JPS60178357A - リガンドのアツセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアッセイおよびそのアッセイに用いられる製品
に関−づ−る。より詳細には本発明はハプテン、抗原ま
たは抗体のアッセイに関する。

試料中の種々のりガント（被分析体）のアッセイは当技
術分野で知られている。ある型のアッセイにおいては被
分析体および（票識された形の被分析体（トレーサー）
がトレーサーおよび被分析体に対し特異的な結合剤（た
とえば抗体）上の限られた数の納会部位に対して競合す
る。結合剤に結合するトレーザーの用は試料中の被分析
体の敏に反比例′する。結合剤に結合しているトレーサ
ー（結合分）は結合剤に結合していないトレーサー（遊
離分）から分離され、試料中の被分析体の量は結合分お
よび／または遊離分中のトレーサーの量を、既知肝の被
分析体ケ含む試料をアッセイに用いて借られた標準曲線
の使用により測定することによって判定１−ることかで
きる。

多くの場合、アッセイすべき被分・グ「体ヲき有する試
料には、試料中に残存する遊離トレーサー分中のトレー
サーの量の測定を妨げると思われる物置が含まれる。た
とえば螢光標識を含有するトレーサーを用いるアッセイ
の場合、被分析体を含有する血清試料には一般にバック
グラウンド螢光が含まれる。このバックグラウンド螢光
は血清試料中に遊離分として残存するトレーサーの量ヲ
適正に測定する性能を妨げるであろう。これはアッセイ
の正確度および精度を損う可能はがある。

本発明の一観点によれば、試料中の被分析体のアッセイ
における改良法が提供され、その際アッセイ処理に際し
て試料中に可溶性結合剤に結合したトレーサー（結合ト
レーサー）および結合剤に結合していないトレーサー（
遊離トレーサー）の混合物が生成される。本発明の一観
点によれば、結合トレーサーと遊離トレーサーの混合物
？含有する試料を寸ず支持された第１結合剤と接触させ
、次いでこの試料を支持された第１結き剤から分離′し
、分離された試料を支持された第２結合剤と接触させ、
そして試料を支持された第２結合剤から分離し、その際
支持された第１および第２結ば剤のうちの一方はトレー
サーに対する結合剤であり、第１および第２トレーサー
のうちの他方は６■溶性結合剤に対する結合剤であり、
これにより結ハトレーザーおよび遊離トレーサーの双方
が試料から分離される。この方法で結合トレーサーおよ
び遊離トレーサーの双方を試料から分離して測定でき、
分離された結合トレーサーおよび遊離トレーサーのうち
少なくとも一方、奸才しくけ双方を試料中の被分析体の
尺度として用いることができる。

より詳細には、−アッセイ法によれば被分析体を含有す
る試料をトレーサーおよびトレーサーに対する可溶性結
合剤と共にインキュベートして、遊離トレーサーと可溶
性結合剤に結合したトレーサーの混合物を生成させる。

インキュベートした試料を次いで固体支持体上に支持さ
れた第１結合剤と接触させ（この第１結合剤は町溶性結
汗剤に対する結合剤である）、これにより可溶性結合剤
に結合したトレーサーの複合体を結ばさせる。こうして
、結合トレーサーは試料から除かれる。次いで試料を支
持された第１結合剤から分離したのち、試料を固体支持
体上に支持された第２結合剤と接触させ（この第２結合
剤はトレーサーに対する結合剤である）、これにより試
料中に残存する０離トレーサーを支持された第２結合剤
と結合さぜる。試料を支持された第２結合剤と分離した
のち、結合した画分中のトレーサー（可溶性結合剤を介
して支持された第１結合剤に結合したトレーサー）およ
び遊離トレーサー（直接に、支持された第２結合剤に結
合したトレーサー）の累ヲ試ネ」中の被分析体の尺度と
して測定することができる。

たとえばそれぞれのトレーサー量を測定するために、結
合トレーサーおよび遊離トレーサーをそれぞれ支持され
た第１結合剤および支持された第２結合剤から溶離する
ことかできる。

あるいは上記の方法において、試料をまず支持された第
２結合剤と接触させ、次いで支持された第１結合剤と接
触させることもできる。

他の方法によれば、本発明のアッセイｆ；！０：複数の
抗原決定部位ないしは結合部位をもつ抗原の測定に用い
ることができる。このようなアッセイ法においては、複
数の結合部位をもつ抗原（被分析体）を含有する試料を
、適宜なマーカーで標識された、該抗原に対する結合剤
の形のトレーサーと接触させる。この接触の結果、試料
は結合トレーサー（抗原に結合した標識された結合剤の
複合体）および遊離トレーサー（抗原に結合していない
標識された複合体）を含有することとなる。

次いで上記混合物を、抗原に対する結合剤であ・　る支
持された第１結合剤と接触させ、これにより結合トレー
サー（標識された結合剤に結合した抗原の複合体）￥支
持された第１結合剤に結合させる。次いで試料を支持さ
れたｇ１１結剤から分力「し、次いでこの分離した試料
をアッセイに用いた標識結合剤に対する結合剤である支
持された第２結合剤と接触させ、これにより遊離トレー
サー（インキュベートした試料中の結合していふい標識
された結合剤）を支持された第２結合剤に結合させる。

こうして遊離トレーサーおよび結合トレーサーの双方を
試料から分離させる。次いで遊離トレーサーおよび結合
トレーサーを試料中の被分析体（複数の結合部位をもつ
抗原）の尺度として測定することができる。

特に好ましい実施態様によれば、トレ−サーは抗原の抗
原決定部位ないしは結合部位の１つに対する標識された
モノクローナル抗体であり、支持された第１および第２
結合剤のうちの一方は抗原（被分析体）捷たけその適宜
な同族体であり（好１しくけ支持された第１結合剤）、
支持された第１および第２結合剤のうちの他方は抗原の
他の決定因子ないしは結合部位に対するモノクローナル
抗体である。このような実施、暢様においてに、遊離ト
レーサー（結合していない標識されｆｃモ／クローナル
抗体）は、支持された被分析体（または支持されたその
適宜な同族体）に結合させることにより試料から分＝ｔ
＋され、結合ｌ・レーサー（被分析体に結合した標識さ
れたモノクローナル抗体の複合体）は複合体を抗原の１
山の抗原決定部位に対する支持されたモノクローナル抗
体に結合させることにニジ試料から分離される。こうし
て結合トレーサーおよび遊離トレーサーの双方をアッセ
イ試料から分離し、アッセイ試料から分離された状態で
測定することかで゛きる。

従って上記から明らかなように本発明は、アッセイ系に
おいて形成された結合トレーサーおよび非結合トレーサ
ー（遊離トレーサー）がそれぞれ別個に、支持された結
合剤に結合し、第１結合剤および第２結合剤のうちの一
方が結合トレーサーを結合する機能を−もち、支持され
た第１および第２結合剤のうちの他方が遊離トレーサー
に結合する機能をもち、これによりアッセイ系において
形成された結合トレーサーおよび遊離トレーサーの割合
をアッセイ還境とは無関係な別個の環境中で決定するこ
とができる限り、各種のアッセイ法に適用することがで
きる。

本発明のアッセイにおいて、固体支持体に支持された第
１および第２結舒剤はアッセイ法により決定される。た
とえば第１結合剤が抗原またはノ・ブテン（結合した複
合体または遊４（ｔの状態のいずれで存在するにしても
）に特異的である場合、結舒剤はこの１重の抗原まｆｃ
はノ・ブテンに対する天然の結合剤または抗体であって
よい。支持された第１または第２結合剤が抗体に対し特
異的な結ば剤である場合、この種の結合剤は抗体に対し
免俊特異性をもつ抗原もしくはノ・ブテンであるか、ま
たは結合すべき抗体に応答して誘導された抗体であるか
、または抗体に対し特異的な物質（たとえば抗体のＦｃ
断片に選択的に結合する蛋白質Ａ）であってもよい。本
発明のアッセイにおける支持された第１および第２結合
剤として用いるのに適した結合剤の選択は、本明細、廁
の開示から当業者がなしつる範囲にあると思われる。

支持された第１および第２結合剤は、結合剤をアッセイ
溶媒に溶解しない谷、１重のｌｉ！ＬＩ体支持体に支持
させることによって製造できる。各結合剤に用いられる
固体支持体（・ゴ異なるかまたは同一の支持体である。

当技術分野で知られるように、この種の支持体には適切
なポリマー、たとえばポリスチレン、ポリエチレン、ポ
リプロピレン、ポリテトラクロルエチレン、ポリアミド
、ポリアクリルアミド、架橋したアガロース、デキスト
ランなど；ガラス、細菌細胞、イオン交換樹脂；綿（米
国特許第４，２００，６２５号明細書に記載したもの八
および米国特許第４，０５９，６８５号明細：書に記載
した種類の支持体が含まれる。本発明の範囲はいずれか
の特定の型の支持体に限定されるものではなく、第１お
よび第２結合剤ケ支持するために用いられる適切な支持
体の選択は本明細跡の開示から当業者がなしうる範囲内
にあると思われる。

同様に結合剤を固体支持体に支持する方法は、当技術分
野で一般に知られており、本発明は結合剤を固体支持体
に支持させるためのいかなる方法にも限定されるもので
はない。たとえば焔技術分野で知られるように結合剤を
固体支持体に吸着、共有結合などにより支持させること
ができる。

また支持体は固体粒子、試・横管、光実シートなどを廿
む多種多様な形状であってよい。特に好ましい実施態様
によれば、支持された第１および第２支持体をそれぞれ
第１および第２貫流室フロースルー室、ｆ］、ｏｗｔｈ
ｒｏｕｇｈ　ｃｈａｍｂｅｒ内の固体支持体に支持させ
、これにより試料を第１および第２結合剤を入れた第１
室および第２室に順次流通させることができる。適切な
貫流室の代表例は米国特許第４，０５９，６８５号明細
、書に記載されている。

アッセイに用いられるトレーサーは本方法で測定される
べき被分析体に応じて定められる。たとえば被分析体が
抗原である場合、トレーサーは適切なマーカーで標識さ
れた抗体であってもよく、適切なマーカーで標識された
′抗原もしくはその抗原の適宜な同族体（適宜な同族体
とは抗原に対づ−る結合剤が結合している同族体を意味
する）であってもよい。被分析体がハプテンである場合
、トレーサーは適切なマーカーで標識されたハプテンま
たはその適宜な同族体であってもよい。被分析体が抗体
である場合、トレーサーは適切なマーカーで標識された
抗原もしくは結合性ハプテンであるか、または適切なマ
ーカーで標識された被分析体に応答して誘発された抗体
であってもよい。

トレーサーの製造に用いられるマーカーは多種多様なマ
ーカーのいずれであってもよく、これには放射性マーカ
ー、吸収性色素系マーカー、螢光マーカー、酵ｉ系マー
カー、化学ルミネセンスマーカーなどが含まれる。この
種のマーカーは当技術分野で既知であり、この腫のマー
カーをトレーサーのリガンド部分に結合させる方法も当
技術分野で既知である。

本発明は螢光トレーサーを用いるアッセイにおいて血清
試料のバックグラウンド螢光が特に問題を生じていたと
いう点を解消するもので、トレーサーの製造に用いるマ
ーカーが螢光マーカーであるアッセイに特に利用できる
。

アッセイに用いられる”Ｊ溶性結合剤も４１１１足すべ
き被分析体に応じて定められる。支持された結合剤の、
場合と同様に、支持された第１および第２結合剤と順次
接触させる試料におげろ、結合トレーサーおよび非結合
トレーサーを製造するだめの支持されていない結合剤（
可溶性結合剤）の選択は、適宜本明細−内の開示から当
業者がなしつる範囲のものと考えられる。

本発明の好ましい実施態様によれば、支持された第１お
よび第２結合剤は、アッセイ操作中に結ばした物質をこ
れから溶離することによりアッセイに再使用するために
再生される。このため、この溶離は第１および第２の結
合剤上を流動して、支持された結合剤の結合能を損なう
ことなく結合した物質を溶離する適切な溶離液の使用に
より行われる。この踵の溶離液を結合剤の再生に使用す
ることは（結合した物質が抗原、ハプテンまたは抗体の
いずれであっても）当技術分野で一般に知られており、
従って適切な溶離′ｏ、を選択することは本明細書の記
載から当業者がなしうる範囲にあると考えられる。

本発明は結合剤がアッセイに再使用するために再生され
ないアッセイ法にも適用できるが、本発明は第１および
第２結合剤を特に自動アッセイに使用するために再１吏
用できるアッセイに荷に利用できる。

支持された結合剤が再使用される、被分析体（抗原また
はハプテン）のアッセイに螢光トレーサーを用いる特定
の方法によれば、被分析体（抗原またはハプテン）を含
有する試料を、被分析体に対する可溶性結合剤（一般に
抗体）および螢光性マーカー・により標識された被分析
体もしくはその適宜な同族体である螢光トレーサーと共
にインキュベー１−ｊ４゜インキュベーションノ結果、
トレーサーと被分析体は結舒剤上にある結合部位に対し
て競合し、結合トレーサー（抗体と複合体を形成しタト
レーサー）およ−ぴ非結合もしくは遊離ｌ・レーサー（
抗体と複合体を形成していないトレーサー）を含有する
混合物が生成する。結合トレーサーの量は試料中の被分
析体の量と反比夕１」゛する。

インキュベーションののチ、インキュベートサれた試ネ
」を固体支持体に支持された第１結合剤を入れた室内に
貫流させる。第１結合剤はインキュベートした試料中の
遊離トレーサーに対する結ば剤てあってもよい。あるい
は第１結合剤はインキュベートした試料中の抗体に対１
−る結合剤であってもよく、これにより結合トレーサー
は第１結合剤に結ばする。

第１室内の結合剤が被分析体に対する結合剤である場合
、インキュベートした試料中の遊離トレーサーは第１室
内の支持された第１結合剤に結合する。第１室を貫流す
る試料は結合トレーサーを含有し、これにより第１室内
では遊離トレーサーのみが支持された結合剤に結合し、
この残りの試料が支持された結合剤を入れた第２室を貫
流する。

この第２室の結合剤はインキュベーション工程で用いた
可溶性抗体に対する結合剤である。第２室においては結
合トレーサーが試料から除かれ、これにより可溶性抗体
に結合したトレーサーの複合体はその抗体部分での結合
によって支持された第２結合剤に結合する。第２室内の
結合剤は、アッセイに用いられた可溶性抗体に応答して
誘発される抗体であってもよいみこうして結ａトレーサ
」が第２室内で試料から除かれる。

次いで溶離液を第１室および第２室にそれぞれ別個に導
通して、それぞれの結合剤から遊離トレ゛−サーおよび
結合トレーサーを溶離し、溶出した遊離トレーサーおよ
び溶出した結合トレーサーを遊離画分および結合画分の
測定のため適切な検出器に別個に導通する。次いでこれ
らの室を再１更用できるように適切な液体を室内に導通
する。

こうして結合画分および遊離画分をそれぞれ血清試料中
に存在′１−るＦ５Ｊ能件のある妨害物賃のない状態で
測定することができる。さらに適宜な比率、たとえば結
合画分対遊離画分の比率、および／または結合画分対総
トレーサーの比率、その１ｍ標準曲線を作成し、この標
準曲線を未知の試料中の被分析体の濃度の測定に用いろ
ことができる他の何らかの方法をプロットしつるために
、異なる２種のデータ点を測定することができる。

複数部１立抗原（２個以北の抗原決定部位をもつ抗原う
のアッセイに螢光トレーサーを用いる他のパ持異的方法
によれば、複数部１〃抗原（被分析体）を含むかまたは
含むと思われる試料を被分析体に対する標識された結合
剤の形のトレーサー（特に被分析体に対１−る標識され
た抗体、これは抗原決定部位のうちの１つに対する１票
識されたモノクローナル抗体であってもよい）と共にイ
ンキュベートする；なお、抗体は螢光物質で標識されて
いる。

インキュベーションの、結果、螢光トレーサーノ一部が
被分析体に結合し、これに、ｌ：り結合トレーサー（被
分析体とのトレーサー複合体〕おまひ遊離トレーサーの
混合物が生成１〜、結合トレーサーの量は試料中の被分
析体の量に比例１−る。

インキュベーションののちインキュベートシタ試料を、
固体支持体上の第１結合剤？入れた室内に貫流させる。

トレーサーが螢光標識されたモノクローナル抗体リグ１
のものである場合、第１結合剤は被分伯″体に対する結
合剤であり、これにより被分析体に結合したトレーサー
の複８一体が第１結合剤に結合１−る。トレーサーがア
ッセイ１−べき抗原の〃１、原決定部１文の１つにχ・
Ｊ′１−るモノクローナル抗体から形成される場合、第
１結ば剤（ま被分乍「体もしくはそのｊＮ宜な同族体で
あめか、またけ被分析体の１１．１２の抗原決定部位に
対するモノクローナル１）”１４体であってもよい。第
１結合剤が被分析体もしくはその適宜な同族体である場
合、遊離トレーサーは支持された第１結ａ剤に結ばする
　支持された第１結合剤が被分析体の１１μの抗原決定
部位に対するモノクローナル抗体である場佇、トレーサ
ーと被分析体の複合体は支持された／ｇ１結合剤に結合
する。

試料の残部は支持された第２結合剤ケ入れた犀２室を質
流させられる。支持された第２結合剤は支持された第１
結合剤に結合しない部分のトレーサーに対する結合剤で
ある。支持された第１結合剤が被分析体に対する結合剤
であって被分析体に結合したトレーサーの複合体に結合
１−る場合、支持された第２結合剤は螢光標識された抗
体に対する結合剤、たとえば扱方□’ｄ「体またはその
ノＮ宜な同族体であり、これにエリ遊離トレーサーが試
料から分離される。第ｌ結汁剤が部分・１ハ゛体寸たは
その適宜な同族体である場合、支持された第２結き剤は
被分析体の曲の抗原決足部ｒ〜ｔに対するモノクローナ
ル抗体である。支持された第１結汗剤が被分析体の曲の
抗原決定都１立にｚｌするモノクローナル抗体である場
合、支持された第２結合剤（ま被分析体またはその適宜
な同族体であり、トレーサーとして用いられる螢光標識
されたモノクローナル抗体と結合する。

次いで溶離液を第１室および第２室それぞれに別個に導
通し、個々の結合剤から遊離トレーサーおよび結合トレ
ーサーを溶離し、これらを遊Ａｌｔ画分および結合画分
の測定のため適宜な検出詣に別個に導通する。

前記のように、結合トレーサーおよび遊離トレーサーそ
れぞれの両分を血清試料中に存在する可能性のある妨害
物質のない状態で測定′１″ることかできる。

本発明の他の観点によれば、本丸明によりアッセイを行
うための、１１ζ切な試薬キット′ｉたけパッケージが
提供され、この挿のキット−またはパッケージには主要
な構成部品として（ａＪ固体支持体に支持された第１結
合剤であって、アッセイに賑して生じる遊離トレーサー
画分に対して特異的な結合剤：および（１））固体支持
体に支持されｒｖｇ２結合剤であって、第１結合剤とは
異なり、かつアッセイに隙して生じる結合トレーサー画
分（競合型のアッセイにおいては可溶性結合剤と複合体
ケ形成したトレーサー、およびサンドインチ型のアッセ
イにおいては被分析体と複合体を形成したトレーサー）
に対して特異的である結合剤が含捷れる。好ましい実施
態様によれば支持された第１結合剤が１個のフロースル
ー室内にあり、支持された第２結合剤が１個のフロース
ルー至内にある。

試薬キット寸たはパッケージには測定すべき被分析体に
対するトレーサーも含まれる。トレーサーは一般に螢光
標識されｆｔ　’）ガントである。試薬キットｔたはパ
ッケージには適切な緩衝液、溶離液、適宜な洗浄液、標
準液などが含まれていてもよい。種々の成分は適切な場
合には、試薬キットまたはパッケージにおいて別個の容
器（たとえばバイアル−）中に入れられる。これらの拐
泊トのうち１種捷たけ２種以上を試薬キット分離して別
個に包装するか、または別個の商品として包装し、販売
することができる。たとえば１ん体支持体に支持された
第１および第２結合剤を入れた第１およびｆＪ２フロー
スルー室を他の試薬とそれぞれ分離して包装し、別個の
試薬キットまたはパッケージとして販売することができ
る。

本発明のアッセイは多種多様なりガントを測定−するた
めに用いることができる。特に本方法は測定すべき被分
析体を含む試料につき結合画分および遊離画分の双方を
試料から分離して測定することにより、試料中の低濃度
の被分析体を検出する性能を著しく改善づ−るので、試
料（特に血清試料ン中に低濃度で存在するりガントに適
用できる。たとえば本発明方法により測定できる適切な
りガントの代表例としては、ヒト甲状腺刺激ホルモン。

ＨＯＧ　；　ＦＳＨ；　ＬＨ；インシュリフ；ＣＥＡ；
７エリチン；肝炎関連抗原ＡおよびＢ：成長ホルモン；
Ｔ４、Ｔ３、ジゴキシン、コルチゾール、エストリオー
ル；各種薬剤、たとえばテオフィリン、ゲンタマイシ７
などがあげられる。

本発明をさらに下記の実施例に関して記述するが本発明
の、ｆＩ巳囲はこれによって１展定されるものではない
。

実施例 〉コキシンの血清試料をフルオレセイン−ジゴキシン（
以下トレーサーと呼ぶ）の溶液に添加した。ウサギ抗ジ
ゴキシンをこの溶液に添加し、１０分間インキュベート
した。この溶液を次いで固体−支持体に支持されたウサ
ギ抗ジゴキシン上に流した。可溶性ウサギ抗ジゴキ／ン
に結合した標識したジゴキシ／および標識されていない
ジゴキシ／は第１結合剤をそのまま通過し、これに対し
て、上記の結合をしなかったジゴキシンおよびトレーサ
ーはウサギ抗ジゴキシン結合剤に結合した。溶液の通過
部は、さらに固体支持体に支持されたヤギ抗体および抗
ウサギ抗体からなる第２結合剤に流した。これにより可
溶性抗体（その一部はトレーサーに結合しているうは第
２の免疫吸着剤に吸着された。試料の残部を廃液受は器
に達する捷で貫流させた。次いで系全体を洗浄してすべ
ての汚染物質を除去した。

この時点で２室間に配置された弁により各室に別個に溶
離緩衝液を、４通した。第１室からは標識された抗原が
放出され、これは検出器に流れ、測定された。この測定
な゛カツプフ’）　−（ｃｕｐｆｒｅｅ　）’“と定め
る。第２室からは標識されたジゴキシンおよび標識され
ていないジゴキシン、ならびに可溶性抗体が結合剤から
放出された。トレーサー乞検出器に流し、測定し、バカ
ツブ結合″画分と表示した。

本発明はアッセイにおいて結合トレーサー寂よび遊離ト
レーサーの双方を、分析すべき被分析体を含有する試料
から分離して測定できる点で時に有利である。こうして
これらの結合トレーサーおよび遊離トレーサーが試料中
に存在するＥｌ能件のある妨害物質馨含まない状態で測
定されるので、結合トレーサーおよび遊離トレーザー画
分ンより精確に測定することができる。これは、血清試
料がしばしば血清試料中の少針のトレーサー７測定する
性能を妨害する高い量のバックグラウンド螢光をもつ螢
光アッセイにおいて特に有利である。

本発明の他の利点は、トレーサーの総量（遊離および結
合）が直接に測定されるので、可溶性抗体に結合した被
分析体の割合をに址しうる点である。

以上の開示を考慮して多数の修正および変更を行うこと
ができるので、本発明は特許請求の範囲に記載したｉ１
α囲で上記以外の態様で実施することができる。

特許用９顆人　ベクトン・ディッキンソン・アンド・カ
ンパニー 代理人　弁理士　湯　浅　恭　三ニー、’）（外５名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）被分析体に対する可溶性結合剤および被分析体よ
   りなる群から選ばれる貰子に結合したトレーサーの複合
   体ならびに遊離１・、レーサーな倉む混合物を試料中に
   生成させることによる試料中の被分析体のアッセイ法で
   あって、 結合および遊離トレーサーの混合物を言む試料を支持さ
   れた第１結合剤と接触させ：試料を支持された第１結合
   剤から分離し：分離した試料を支持された第２結合剤と
   接触させ；試料を支持された第２結合剤から分離し、そ
   の際支持された第１および第２結ａ剤のうちの一方が遊
   離トレーサーに対する結合剤であり、支持された第１お
   よび第２結合剤のうちの他方が上記複合体に対する結合
   剤であ、す、これにエリ結合トレーサーおよび遊離トレ
   ーサーの双方が試料から分離され；そして分離された結
   合トレーサーおよび分離された遊離トレーサーのうち少
   なくとも一方を被分析体の尺度として測定する点におい
   て改良されたアッセイ法。 （２）分離された遊離および結合トレーサーの双方を被
   分析体の尺度として別個に測定する、特許請求の範囲第
   １項に記、或のアッセイ法。 （３）複合体および遊離トレーサーをそれぞれ測定前に
   、支持した結合剤から溶離する、特許請求の範囲第２項
   に記載のアッセイ法。 （４）トレーサーが螢光標識されたリガンドである、特
   許請求の範囲第３項に記載のアッセイ法。 （５）第１および第２結合剤が第１および第２貫流室内
   の固体支持体に支持され、試料がこれらの第１室および
   第２室を特徴とする特許請求の範囲第４項に記載のアッ
   セイ法。 （６）複合体が被分析体に対する可溶性結合剤に結合し
   たトレーサーである、特許請求の範囲第３項に記載のア
   ッセイ法。 （７）可溶性結合剤が抗体である、特許請求の範囲第６
   項に記載のアッセイ法。 （８）トレーサーが螢光標識されたリガンドである、特
   許請求の範囲第７項に記「伐のアッセイ法。 （９）支持された第１および第２結合剤のうちの一方が
   可溶性抗体に対する結合剤であり、他方がトレーサーに
   対する結合剤である、特許請求の範囲囲第８項に記載の
   アッセイ法。 （１０｝　複合体が被分析体に結合したトレーサーであ
   り、被分析体が複数の抗原決定部位をもつ抗原である、
   特許請求の範囲第３項に記載のアッセイ法。 ■　トレーサーが被分析体に対する螢光標識した抗体で
   ある、特許請求の範囲第１０項に記載のアッセイ法。 （ｌ２）支持された第１結合削が被分析体に対する結合
   剤であり、支持された第２結合剤がトレーサーに対する
   結合剤である、特許請求の範囲第１１項に記載のアッセ
   イ法。 ｑ３）トレーサーが被分析体の一つの抗原決定因子に対
   する螢光標識されたモノクローナル抗体であり、支持さ
   れた第１および第２結合剤のうちの一方が被分析体の池
   の抗原決定部位に対するモノクローナル抗体であり、支
   持された第１および第２結合剤のうちの他方が被分析体
   である、特許請求の範囲第１０項に記載のアッセイ法。 ０４）試料中で被分析体に対する可溶性結合剤および被
   分析体よりなる群から選ばれる貰子に結合したトレーサ
   ーの複合体と遊離トレーサーとの混合物が形成された試
   料中の被分析体をアッセイするだめの試薬キットであっ
   て： 固体支持体に支持されたＪｌ結合剤；固体支持体に支持
   された第２結合剤からなり、弟１および第２結合剤のう
   ちの一方が遊離トレーサーに対する結合剤であり、第１
   および第２結合剤のうちの他方が複合体に対する結合剤
   であるキット。 （ｌ５）固体支持体に支持された第１結合剤が第１貫流
   室内にあり、固体支持体に支持された弟２結。 ば剤が第２貫流室内にある、特許請求の範囲第１４項に
   記載のキット。 （■６）さらに被分析体およびトレーサーの双方に対す
   る可溶性結合剤を営む、特許請求の範囲第１５項に記載
   のキット− （１カ　トレーサーが螢光標識されたりガントである、
   特許請求の範囲第１６項に記載のキット。 （ｌ８）分析すべき被分析体が複数の抗原決定部位をも
   つ抗原であり、トレーサーが被分析体に対する標識され
   た抗体である、特許請求（／）　！ｌｉα囲弟１４項に
   記・戒のキット。 ０９）標識が螢光標識である、特許請求の範囲第１８項
   に記載のキット。 （２０）トレーサーが螢光標識で標識された被分析体の
   抗原決定部位の１つに対するモノクローナル抗体からな
   る、特許請求の，ｆｔ（ｉ囲，第１９項に記載のキット
   。　′ （２ｌ）而（宵試料中の抗原お裏び／・ブテンよりなる
   群から選ばれる被分析体のアッセイ法であって、被分析
   体を含有する血清試料を被分析体に対する可溶性抗体お
   よび螢光標識で標識された該可溶性抗体が結合したりガ
   ントからなるトレーサーと接触させて、該＋’Ｊ’　＃
   ：性結合剤に結合したトレーサーの複合体ケ形成させ、
   該試料がさらに遊離トレーサーを含有し；該試料を支持
   された第１抗体と接触させ：試料を支持された第１抗体
   から分離し：分離した試料を支持された第２抗体と接触
   させ：支持された第１および第２抗体のうちの一方が被
   分析体に対する抗体であり、第１および第２抗体のうち
   の他方が可溶性抗体に対する抗体であり、これにより遊
   離トレーサーが第１および第２抗体のうちの一方に結合
   することによって試料から分離され、複合体が第１およ
   び第２抗体のうちの他方に結合することによって試料か
   ら分離され；そして分離された複合体のトレーサーおよ
   び分離された遊離トレーサーを被分析体の尺度として別
   個に測定することよりなるアッセイ法。 （２つ　支持された第１および第２抗体が第１および第
   ２貝流室内に支持されている、特許請求の範囲第２１項
   に記載のアッセイ法。 （２３）複合体および遊離トレーサーがそれぞれ測定前
   に、支持された結合剤から溶離される、特許請求の範囲
   第２２項に記載のアッセイ法。