß die chemische Zusammensetzung und der Ansatz des Ligandenanalogon mit denen des interessierenden Analyten identisch ist; in einer begrenzten Anzahl von Fällen wird das Ligandenanalogon jedoch eine verschiedene chemische Zusammensetzung haben, jedoch eine selektive Bindungskapazität für den speziellen Bindungspartner zeigen, die gleichartig oder identisch mit der Bindungskapazität des interessierenden Analyten ist.

Es ist einzusehen, daß das Ligandenanalogon in zwei verschiedenen Arten verwendet werden kann: Als diskrete Einheit und Konkurrent für den interessierenden Analyten hinsichtlich der Bindung an die speziellen Stellen des Bindungspartners und als eine Komponente, die den konjugierten Reaktanden des Typs 2 enthält. Bei dem mit konkurrierender Bindung arbeitenden Verfahrenstyp wird das diskrete Ligandenanalogon typischerweise auf der Oberfläche eines festen Substrats fixiert vor der Verwendung mit den Verfahren und Reagenzien, die beim Stand der Technik konventionell bekannt sind. Die Fixierung des diskreten Ligandenanalogons stellt daher das Mittel für die Trennung der Reaktionsprodukte dar nachdem die kompetitive Bindungsreaktion bis zu einem Gleichgewicht fortgeschritten ist. Bei der zweiten Variante, als eine der drei Komponenten, die den konjugierten Reaktanden des Typs 2 bilden, ist es erforderlich, daß das Ligandenanalogon mindestens eine primäre Amingruppe aufweist, die für eine chemische Reaktion verfügbar ist. In den Fällen, in denen das gewählte Ligandenanalogon im natürlichen Zustand oder Ansatz nicht mindestens eine Aminogruppe enthält, ist es erforderlich, das Ligandenanalogon mit einer ein Amin enthaltenden Verbindung zur Reaktion zu bringen um ein hydrides Reaktionsprodukt zu bilden. Es ist auch wesentlich, daß dieses hybride Reaktionsprodukt die selektive Bindungsfähigkeit für den speziellen Bindungspartner beibehält, auf die oben hingewiesen wurde. Es muß jedoch verstanden und betont werden, daß diese zusätzliche Prozedur, dem funktionellen Ligandenanalogon mindestens eine Aminogruppe hinzuzufügen, nur in denjenigen Fällen erforderlich ist, in denen das konjugierte Reagenz herzustellen ist und nur in denjenigen Fällen, in denen im Ligandenanalogonmolekül anfänglich keine Amingruppe verfügbar ist.

Der spezifische Bindungspartner

Der spezifische Bindungspartner hat, wie aus den Fig. 1 bis 3 ersichtlich ist, nur eine wesentliche Funktion und ein erforderliches Merkmal: Die nachweisliche Fähigkeit, sich selektiv mit dem interessierenden Analyten und dem Ligandananalogon zu binden. In denjenigen Fällen, in denen der interessierende Analyt und das Ligandenanalogon identisch sind, werden auch die Bindungsfähigkeit, die optimalen Bindungsverhältnisse und die Stärke der Bindung an den jeweiligen Bindungsstellen oder Rezeptoren gleich sein; in anderen Fällen jedoch, wo der interessierende Analyt und das Ligandenanalogon chemisch nicht identisch sind, ist es notwendig, daß der Grad der Affinität und die Bindungsstärke für den spezifischen Partner für das Ligandenanalogon vergleichbar hinsichtlich der Größe, der Art der Bindung und der Stärke der Bindung mit denen, die bei den Reaktionen mit dem interessierenden Analyt vorliegen.

Der spezifische Bindungspartner kann in einer von zwei Arten verwendet werden: In der ersten Art wird der spezifische Bindungspartner als diskrete Einheit in der auf der Basis kompetitiver Bindungen arbeitender Assay-Verfahrensweise in begrenzter Konzentration verwendet, so daß, wenn die Fluide oder flüssige Reaktionsmischung den interessierenden Analyten nicht enthält, das Ligandenanalogon vollständig vom spezifischen Bindungspartner, der im Fluid vorhanden ist, gebunden wird. Bei dieser Arbeitsweise mit kompetitiver Bindung sind die chemische Zusammensetzung, der Ansatz und die spezielle strukturelle Orientierung des spezifischen Bindungspartners unwesentlich, solange wie die nachweisliche selektive Bindungsfähigkeit erhalten bleibt. Wenn auch der spezifische Bindungspartner in der überwiegenden Anzahl der Fälle ein Protein oder ein Polypeptid sein wird und funktionell als Antikörper (monoklonaler oder polyklonaler Herkunft) klassifiziert werden kann, oder als ein Antikörper-Fragment (wie ein Fab-Fragment oder Fab′-Fragment) ist dies nicht ein wesentliches Merkmal oder eine wesentliche erforderliche Einschränkung. Beispielsweise kann ein spezifischer Bindungspartner ein Polysaccharid-Inhibitor sein, der für einen interessierenden enzymatischen Analyten spezifisch ist. Es wird ferner erwartet und angestrebt, daß in manchen mit kompetitiver Bindung arbeitenden Assays der spezifische Bindungspartner auf der Oberfläche eines Festkörpers fixiert sein wird, der dann das Mittel für die Trennung der chemischen Einheiten in der Reaktionsmischung bildet. Es soll nochmals betont werden, daß die Mittel für die Fixierung irgendeines spezifischen Bindungspartners durch Chemie und Reaktionen erfolgen kann, die gebräuchlich und Stand der Technik sind; die Tatsache, daß der spezifische Bindungspartner in einem fixierten Zustand oder in frei beweglichem Zustand verwendet wird, ist dementsprechend für die vorliegende Erfindung nicht wesentlich.

Die zweite Art der Verwendung des spezifischen Bindungspartners ist als eine Komponente in einem Konjugat- Reaktanden des Typs 1. Bei Verwendung auf diese Art und Weise unterliegt die Wahl des spezifischen Bindungspartners einer zweiten wesentlichen Bedingung: Das Vorhandensein mindestens einer primären Amingruppe für eine chemische Reaktion als Teil der chemischen Zusammensetzung als ganzes. In denjenigen Fällen, in denen der spezifische Bindungspartner stickstoffhaltig ist und Konstituenten, wie Aminosäuren, primäre und dergleichen enthält, ist diese Bedingung von Natur aus erfüllt. In denjenigen Fällen, in denen der spezifische Bindungspartner nicht mindestens eine für eine anschließende chemische Reaktion zur Verfügung stehende Amingruppe enthält, ist es erforderlich, diesen gewählten spezifischen Bindungspartner mit einer aminhaltigen Zusammensetzung zu kombinieren, um unter Verwendung von bekannten Reagenzien und Reaktionen ein hybrides Reaktionsprodukt zu bilden. Das hybride Reaktionsprodukt wird auf diese Weise als funktionelles Äquivalent des spezifischen Bindungspartners verwendet und beide wesentlichen Merkmale zeigen: Die Fähigkeit der selektiven Kombination mit dem interessierenden Analyten und die Verfügbarkeit mindestens einer Amingruppe für eine chemische Reaktion. Es sei jedoch wieder bemerkt, daß diese letztere Bedingung und die alternative Prozedur zur Herstellung eines hybriden Reaktionsprodukts nur in den Fällen notwendig und nützlich ist, in denen der spezifische Bindungspartner als Komponente bei der Herstellung des konjugierten Reaktanden des Typs 1 verwendet wird.

Der Konjugat-Reaktand

Wie in Fig. 1 bis 3 zeigen, dient der Konjugat- Reaktand beim vorliegenden Verfahren als funktionelles Äquivalent der "identifizierenden Markierung", die sich gewöhnlich in den bekannten Assaytechniken findet. Beim vorliegenden Verfahren wird der Konjugat-Reaktand jedoch in alternativen Formen hergestellt, die entweder den spezifischen Bindungspartner oder das Ligandenanalogon als Komponente verwenden. Bei dem Konjugat-Reaktanden, der hier als Typ 1 bezeichnet wird, wird der spezifische Bindungspartner als eine Komponente in Kombination mit einem chelatierbaren metallischen Kation und einer freisetzbaren Markierungssubstanz verwendet. Alternativ wird bei einem Konjugat-Reaktanden, der hier als Typ 2 bezeichnet wird, das Ligandenanalogon als eine Komponente in Kombination mit einem chelatierbaren metallischen Kation und einer freisetzbaren Markierungssubstanz verwendet.

Die chemische Relation und Art der Herstellung des Konjugat-Reaktanden sind gleich unabhängig davon ob eine Verbindung oder Zusammensetzung des Typs 1 oder des Typs 2 hergestellt wird. Die Wahl des metallischen Kations und der freisetzbaren Markierungssubstanz kann bei Formen des Typs 1 und des Typs 2 gleich sein; alternativ können das gewählte metallische Kation und die gewählte freisetzbare Markierungssubstanz nach Wunsch variiert werden, wenn die alternierenden Formen hergestellt werden. Es sei jedoch ausdrücklich darauf hingewiesen, daß es hinsichtlich des chelatierbaren metallischen Kations und der freisetzbaren Markierungssubstanz keinen sinnvollen Unterschied zwischen den Formen des Typs 1 und des Typs 2 des Konjugat- Reaktanden gibt; der einzige erkennbare und sinnvolle Unterschied hängt daher ausschließlich davon ab, ob der spezifische Bindungspartner oder das Ligandenanalogon als die eine Komponente verwendet wird.

Der Konjugat-Reaktand ist unabhängig von seiner genauen chemischen Zusammensetzung, seiner strukturellen Orientierung oder seiner spezifischen Aktivität ein stabilisierter Iminkomplex oder in einer alternativen Terminologie eine stabilisierte Schiff-Base. Die Stabilisierung des Konjugat-Reaktanden wird durch das chelatierbare metallische Kation bewirkt, welches seinerseits auch das spezifische Mittel bildet, um die Markierungssubstanz bei Bedarf in kontrollierter Weise aus dem Komplex freizusetzen. Die freisetzbare Markierungssubstanz enthält in jedem Falle mindestens eine für eine chemische Reaktion zur Verfügung stehende Carbonylgruppe

Wenn also der spezifische Bindungspartner oder das Ligandenanalogon, die die erforderliche Amingruppe aufweisen, mit der freisetzbaren Markierungssubstanz, die die erforderliche Carbonylgruppe aufweist, und dem metallischen Kation vereinigt werden, wird ein stabilisierter Iminkomplex (oder eine stabilisierte Schiff-Base) gebildet. Der generelle Reaktionsablauf entspricht der folgenden Formel I:

wobei R, R′ und R′′ ein Alkyl, Aryl, eine aromatische oder aliphatische Verbindung oder Wasserstoff sind.

In vielen Fällen ist zu erwarten, daß der spezifische Bindungspartner oder das Ligandenanalogon, die bei der Herstellung des Konjugat-Reaktanden verwendet werden, eine Mehrzahl anderer reaktiver Gruppen enthalten und daß die gewählte freisetzbare Markierungssubstanz ebenfalls reaktive Gruppen zusätzlich zu der erforderlichen Carbonylgruppe enthält. Für diese Fälle ist beispielhaft die Gegenwart der Alphaaminosäure Lysin in einer Polypeptidkette, welches eine zweite Aminogruppe am Epsilon-Kohlenstoffatom hat, die für eine Reaktion zur Verfügung steht; einer bevorzugt aromatischen Substanz, Salicylaldehyd; und eines bevorzugten chelatierbaren metallischen Kations, Cupri-Kupfer. Diese Reaktanden reagieren unter Bildung einer stabilisierten Schiff-Base. Die wahrscheinlichste Konfiguration dieses stabilisierten Iminkomplexes wird durch die freisetzbare Markierungssubstanz kontrolliert, ein Aldehyd, das einer Pi-Bindungs-Aktivierung fähig ist, wie Salicylaldehyd, in Kombination mit der Fähigkeit des metallischen Kations, die Schiff-Base zu stabilisieren, nachdem sie einmal gebildet worden ist. Die Reaktionsfolge als ganzes ist in der folgenden Gleichung II dargestellt.

Die Stabilisierung einer Schiff-Base durch Incorporation eines metallischen Kations ist in der Literatur gut beschrieben und dokumentiert, siehe z. B. Eichhorn und Marchaud, J. Am. Chem. Soc. 78 : 2688-2691 (1956); Gunther et al., J. Am. Chem. Soc. 78 : 2688-2691 (1956); Nunez et al., J. Am. Chem. Soc. 84 : 901-906 (1962); Bai et al., J. Am. Chem. Soc. 89 : 6126-6130 (1967). Die Existenz solcher stabilisierter Iminkomplexe und die Verfahren zur Herstellung stabilisierter Schiff-Basen sind also gut eingeführte, bekannte Reaktionen; trotzdem sind die Art der Freigabe der carbonylhaltigen Markierungssubstanz, ihr funktioneller Wert und ihre Nützlichkeit als freisetzbare Komponente, sowie der Bereich der nützlichen Zusammensetzungen oder Verbindungen innerhalb der stabilisierten Iminkomplexe in der existierenden Literatur weder festgestellt noch erkannt worden. Aus diesen Gründen werden die jeweiligen Komponenten des beim vorliegenden Verfahren verwendeten Konjugat-Reaktanden nun im einzelnen beschrieben:

Der spezifische Bindungspartner und das Ligandenanalogon

Die chemische Natur, Funktion und spezifische Aktivität sowohl des spezifischen Bindungspartners als auch des Ligandenanalogons sind oben bereits beschrieben worden. Als eine Komponente in der Konjugat-Reaktion sind nur zwei Merkmale wesentlich und erforderlich: Die nachweisliche Fähigkeit, sich selektiv mit einer anderen Einheit als spezifische Bindungspaar zu binden und die Verfügbarkeit mindestens einer Amingruppe für eine chemische Reaktion mit der Carbonylgruppe der freisetzbaren Markierungssubstanz in Gegenwart eines chelatierbaren metallischen Kations zur Bildung eines stabilisierten Iminkomplexes. Die üblichsten Beispiele sind Proteine und Polypeptide, die die nachweisliche Fähigkeit, sich selektiv zu binden, aufweisen. Wie bereits erwähnt wurde, kann auch ein hybrides Reaktionsprodukt hergestellt werden, welches funktionell und chemisch beide erforderlichen Elemente aufweist.

Die chelatierbaren metallischen Kationen

Die bevorzugten chelatierbaren metallischen Kationen sind die ionisierbaren Metalle, wie zweiwertiges Kupfer (Cu⁺⁺), Nickel (Ni⁺⁺) und Zink (Zn⁺⁺). Diese Metallionen ergeben den erforderlichen Grad von Stabilität im konjugierten Reaktanden und gestatten noch, daß die Markierungssubstanz in späteren Arbeitsschritten chemisch oder physikalisch freisetzbar ist. Andere Metallionen, die ebenfalls verwendet werden können, sind unter anderem zweiwertiges Eisen (Fe⁺⁺), Cadmium (Cd⁺⁺) und Kobalt (Co⁺⁺). Im allgemeinen wird jedes chelatierbare Ion als brauchbar angesehen. Die Wahl und Konzentration des metallischen Kations ändert sich typischerweise mit der chemischen Zusammensetzung der anderen gewählten Komponenten, ihrer Konzentration und dem pH-Wert des Reaktionsmediums.

Die freisetzbare Markierungssubstanz

Die bevorzugte Markierungssubstanz muß mindestens zwei und vorzugsweise drei Bedingungen erfüllen: Es ist wesentlich, daß die Markierungssubstanz mindestens eine Carbonylgruppe hat, die für eine Reaktion mit dem spezifischen Bindungspartner oder Ligandenanalogon zur Verfügung steht, um einen stabilisierten Iminkomplex zu bilden. Es ist wünschenswert, daß die Festigkeit der stabilisierten Iminbindung des Komplexes genügend stark und dauerhaft ist um die chemische Integrität des konjugierten Reaktanden als ganzes für die Verwendung in der Methodik aufrechtzuerhalten, und daß diese Iminbindung später durch physikalische oder chemische Mittel leicht destabilisiert werden kann, um die Markierungssubstanz bei Bedarf schnell aus dem Konjugat- Reaktanden freizusetzen. Es ist außerdem wesentlich, daß die freigesetzte Markierungssubstanz dann in der Lage ist, chemisch mit einem immobilisierten Derivatisierungsmittel zu reagieren, um eine Reihe von Keimbildungsstellen für die Züchtung von Kristallen in situ zu bilden.

Die erste dieser Bedingungen, das Vorhandensein mindestens einer Carbonylgruppe, wurde oben bereits im einzelnen erläutert. Der Bereich der chemischen Zusammensetzungen oder Verbindungen die eine solche Carbonylgruppe haben, ist groß und enthält viele verschiedene Klassen und Varietäten von chemischen Zusammensetzungen einschließlich Alkyl, Aryl, aliphatische und aromatische Verbindungen, die zusätzliche funktionelle reaktive Gruppen enthalten können oder nicht. Es wurde festgestellt, daß diejenigen Carbonylverbindungen, die ein kleineres im Gegensatz zu einem größeren Molekulargewichts haben und diejenigen, die eine einfachere dreidimensionale Struktur im Gegensatz zu einer mehr komplexen Struktur haben, wegen der einfacheren Verwendung und Herstellung bevorzugt werden; trotzdem sind weder das wahre Molekulargewicht, die strukturelle Konfiguration, die Komplexität oder andere chemische und funktionelle Eigenschaften der gewählten Verbindung wesentlich solange diese den Zweck der Markierungssubstanz zur Herstellung des Konjugat-Reaktanden und die Verwendung des stabilisierten Iminkomplexes im vorliegenden Verfahren nicht wesentlich stören. Nicht einschränkende Beispiele der Vielfalt von verschiedenen chemischen Verbindungen mit mindestens einer reaktionsfähigen Carbonylgruppe, die als freisetzbare Markierungssubstanzen brauchbar sind, sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt:

Tabelle I

Es dürfte einleuchten, daß die Angaben in Tabelle I nicht nur eine extensive Liste von freisetzbaren Markierungssubstanzen unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung liefern sondern auch die bevorzugten Derivatierungsmittel bezeichnen, die bei der vorliegenden Erfindung mit der betreffenden freisetzbaren Markierungssubstanz verwendet werden sollen. Einzelheiten bezüglich der Wechselwirkung der Markierungssubstanz mit ihrem bevorzugten Derivatisierungsmittel sind unten angegeben.

Mittel zur Freisetzung der Markierungssubstanz

Wie aus den Fig. 1 bis 3 ersichtlich ist, beruht das vorliegende Verfahren auf der Möglichkeit, die Markierungssubstanz, nachem die Reaktionsprodukte in die individuellen Fraktionen aufgeteilt wurden, vom (gebundenen oder ungebundenen) Konjugat-Reaktanden in der abgetrennten Fraktion freizusetzen. Die Mittel zum Bewirken einer solchen Freigabe sind vorzugsweise so sanft wie möglich, um zu verhindern, daß die Markierungssubstanz wesentlich geändert oder nachteilig beeinflußt wird. Die Markierungssubstanz kann vom Konjugat-Reaktanden in jeder abgetrennten Fraktion durch Verwendung einer Vielfalt von physikalischen oder chemischen Mitteln freigesetzt werden, einschließlich: Säurehydrolyse, Hitze, Chelatierungsmittel und enzymatische Hydrolyse. Der gewünschte Effekt besteht in jedem Falle unabhängig von dem verwendeten spezifischen Mittel darin, den Konjugat-Reaktanden zu destabilisieren, die vorhandene Iminbindung zu spalten und die Markierungssubstanz in einer Form mit einer funktionellen Carbonylgruppe, die wieder für eine chemische Reaktion verfügbar ist, freizusetzen. Für die in Tabelle I aufgelisteten Markierungssubstanzen ist das bevorzugte Freisetzungsverfahren die Säurehydrolyse. Diese wird dadurch bewirkt, daß die individuelle Fraktion mit einer organischen oder metallischen Säure behandelt wird. In der Praxis wurde gefunden, daß die Konjugat-Reaktanden (Typ 1 und Typ 2) bei neutralen Werten pH-stabil sind. Wenn jedoch der pH-Wert der Flüssigkeit 2,0 oder weniger ist, tritt sofort eine Hydrolyse des Konjugat-Reaktanden ein wobei gleichzeitig die Markierungssubstanz in funktionell intakter Form freigesetzt wird. Am meisten bevorzugt wird, das organische Säuren anstatt Metallsäuren für diesen Zweck verwendet werden; brauchbare Säuren sind u. a. Essigsäure, Maleinsäure, Milchsäure und dergleichen. Brauchbare anorganische Säuren sind u. a. Schwefelsäure und Chlorwasserstoffsäure. In anderen Fällen werden sanftes Erhitzen der individuellen Fraktion oder der Zusatz eines geeigneten spezifischen Enzyms zur abgetrennten Fraktion ebenfalls die konsistente Freisetzung der Markierungssubstanz in brauchbarer Weise bewirken.

Eine andere Möglichkeit, die Freisetzung der Markierungssubstanz von dem gebundenen oder ungebundenen Konjugat-Reaktanden zu erreichen besteht im Zusetzen von starken Chelatierungsmitteln zu den Reaktionsprodukten in den abgetrennten Fraktionen. Solche Chelatierungsmittel konkurrieren bezüglich des metallischen Kations des stabilisierten Iminkomplexes; im Hinblick auf ihre hohe Affinität für Metallionen und die bekannte Stabilität der mit solchen Kationen gebildeten Chelate sind diese Chelatierungsmittel besonders bevorzugt als Mittel zur Destabilisierung des Iminkomplexes und zum Bewirken der Freigbe der Markierungssubstanz in funktioneller Form. Repräsentative nützliche Chelatierungsmittel sind EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) und ihre verschiedenen Derivate und Analoge; Gluconsäure; Kojisäure; Oxalsäure; Quadrol (N,N,N′,N′-bis- (2-hydroxypropyl)ethylendiamin) und Zitronensäure.

Eine bemerkenswerte Eigenschaft, die jedes der gewählten Mittel zur Freisetzung der Markierungssubstanz von einer individuellen Fraktion begleitet, ist die Fähigkeit der gewählten Markierungssubstanz, im freigesetzten Zustand leicht aus einem wäßrigen System zu verdampfen und anschließend in Dampfform mit dem Derivatisierungsmittel in Berührung zu kommen und zu reagieren. Die Fähigkeit einer Markierungssubstanz, nach der Freigabe zu verdampfen, ist besonders nützlich, wenn minimale Flüssigkeitsvolumina in dünnen Flüssigkeitsströmen verwendet werden, welche die Verdampfungsfähigkeit der Markierungssubstanz bei der Freisetzung fördern und verbessern. Alternativ können, falls gewünscht, Mittel gewählt werden, welche die freigesetzte Markierungssubstanz dazu veranlassen, in der Flüssigkeit zu verbleiben und ihre Verdampfung zu verhindern. Nichtsdestotrotz wird bei Verwendung des im folgenden beschriebenen Gerätes bevorzugt, daß die Markierungssubstanz von irgendeinem gekomplexten Konjugat- Reaktanden oder einer ungebundenen Konjugat-Reaktandenfunktion so freigesetzt wird, daß sie bei der Freigabe sofort verdampft und während sie in der Dampfform verbleibt mit dem Derivatisierungsmittel vereinigt wird.

Das Derivatisierungsmittel

Das Derivatisierungsmittel ist eine aminhaltige chemische Zusammensetzung, die vorzugsweise auf der Oberfläche eines festen Substrats fixiert ist. Als solches ist es in der Lage, sich mit der freigesetzten Markierungssubstanz im verdampften oder in der Flüssigkeit gelösten Zustand unter Bildung eines Reaktionsproduktes in situ zu vereinigen, welches als eine Reihe von Kristall-Keimbildungsstellen für die spätere Bildung und Züchtung von Kristallen dient. Das Derivatisierungsmittel ist auf der Oberfläche des festen Substrats vorzugsweise als im wesentlichen monodisperses System von Partikeln fixiert, die eine Größe im µm- und Sub-µm-Bereich haben.

Die Verwendung solcher Derivatisierungsmittel als Filme von monodispersen Partikeln in Kombination mit übersättigten Lösungen für die Feststellung und Identifizierung von kleinen Kristallen ist in der Literatur beschrieben, siehe z. B. Vonnegut, B., Science 116: 300-301 (1952) und US- PS 43 80 587. Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete fixierte Derivatisierungsmittel ist also eine Dispersion von Teilchen im wesentlichen der gleichen Größe, die auf der Oberfläche eines festen Substrats mit relativ gleichen gegenseitigen Abständen fixiert sind, wobei die Teilchen vorzugsweise Größen im Bereich von etwa 0,1 µm bis 1,0 µm aufweisen. Eine brauchbare jedoch nicht erschöpfende Aufstellung von Zusammensetzungen oder Verbindungen, die als bevorzugte Derivatisierungsmittel brauchbar sind, findet sich in der Tabelle I. Es dürfte auch ersichtlich sein, daß ein einziges Derivatisierungsmittel für eine Reaktion mit einer Vielfalt verschiedener freisetzbarer Markierungssubstanzen verwendet werden kann und zwar sowohl im verdampften als auch im fluidgelösten Zustand - welche jeweils mit dem gewählten Derivatisierungsmittel reagieren werden, um eine Vielzahl von Keimbildungsstellen in situ auf der Oberfläche des festen Substrats zu bilden. Die in situ gebildeten Keimbildungsstellen sind selbstverständlich ihrerseits Kristalle, die für das unbewaffnete Auge unsichtbar sind und später als spezifische Anfangsplätze für die Bildung und die Züchtung optisch feststellbarer Kristalle dienen.

Ein Film von monodispersen Partikeln, die das Derivatisierungsmittel enthalten, läßt sich bequem dadurch herstellen, daß man ein Aerosol einer Lösung des Derivatisierungsmittels in konventioneller, bekannter Weise auf die Oberfläche eines festen Substats richtet. Dadurch, daß man die Konzentration des Aerosols und die Auftragsgeschwindigkeit des Aerosols auf die Oberfläche des festen Körpers fortlaufend sehr genau steuert, kann man eine genau kontrollierte Menge des Derivatisierungsmittels auf die Oberfläche aufbringen. Für eine zufriedenstellende Haftung der Aerosolteilchen auf der Oberfläche des festen Körpers ist es oft wünschenswert (jedoch nicht notwendig), die Oberfläche durch Aufbringen einer elektrostatischen Lösung vorzubehandeln und/oder das Aerosol zu erwärmen. Einrichtungen zur Erzeugung eines Aerosols mit dem gewünschten Teilchengrößenbereich sind im Handel erhältlich.

Es sei auch bemerkt, daß das feste Substrat, auf dem das Derivatisierungsmittel fixiert wird, eine Vielfalt verschiedener Formen und Konfigurationen aufweisen kann. Man kann auf diese Weise eine Vielfalt von Geräten und Artikeln als Testkits herstellen, in denen das fixierte Derivatisierungsmittel in der beschriebenen Weise für die Reaktion mit der freigesetzten Markierungssubstanz und für die Bildung einer Vielzahl von Keimbildungsstellen in situ verwendet wird. Eine Vielfalt von Artikeln und Einrichtungen, die für Kit-Form nützlich sind, wird später beschrieben werden.

Die metastabile übersättigte (Entwickler-)Lösung

Die metastabile übersättigte (Entwickler-)Lösung ist eine wäßrige oder nichtwäßrige Flüssigkeit (Fluid), welche in übersättigter Konzentration eine zur Kristallzüchtung geeignete chemische Zusammensetzung enthält, die trotz ihrer übersättigten Konzentration für eine bestimmte Zeitspanne chemisch und physikalisch stabil ist. Bei Vereinigung mit den Keimbildungsstellen auf der Oberfläche des festen Substrats wird dann an den individuellen Keimbildungsstellen eine Kristallisation eintreten, welche in der Bildung und dem Züchten von optisch feststellbaren Kristallen resultiert. Eine brauchbare jedoch nicht erschöpfende Auflistung von bevorzugten metastabilen übersättigten (Entwickler-)Lösungen ist in Tabelle I gegeben, wobei jede (Entwickler-)Lösung einem bevorzugten Derivatisierungsmittel und einer freisetzbaren Markierungssubstanz zugeordnet ist. Die Mengen der jeweiligen chemischen Zusammensetzung und die Art der Verwendung der jeweiligen chemischen Zusammensetzungen zur Herstellung einer metastabilen übersättigten (Entwickler-) Lösung in wäßrigen oder nichtwäßrigen Fluiden ist Stand der Technik.

Es ist bemerkenswert, daß die Aufstellung in Tabelle I zeigt, daß die metastabile übersättigte Lösung fast immer eine übersättigte Lösung einer Zusammensetzung oder Verbindung ist, welche tatsächlich das Reaktionsprodukt ist, welches durch die Vereinigung der Markierungssubstanz mit dem fixierten Derivatisierungsmittel gebildet wird. In der überwiegenden Anzahl der Fälle besteht daher eine vollständige chemische Übereinstimmung zwischen der Zusammensetzung der in situ gebildeten Keimbildungsstellen und der chemischen Zusammensetzung der metastabilen übersättigten Lösung, die auskristallisiert und während des Kristallisationsprozessess Material um die einzelnen Keimbildungsstellen niederschlägt. In manchen Fällen ist jedoch die chemische Zusammensetzung der metastabilen übersättigten Lösung chemisch nicht identisch mit den individuellen Keimbildungsstellen, aber genügend ähnlich, um den Kristallisationsprozeß einzuleiten.

Es ist ferner bemerkenswert, daß die Natur und Größe der auf der Oberfläche des festen Substats gebildeten und gezüchteten Kristalle direkt beeinflußt wird durch die Anzahl der Keimbildungsstellen, die anfänglich in situ durch die Wechselwirkung der freigesetzten Markierungssubstanz und des fixierten Derivatisierungsmittels gebildet wurden. Relativ gesagt, wenn die untersuchte abgetrennte Fraktion nur eine kleine Mengenmarkierungssubstanz freigibt, werden auf der Oberfläche des festen Körpers nur relativ wenige Keimbildungsstellen gebildet; wenn andererseits die individuelle abgetrennte Fraktion eine relativ große Mengenmarkierungssubstanz freigibt, wird auf der Oberfläche des festen Körpers eine proportional größere Anzahl von individuellen Keimbildungsstellen gebildet. Die Anzahl der gebildeten Keimbildungsstellen bestimmt direkt die letztliche Größe der Kristalle, die wachsen, da die Menge der kristallisierbaren Verbindung in der Entwicklerlösung sich gleichmäßig auf alle Keimbildungsstellen aufteilt, unabhängig von ihrer Anzahl. Wenn also eine größere Anzahl von Keimbildungsstellen vorhanden ist, verteilt sich die Menge der kristallisierenden Verbindung in der Entwicklerlösung auf eine größere Anzahl von Keimbildungsstellen und die Größe der einzelnen gebildeten und gezüchteten Kristalle ist relativ klein. Wenn andererseits die Anzahl der gebildeten Keimbildungsstellen relativ klein ist, wird die gleiche Konzentration der kristallisierbaren Substanz in der Entwicklerlösung gleichmäßig auf eine kleinere Anzahl von individuellen Stellen verteilt, was bewirkt, daß eine größere Menge von Material auf jeder individuellen Stelle niedergeschlagen wird. Dies bewirkt die Bildung und Züchtung von Kristallen größerer Abmessungen.

Die wahre Konzentration der kristallisierbaren Materie in der metastabilen übersättigten (Entwickler-)Lösung ist also wichtig, sie soll genügend groß sein, um das Wachsen von optisch bestimmbaren Kristallen auch dann zu gewährleisten, wenn die Anzahl der individuellen Keimbildungsstellen ein Maximum ist. Aus diesem Grunde werden die metastabilen übersättigten (Entwickler-) Lösungen vorzugsweise mit einer Konzentration im Bereich vom 2- bis 10fachen der Sättigung hergestellt. Bei Verwendung solcher (Entwickler-)Lösungen in gleichförmigen metastabilen Konzentrationen treten gewöhnlich ein schnelles Bilden und Wachsen von Kristallen nach einem 1- oder 2minütigem Kontakt mit den individuellen Keimbildungsstellen ein. Maximales Kristallwachstum ist typischerweise innerhalb von 5 bis 10 Minuten erreicht und in nicht mehr als 60 Minuten in jeder Hinsicht vollständig sichtbar. Es ist auch zu erwarten und wird bevorzugt, daß alle anderen Faktoren, die die Wechselwirkung zwischen der metastabilen übersättigten (Entwickler-)Lösung und den Keimbildungsstellen auf der Oberfläche des festen Substrats beeinflussen, kontrolliert werden. Auf diese Weise wird die Rate des Materialniederschlags in jeder Hinsicht gleichmäßig sein.

Die Steuerung der Geschwindigkeit des Materialniederschlags beeinflußt auch direkt die Fähigkeit, die gezüchteten Kristalle optisch zu bestimmen. Beispielsweise besteht bei einem schnellen Niederschlagen des kristallisierbaren Materials aus der (Entwickler-) Lösung auf den Keimbildungsstellen die Neigung, die Kristallfläche zu einer irregulären Spitze aufzubauen, während ein allmähliches Niederschlagen des kristallisierbaren Materials ein kristallines Gitter erzeugt, dessen Kristallfläche im wesentlichen eben ist. Optisch wird Licht leichter durch Kristalle gestreut, die irreguläre und spitze Flächen haben und daher als Ergebnis des Lichtstreungseffektes besser "sichtbar" werden; im Vergleich hierzu streuen ebenflächige Kristallgitter das Licht minimal und sind schwieriger mit dem unbewaffneten Auge oder mit spezifischen Detektorgeräten zu sehen. Auch aus diesem Grunde wird bevorzugt, daß in allen Fällen die Konzentration der chemischen Zusammensetzungen, die bei der Herstellung der metastabilen übersättigten (Entwickler-)Lösungen hergestellt werden, so hoch wie möglich gemacht werden, um ein schnelles Niederschlagen des kristallisierbaren Materials zu fördern, wenn dieses in Reaktionsberührung mit den individuellen Keimbildungsstellen gebracht wird.

Zusätzlich ist es wegen der naturgegebenen Instabilität einer übersättigten Lösung, die mit maximaler Konzentration hergestellt wurde, zweckmäßig, die (Entwickler-)Lösung erst kurz vor dem Gebrauch zuzubereiten. Weiterhin sind Stabilisierungsmittel, wie Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Agar, Natriumcarboxymethylzellulose, Methyl- und Ethylzellulose und dergleichen nützlich und wünschenswert, um die effektive Gebrauchsdauer der übersättigten (Entwickler-) Lösung bei der vorliegenden Erfindung zu verlängern. In der Praxis ist es daher zweckmäßig, zwei vorbereitete Reagenzien zur Verfügung zu haben, von denen eines oder beide in Lösung vorliegen und die an Ort und Stelle in einem vorgegebenen Verhältnis gemischt werden können, um die metastabile übersättigte (Entwickler-)Lösung zu bilden. Die gemischte Lösung kann dann mit den Keimbildungsstellen auf der Oberfläche des festen Substrats vereinigt werden.

Die Bildung und das Wachsen der Kristalle bewirkt eine optisch feststellbare und bestimmte Änderung, welche ein Maß für den interessierenden Analyten in der flüssigen Probe ist. Das Ausmaß der optisch bestimmbaren Kristalle liefert ein qualitätives und/oder quantitatives Maß der Reaktionspartner in der betreffenden abgetrennten Fraktion, was wiederum mit einer kalkulierten Menge des interessierenden Analyten in der Fluidprobe korrelierbar ist. Typischerweise kann man quantitative Resultate im Nanogramm-pro-Milliliter- Bereich reproduzierbar erhalten, in dem man optisch bestimmbare Kristalle in der beschriebenen Weise bildet und züchtet. Für die besten quantitativen Resultate wird bevorzugt, eine einzige optische Messung, wie die diffuse Reflexion, als eine indirekte Korrelation zur Errechnung der Menge des interessierenden Analyten in der Probe zu verwenden.

Beispiel

Um die Bestimmungsmethoden zu erläutern, die mit den oben beschriebenen chemischen Komponenten arbeiten, wird der immundiagnostische Assay des Choriongonadotropins (im folgenden "hCG") im einzelnen erläutert. Die quantitative Bestimmung von hCG in Urinproben weiblicher Personen wird, wie bekannt, routinemäßig als Schwangerschaftstest verwendet. Es sei jedoch ausdrücklich betont, daß dieses Beispiel lediglich zur Erläuterung dient und nicht als Einschränkung der Anwendungen oder des Schutzumfanges der vorliegenden Erfindung anzusehen ist.

Herstellung der Reaktanden

Das Verfahren wird in Form eines mit kompetitiver Bindung arbeitenden Assayprotokoll verwendet, in dem hCG der interessierende Analyt ist; im Handel erhältliches, an rote Blutkörperchen gebundenes hCG ist bei den aus der Literatur bekannten Verfahren (Kabat und Mayer, Experimental Immunochemistry (2. Auflage), Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, 1971, Seite 120) das Ligandenanalogon und der Konjugat-Reaktand enthält antihumane Choriongonadotropin-Antikörper (der spezifische) Bindungspartner), Kupfer-II-Acetat (das chelatierbare metallische Kation) und Salicylaldehyd (die freisetzbare Markierungssubstanz).

Der Konjugat-Reaktand des Typs 1 wurde wie folgt hergestellt: Das Salicylaldehydreagenz wurde hergestellt durch Auflösen von 0,1 ml Salicylaldehyd in 80 ml destilliertem Wassers durch Mischen. Der Lösung wurden 50 mg Natriumacetat zugesetzt, um ein resultierendes flüssiges Reagenz zu bilden, das einen pH-Wert von 6,6 und eine gelbe Farbe hat. Zu 1,0 ml dieses Salicylaldehydreagenzes wurde 1,0 ml antihumaner Choriongonadotropin Antikörper zugesetzt, der in Kaninchen gezüchtet worden war (Kaninchen-Anti-hCG = 6,5 mg/ml durch Globulinassay). Diese Fluidmischung ließ man bei 3°C 3 Tage lang reagieren. Anschließend wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur gebracht und der Flüssigkeit wurde 1,0 ml einer 0,2%igen Cupriacetatlösung (pH 5,9) zugesetzt. Die resultierende Lösung war etwas trübe, hatte eine gelbe Farbe und einen pH-Wert von 5,7. Die resultierende Lösung ließ man dann 1 Stunde stehen, während der sich ein gelber Niederschlag bildete. Die Lösung wurde dann zentrifugiert, typischerweise 30 Minuten beim 10 000fachen der Schwerkraft, und die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt. Die überstehende Fraktion enthielt den kupferstabilisierten Salicyliden/Antihuman- Choriongonadotropin-Iminkomplex, der dann in der folgenden Weise gereinigt wurde.

Zu 2,2 ml des Überstandes wurden 1,1 ml 8%iges TRIS (Tris- (hydroxymethyl)-aminomethan) zusetzt. Die Flüssigkeitsmischung wurde dann unter Verwendung einer 4-Kubikzentimeter-Sephacryl-Säure mit einem 0,1 m TRIS-Puffer, pH 7,4, der 0,001 m CuCl₂ als Eluierungsmittel gereinigt. Während der Eluierung wurde eine Reihe von 0,5 ml Flüssigkeitsfraktionen gesammelt und diejenigen Fraktionen, die eine Ultraviolettabsorption bei 280 nm zeigten, wurden als diejenigen identifiziert, die die gewünschte Proteinfraktion enthielten. Es wurde eine Ausbeute von 69% bezogen auf das Protein, erhalten. Durch Analyse wurde festgestellt, daß der auf diese Weise erhaltene, gereinigte konjugierte Reaktand 4 Moleküle Salicylaldehyd pro Molekül Kaninchen-Antihum-Choriongonadotropin enthielt.

Das fixierte Derivatisierungsmittel wurde wie folgt hergestellt: 2,5 g Semicarbazid-Hydrochlorid und 2,5 g Ammoniumoxalat wurden in 10 ml destilliertem Wasser gelöst. Diese Lösung wurde dann unter Rühren zu 240 ml Methanol hinzugefügt, was eine Flüssigkeit mit einem pH-Wert von 3,7 ergab. Diese Semicarbazid-Hydrochlorid-Lösung wurde einem 5 ml fluoriertem Polyethylen/Polypropylen-Polymer, dem festen Substrat, hinzugefügt. Die Semicarbazid-Hydrochlorid-Lösung wurde vorzugsweise unter Verwendung eines Fluidzerstäubungs-Aerosolgenerators (Environmental Research Corporation) aufgebracht, der wie folgt eingestellt war: Luftdruck = 38; Zerstäubung = 90; Verdünnung = 60; und es wurde eine Aerorolabgaberöhre verwendet, die ca 1 m lang war, einen Durchmesser von 25 mm hatte und eine Öffnung von 16 × 6,35 mm Zoll hatte. Das Aerosol wurde während des Beschichtungsprozesses auf 110°C erwärmt. Die Abgabegeschwindigkeit für das Aerosol lag typischerweise im Bereich zwischen etwa 6′′ pro Minute und 15′′ pro Minute. Die Semicarbazid-Hydrochlorid-Teilchen, die als fixiertes Derivatierisungsmittel auf der Oberfläche dieses festen Substrats dienten, lagen im Größenbereich von etwa 0,4 µm bis etwa 0,6 µm.

Die metastabile übersättigte (Entwickler-)Lösung wurde wie folgt hergestellt: Um eine Instabilität zu vermeiden, wurde die (Entwickler-)Lösung durch Mischen von zwei verschiedenen Flüssigkeiten zur Bildung der übersättigten (Entwickler-)Lösung unmittelbar vor Gebrauch hergestellt. Flüssigkeit A wurde hergestellt durch Zugeben von 0,2 ml Salicylaldehyd zu 10 g wasserlöslicher Gelatine in 10 ml destilliertem Wasser. Die Flüssigkeit B wurde hergestellt durch Auflösen von 0,15 g Semicarbazid-Hydrochlorid in 100 ml destillierten Wassers. Die Flüssigkeiten A und B bleiben für eine längere Zeitspanne stabil. Wenn die metastabile übersättigte (Entwickler-)Lösung beim Gebrauch benötigt wird, werden gleiche Mengen der Flüssigkeiten A und B vereinigt, wobei sich sofort eine brauchbare (Entwickler-)Lösung ergibt, die Salicylaldensemicarbazon enthält. Die (Entwickler-)Lösung wird unmittelbar nach ihrer Bildung verwendet.

Durchführung des Verfahrens

Der bevorzugte Ablauf bei der Durchführung des kompetitiven Bindungsassays verläuft wie folgt:

1. Die folgenden Ingredienten werden in ein Reagenzglas eingebracht:
100-200 µl des Konjugat-Reaktanden des Typs 1;
100-200 µl von 0,15 molarem Boratphosphatpuffer, pH 6,0;
100-200 µl flüssige Probe, typischerweise Urin, in dem hCG vermutet wird;
350-600 µl einer 0,5%igen Suspension von stabilisierten roten Schafsblutkörperchen, die vorher in der oben beschriebenen Weise mit hCG reagiert worden waren.

2. Diese Reaktionsmischung wurde sanft gemischt und ungestört 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen.

3. Am Ende dieser Reaktionsperiode wurde die Reaktionsmischung ausgewertet, um festzustellen, ob eine Agglutination eingetreten ist; dementsprechend wurde die Reaktionsmischung dann etwa 10 Minuten beim 2000fachen der Schwerkraft zentrifugiert.

4. Der Überstand wurde entfernt und in ein sauberes Reagenzglas übergeführt, das etwa 100 mg Zitronensäure enthielt; diese Flüssigkeitsmischung wurde dann von Hand sanft gemischt.

5. Das vorher auf dem festen Substrat fixierte Derivatisierungsmittel wurde dann mit der Flüssigkeit des Reagenzglases vereinigt und die Öffnung des Reagenzglases wurde mit Parafilm abgedichtet. Die Abdichtung mit Parafilm verhindert, daß sich die verdampfte Markierungssubstanz, das freigesetzte Salicylaldehyd, verflüchtigt.

6. Nach einer Inkubation von 5 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde das feste Substrat entfernt und dann in die frisch zubereitete metastabile übersättigte (Entwickler-) Lösung in einem Volumen, das ausreicht, um die Oberfläche des festen Substrats zu bedecken, eingebracht. Dieses Eintauchen dauerte 5 bis 10 Minuten.

7. Das feste Substrat wurde aus der (Entwickler-)Lösung entfernt und ein Film von für das unbewaffnete Auge optisch feststellbaren Kristallen wurde beobachtet. Das Vorhandensein der gebildeten Kristalle zeigt qualitativ das Vorhandensein von hCG in der Urinprobe an; eine Messung der Opazität des kristallisierten Films auf der Oberfläche des festen Substrats ist korrelierbar mit vorgegebenen, standardisierten Mengen von hCG und liefert daher gewünschtenfalls quantitative Resultate.

Test-Kits und Reagenzien für das vorliegende Verfahren

Es wird erwartet und angestrebt, daß eine Mannigfaltigkeit von Test-Kits für die Feststellung eines oder mehrerer interessierender Analyten, die in einer Fluidprobe erwartet werden, im voraus hergestellt wird. Selbstverständlich kann die Fluidprobe von irgendeiner beliebigen Quelle stammen (menschlich, tierisch, Trinkwasser und dergl.) und sie kann in der Praxis auch eine hergestellte Fluidzubereitung sein, in der der gesuchte Analyt zum Zwecke des qualitativen Nachweises und/oder der quantitativen Bestimmung gelöst oder auf einem inerten Träger fixiert wurde. Solange der interessierende Analyt, der nachzuweisen oder zu bestimmen ist, dem Kriterium genügt, daß er gelöst, suspendiert oder von einem inerten Träger getragen wird, sind die wahre chemische Zusammensetzung und/oder die strukturelle Organisation des Analyten irrelevant.

Test-Kits zum Ermitteln eines interessierenden Analyten in einer Fluidprobe werden also folgende Reagenzien enthalten: Einen Konjugat-Reaktanden enthaltend (a) einen für den interessierenden Analyten spezifischen Bindungspartner, der mindestens eine Amingruppe enthält, die für eine Reaktion zur Verfügung steht, (b) eine chelatierbares Metallkation und (c) eine freisetzbare Markierungssubstanz, welche mindestens eine Carbonylgruppe aufweist, die für eine Reaktion zur Verfügung steht; Mittel zum Vereinigen der Fluidprobe mit dem Konjugat-Reaktanden zu einer Reaktionsmischung; Mittel zum Trennen der Produkte der Reaktionsmischung in individuelle Fraktionen; Mittel zum Freisetzen der Markierungssubstanz aus dem gebundenen und ungebundenen Konjugat-Reaktanden; ein fixiertes Derviatisierungsmittel, das einer Kombination mit der freigesetzten Markierungssubstanz derart fähig ist, daß eine Vielzahl von Keimbildungsstellen in situ gebildet werden, wobei das Derivatisierungsmittel auf der Oberfläche eines festen Substrats fixiert ist; und eine metastabile übersättigte (Entwickler-)Lösung, die vorzugsweise zum Zeitpunkt des Assays an Ort hergestellt wird.

In den oben beschriebenen Kit-Geräten kann das auf der Oberfläche eines festen Substrats fixierte Derivatisierungsmittel die Form eines Tauchstabes annehmen, der auf dem Konzept beruht, das bei dem erläuterten Beispiel zur Feststellung von hCG beschrieben wurde. Solche Tauchstäbe sind in den Fig. 4, 5 und 6 dargestellt. Die Hauptunterschiede zwischen diesen Ausführungsformen ist die Konzentration des verwendeten Derivatisierungsmittels und die Verteilung des Derivatisierungsmittels als Funktion der Anzahl der Teilchen pro Flächeneinheitsquadrat. Dementsprechend ist das Derivatisierungsmittel, wie Fig. 4 zeigt, in Form gleichförmig dispergierter Partikel (10) über die ganze Oberfläche (12) des festen Substrats (14) verteilt; obgleich die genauen Abmessungen variieren können, um dem Bedarf oder der Bequemlichkeit des Benutzers Rechnung zu tragen, besteht das kritische Merkmal darin, daß die Dispersion gleichförmig über die Gesamtheit des Oberflächenbereiches ist. Als Ergebnis bilden sich dann, wenn die freigegebene Markierungssubstanz in Berührung mit den Partikeln (10) des Derivatisierungsmittels kommt, eine gleichförmige Reihe von Keimbildungsplätzen in situ, deren Konzentration und Dichte über die Oberfläche (12) des festen Körpers (14) konsistent ist.

Alternative Ausführungsformen

Alternativ liefern die Ausführungsformen gemäß Fig. 5 und 6 quantitative Daten bezüglich der Konzentration des interessierenden Analyten in der Fluidprobe. Bei diesen Ausführungsformen ist das Derivatisierungsmittel in diskreten Blöcken 22, 24 bzw. 26) aufgebracht, welche zunehmend größere Konzentrationen des Derivatisierungsmittels innerhalb gleicher Oberflächenbereiche enthalten. Die in Fig. 5 dargestellte Ausführungsform zeigt zunehmende Konzentration des fixierten Derivatisierungsmittels in Form einer Folge diskreter Blöcke; zum Vergleich ist bei der Ausführungsform gemäß Fig. 6 ein sich kontinuierlich ändernder Dichtegradient des fixierten Derivatisierungsmittels vorgesehen, in dem die Konzentration in der Zone (30) quantitativ die kleinste ist, gefolgt von Zonen (32, 34, 36, 38 und 40) laufende zunehmender Konzentration bis die maximale Dichte und Konzentration des Derivatisierungsmittels in einer Zone (42) erreicht ist. Wenn eine freigegebene Markierungssubstanz in Kontakt mit dem fixierten Derivatisierungsmittel in diesen Zonen kommt, wird die Vielzahl der Kristallkeimbildungsstellen in der Richtung zunehmender Derivatisierungsmitteldichte gebildet. Je mehr Markierungssubstanz freigesetzt wird, um so größer ist dementsprechend die Dichte des Derivatisierungsmittels, die chemisch unter Bildung von Keimbildungsstellen in situ reagiert. Wenn die ganze freigesetzte Markierungssubstanz vollständig reagiert hat und erschöpft ist, wird der Teil des fixierten Derivatisierungsmittels, der dichter war als erforderlich, überflüssig sein. Als Ergebnis hiervon wird also, wenn die (Entwickler-)Lösung zugesetzt wird, eine Kristallisation nur in denjenigen Zonen eintreten, in denen Keimbildungsstellen gebildet wurden. Auf diese Weise sind, je größer die Menge der freigesetzten Markierungssubstanz ist, die reagierten Zonen des Derivatisierungsmittels und der Oberflächenbereich der Kristallisation um so größer.

Bevorzugte Kits

Das bevorzugte Kit zur Durchführung der erfindungsgemäßen Methodik ist in den Fig. 7a bis 7e dargestellt. Wie aus Fig. 7a ersichtlich ist, ist für den Benutzer ein Kit in Form eines vorbereiteten Artikels vorgesehen, der vier unterschiedliche Kammern aufweist. Die individuellen Kammern (1, 2, 3 bzw. 4) haben begrenzten Zugang zueinander, wie in Fig. 7b gezeigt ist. Kammer (1) gewährleistet dementsprechend Zugang für die Einführung einer Flüssigkeitsprobe über eine Leitung (60). Ein Auslaßweg (62) ermöglicht das Fließen von Fluid von der Kammer (1) in das Innere der Kammer (2). In entsprechender Weise gestattet ein Auslaßweg (66), das Fluid oder Dampf in der Kammer (2) direkt ohne Unterbrechung in ein Ende der Kammer (4) strömt. Ein Strömungsweg (64) ermöglicht schließlich, Fluid von der Kammer (3) auch in das andere Ende der Kammer (4) einzuführen.

Die jeweiligen Kammern (1, 2, 3 und 4) sollen in der folgenden Weise verwendet werden: Das Test-Kit als ganzes ist spezifisch für die Bestimmung einer speziellen interessierenden Analyten, wie hCG präpariert. Auf den Innenflächen der Kammer (1) ist das Ligandenanalogon - in diesem Falle eine bekannte begrenzte Konzentration von hCG-Molekülen - fixiert. Zusätzlich enthält die Kammer (1) den Konjugat-Reaktanden in getrockneter Form, wobei der Konjugat-Reaktand einen spezifischen Bindungspartner für hCG, ein chelatierbares metallisches Kation und eine freigebbare Markierungssubstanz, hergestellt wie oben in dem erläuterten Beispiel beschrieben, enthält. Die Kammer (2) enthält die Mittel zur Freisetzung der Markierungssubstanz in einem präparierten trockenen Zustand; ein bevorzugtes Beispiel für die Freisetzungsmittel wäre eine begrenzte Konzentration von Zitronensäure als getrocknetes oder lyophilisiertes Pulver. Die Kammer (3) enthält die metastabile übersättigte (Entwickler-)Lösung der Wahl, die vorzugsweise erst zum Zeitpunkt des Tests in die Kammer (3) eingeführt wird. Die Kammer (4) ist praktisch eine Miniaturausführung des oben in den Fig. 4, 5 und 6 dargestellten Tauchstabes, der eine bekannte Menge eines fixierten Derivatisierungsmittels enthält. Die Folge der das vorliegende Verfahren bildenden Manipulationsschritte ist dann durch die Pfeile in den Fig. 7c, 7d bzw. 7e dargestellt. Die Testflüssigkeit, die im Verdacht steht, den interessierenden Analyten hCG zu enthalten, wird durch die Leitung (60) in die Kammer (1) eingeführt, wodurch der in dieser enthaltene Konjugat- Reaktand gelöst wird. In der Kammer (1) findet eine konkurrierende Bindungsreaktion statt, die man für eine vorgegebene Zeitspanne andauern läßt. Die kompetitiven Bindungsreaktionen, die hier oben beschrieben wurden, finden alle im Inneren der Kammer (1) statt. Nachdem die bestimmte Reaktionszeit verstrichen ist, wird das Reaktionsfluid physikalisch durch den Strömungsweg (72) in das Innere der Kammer (2) ausgequetscht, die Zitronensäure, das Mittel zur Freisetzung der Markierungssubstanz, enthält. Auf diese Weise wird eine solche Markierungssubstanz, wenn sie durch die Zitronensäure in der Kammer (2) freigesetzt wird, verdampft und über den Strömungsweg (66) in das eine Ende der Kammer (4) übergeführt. Die Überführung der freigesetzten Markierungssubstanz in Dampfform läßt man für eine vorgegebene Zeitspanne, typischerweise wenige Minuten, stattfinden. Dies resultiert in der Bildung von Keimbildungsstellen in der Kammer (4). Anschließend wird die metastabile übersättigte (Entwickler-)Lösung in die Kammer (3) eingeführt und ihrerseits physikalisch durch den Strömungsweg (64) gequetscht, so daß sie in die Kammer (4) an deren anderem Ende eintritt. Die (Entwickler-)Lösung wird über den ganzen Oberflächenbereich der Kammer (4) fließen gelassen und wird die Bildung von Kristallen an den Keimbildungsstellen einleiten, die vorher durch die Reaktion des fixierten Derivatisierungsmittels mit der verdampften Markierungssubstanz gebildet worden waren. Nach einer Dauer von etwa 10 Minuten wird der Überschuß der (Entwickler-)Lösung aus der Kammer (4) entfernt.

Das Vorhandensein von gebildeten gezüchteten Kristallen ist mit dem unbewaffneten Auge nach 5 bis 10 Minuten feststellbar. Das Vorhandensein von optisch feststellbaren Kristallen ist ein qualitatives Maß dafür, daß in der flüssigen Testprobe etwas hCG vorhanden war; die Opazität der gezüchteten Kristalle, wie sie sich in der Kammer (4) nach oben erstreckt, liefert ein quantitatives Maß für die Menge des im Testfeld vorhandenen hCG.

Claims

1. Verfahren zum Nachweisen oder Bestimmen eines interessierenden Analyten in einer Fluidprobe durch spezifische Bindungsreaktion, gekennzeichnet durch Bereitstellen eines konjugierten Reaktanden, der gebildet ist aus:

(a) einem Bindungspartner, der für den interessierenden Analyten spezifisch ist und mindestens eine Amingruppe enthält,
(b) einem metallischen Kation und
(c) einer freisetzbaren Markierungssubstanz, die mindestens eine Carbonylgruppe hat,

wobei aus diesen drei Bestandteilen ein stabilisierter Imin-Komplex gebildet ist;
Vereinigen der Fluidprobe mit dem Konjugat-Reaktanden derart, daß der interessierende Analyt an mindestens einen Teil des Konjugat-Reaktanden bindet, um ein Analyt-Komplex-Produkt zu bilden;
Trennen des Analyt-Komplex-Produktes vom ungebundenen Teil des Konjugat-Reaktanden in individuelle Fraktionen nach bekannten Methoden;
Freisetzen der Markierungssubstanz von mindestens einer der getrennten Fraktionen;
Vereinigen der freigesetzten Markierungssubstanz mit einem fixierten Derivatisierungsmittel derart, daß eine Mehrzahl von Kristall-Keimbildungsstellen in situ gebildet werden, wobei das Derivatisierungsmittel auf der Oberfläche eines festen Substrats fixiert ist;
Behandeln der Kristall-Keimbildungsstellen mit einer metastabilen übersättigten Lösung derart, daß eine Vielzahl von optisch feststellbaren Kristallen gebildet wird; und optisches Bestimmen des Vorhandenseins der gebildeten Kristalle, welche ein Maß für den interessierenden Analyten in der Fluidprobe sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Vereinigen der Fluidprobe mit dem Konjugat-Reaktanden ein Liganden-Analogon des interessierenden Analyten hinzugefügt wird.

3. Verfahren zum Nachweisen oder Bestimmen eines interessierenden Analyten in einer Fluidprobe durch spezifische Bindungsreaktion, gekennzeichnet durch Bereitstellen eines konjugierten Reaktanden, der gebildet ist aus

(a) einem Liganden-Analogon zum interessierenden Analyten welches mindestens eine Amingruppe enthält,
(b) einem metallischen Kation und
(c) einer freisetzbaren Markierungssubstanz, die mindestens eine Carbonylgruppe hat,

wobei aus diesen drei Bestandteilen ein stabilisierter Imin-Komplex gebildet ist;
Vereinigen der Fluidprobe mit einem spezifischen Bindungspartner derart, daß mindestens ein Teil des interessierenden Analyts sich den spezifischen Bindungspartner bindet;
Hinzufügen des konjugierten Reaktanden zu der Fluidprobe derart, daß der ungebundene Teil des spezifischen Bindungspartners sich mit mindestens einem Teil des Konjugat-Reaktanden verbindet, um ein Liganden-Komplex-Produkt zu bilden;
Abtrennen des Liganden-Komplex-Produktes vom ungebundenen Konjugat-Reaktanden in individuelle Fraktionen nach bekannten Methoden;
Freisetzen der Markierungssubstanz von mindestens einer der getrennten Fraktionen;
Vereinigen der freigesetzten Markierungssubstanz mit einem fixierten Derivatisierungsmittel derart, daß eine Vielzahl von Kristall-Keimbildungsstellen in situ gebildet werden, wobei das Derivatisierungsmittel auf der Oberfläche eines festen Substrats fixiert ist;
Behandeln der Kristall-Keimbildungsstellen mit einer metastabilen übersättigten Lösung derart, daß eine Vielzahl von optisch feststellbaren Kristallen gebildet wird; und optisches Bestimmen des Vorhandenseins der gebildeten Kristalle, welche ein Maß für den interessierenden Analyten in der Fluidprobe sind.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Ligandenanalogon der Fluidprobe gleichzeitig mit dem Konjugat-Reaktanden zugesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische Bindungspartner der Reaktionsmischung gleichzeitig mit der Konjugat-Reaktion zugesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Liganden-Analogon eine Zusammensetzung ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Polypeptiden, Proteinen und ihren jeweiligen Derivaten besteht.

7. Verfahren nach Anspruch 1, 2, oder 3, dadurch gekenn zeichnet, daß der spezifische Bindungspartner eine Zusammen setzung ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Polypeptiden, Proteinen und ihren jeweiligen Derivaten besteht.

8. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Liganden-Analogon aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Antigenen, Haptenen, Enzymen, Antikörpern, Antikör per-Fragmenten, Enzymsubstraten und Enzym-Co-Faktoren besteht.

9. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeich net, daß der spezifische Bindungspartner aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Antigenen, Haptenen, Antikörpern, Antikörper-Fragmenten, Enzymen, Enzym-Substraten und enzyma tischen Co-Faktoren besteht.

10. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeich net, daß die freisetzbare Markierungssubstanz aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Alkylverbindungen, Aryl verbindungen, aromatischen Verbindungen und aliphatischen Verbindungen besteht.

11. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die freisetzbare Markierungssubstanz aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Salicylaldehyd, 4-Chlorsalicyladehyd, 5-Chlorsalicylaldehyd, 4,6,-Dimethyl salicylaldehyd, 3-Ethoxy-salicyladehyd, 3-Fluor-salicyl aldehyd, 4-Methoxy-salicylaldehyd, 5-Methylsalicyladehyd, 5-Sulfo-salicylaldehyd, 2-Hydroxy-1-naphthaldehyd, 2-Hydro xy-3-naphthaldehyd, 2-Hydroxy-Zimtaldehyd, Pyridoxal, 2-Thiophenaldehyd, Pyrrolaldehyd, 4-Hydroxynikotinaldehyd, 3-Hydroxy-Isonikotinaldehyd besteht.

12. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekenn zeichnet, daß das fixierte Derivatisierungsmittel eine Zusammensetzung ist, welche in der Lage ist, mit der freigesetzten Markierungssubstanz ein Imin zu bilden.

13. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekenn zeichnet, daß das Derivatisierungsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus p-Hydroxybenzoesäure, Hydrazid, Salicylhydrazid, Nikotinsäurehydrazid, 2,4-Dinitrophenyl hydrazin, p-Carboxy-phenylhydrazin, Semicarbazid besteht.

14. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die metastabile übersättigte Lösung eine mit dem Reaktionsprodukt der freigesetzten Markierungs substanz und dem Derivatisierungsmittel identische Zusammen setzung ist.

15. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die metastabile übersättigte Lösung aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus Salicylaldehyd-p-Hydroxybenzoesäure-Hydrazon, 4-Chlor salicylaldehyd-p-Hydroxybenzoesäurehydrazon, Salicylaldehyd- p-Hydroxybenzoesäurehydrazon, 5-Chlor-salicylsäurealdehyd-p- Hydroxybenzoesäurehydrazon, 4,6-Dimethylsalicylaldehyd- salicylhydrazon, 3-Ethoxy-salicylaldehydsalicylhydrazon, 3-Fluor-salicyladehyd-salicylhydrazon,4-Methoxy-salicyl aldehyd-Nikotinsäurehydrazon, 5-Sulfosalicylaldehyd-Nikotin säurehydrazon, 2-Hydroxyl-1-naphthaldehyd-2,4-Dinitrophenyl hydrazon, 2-Hydroxy-3-naphthaldehyd-2,4-Dinitrophenylhy drazon, 2-Hydroxy-Zimtaldehyd-p-Carboxyphenylhydrazon, Pyridoxal-p-Carboxylphenylhydrazon, 2-Thiophen-aldehyd-p- Carboxyphenylhydrazon, Pyrrolaldehyd-Semicarbazon, 4-Hydro xynonikotinaldehyd-Semicarbazon, 3-Hydroxy-Isonikotinaldehyd- Semicarbazon.

16. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die Freisetzung der Markierungssubstanz durch eine Verringerung des pH-Wertes geschieht.

17. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die Freisetzung der Markierungssubstanz durch Einwirkung von Wärme geschieht.

18. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die Freigabe der Markierungssubstanz durch Zusatz eines Chelatierungsmittels bewirkt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die Freigabe der Markierungssubstanz durch enzymatische Hydrolyse bewirkt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Verringerung des pH-Wertes durch Zusatz einer Säure erfolgt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Säure aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus organischen Säuren und metallischen Säuren besteht.

22. Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, bestehend aus einem konjugierten Reaktanden, der gebil det ist aus

a) einem Bindungspartner, der für den interessierenden Analyten spezifisch ist und mindestens eine Amingruppe enthält,
b) einem metallischen Kation und
c) einer freisetzbaren Markierungssubstanz, die mindestens eine Carbonylgruppe hat, wobei aus diesen drei Bestand teilen ein stabilisierter Imin-Komplex gebildet ist.

23. Reagens nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin ein Liganden-Analoges zum interessierenden Analyten enthält.

24. Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 3, bestehend aus einem konjugierten Reaktanden, der gebil det ist aus

a) einem Liganden-Analogon zum interessierenden Analyten, welches mindestens eine Amingruppe enthält,
b) einem metallischen Kation und
c) einer freisetzbaren Markierungssubstanz, die mindestens eine Carbonylgruppe hat,

wobei aus diesen drei Bestandteilen ein stabilisierter Imin-Komplex gebildet ist.