JPS63501661A - 流体試料中の被検体を検出する新規な方法および装置 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 流体試料中の被検体を検出する新規な方法および装置発明の分野 本発明は、不均質アッセイにおける改良に関し、とくに独特の核化および結晶の 生長技術を利用する、問題の被検体（ａｎａｌｙｔｅ　ｏｆ　１ｎｔｅｒｅｓｔ ）の定性的および定量的検出に関する。

発明の背景 すべての生化学的アッセイおよびすべてのイムノアッセイを包含する分析アッセ イ法は、２つの広いアッセイ技術に分類できる：均質アッセイ、ここで反応成分 を反応混合物として一緒にし、そしてそれぞれの最終生成物の同定法は化学的構 成成分を分離しないで実施する；および不均質アッセイ、これは反応成分を反応 混合物として一緒にするが、それらの同定前に反応生成物の分離を必要とする。

２つの広いクラスの間で、不均質アッセイは分析の研究目的において、および臨 床的／診断的アッセイにおいて、非常にいっそう普通に使用されるようになった 。

不均質アッセイにおいてとくによく知られた発展は、イムノアッセイであり、こ のイムノアッセイは、抗原およびハプテンと選択的に結合する、特定のモノクロ ーナル抗体およびポリクローナル抗体の能力を利用する。このような免疫学的構 成成分を、単独であるいは他の化学化合物と組み合わせて、定性的および定量的 検出に使用することは、現在堅固に確率されている。不均質イムノアッセイ法の 古典的な、多分量もよく知られた例はラジオイムノアッセイ（以後「ＲＩＡ」） であり、これは多数のの種類の異なる蛋白質、ポリペプチド、ホルモン、薬物、 および他の化学的組成物を検出するための確立された手順を提供する。すべての ＲＩＡ法は、個々の変法に無関係に、Ｒ，Ｓ、ヤロウ（Ｙａｌｌｏｗ）お（１９ ６０）］が本来記載した技術に基づく。基本的プロトコールを使用する極めて多 くの異なる変法が開発されてきているが、抗体上の限定された数の特異的結合部 位についての、問題の被検体とその放射性核種標識された類似体との間の競合（ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）に頼る。これらの試験条件下で、放射性核種標識類似 体の濃度は、試験試料中の問題の被検体の濃度とともに、特異的抗体に結合する それらのそれぞれの能力において逆に変化するであろう。平衡技術、置換技術、 および順次の飽和を包含する、競合結合アッセイの多くの変法は、種々の異なる 用途を満足するために開発されてきている；これらの異なる手順の各々の完全な 説明は、臨床のラジオアッセイ手順：要約（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｒａｄｉｏａｓ ｓａｙ　Ｐｒ。

ｃｅｄｕｒｅ　：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ）　［パイプ（Ｐａｉｇｅ）　Ｋ 、ベスチ（Ｂ　ｅｓｃｈ）、編者］臨床化学者のアメリカン・アソシエーション 社（Ｔｈｅ　ＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ１ｉｎｉｃａ ｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ、Ｉ　ｎｃ、、１９７５、に記載されている。

ＲＩＡの本質的の性質は不均質アッセイ法であるので、意味ある結果を得るため に反応生成物を分離することが必要である。したがって、個々の化学反応生成物 を分離するために、ある数の異なる手段が案出されてきている。ある場合におい て、反応流体中に懸濁することができかつ放射線標識できる、大きい固体の坦体 、例えば、赤血球などに反応成分の１つは化学的に結合された：他の技術におい て、放射線標識した類似体または放射線標識した抗体を固体の基質の上に固定化 する。その結果、固体、例えば、プラスチック試験管およびディスク、アガロー スおよびプラスチックのビーズ、多孔質ガラス、およびポリアクリルアミドのゲ ルに、直接あるいは「リンカー−アーム」を介して、試薬を固定化することにつ いての開発の長い歴史が存在する。［メソッズ・イン・エンジ（１９７９）；米 国特許第３．７９３．４４５号：米国特許第３，９７０．４２９号；および米国 特許第４．１３８．４７４号］。

ＲＩＡの開発に引続いて、放射性核種以外の広範な種類の「標識」が種々の目的 で不均質アッセイ系に導入された。これらの非アイソトープ標識の普通の例は、 蛍光色素、電子スピンラジカル、特異的結合性蛋白質対（例えば、アビジンおよ びビオチン）、および酵素のそれぞれのコファクターおよび特異的基質に関連し て使用される異なる酵素の全宿主を包含する。これらの最後は、実施例結合免疫 収着アッセイすなわち「ＥＬＩＳＡＪとして、イムノアッセイ分野において問題 なく最も知られるようになった。

不均質アッセイにおけるこらのすべての改良にかかわらず、現在知られている既 知に使用されているアッセイ法の各々はユーザーに望ましくない制限および限定 を与えている。例えば、ＲＴＡ技術のみはピコグラム（１０−”ｇ）のレベルの 分析感度を提供するが、他の標識アッセイ技術はマイクログラム（１０−’ｇ） の範囲においてのみ再現性ある結果を提供する。不都合なことには、放射性核種 の標識は注意して取扱わなくてはならず、そして廃棄物処理の問題はほとんど克 服できない程度に発生してきた。既知の標識の１つを使用する現在用いられてい る方法のすべては、精確な結果を得るために、よく訓練された熟練技術者および 複雑な検出装置を必要とする。その上、現在知られた方法のいずれも、この分野 においてとくに有用ではなく、そして定性的および定量的決定のいずれのために も、その場で使用できない。したがって、明らかなように、一般に不均質アッセ イ、とくにイムノアッセイにおいて、被検体の検出および定量のための新規な「 標識」および新しい方法の必要性がよく認識されかつ絶えず要求されている。

発明の要約 本発明は、直接および間接の技術を用いて、流体試料中の問題の被検を検出する 、迅速な、精確なかつ極端に感度のある方法を提供する。

最も簡単なプロトコールは、工程＝（ａ）問題の被検体に対して特異的な結合相 手、前記結合相手は化学反応に有効な少なくとも１つのアミン基を有する、（ｂ ）キレート化可能な金属陽イオン、（ｃ）反応に有効な少なくとも１つのカルボ ニル基を有する解放可能なマーカー物質（ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ　ｍａｒｋｅｒ 　５ｕｂｓｔａｎｃｅ）　、からなる接合体反応成分を準備し、前記特異的結合 相手および前記金属陽イオンおよび前記解放可能なマーカー物質は結合して接合 体を形成しており、問題の被検体が前記接合体反応成分の少なくとも一部に結合 して被検体複合生成物（ａｎａｌｙｔｅ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔ ）を形成するように、流体試料を前記接合体反応成分と一緒にし、前記被検体複 合生成物を前記接合体反応成分の結合しない部分から個々の分画として分離し、 前記被検体複合生成物の分画および前記結合しない接合体反応成分の分画から成 る群より選択される分離した分画の少なくとも１つから前記マーカー物質を解放 し、複数の核化部位がその場で形成するように、前記解放されたマーカー物質を 固定化された誘導化剤と一緒にし、前記誘導化剤は固体の基質の表面上に固定化 されており、複数の光学的に検出可能な結晶が形成するように、前記核化部位を 準安定性過飽和溶液で処理し、そして前記形成した結晶の存在を光学的に検出し 、前記結晶は流体試料中の問題の被検体の測度である、を含んでなる、直接法で ある。

本発明は、また、好ましい競合結合アッセイを提供し、ここで問題の被検体に類 似する配位子を競合結合アッセイにおいて問題の被検体の定性的および定量的検 出のために用いる。さらに、新規な方法の便利さおよび実用性を全体として最大 にし、かつ種々の異なる環境的、生化学的、免疫学的、および臨床的／診断的応 用の分野において、その場でアッセイ法の使用することを可能とする、試験キッ ト装置が提供される。

図面の簡単な説明 本発明は、添付図面に参照すると、より完全にかつ容易に理解できるであろう。

ここで、 第１図は、直接アッセイのプロトコールとして本発明を図解する略フローダイヤ グラムである。

第２図は、競合結合アッセイのプロトコールとして本発明を図解する略７０−ダ イヤグラムである。

第３図は、別の競合結合アッセイのプロトコールとして本発明を図解する略フロ ーダイヤグラムである。

第４図は、固相の基質の表面上に固定化されｔ；誘導化剤の１つの実施態様の図 解である。

第５図は、固体の基質の上に離散したブロックのゾーンで固定化された誘導化剤 の好ましい実施態様の図解である。

第６図は、固体の基質の上に密度の勾配として固定化された誘導化剤の好ましい 実施態様の図解である。

第７ａ図〜第７ｅ図は、本発明の方法を実施するための好ましい試験キットを図 解する。

好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は、流体試料中の問題の被検体を定性的および／または定量的方法で検出 するために有用な、一般的不均質アッセイ法である。この新規な方法は、独特な 同定用「標識」を結晶生長技術と組み合わせて使用して、精確かつ再現性ある結 果を生成する。本発明は、また、互いに特異的に結合する能力を有するとして認 識される、化学的組成物のよく確立された特性および実用性を使用し、そしてこ れらの化学的組成物を対で使用して、問題の被検体の存在および濃度を同定する 。これらの理由で、本発明のための応用は、免疫診断アッセイに限定されず、そ の代わり、環境的研究、生化学的分析、および問題の被検体の同定のｔ；めの− 膜化学的検出技術において有用である。

この独特な方法は、種々の化学成分および反応成分を１系列の操作工程において 使用し、これらの工程は光学的に検出可能な結晶の生長を試験試料中の問題の被 検体の存在と関係づける。こうして、流体試料中の特定の問題の被検体の存在を 同定する（定性的および定量的に）ために化学成分の調製および使用は、肉眼で 観察可能な生長した結晶の出現によって特徴づけられる。本発明において使用す る必須の化学成分は次のものを包含する：特異的結合相手、キレート化可能な金 属陽イオン、および解放可能なマーカー物質からなるか、あるいは問題の被検体 に類似する配位子、キレート化可能な金属陽イオン、および解放可能なマーカー 物質からなる、接合体反応成分（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ｒｅａｃｔａｎｔ）　； マーカー物質を解放する手段；固定化された誘導化剤：および準安定性過飽和（ 現像剤）溶液。直接アッセイ手順においておよび２つの競合アッセイ手順におい て、これらの化学成分を使用する操作工程は、第１図、第２図および第３図に略 フローシークエンスで図解されている。

第１図に図解する直接アッセイのプロトコールは、流体試料中の問題の被検体を 、問題の被検体のための特異的結合相手、金属陽イオン、および解放可能なマー カー物質からなる接合体反応成分の過剰量と一緒にする。問題の被検体と接合体 反応成分との間の相互作用は、問題の被検体と特異的に結合しかつ流体中の他の 化学物質との結合を回避する、接合体反応成分の特異的結合相手の能力に完全に 依存する。被検体のすべてが過剰１１．度の接合体反応成分と結合するために十 分な時間が経過した後、すべての不均質アッセイにおいて必要な分離工程を実施 し、この分離工程は別々の個々の分画を生成する：被検体複合生成物を含有する 分画、ここで問題の被検体は接合体反応成分の特異的結合相手にしっかり結合す るようになっている；および結合しないの接合体反応成分の残部を含有する含有 、ここで接合体反応成分は本来過剰であるが、既知の量または濃度で存在する。

いずれの場合においても、反応生成物を個々の分画に分割するために従う操作工 程の順序は同一である。

第１図の示す操作工程の順序に従い、分離した分画の少なくとも１つを利用しか つマーカー物質を解放する特定の手段、すなわち、接合体反応成分をｉｆｆする 成分の１つ、と−緒にする。このマーカー物質の解放は、従来知られているアッ セイ法における「同定用標識」の機能的等価である。このアッセイのプロトコー ルを構成する核化を直接開始しかつ光学的に検出可能な結晶の生長を定性的にコ ントロールするのは、このマーカー物質の解放およびその引続く誘導化剤との相 互作用である。したがって、解放されたマーカー物質は固定化された誘導化剤と 反応的に接触して配置され、この誘導化剤は固体の基質の上に前もって固定化さ れ、そしてマーカー物質と化学的に反応して複数の微細粒子をその場で生成する ことのできる化学的組成物であり、前記粒子は前記固体の表面上に結晶の生長の ための核化部位としてはたらく。引続いて、準安定性過飽和（現像剤）溶液を固 体の基質上の核化部位に添加する。核化部位と現像剤溶液との組み合わせは、光 学的に検出可能な結晶を形成させかつ生長させ、この結晶は不透明のフィルムと して明らかに見ることができるい。定性的決定のため、肉眼による結晶の不透明 フィルムとしての視的観察は流体試験試料中の問題の被検体の存在を同定する； 定量的アッセイのため、合計の不透明度の決定は、絶えず、問題の被検体の検出 をナノグラム範囲で提供し、そして特別にコントロールされた条件下に、検出を ピコグラムの範囲で提供するであろう。

競合結合反応を利用する新規な検出法の好ましい実施態様は第２図および第３図 に示されている。第２図のプロトコールと第３図のプロトコールとの間の操作工 程における本質的な差は、限定された濃度で使用する接合体反応成分の組成であ る。認識されるように、第２図に示す接合体反応成分は、問題の被検体に類似す る配位子に特異的に結合することができ、ならびに問題の被検体自体に特異的に 結合することができる、特異的結合相手からなる。この特異的結合相手を、キレ ート化可能な金属陽イオンおよび解放可能なマーカー物質と一緒にして、接合し た分子を形成する。対照的に、第３図において見られる接合体反応成分（同様に 限定された濃度）は、別のタイプであり、そして問題の被検体に類似する配位子 、キレート化可能な金属陽イオン、および解放可能なマーカー物質からなる。理 解されるように、金属陽イオンおよび解放可能なマーカー物質の化学的組成は、 特異的結合相手からなるタイプｌの接合体反応成分および配位子類似体からなる タイプ２の接合体反応成分の両者において同一である。

さらに、観察されるように、第２図および第３図に示す競合アッセイのプロトコ ールは第１図の直接アッセイのプロトコールと異なり、競合プロトコールにおい て、反応混合物中の問題の被検体と配位子類似体との間に、特異的結合相手上の 結合部位について、競合が存在する。好ましくは、接合体反応成分の量または濃 度（タイプｌおよびタイプ２の両者）は、限定されており、モして配位子類似体 の制限された量と最適な比にあり、こうして問題の被検体が流体試料中に存在し ない場合、配位子類似体の全量は特異的結合相手のすべてに結合し、いずれの成 分もほとんどあるいはまったく残留しないであろう；この理由で、問題の被検体 が流体試料中に存在する場合、それは特異的結合相手（制限された濃度で存在す る）と結合し、このようにして配位子類似体の特定の量と置換し、次いでこの量 の配位子は反応混合物中に結合しない状態でとどまるであろう。この反応順序は 、配位子類似体または特異的結合相手が接合体反応成分の１成分であるか否かに かかわらず、起こるであろう。

第２図に見られるように、特異的結合相手からなるタイプｌの接合体反応成分を 問題の被検体および配位子類似体と一緒にして反応混合物を形成し、ここで問題 の被検体と配位子類似体との間に、接合体反応成分の特異的結合相手の成分の結 合部位について、競合が存在する。配位子類似体およびタイプ１の接合体反応成 分の両者は、好ましくは、制限された最適の比の濃度で存在するので、問題の被 検体と特異的結合相手との結合は当量の配位子類似体を置換し、この量の配位子 類似体は反応混合物の流体中で結合しないでとどまりかつ自由に移動することが できる。

適当な反応時間が経過した後、個々の反応生成物の各々−被検体複合生成物、配 位子複合生成物、および結合しない配位子類似体−は、慣用の装置および技術を 用いて、個々の分画に分離される。この必要な分離工程が実施された後、３つの 分離された個々の分画の２つを利用して意味あるデータを得ることができる：そ れぞれ、被検体複合生成物および配位子複合生成物。これらの分画のいずれか一 方あるいは双方を使用して、分離された複合反応生成物をマーカー物質の解放手 段と一緒にする。マーカー物質は、いったん解放（蒸気または流体の形態で）さ れるど、固定化された誘導化剤と一緒にし、この誘導化剤は、固体の基質の表面 上に、好ましくは単分散粒子のフィルムとして固定化されている。マーカー物質 と固定化された誘導化剤との反応は、固体の基質の表面上に複数の核化部位をそ の場で（ｉｎ−ｓｉｔｕ）形成する。引続いて、準安定性過飽和（現像剤）溶液 を固体の基質上の核化部位上に添加し、これにより前記固体の表面上に光学的に 検出可能な結晶が形成しかつ生長する。第２図に示すように、被検体複合生成物 または配位子複合生成物のいずれを光学的に検出可能な結晶の形成および生長に 利用するがどうかは重要ではない；いずれの場合においても、光学的に検出可能 な性質、例えば、不透明性、を有する可視の結晶の出現は、問題の被検体の存在 を、定性的および／または定量的測定として同定するであろう。

第３図に示す競合的反応の反応アッセイは第２図に見出される操作工程の順序に 従うが、ただし限定された濃度で使用する接合体反応成分は代替のタイプであり 、そしてキレート化可能な金属陽イオンおよび解放可能なマーカー物質に加えて 、問題の被検体に類似する配位子を含む。

このプロトコールにおいて、タイプ２の接合体反応成分を、順次にあるいは同時 に、流体試料中の問題の被検体と、および限定された濃度の特異的結合相手（こ れは問題の被検体および接合体反応成分の配位子類似体成分の両者に特異的に結 合する立証された特徴ある能力を有する）と−緒にする。したがって、これらを 反応混合物として一緒にし、ここで特異的結合相手の一部は問題の被検体と結合 して、結合した被検体を形成する；特異的結合相手の一部はタイプ２の接合体反 応成分の配位子類似体と結合して、配位子複合生成物を形成し；そしてタイプ２ の接合体反応成分の他の部分は流体混合物中に結合しないしないまま残る。しか しながら、このプロトコールの好ましい実施態様において、特異的結合相手の量 はタイプ２の接合体反応成分に関して限定された、最適濃度で使用し、こうして 問題の被検体が反応混合物中に存在しない場合、特異的結合相手のすべてはタイ プ２の接合体反応成分と反応して、配位子複合生成物を形成する：したがって、 問題の被検体が流体試料中に存在するとき、その量の被検体は特異的結合相手と 競合しかつそれに結合し、これによって比例的量のタイプ２の接合体反応成分を 置換し、次いでそのタイプ２の接合体反応成分は反応混合物中に結合しないでと どまる。

この理由で、反応生成物が個々の分画に分離されると、認識されるように、結合 しないタイプ２の接合体反応成分の量および／または配位子複合生成物の量は、 それぞれ、他の分画中の結合した被検体の量の測度である。したがって、この基 準で、これらの分画の一方まｊ；は双方は光学的に検出可能な結晶の形成および 生長において使用できる。

こうして操作工程の順序は、第１図および第２図について前述のプロトコールに 従う。結合しないタイプ２の接合体反応成分の分画および／または配位子複合生 成物の分画の一方または双方は、マーカー物質を解放する特定の手段と個々に一 緒にする。マーカー物質が解放された後、それを固定化されＩ；誘導化剤と一緒 にし、前記誘導化剤は、好ましくは、固体の基質の表面上の単分散した粒子の形 態である。マーカー物質と固定化された誘導化剤との反応により、前記固体上の 表面に複数の核化部位が形成する。引続いて、準安定性過飽和（現像剤）溶液を 核化部位に添加して、前記固体の表面上で光学的に検出可能な結晶を形成しがっ 生長させる。生長した結晶は肉眼で視的に明らかであり、そして特定の性質、例 えば、拡散反射および不透明度について光学的に検出できる。このようにして、 光学的に検出可能な結晶の存在は、流体試料中の問題の被検体について、定性的 および／または定量的の両者のデータを提供する。

本発明のすべての実施態様において、個々の反応生成物を分離する手段は、この 方法を実施する特定の方法に無関係に使用しなくてはならない。反応生成物を個 々の分画に分離する手段および装置は、この分野において従来知られかつ入手可 能なものであり、それらの多くは販売されている。本発明の好ましい実施態様に おいて、個々の分画への分離は、濾過、デカンテーション、遠心、および１種ま たは２種以上の化学的成分を固定化するための固相基質の使用を包含する方法に よって達成される。例えば、不溶性坦体（例えば、赤血球、白血球、特定の組織 など）を利用して問題の被検体をそれらの表面上に支持または存在させる場合、 これらの不溶性坦体は、反応混合物から、沈降、濾過およびデカンテーションに よって分離できる。このような天然に産出する坦体（血球など）の使用は、また 、第１図に示すように、直接のモードでアッセイを実施することを可能とする。

あるいは、競合的反応のアッセイを実施するとき、配位子類似体または特異的結 合相手は、固体の基質の使用上に、直接あるいは「リンカー−アーム」を介して 、固定化することが好ましい；特異的結合相手および配位子類似体を固定化する 方法は、この分野において従来知られており、そしてここの組成物の特定の要求 を満足する種々の異なる反応において利用できる。固定化に有用である固体の基 質の例は、不溶性のポリマーまたはプラスチック、例えば、ラテックスビーズ、 ベントナイト粒子、セルロース、架橋したデキストラン、およびアガロースおよ びポリアクリルアミドの粒子である。流体に可溶性の配位子類似体および特異的 結合相手は、この分野においてよく確立されかつ記載されている特定の化学反応 を経て、これらの固体の基質に直接取り付ける。したがって、反応生成物を固定 化しかつ分離する手段は、本発明に関して全体として無意味であると思われ、そ して本発明が１系列の操作工程で実施される用途および方法において非限定的で ありかつ無関係である。

本発明によって提供される利点は、実質的でありかつ多数である二流体試料中の 問題の被検体を検出する方法は、迅速に実施されかつ試験試料の大きさおよび反 応成分の体積のその要件において効率的である；この方法は、それを直接のモー ドあるいは間接の競合的モードのいずれで実施するかどうかに無関係に、精確か つ再現性あるデータを提供する：本発明の方法は、ユーザーに、彼の特定の要求 および欲求を満足する定性的および／または定量的結果の選択を提供する；試験 結果は肉眼で視的に観察可能であり、そして複雑でない検出装置を使用して評価 することができる；この独特の方法は、ユーザーの側に、精確な結果を得るため に大きい知識または情報を要求せず、そしてユーザーが高度に熟練しているかあ るいは技術的に訓練されていることを要求しない；この新規なプロトコールを実 施するための装置は、この分野において入手可能であり、そして得るために比較 的安価である：この方法は現場で精確にかつ再現性をもって実施することができ 、これによって特定の位置で特定の試料を調製および／または供給することを排 除し、こうして試料の安定性、輸送、および試料の移送に関連する貯蔵という固 有の問題を回避する；最後に、本発明の方法の感度はナノグラム／ｍｌの範囲に ８いて再現性ある結果を絶えず提供する。

本発明を用いる用途および使用の広い範囲を完全に理解するために、検出できる 種々の被検体および操作工程において使用する種々の化学的成分について詳細に 説明する。しかしながら、各記載する成分についての化学的組成および配合は、 使用できる範囲の組成についての単なる例示であり、そして達成する目的および 目標の例示でることを、強調して意図しておりそして明瞭に理解すべきである。

いずれにしても、記載する実施態様は全体として本発明を制限しかつ限定するも のではない。

問題の被検体 問題の被検体は、本発明の方法を構成する操作工程を用いて流体試験試料中で検 出すべき化学種である。１つの、かつ１つのみの必須要件が存在する二流体媒質 中の問題の被検体対して特異的でありかつそれに選択的に結合するであろう、明 確な結合相手の存在。問題の被検体が流体媒質中に可溶性であるかあるいは不溶 性であるかどうか、あるいは問題の被検体がより大きい分子の一部を構成する化 学的部分であるかどうかは、被検体がその分子の表面上に見出されかつ化学反応 に有効であるかぎり、重要ではない。特異的の結合性の化学的組成物のこのよう な対の存在は、よく確立されており、そして次のものを包含する：ポリクローナ ルおよびモノクローナルの抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片およびそれらのそれ ぞれの抗原および／またはハプテン；特定の結合性対、例えば、アビジンおよび ビオチン；ホルモンおよびそれらのそれぞれの受容体部位：酵素およびそれらの それぞれの特定のコファクターおよび阻害剤；および特定の金属イオンおよびキ レート剤。問題の被検体の真の化学的組成物および／または配合は、重要ではな くおよび有意でない。したがって、被検体は次のものからなることができる：蛋 白質、ポリペプチド、リポ蛋白質、アミノ酸、イオン化可能な金属および塩、酵 素のコファクターおよび基質など。好ましい免疫診断の用途において、抗体およ び抗原（またはハプテン）およびそれぞれの誘導体のいずれも、源に無関係に、 最も普通に使用されることが期待され、抗体の特異性およびその特異的結合相手 に対する親和性の程度は、現在入手可能な広範な種類の知られた技術によって、 実験的に立証される。

問題の被検体に類似する配位子 配位子類似体は、問題の被検体と同一であるかあるいはそれに類似する化学的組 成物である。それは、問題の被検体に対して特異的な結合相手と、また、選択的 に結合するその能力を基準にして選択される。配位類似体は、第２図および第３ 図に示す競合結合アッセイにおいて有用である。配位子類似体は、特異的結合相 手と最適な結合のために限定された濃度で反応混合物に添加され、そして、流体 試料中に存在するような問題の被検体による結合から提供されるとき、置換され かつこのような問題の被検体による結合から防止される。大抵の場合において、 配位子類似体の化学的組成および配合は問題の被検体のそれと同一であろう；し かしながら、制限された数の場合において、配位子類似体は異なる化学的組成を もつが、問題の被検体の結合能力に類似するかあるいはそれと同一である特異的 結合相手についての選択的結合能力を明らかにするであろうことを、意図しかつ 期待する。

配位子類似体は２つの異なるモードで使用できることが認識されるであろう：結 合相手の特異性部位への結合のための、問題の被検体についての明確な（ｄｉｓ ｃｒｅｔｅ）実在物および競合体として、およびタイプ２の接合体反応成分を構 成する１つの成分として。競合結合のモードにおいて、明確な配位子類似体は、 この分野において従来知られている方法および試薬を用いて、使用前に固体の基 質の表面上に典型的には固定化される。こうして、明確な配位子類似体の固定化 は、競合的結合反応が平衡に進行した後、反応生成物を分離する手段を提供する 。第２のモードにおいて、タイプ２の接合体反応成分を構成する３つの成分の１ つとして、配位子類似体は化学反応に有効な少なくとも１つのアミン基を有する ことを必要とする。選択した配位子類似体がその自然の状態または配合において 少なくとも１つアミン基を含有しない場合、配位子類似体をアミン含有化合物と 反応させて混成反応生成物を形成することが必要である。また、この混成反応生 成物は、前に明らかにした特異的結合相手について、選択的結合能力を保持する ことが必須である。しかしながら、機能的配位子類似体へ少なくとも１つアミン 基を付加するこの追加の手順は、接合体試薬を調製すべき場合においてのみ、お よび配位子類似体分子中に最初からアミン基が存在しない場合においてのみ、必 要であることを理解しかつ強調しなくてはならない。

特異的結合相手 特異的結合相手は、第１図〜第３図に示すように、１つのみの必須機能および１ つのみの要求する特徴を有する二問題の被検体および配位子類似体と選択的に結 合する立証可能な能力。問題の被検体および配位子類似体が同一である場合、結 合部位または受容体の各々における最適な結合比、および結合の強さは同一であ ろう；しかしながら、問題の被検体および配位子類似体が化学的に同一ではない 他の場合において、特異的相手が配位子類似体に結合する親和性および強さの程 度は、問題の被検体との反応において存在するものへの結合の程度および結合の 強さにおいて類似することが必要である。

特異的結合相手は、２つのモードの１つにおいて使用できる：第１モードにおい て、特異的結合相手は明確な実在物として競合結合アッセイのプロトコールにお いて限定された濃度で使用し、こうして問題の被検体が流体反応混合物中に存在 しない場合、配位子類似体のすべては前記流体中に存在する量の特異的結合相手 と結合するであろう。この競合結合のモードにおいて、特異的結合相手の、化学 的組成物、配合、または特定の構造的配向は、明らかにした選択的結合が保持さ れるかぎり、重要ではない。特異的結合相手は大部分の場合において蛋白質また はポリペプチドであり、そして機能的に抗体（モノクローナルまたはポリクロー ナルの起源の）、または抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片またはＦ　ａｂ’断片） として分類できるが、これは必須の特徴または要求する限定ではない。例えば、 特異的結合相手は、酵素の問題の被検体について特異的な多糖の阻害剤であるこ とができる。また、ある競合結合アッセイにおいて、特異的結合相手は固体の表 面上に固定化し、次いでこの固体は反応混合物中の化学的実在物を分離する手段 を提供するであろうことが期待および意図される。再び、特異的結合相手を固定 化する手段は、先行技術においてよく確立されかつ知られている反応および化学 を使用することが強調される；したがって、特異的結合相手を固定化された状態 で、あるいは自由に可動な状態で使用するという事実は、本発明に関して無意味 である。

特異的結合相手を使用する第２モードは、タイプｌの接合体反応成分を構成する ｌ成分としてである。このモードにおいて使用するとき、選択した特異的結合相 手に付与される第２の必須要件が存在する：全体の化学的組成物の一部として化 学反応のための少なくとも１つのアミン基が存在すること。特異的結合相手が窒 素含有構成成分、例えば、アミノ酸、第一などから構成されている場合、このよ うな要件当然満足される。

特異的結合相手が引続く化学反応に有効な少なくとも１つのアミン基を含有しな い場合、この分野において従来入手可能な試薬および反応を用いて、選択した特 異的結合相手をアミン含有組成物と一緒にして混成反応生成物を形成することが 必要である。このようにして、混成反応生成物は特異的結合相手の機能的同等体 として利用され、そして必須の両者の機能を明らかにするであろう二問題の被検 体と選択的に結合する能カニおよび化学反応のだめの少なくとも１つのアミン基 の有効性。しかしながら、再び、注意されるように、この後者の要件および混成 反応生成物をつ＜ｊ；めの別の手順は、特異的結合相手をタイプｌの接合体反応 成分の調製におけるＬ成分として使用するべき場合においてのみ、必要でありか つ有用である。

接合体反応成分 第１図〜第３図に示すように、この新規な検出法における接合体反応成分は、先 行アッセイ技術において普通に見出される「同定用標識」の機能的同等体として はたらく。しかしながら、本発明の範囲内において、接合体反応成分は別の形態 で調製され、これはｌ成分として特異的結合相手または配位子類似体を利用する 。ここにタイプｌとして識別する接合体反応成分は、キレート化可能な金属陽イ オンおよび解放可能なマーカー物質と組み合わせて、ｌ成分として特異的結合相 手を用いる。あるいは、ここでタイプ２と識別する接合体反応成分は、キレート 化可能な金属陽イオンおよび解放可能なマーカー物質と組み合わせて、ｌ成分と して配位子類似体を用いる。

接合体反応成分を調製する化学的関係および方法は、タイプ１またはタイプ２の 組成物のいずれをつくるかに無関係に、同一である。金属陽イオンおよび解放可 能なマーカー物質の選択はタイプｌおよびタイプ２の両者の形態において同一で あることができる；あるいは、選択した金属陽イオンおよび選択した解放可能な マーカー物質は、交互の形態を調製するとき、必要に応じて変化することができ る。しかしながら、表現的に理解されるように、タイプｌの接合体反応成分およ びタイプ２の接よび解放可能なマーカー物質に関して存在しない；したがって、 唯一の認識可能なかつ有意の差は、１成分として特異的結合相手または配位子類 似体のいずれを使用するかに関してのみ存在する。

その精確な化学的組成、その構造的配向、またはその特定の活性に無関係に接合 体反応成分は安定化されたイミン複合体であり、あるいは別の用語において、安 定化されたシッフ塩基である。接合体反応成分の安定化はキレート化可能な金属 陽イオンによって提供され、そして金属陽イオンは、また、要求に応じて複合体 からマーカー物質をコントロールされた方法で解放する特定の手段を提供する。

各場合において、解放可能なマーカー物質は、化学反応に有効な少なくとも１つ のカルボニル（＝Ｃ−０）基を含有する。したがって、必要なアミン基を有する 特異的結合相手または配位子類似体を、必要なカルボニル基を有する解放可能な マーカー物質および金属陽イオンと一緒にするとき、安定化されたイミン複合体 （または安定化されたシッフ塩基）が形成する。一般的反応順序は下の合成■に よって表わされる：ここでＲ，Ｒ″およびＲ”はアルキル、アリール、芳香族お よび脂肪族の化合物および水素から成る群より選択される。　゛多くの場合にお いて、接合体反応成分の調製に使用する特異的結合相手または配位子類似体は、 複数の反応性基を有するであろうこと、および選択した解放可能なマーカー物質 は、また、必要なカルボニル基に加えて反応性基を提供するであろうことが期待 される。これらの場合は、ポリペプチド鎖内のアルファアミノ酸リジン、このリ ジンは反応に有効なニブシロン炭素原子上に第２７ミノ基を有する；好ましい芳 香族物質、アリチルアルデヒド：および好ましいキレート化可能な金属陽イオン 、第２銅の網布の存在によって例示される。これらの反応成分は一緒になって安 定化されたシップ塩基を形成する。この安定化されたイミン複合体の最も本当ら しい形状は、いったん形成したシップ塩基を安定化する金属陽イオンの能力と組 み合わせた、解放可能なマーカー物質、ｐｉ−結合活性化可能なアルデヒド、例 えば、サリチルアルデヒドによってコントロールされる。全体の反応順序は、合 成ＩＩによって与えられる。

Ｈ （安定化されたシップ塩基） 金属陽イオンの組込みによるシップ塩基の安定化は、文献においてよく記載され かつ証明されている［エイショーン（Ｅ　１ｃｈｈｏｒｎ）およびマルチャウド （Ｍａｒｃｈａｕｄ）　、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・うして、 このような安定化されたイミン複合体の存在および安定化されたシッフ塩基の調 製法は、この分野において利用可能なよく確立された反応である；それにもかか わらず、カルボニル含有マーカー物質を解放する方法、解放可能な成分どしての その機能的価値および利用、および安定化されたイミン複合体内において有用な 組成物の範囲は、存在する文献において判断または認識されていない。これらの 理由で、本発明において使用する接合体反応成分を構成する成分の各々をここで 詳細に記載する。

特異的結合相手および配位子類似体 特異的結合相手および配位子類似体の両者の化学的性質、機能、および特異的活 性は前述した。接合体反応成分中の成分として、わずかに２つの特徴が必須であ いかつ要求される：特異的結合対として他の実在物と選択的に結合する立証可能 な能力；およびキレート化可能な金属陽イオンの存在下に解放可能なマーカー物 質のカルボニル基と化学的反応して安定化されたイミン複合体を形成するための 少なくとも１つのアミノ基の有効性。最も普通な例は、選択的に結合する立証さ れた能力を有する蛋白質およびポリペプチドである。前に述べたように、混成反 応生成物をつくることができ、この反応生成物は、また、機能的にかつ化学的に 両者の必要な要素を提供する。

キレート化可能な金属陽イオン 好ましいキレート化可能な金属陽イオンはイオン化可能な金属、例えば、第２銅 の銅［Ｃｕ　＋　＋　］、ニッケル［Ｎｉ”］　、および亜鉛［Ｚｎ◆＋１であ る。これらの金属は接合体反応成分において要求される程度の安定性を提供し、 そしてしかもマーカー物質が引続く操作工程において化学的または物理的に解放 できるようにする。また、使用できる他の金属陽イオンは、第２鉄の鉄［Ｆｅ＋ ＋］　％カドミウム［Ｃｄ＋＋］、およびコバルト［ＣＯ＋＋］を包含する。一 般に、いかなるキレート可能なイオンも有用であると思われる。金属陽イオンの 選択および濃度は、典型的には、選択した他の成分の化学的組成、それらの濃度 、および反応媒質のｐＨとともに変化するであろう。

解放可能なマーカー物質 好ましいマーカー物質は少なくとも２つ、好ましくは３つの要件を満足しなくて はならない：マーカー物質は、安定化されたイミン複合体を形成するために、特 異的結合相手または配位子類似体との反応に有効な少なくとも１つのカルボニル 基を有することが必須である。複合体の安定化されたイミン結合の強度は、この 方法において使用するために、全体として接合体反応成分の化学的一体性を維持 するために十分に強くかつ耐久性であること；および引続いて、このイミン結合 は、必要なとき接合体反応成分からマーカー物質を急速に解放するため、物理的 または化学的手段によって容易に脱安定化されかつ開裂されることがが望ましい 。また、次いで、解放されたマーカー物質は固定化された誘導化剤と化学的に反 応して、結晶の生長のためｌ系列に核化部位を形成できることが必須である。

これらの要件の第１１少なくとも１つのカルボニル基の存在は詳細に前述した。

このようなカルボニル基を有する化学的組成物の生長は、広く、そして化学的組 成物ノ多数の異なるクラスおよび変種、例えば、追加の機能的反応性基を含むこ ともできる、アルキル、アリール、脂肪族および芳香族の組成物を包含する。よ り大きい分子量よりもむしろより小さい分子量を有するカルボニル組成物および より複雑な構造よりもむしろ簡素化された３次元構造を有するものは、使用およ び調製が容易なため好ましいことが、認識される；それにもかかわらず、選択し た組成物の真の分子量分子量、構造の配向、複雑さ、または他の化学的および機 能的特性は、これらが、本発明を構成する方法において、接合体反応成分の調製 におけるマーカー物質の目的および安定化されたイミン複合体の使用を妨害しな いかぎり、有意である。限定されないが、例示すると、解放可能なマーカー物質 として有用であると思われる少なくとも１つのカルボニル基を有する種々の異な る化学的組成物を表■に記載する：青１ 解放可能なマーカー　好ましい準安定性過飽和物質　好ましい誘導化剤　（現像 剤）溶液サリチルアルデヒド　ｐ−ヒドロキシ安息香　サリチルアルデヒド−ｐ 酸ヒドラジド　−ヒドロキシ安息香酸ヒ４−クロローサリチ　ｐ−ヒドロキシ安 息香　４−クロロ−サリチルアルアルデヒド　酸ヒドラジド　ルデヒドーｐ−ヒ ドロキシ安息香酸ヒドラゾン （サリチルアルデヒド−ｐ −ヒドロキシ安息香酸ヒ ドラジン）＊ ４−クロローサリヂ　ｐ−ヒドロキシ安息香　３−クロロ−サリチルアルアルデ ヒド　酸ヒドラジド　ルデヒドーｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラゾン ４．６−シメチルー　サリチルアルデヒド　４．６−シメチルーサリサリチルア ルデヒド　チルアルデヒドサリチルヒドラゾン ３−エトキシーサリ　サリチルアルデヒド　３−エトキシ−サリチルチルアルデ ヒド　アルデヒドサリチルヒドラゾン ３−フルオローサリ　サリチルアルデヒド　３−フルオロ−サリチルチルアルデ ヒド　アルダとドサリチルヒドラゾン ４−メトキシーサリ　ニコチン酸ヒドラジド　４−メトキシ−サリチルチルアル デヒド　アルデヒドサリチルヒドラゾン ５−メチルーサリチ　ニコチン酸ヒドラジド　５−メチル−サリチルアルアルデ ヒド　ルデジドニコチン酸ヒドラゾン ５−スルホーサリチ　ニコチン酸ヒドラジド　５−スルホ−サリチルアルアルデ ヒド　ルデジドニコチン酸ヒドラゾン ２−ヒドロキシ−１２，４−ジヒドロ７エ　２−ヒドロキシ−１−ナーナフトア ルデヒド　ニルヒドラジン　７トアルドヒド２．４−ジニトロフェニルヒドラ ２−ヒドロキシ−３２，４−ジヒドロ７エ　２−ヒドロキシ−３−ナーナ７トア ルデヒド　ニルヒドラジン　７トアルドヒド２，４−ジニトロフェニルヒドラ ジン ２−ヒドロキシイソ　ｐ−カルポキシフェニ　２−ヒドロキシシンナムンナムア ルデヒド　ルヒドラジン　アルドヒト−ｐ−カルボキシフェニルヒドラゾン ピリドキサール　ｐ−カルポキシフェニ　ピリドキサール−ｐ−カルヒドラジン 　ルポキシフェニルヒドラゾン ２−チオ７エンアル　ｐ−カルポキシフェニ　２−チオフエンーアルデデヒド　 ルヒドラジン　ヒト−ｐ−カルボキシフェニルヒドラゾン ビロールアルデヒド　セミカルバジド　ピロールアルデヒドセミ−カルバゾン ４−ヒドロキシイソ　セミカルバジド　４−ヒドロキシニコチンチンアルデヒド 　アルデヒドセミ−カルバゾン ３−ヒドロキシイソ　セミカルバジド　４−ヒドロキシイソニコニコチンアルデ よド　チンアルデヒドセミーカルバゾン ＊サリチルアルデヒドーｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラゾンは４−クロロ−サリ チルアルデヒドローヒドロキシ安息香酸ヒドラゾンと類質同形であるので、４− クロロ−サリチルアルデヒドローヒドロキシ安息香酸ヒドラゾン核を可視化する ための準安定性過飽和（現像剤）剤として使用できる。試薬溶液の適切な選択は この場合において非常に重要である。

この現象を利用するとき、それをエビタクシ−と呼ぶ。。

理解されるように、表■は異なる化学的組成の解放可能なマーカー物質の広範な リストを提供するばかりでなく、かつまたその解放可能なマーカー物質と一緒に 使用すべき好ましい誘導化剤を表わす。マーカー物質とその好ましい誘導化剤と の相互作用に間して、下に詳述する。

マーカー物質を解放する手段 第１図〜第３図に示すように、反応生成物を個々の分画に分離した後、この方法 は分離した分画においてマーカー物質を接合体反応成分（結合したあるいは結合 しない）から解放する。このような解放を達成する手段は出来るだけおだやかで あって、マーカー物質が実質的に変更されるかあるいは悪影響を受けることを防 止することが好ましい。マーカー物質は任意の分離した分画中の接合体反応成分 から、次のものを報賀する種々の物理的または化学的手段を用いて解放すること ができる：酸加水分解；加熱；キレート剤；および酵素的加水分解。使用する特 定の手段に無関係に各場合における所望の作用は、接合体反応成分を脱安定化す ること、存在するイミン結合を開裂すること、および化学反応に再び有効な實能 的カルボニル基を解放することである。表■に列挙するマーカー物質について、 好ましい解放の方法は酸加水分解である。これは個々の分画を有機酸または金属 酸で処理することによって達成される。実際には、接合体反応成分（タイプｌお よびタイプ２）は、中性の値のｐＨに対して安定であることがわかった。しかし ながら、流体のｐＨが２゜０以下であるとき、接合体反応成分の加水分解は直ち に起こり、同時にマーカー物質が官能的に完全な形態で解放される。この目的に 対して金属酸よりもむしろ有機酸を利用することが最も好ましい；有用な酸の範 囲は酢酸、マレイン酸、乳酸などを包含する。有用な金属酸は、それぞれ、硫酸 および塩酸を包含する。他の場合において、個々の分画のおだやかな加熱または 分離した分画への適当な酵素の添加は、また、マーカー物質を絶えず有用な方式 で解放する。

結合したあるいは結合しない接合体反応成分からのマーカー物質の解放を達成す るために他のモードは、強いキレート剤を個々の分画中の反応生成物へ添加する ことを包含する。このようなキレート剤は安定化されたイミン複合体のマーカー 物質について競合する：それらの金属イオンへの高い親和性およびこのような陽 イオンと形成したキレートの認識された安定性をかんがみて、これらのキレート 剤は、イミン複合体を脱安定化しかつマーカー物質を官能的形態で解放させる手 段として、ことに好ましい。有用なキレート剤の代表的リストは、ＥＤＴＡ　（ エチレンテトラミン四酢酸およびその種々の誘導体および類似体ニゲルコン酸； コージ酸；シュウ厳；クアドロール（Ｑｕａｄｒｏｌ）　［Ｎ＋　Ｎ、　Ｎ’　 、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン］　：およびクエン 酸を包含する。

個々の分画からマーカー物質を解放するための選択した手段に付随する注目に値 する特徴は、水性系からその解放された形態で容易に蒸発し、そして引続いて蒸 気の形態で誘導化剤と接触および反応する選択したマーカー物質の能力である。

解放するとき蒸発するマーカー物質の能力は、小さい体積の流体を薄い流体の流 れで使用するとき、ことに有用であり、この流れは解放のときマーカー物質の蒸 発する能力を促進しかつ高める。

あるいは、解放されたマーカー物質を誘発して流体内に残留させかつその蒸発を 防止する手段を、必要に応じて、選択することができる。それにもかかわらず、 後述する装置を使用するとき、複合化した接合体反応成分または結合しない接合 体反応成分の分画からマーカー物質を解放し、こうしてマーカー物質が解放のと き直ちに蒸発し、そして蒸気の形態にとどまるとき、誘導化剤と一緒になるよう にすることは好ましい。

誘導化剤 誘導化剤は、好ましくは固体の基質の表面上に固定化されｔ；、アミン含有化学 的組成物である。そのままで、それは蒸発または流体に溶解した状態の解放され たマーカー物質と結合して、その場で反応生成物を形成することができ、この反 応生成物は引続く結晶の形成および生長のための１系列の核化部位としてはたら く。誘導化剤は、ミクロンまたは１ミクロンより小さい範囲の大きさを有する粒 子の実質的に単分散した系として、固体の基質の表面上に固定化されることが好 ましい。検出のために過飽和溶液と組み合わせて、このような誘導化剤を単分散 した粒子のフィルムとして使用すること、および小さい結晶の同定は、文献に記 号］。こうして、本発明において使用する固定化された誘導化剤は、固きさの粒 子の分散物であり、粒子は好ましくは約０．１μｍ〜１．０μｍの大きさである 。好ましい誘導化剤として有用な組成物の有用であるが、広範ではないリストは 表■内に与えられている。また、認められるように、単一の誘導化剤を、蒸発ま たは流体に溶解した状態の、種々の異なる解放可能なマーカー物質との反応のた めに使用することができ−次いでその各々は選択した誘導化剤と固体の基質表面 上にその場で複数の核化部位を形成することができる。理解されるように、その 場で形成した核化部位はそれら自体結晶であり、これらの結晶は、引続く光学的 に検出可能な結晶の形成および生長のｔ；めの、特有の開始部位としてはたらく 。

誘導化剤を構成する単分散した粒子のフィルムは、誘導化剤の溶液のエアゾール を固体の基質の表面に対して従来知られた方法で向けることによって便利に調製 される。エアゾール中の濃度についである時間にわたって非常に精確なコントロ ールを維持しかつエアゾールの固体の基質の表面への供給速度をコントロールす ることによって、精確にコントロールされた量の誘導化剤を表面上に付着するこ とができる。固体の表面へのエアゾール粒子の満足な付着を得るために、表面を 静電荷の適用および／またはエアゾールの加熱によって処理することがしばしば 望ましい（が必要ではない）。所望の大きさの範囲の粒子でエアゾールを形成す る装置は商業的に入手可能である。

また、誘導化剤をその上に固定化できる固体の基質は種々の異なる形態および形 状に造形できることに注意すべきである。このようにして、種々の装置および物 品を試験キットとして調製することができ、この試験キットは、解放されたマー カー物質との反応のためおよび複数の核化部位のその場での形成のために、記載 した方法で固定化された誘導化剤を使用する。キットの形態に有用な種々の物品 および装置について後述する。

準安定性過飽和（現像剤）溶液 準安定性過飽和（現像剤）溶液は、結晶生長用化学的組成物を過飽和濃度で含有 する水性または非水性の流体であり、この流体は、その過飽和の濃度にかかわら ず定めた時間の間、化学的ｌこおよび物理的に安定である。固体の基質の表面上 の核化部位と一緒にすると、個々の核化部位の各々において結晶化が起こり、光 学的に検出可能な結晶が形成しかつ生長するであろう。好ましい準安定性過飽和 （現像剤）溶液の有用であるが、広範ではないリストは表１に与えられており、 各現像剤溶液は好ましい誘導化剤および解放可能なマーカー物質と相関関係があ る。水性および非水性の流体で準安定性過飽和（現像剤）溶液を調製するための 各化学的組成物の量および各特定の化学的組成物を利用する方法は、この分野に おいて従来知られている。

表Ｉのリストが示すように、準安定性過飽和溶液はほとんど常に組成物の過飽和 溶液であり、この組成物は、事実、マーカー物質と固定化された誘導化剤との組 み合わせによって形成する反応生成物であることは、注目に値する。したがって 、大部分の場合において、その場で形成した核化部位の組成物と、準安定性過飽 和溶液の化学的組成物との間に完全な化学的同一性が存在し、この同一性は結晶 化プロセスの間に個々の核化部位のまわりに物質を結晶化させかつ付着する。あ る場合において、準安定性過飽和溶液の化学的組成物は個々の核化部位と化学的 同一ではないが、十分に類似して結晶化プロセスを誘発する。

固体の基質の表面上で形成しかつ生長した結晶の性質および大きさは、解放され たマーカー物質と固定化された誘導化剤との相互作用Ｉ；よって、その場で最初 に形成した核化部位の数によって直接影響を受けることは注目に値する。比較し て述べると、試験した分離した分画がわずかな量のみのマーカー物質を解放する 場合、比較的わずかの核化部位が固体の表面上に形成する；あるいは、個々の分 離した分画が比較的大きい量のマーカー物質を解放する場合、比例的に大きい数 の個々の核化部位が固体の表面上に決定するであろう。現像剤溶液中の結晶化可 能な化合物の量は、核化部位の数に無関係に、すべての核化部位の間で等しく分 割されるであろうから、形成した核化部位の数は生長した結晶の究極の大きさを 直接決定する。したがって、大きい数の核化部位が存在する場合、現像剤溶液中 で結晶化する化合物の量は大きがずの核化部位にわたって分布し、そして形成し かつ生長する結晶の大きさは比較的小さい。逆に、形成する核化部位の数が比較 的小さい場合、現像剤溶液中の同一濃度の結晶化可能な物質がより小さい数の核 化部位にわたって等しく分布され、これによってより大きい量の物質が各部位に 個々に付着する。これによって、より大きい結晶が形成しかつ生長する。

こうして、準安定性過飽和（現像剤）溶液中の結晶化可能な物質の真の濃度は重 要であり、この濃度は均一でありかっ、個々の核化部位の数が最大であるときで さえ、光学的に検出可能な結晶を生長させるために十分な大きさであるべきであ る。この理由で、準安定性過飽和（現像剤）溶液は、好ましくは、飽和の２〜１ ０倍の濃度範囲で調製される。このような現像剤溶液を均一な準安定性濃度で使 用することによって、急速な結晶の形成および生長は、通常、個々の核化部位と 接触後１または２分で起こる。典型的には、最大の結晶の生長は５〜１０分以内 で得られ、そして６０分以下の時間ですべての面において視的に完全である。ま た、準安定性過飽和（現像剤）溶液と固体の基質の表面上の核化部位との間の相 互作用に影響を及ぼすすべての他の因子はコントロールされることが期待されか つ好ましい。このようにして、物質の付着割合はすべての面において均一であろ う。

物質の付着速度のコントロールは、また、生長した結晶が光学的に検出される能 力に影響を及ぼす。例えば、現像剤溶液から核化部位上への結晶化可能な物質の 急速な付着は、結晶面を不規則な点に向かって構成する傾向がある；これに対し て、結晶化可能な物質のより時間をかけて析出させると、結晶面が本質的に平ら である結晶格子が生成する。光学的に、光は不規則かつ尖った面を有する結晶か らいっそう容易に散乱され、こうして光の散乱効果の結果いっそう「可視」とな る：比較すると、平らな面の結晶格子は光を最小に散乱し、そして肉眼であるい は特定の検出装置を使用して可視化することがいっそう困難である。この理由で 、また、すべての場合において、準安定性過飽和（現像剤）溶液をつくるとき使 用する化学的組成物の濃度は出来るだけ濃くして、個々の核化部位との反応的接 触になったとき、結晶物質の急速な析出を促進することが好ましい。

さらに、再々濃度で調製した過飽和溶液の固有の不安定性のため、現像剤溶液（ ま使用直前に調製することが推奨される。さらに、安定剤、例えば、ポリビニル アルコール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、寒天、ナトリウムカルボキシメ チルセルロース、メチルおよびエチルセルロースなどは、本発明における準安定 性過飽和（現像剤）溶液の有効寿命を延長するために有用でありかつ望ましい。

したがって、実際的事項として、利用可能な２つの調製した試薬を準備すること が便利であり、こらの一方または双方は溶液であり、現場で前もって決定した比 率で混合して準安定性過飽和（現像剤）溶液を形成できる。次いで、この混合し た溶液を固体の基質の表面上の核化部位と一緒にすることができる。

結晶を形成しかつ生長させる効果は、流体試験試料中の問題の被検体の測度であ る、光学的に観測および検出可能な変化を発生する。光学的に検出可能な結晶の 程度は、分離した分画中お反応成分の定性的および／または定量的測度の両者を 提供し、この測度は、順次に、流体試料中の問題の被検体の計算量に相関関係づ けられる。典型的には、ナノグラム／ｍｌの範囲の定性的結果は、記載する方法 で光学的に検出可能な結晶を形成および生長させることによって再現性をもって 得ることができる。

最良の定性的結果のためには、拡散反射を、試験試料中の問題の被検体の量の計 算に間接的補正として利用することが好ましい。

例示的実施塔 ここで前述した化学的成分を利用する検出法を例示するために、ヒト絨毛膜ゴナ ドトロピン（以後ｒｈｃＧＪ）の免疫診断アッセイを詳述する。理解されるよう に、ヒト女性からの尿の試料中のｈＣＧの定量的決定は妊娠の試験として日常的 に利用される。しかしながら、表現的に理解されるように、この実施例は本発明 の応用または範囲の唯一の例示的かつ非制限的実施例である。

反応成分の調製。

この方法を競合結合アッセイにおいて利用し、ここでｈＣＧは問題の被検体であ る；先行技術の文献［カバト（Ｋａｂａｔ）およびマイヤー（Ｍａｙｅｒ）　、 ｐ験免疫化学（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） 　（第２版）、チャールス（Ｃｈａｒｌｅｓ）　Ｃ，トマス（Ｔｈｏｍａｓ）　 ｓイリノイ州スプリングフィールド、１９７１年、１２０ページ］において利用 可能な物質を用いて赤血球に結合しｔ；商業的に入手可能なｈＣＧは配位子類似 体である；そして接合体反応成分は抗絨毛膜ゴナドトロピン抗体（特異的結合相 手）、酢酸第２銅（キレート化可能な金属陽イオン）、およびサリチルアルデヒ ド（解放可能なマーカー物質）からなる。

タイプｌの接合体反応成分は次のようにして調製した：サリチルアルデヒド試薬 は、０．１ｍｌのサリチルアルデヒド［アルドリッヒ・ケミカル・カンパニー（ Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　］を８８０ｍの蒸留水 中に混合しながら溶解することによってつくりだ。この溶液に、５０ｍｇの酢酸 ナトリウム［フィッシャー・サイエンティフィック・カンパニー　（Ｆｉｓｈｅ ｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　］を添加して、ｐＨ５，６を有 する得られる流体試薬を形成した。この溶液は黄色である。このサリチルアルデ ヒド試薬の１．ｍｌに、ウサギにおいてレイズ（ｒａｉｓｅ）　した抗ヒト絨毛 膜ゴナドトロピン抗体の１．０ｍ１（ウサギ抗ｈＣＧ−６，５ｍｇ／ｍｌ、グロ ブリンアッセイによる）を添加した。この流体混合物を３°Ｃで３日間反応させ た。引続いて、この反応混合物を室温にし、そして１．０ｍｌの０．２％の硫酸 第二銅溶液（ｐＨ５，９）をこの流体に添加した。得られる溶液はわずかに濁っ ており、黄色であり、そしてｐＨ５。

７を有した。次いで、この得られる溶液を１時間放置し、その間黄色の沈殿が形 成した。次いで、この溶液を、典型的には１０．０ＯＯＸ重力で３０分間、遠心 し、そして上澄みを除去した。この上澄み分画は銅安定化されたサリチリデン／ 抗ヒト絨毛膜ゴナドトロピンイミン複合体を含有し、次いでこの複合体を次の方 法で精製した。

上澄みの２．２ｍｌに、１．１ｍｌの８％のトリス（ＴＲＴＳ）［）リス−（ヒ ドロキシメチル）−アミノメタン、ＩＣＮ　ニュートリショナル・バイオケミカ ルス・カンパニー　（Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｃ ｏｍｐａｎｙ）　］を添加した。次いで、４ｃｍ”のセファクリル（Ｓ　ｅｐｈ ａｃｒｙｌ）　Ｓ　−２００カラムＦフアーシア・コーポレーション（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）　］を使用し、溶離剤として０．００１ モルのＣｕＣ］□を含有する０、１モルのトリス緩衝液、ｐＨ７，４，［マリン クロット・ケミカル・カンパ、＝、　−（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　］　を使用して、この流体混合物を精製した。溶 離の間、■系列の０．５ｍｌの流体分画を集め、２８０ｎｍにおいて紫外線吸収 を示す分画を所望蛋白質分画を含有するものとして同定した。蛋白質に基づく収 率は６９％であった。この方法において得られた精製した接合体反応成分は、分 析すると、ウサギ抗ヒト絨毛膜ゴナドトロピンの１分子につき４分子のサリチル アルデヒドを含有することがわかった。

固定化された誘導化剤は次のようにして調製し？＝＝２．５ｇの全標識等級のセ ミカルバジド塩酸塩（アルドリッヒ・ケミカル・カンパニー）および２．５ｇの シュウ酸アンモニウム（マリンクロット・ケミカル・カンパニー）を、１０ｍ１ の蒸留水中に溶解した。次いで、この溶液を、撹拌しながら、２４０ｍ１のメタ ノール中に溶解して、ｐＨ３，７を有する流体を生成した。このセミカルバジド 塩酸塩の溶液を５ｍｌのフッ化ポリエチレン／ポリプロピレンポリマー、固体の 基質、へ適用した。このセミカルバジド塩酸塩溶液は、好ましくは、流体アトマ イジング用エアゾール発生器［エンバイロメンタル・リサーチ・コーポレーショ ン（Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔ、１１　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ）　］に適用し、この発生器は次のようにセットされていた：空気圧−３８：ア トマイジング化−９０；希釈−６０：およびエアゾール放出管、この管は長さ４ ５”、直径１″であり、モして３Ｘ０．２５”の開口を含有した。エアゾールは 被覆の間１１０℃に加熱した。エアゾールの放出速度は、典型的には、約６”／ 分〜１５”７分の範囲であった。この固体の基質の表面上で固定化された誘導化 剤としてはたらくセミカルバジド塩酸塩の粒子は、約０゜４μｍ〜約０．６μｍ の範囲の大きさであった。

準安定性過飽和（現像剤）溶液は次のようにして調製した：不安定性を回避する ため、使用直前に２つの異なる流体を混合して過飽和現像剤溶液を形成すること によって、この現像剤溶液を調製した。１０ｍ１の蒸留水中の１０ｇの水溶性ゼ ラチン［キング・アンド・ノックス・カンパニー（Ｋｉｎｇ　ａｎｄ　Ｋｎｏｘ 　Ｃｏｍｐａｎｙ）　］に、Ｑ、２ｍｌのサリチルアルデヒド（アルドリッヒ・ ケミカル・カンパニー）を添加することによて、流体Ａを調製した。１０ｍ１の 蒸留水中にＯ，１５ｇのセミカルバジド塩酸塩（アルドリッヒ・ケミカル・カン パニー）を溶解することによって、流体Ｂを調製した。流体Ａおよび流体Ｂは、 それぞれ、延長した期間の間安定にとどまった。準安定性過飽和（現像剤）溶液 を使用において必要なとき、等しい量の流体Ａおよび流体Ｂを一緒にして、サリ チルアルデヒドセミカルバゾンからなる有用な現像剤溶液を直ちに形成した。こ の現像剤溶液はその形成後すみやかに使用する。

例示のプロトコール この競合結合アッセイを実施するための好ましいプロトコールは次の通りである ： ｌ１次の成分を試験管に添加する： １００〜２００μｌの接合体反応成分；１００〜２００μｍの０．１５モルのホ ウ酸塩リン酸塩緩衝液　ｐＨ６，０； １００〜２００／１１の流体試験試料、典型的にはｈＣＧを含有すると信じられ る尿； ３５０〜６００μｌの、前述の方法でｈＣＧと前もって反応させた、安定化され たヒツジ赤血球の懸濁液の０．５％の懸濁液。

２、この反応混合物をおだやかに混合し、そして室温において１〜２時間の間混 乱させないで放置した。

３、この反応期間の終りに、反応混合物を評価して、凝集が起こったかどうかを 決定した；したがって、反応混合物を次いで２０００Ｘ重力でほぼ１０分間遠心 した。

４、上澄みを取り出し、そして約１００ｍｇのクエンン酸を含有する清浄な試験 官に移した；次いでこの流体混合物を手でおだやかに混合した。

５、次いで、固体の基質上に前もって固定化した誘導化剤を試験管の流体と一緒 にし、そして試験管の上部をバラフィルムで密閉した。パラフィルムによる密閉 は、蒸発したマーカー物質、解放されたサリチルアルデヒド、が消散するのを防 止するであろう。

６、室温で５〜３０分間インキュベーションした後、固体の基質を取り出し、次 いで固体の基質の表面を覆うために十分な体積の新しく調製した準安定性過飽和 （現像剤）溶液中に浸漬した。この浸漬は５〜ｌＯ分間続けた。

７、固体の基質を現像剤溶液から取り出し、そして肉眼に可視の光学的に検出可 能な結晶のフィルムが観察された。形成した結晶の存在は、尿の試料中のｈＣＧ の存在を定性的に示す；固体の基質の表面上の結晶化したフィルムの不透明性の 測定は、前もって決定した、標準化した量のｈＣＧに対して関係づけられ、こう して、必要に応じて、定量的結果を提供する。

新規な検出法を利用する試験キット 流体試料中に存在すると信じられる１種または２種以上の問題の被検体の検出の ため、種々の試験キットを前もって調製できることが期待されかつ意図される。

理解されるように、流体試料は任意の源（ヒト、動物、飲料水など）から得るこ とができ、そして、事実、定性的および／または定量的検出を目的として、不活 性坦体上に所望の被検体が固定化され、あるいは可溶化されている、製造した流 体調製物であることができる。検出すべき問題の被検体が溶解し、懸濁し、ある いは不活性坦体により支持されるという基準を満足するかぎり、被検体の真の化 学的組成および／または構造の向きは無関係である。

こうして、流体試料中の問題の被検体を検出するための試験キットは次のものか らなる＝（ａ）問題の被検体に対して特異的な結合相手、この結合相手は反応に 有効な少なくとも１つのアミノ基を有する、（ｂ）キレート化可能な金属陽イオ ン、および（ｃ）反応に有効な少なくとも１つのカルボニル基を有する解放可能 なマーカー物質、からなる接合体反応成分；流体試料を接合体反応成分と反応混 合物として一緒にする手段：反応混合物の生成物を個々の分画に分離する手段； 結合したおよび結合しない接合体反応成分からマーカー物質を解放する手段：複 数の核化部位がその場で形成するように、解放されたマーカー物質と一緒にする ことができる固定化された誘導化剤、この誘導化剤は固体の基質の表面上に固定 化されている；および、好ましくはアッセイの時現場で調製される、準安定性過 飽和（現像剤）溶液。

上に記載したキット装置において、固体の基質の表面上に固定化された誘導化剤 は、ｈＣＧを検出するために例示的実施例に記載した概念に基づいて、ディツプ スチックの形態を取ることができる。このようなディツプスチックは、それぞれ 、第４図、第５図および第６図に示されている。これらの実施態様の各々の間の 主な差は、使用する誘導化剤の濃度、および面積の平方単位当りの粒子の数の関 数として、誘導化剤の分布である。したがって、第４図に見られるように、誘導 化剤は固体の基質１４の表面１２の全体にわたって、均一に分散した粒子として 分布している；精確な寸法を変更してユーザーの要求または便利さを満足させる ことができるが、重要な特徴は表面積の全体にわたって分散が均一であるという ことである。結局、解放されたマーカー物質は誘導化剤の粒子１０と接触するよ うになるとき、核化部位の均一な系列がその場で形成し、その濃度および密度は 固体１４の表面１２にわたって一定するであろう。

別の実施態様 あるいは、第５図および第６図の実施態様は流体試料中の問題の被検体の濃度に 関して定量的データを提供する。これらの実施態様において、誘導化剤ＩＯは、 それぞれ、離散したブロック２２．２４、および２６として適用され、それらの 各々は同−表面積内で絶えず増加する濃度の誘導化剤を含有する。第５図に示す 実施態様は、１系列の離散したブロックとして、増加する濃度の固定化された誘 導化剤を示す；これに比べて、第６図の実施態様は連続的に変化する密度勾配の 固定化された誘導化剤を提供し−ここでゾーン３０における濃度は定量的に最低 であり、次いで絶えず増加する濃度のゾーン３２．３４．３６．３８、および４ ０が続き、最後に誘導化剤の最大の密度および濃度がゾーン４２において得られ る。解放されたマーカー物質がこれらのゾーンにおける固定化された誘導化剤と 接触するようになると、複数の核化部位は増加する密度の誘導化剤の方向に形成 するであろう。したがって、解放されるマーカー物質が多くなると、化学的に反 応して核化部位をその場で形成するであろう誘導化剤の密度は大きくなる。解放 されたマーカー物質のすべてが完全に反応しかつ消費されると、要求する密度よ り大きい密度である固定化された誘導化剤の部分は余分であろう。その結果、現 像剤溶液を添加するとき、核化部位が形成したゾーンにおいてのみ、結晶化は起 こるであろう。このようにして、解放されたマーカー物質の量が大きくなると、 反応する誘導化剤のゾーンは大きくなりかつ結晶化の表面積は太き本発明の方法 を実施するための好ましいキットは、それぞれ、第７ａ図〜第７ｅ図に示されて いる。第７ａ図において見られるように、４つの明確な室を有する調製した物品 の形態のキットがユーザーに提供される。

それぞれ、個々の室１，２．３および４は、第７ｂ図に示すように、互いに対し て制限された入口（ａｃｃｅｓｓ）を有する。したがって、室ｌは導管６０を経 て流体試料の導入のための入口を提供する。出口の通路６２は流体を室ｌから室 ２の内部に流入させる。同様に、出口通路６６は室２内の流体または蒸気を、妨 害なしに、室４の一方の端へ直接流入させる。最後に、流路６４は流体を室３か ら室４の他方の端へ、同様によく、導入する。

それぞれの室１，２．３および４の各々は次の方法で使用することを意図する。

試験キットは全体として特定の問題の被検体、例えば、ｈｃＧを検出するために 特別に調製される。室ｌは配位子類似体−この場合において、既知の限定された 濃度のｈＣＧ分子−をその内表面上に固定化して有する。さらに、室ｌは接合体 反応成分を乾燥した形態で含有し、この接合体反応成分はｈＣＧのための特異的 結合相手、キレート化可能な金属陽イオン、および例示的実施例において前述し たように調製された解放可能なマーカー物質からなる。室２はマーカー物質を調 製された乾燥状態で解放する手段を含有する；解放手段の好ましい例は、乾燥し たまたは凍結乾燥した粉末として、制限された濃度のクエン酸であろう。

室３は選択の準安定性過飽和（現像剤）溶液を含有し、それは、好ましくは、室 ３の中に試験の時においてのみ導入される。室４は、実際には、第４図、第５図 および第６図に前に示したディツプスチックの小型の実施態様であり、これは既 知量の固定化された誘導化剤を含有する。次いで、本発明を構成する操作工程の 順序は、それぞれ、第７ｃ図、第７ｄ図および第７ｅ図において矢印によって示 されている。問題の被検体ｈＣＧを含有することが疑われる試験流体を導管６０ を経て室ｌの中に導入し、これによってその中に含有される接合体反応成分を可 溶化する。競合結合反応は室１内で起こり、これを前もって決定した時間の間連 続させる。

ここの前述した競合結合反応のすべては、室ｌの内部で起こる。計画した反応時 間が経過したのち、反応の流体を流路６２を通して、クエン酸、マーカー物質の 解放手段、を含有する室２の内部に、物理的に絞り入れる。このモードにおいて 、このようなマーカー物質は、室２内のクエン酸によって解放されるとき、蒸発 し、モして流路６６を経て室４の一方の端の中に運ばれる。蒸気の形態の解放さ れたマーカー物質の移送は前もって決定した時間、典型的には数分、にわたって 発生させる。これにより、室４内で核化部位が形成する。引続いて、準安定性過 飽和（現像剤）溶液を室３中に導入し、順次に流路６４を通して室４の中にその 他方の端において絞り導入する。現像剤溶液を室４の表面積の全体にわたって流 れさせ、そしてこれは固定化された誘導化剤と蒸発したマーカー物質との反応に よって前に形成した核化部位上の結晶の形成を開始させるであろう。はぼ１０分 の期間後、過剰の現像剤溶液を室４から除去する。

形成し生長した結晶の存在は、５〜１０分後、肉眼で検出できる。光学的に検出 可能な結晶の存在は、多少のｈＣＧが流体試験試料中に存在したという定性的速 度である；生長した結晶の不透明性は、結晶が室４内で上方に向かって伸びると き、試験現場において存在するｈＣＧの量の定量的速度を提供する。

本発明は、限定された形態でなくかつ添付した請求の範囲によって以外限定され ない。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、工程： （ａ）問題の被検体に対して特異的な結合相手、前記結合相手は反応に有効な少 なくとも１つのアミン基を有する、（ｂ）金属陽イオン、 （ｃ）反応に有効な少なくとも１つのカルボニル基を有する解放可能なマーカー 物質、 からなる接合体反応成分を準備し、 前記特異的結合相手および前記金属陽イオンおよび前記解放可能なマーカー物質 は結合して接合体を形成しており、問題の被検体が前記接合体反応成分の少なく とも一部に結合して被検体複合生成物を形成するように・流体試料を前記接合体 反応成分と一緒にし、 前記被検体複合生成物を前記接合体反応成分の結合しない部分から個々の分画と して分離し、 前記被検体複合生成物の分画および前記結合しない接合体反応成分の分画から成 る群より選択される分離した分画の少なくとも１つから前記マーカー物質を解放 し、 複数の核化部位がその場で形成するように、前記解放されたマーカー物質を固定 化された誘導化剤と一緒にし、前記誘導化剤は固体の基質の表面上に固定化され ており、 複数の光学的に検出可能な結晶が形成するように、前記核化部位を準安定性過飽 和溶液で処理し、そして 前記形成した結晶の存在を光学的に検出し、前記結晶は流体試料中の問題の被検 体の測度である、 を含んでなる流体試料中の問題の被検体を検出する方法。 ２、工程： 問題の被検体に類似する配位子を準備し、（ａ）問題の被検体および前記配位子 類似体に対して特異的な結合相手、前記結合相承は反応に有効な少なくとも１つ のアミン基を有する、（ｂ）金属陽イオン、 （ｃ）反応に有効な少なくとも１つのカルボニル基を有する解放可能なマーカー 物質、 からなる接合体反応成分を準備し、 前記特異的結合相手および前記金属陽イオンおよび前記解放可能なマーカー物質 は結合して接合体を形成しており、問題の被検体が前記接合体反応成分の少なく とも一部に結合して被検体複合生成物を形成しかつ前記接合体反応成分の残部が 結合しないままであるように、流体試料を前記接合体反応成分と一緒にし、前記 配位子類似体が、このような結合しない接合体反応成分が流体試料中に存在する とき、それと結合して、配位子複合生成物を形成するように、前記配位子類似体 を流体試料に添加し、前記被検体複合生成物を前記配位子複合生成物から個々の 分画として分離し、 前記被検体複合生成物の分画および前記配位子複合生成物の分画から成る群より 選択される分離した分画の少なくとも１つから前記マーカー物質を解放し、 複数の核化部位がその場で形成するように、前記解放されたマーカー物質を固定 化された誘導化剤と一緒にし、前記誘導化剤は固体の基質の表面上に固定化され ており、 複数の光学的に検出可能な結晶が形成するように、前記核化部位を準安定性過飽 和溶液で処理し、そして 前記形成した結晶の存在を光学的に検出し、前記形成した結晶は流体試料中の問 題の被検体の測度である、 を含んでなる流体試料中の問題の被検体を検出する方法。 ３、工程： （ａ）問題の被検体に類似する配位子、前記配位子類似体は反応に有効な少なく とも１つのアミン基を有する、（ｂ）金属陽イオン、 （ｃ）反応に有効な少なくとも１つのカルボニル基を有する解放可能なマーカー 物質、 からなる接合体反応成分を準備し、 前記配位子類似体および前記金属陽イオンおよび前記解放可能なマーカー物質は 結合して接合体を形成しており、前記配位子類似体および問題の被検体のための 結合相手を準備し、問題の被検体の少なくとも−部が前記特異的結合相手に結合 して結合して被検体生成物を形成しかつ前記特異的結合相手の残部が結合しない ままであるように、流体試料を前記特異的結合相手と一緒にし、前記特異的結合 相手の結合しない部分が前記接合体反応成分の少なくとも−部に結合して配位子 複合生成物を形成するように、前記接合体反応成分を流体試料に添加し、ここで 前記接合体反応成分の残部は結合しないままであり、 前記配位子複合生成物を前記結合しない接合体反応成分から個々の分画として分 離し、 前記配位子複合生成物の分画および前記結合しない接合体反応成分の分画から成 る群より選択される分離した分画の少なくとも１つから前記マーカー物質を解放 し、 複数の核化部位がその場で形成するように、前記解放されたマーカー物質を固定 化された誘導化剤と一緒にし、前記誘導化剤は固体の基質の表面上に固定化され ており、 複数の光学的に検出可能な結晶が形成するように、前記核化部位を準安定性過飽 和溶液で処理し、そして 前記形成した結晶の存在を光学的に検出し、前記形成した結晶は流体試料中の問 題の被検体の測度である、 を含んでなる流体試料中の問題の被検体を検出する方法。 ４、前記配位子類似体を流体試料に前記接合体反応成分と同時に添加する請求の 範囲第２項記載の検出法。 ５、前記特異的結合相手を反応混合物に前記接合体反応成分と同時に添加する請 求の範囲第３項記載の検出法。 ６、前記結晶の検出は問題の被検体の定性的測度である請求の範囲第１、２また は３項記載の検出法。 ７、前記結晶の検出は問題の被検体の定量的測度である請求の範囲第１、２また は３項記載の検出法。 ８、前記配位子類似体は、アミノ酸、ポリペプチド、蛋白質およびそれらの誘導 体から成る群より選択される請求の範囲第１、２または３項記載の検出法。 ９、前記特異的結合相手は、ポリペプチド、蛋白質およびそれらのそれぞれの誘 導体から成る群より選択される請求の範囲第１、２または３項記載の検出法。 １０、前記配位子類似体は、抗原、ハプテン、酵素、抗体、抗体断片、酵素基質 および酵素コファクターから成る群より選択される請求の範囲第１、２または３ 項記載の検出法。 １１、前記特異的結合相手は、抗原、ハプテン、抗体、抗体断片、酵素、酵素基 質および酵素コファクタ−から成る群より選択される請求の範囲第１、２または ３項記載の検出法。 １２、前記解放可能なマーカー物質は、アルキル化合物、アリール化合物、芳香 族化合物および脂肪族化合物から成る群より選択される請求の範囲第１、２また は３項記載の検出法。 １３、前記解放可能なマーカー物質は、サリチルアルデヒド、４−クロロサリチ ルアルデヒド、５−クロロ−サリチルアルデヒド、４．６−ジメチルサリチルア ルデヒド、３−エトキシ−サリチルアルデヒド、３−フルオロ−サリチルアルデ ヒド、４−メトキシ−サリチルアルデヒド、５−メチルサリチルアルデヒド、５ −スルホ−サリチルアルデヒド、２−ヒドロキシ−１−ナフトアルデヒド、２− ヒドロキシ−３−ナフトアルデヒド、２−ヒドロキシ−シンナムアルデヒド、ピ リドキサール、２−チオフェンアルデヒド、ビロールアルデヒド、４−ヒドロキ シニコチンアルデヒド、３−ヒドロキシイソニコチンアルデヒドから成る群より 選択される請求の範囲第１、２または３項記載の検出法。 １４、前記固定化された誘導化剤は、前記解放可能なマーカー物質とイミンを形 成できる組成物である請求の範囲第１、２または３項記載の検出法。 １５、前記誘導化剤は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド、サリチルヒドラジ ド、ニコチン蕨ヒドラジド、２，４−ジニトロフェニルヒドラジド、ｐ−カルボ キシフェニルヒドラジン、セミカルバジドから成る群より選択される請求の範囲 第１、２または３項記載の検出法。 １６、前記準安定性過飽和溶液は、前記解放されたマーカー物質および前記誘導 化剤の反応生成物に同−の組成物である請求の範囲第１、２または３項記載の検 出法。 ｉ７、前記準安定性過飽和溶液は、サリチルアルデヒド−ｐ−ヒドロキシ安息香 酸ヒドラゾン、４−クロロ−サリチルアルデヒド−ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒド ラゾン（サリチルアルデヒド−ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラゾン、５−クロロ −サリチルアルデヒド−ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラゾン、４，６−ジメチル −サリチルアルデヒドサリチルヒドラゾン、３−エトキシ−サリチルアルデヒド サリチルヒドラゾン、３−フルオロ−サリチルアルデヒドサリチルヒドラゾン、 ４−メトキシ−サリチルアルデヒドニコチン酸ヒドラゾン、５−スルホ−サリチ ルアルデヒドニコチン酸ヒドラゾン、２−ヒドロキシ−１−ナフトアルデヒド２ ，４−ジニトロフェニルヒドラゾン、２−ヒドロキシ−３−ナフトアルデヒド２ ，４−ジエトロフェニルヒドラゾン、２−ヒドロキシシンナムアルデヒド−ｐ− カルボキシフェニルヒドラゾン、ピリドキサール−ｐ−カルボキシフェニルヒド ラゾン、２−チオフェン−アルデヒド−ｐ−カルボキシフェニルヒドラゾン、ピ ロールアルデヒドーセミカルバゾン、４−ヒドロキシニコチンアルデヒドーセミ カルバゾン、３−ヒドロキシーイソニコチンアルデヒドーセミカルバゾンから成 る群より選択される請求の範囲第１、２または３項記載の検出法。 １８、前記マーカー物質の解放はｐＨの減少によって達成する請求の範囲第１、 ２または３項記載の検出法。 １９、前記マーカー物質の解放は加熱によって達成する請求の範囲第１、２また は３項記載の検出法。 ２０、前記マーカー物質の解放はキレート剤の添加によって達成する請求の範囲 第１、２または３項記載の検出法。 ２１、前記マーカー物質の解放は酵素的加水分解によって達成する請求の範囲第 １、２または３項記載の検出法。 ２２、前記ｐＨの減少は酸の添加によって起こる請求の範囲第１８項記載の検出 法。 ２３、前記酸は有機酸および金属酸から成る群より選択される請求の範囲第２２ 項記載の検出法。 ２４、前記方法は免疫診断アッセイである請求の範囲第１、２または３項記載の 検出法。 ２５、前記方法は環境的アッセイである請求の範囲第１、２または３項記載の検 出法。 ２６、前記方法は分析的生化学的アッセイである請求の範囲第１、２または３項 記載の検出法。 ２７、構成成分： （ａ）問題の被検体に対して特異的な結合相手および問題の彼検体に類似する配 位子、前記結合相手は反応に有効な少なくとも１つのアミン基を有する、 （ｂ）金属陽イオン、 （ｃ）反応に有効な少なくとも１つのカルボニル基を有する解放可能なマーカー 物質、 からなる接合体反応成分、 前記特異的結合相手および前記金属陽イオンおよび前記解放可能なマーカー物質 は結合して接合体を形成している、問題の被検体に対する前記接合した反応成分 の少なくとも一部および前記接合体反応成分の残部が結合しないままであるよう に、流体試料および前記接合体反応成分を一緒にする手段、前記結合した接合体 反応灰分および結合しない接合体反応成分を別々の分画に分離する手段、 前記結合し接合した反応成分の分画および前記結合しない接合した反応成分の分 画から成る群より選択される前記分離した分画の少なくとも１つから前記マーカ ー物質を解放する手段、複数の核化部位がその場で形成するように、前記解放さ れたマーカー物質と一緒にするための固定化された誘導化剤、前記誘導化剤は固 体の基質の表面上に固定化されている、および複数の光学的に検出可能な結晶が 形成するように、前記形成した核化部位を処理するための準安定性過飽和溶液、 前記検出可能な結晶の存在は流体試料中の問題の被検体の測度である、を含んで なる流体試料中の問題の被検体を検出ための試験キット。 ２８、問題の被検体に類似する配位子をさらに含む請求の範囲第２７項記載の試 験キット。 ２９、構成成分： （ａ）問題の被検体に類似する配位子、前記配位子類似体は反応に有効な少なく とも１つのアミン基を有する、（ｂ）金属陽イオン、 （ｃ）反応に有効な少なくとも１つのカルボニル基を有する解放可能なマーカー 物質、 からなる接合体反応成分、 前記配位子類似体および前記金属陽イオンおよび前記解放可能なマーカー物質は 結合して接合体を形成している、前記配位子類似体に対して特異的でありかつ前 記問題の被検体に対して特異的である結合相手、 前記特異的結合相手の少なくとも一部が前記接合体反応成分と結合して配位子複 合生成物を形成しかつ前記接合した反応成分の一部が結合しないままであるよう に、前記流体試料および前記接合した反応成分および前記特異的結合相手を反応 混合物として一緒にするための手段、前記配位子複合生成物および結合しない接 合した反応成分を別々の分画に分離する手段、 前記配位子複合生成物の分画および前記結合しない接合体反応成分の分画から成 る群より選択される前記分離した分画の少なくとも１つから前記マーカー物質を 解放する手段、 複数の核化部位がその場で形成するように、前記解放されたマーカー物質と一緒 にできる固定化された誘導化剤、前記誘導化剤は固体の基質の表面上に固定化さ れている、および 複数の光学的に検出可能な結晶が形成するように、前記形成した核化部位を処理 するための準安定性過飽和溶液、前記検出可能な結晶の存在は流体試料中の問題 の被検体の測度である、を含んでなる流体試料中の問題の被検体を検出ための試 験キット。