JPS59500832A - 競合的免疫螢光検定法及び試験セット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 競合的免侵蛍光検定法及び試験セット 技術分野 本発明は血精学的診討１εの分野にるる。＠に詳しくは、本発明は抗原に対する 改良された競合的（ｃ　ｏｒｎｐｅ　−ｔｉｔｉｖｅ）先膜蛍光試監に臥する。

技術的背景 抗原やハゲテン類に対する親会的免役検定法は、血清学的診断法の技術分野で知 られている。これらの方法は、仔１足しようとする試料中で、徒減された」九原 （既知）と未什識抗ル（未知）とが牝、異的な抗抗原抗体（ａｎｔｉ−ａｎｔｉ ｇｅｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　）に対して競合することに基つく。抗原／ハプテン と抗体との間に生ずる免疫錯体は分離びれて、その椋識キ、は適当な標識検出手 段によって検出される。試料中の未知（未標識）の抗原／ハフ０テンの１度は、 基準作ル」との比較によって決定される。

合衆国特許第３，９８１，９８２号と第４，２９８．５９２号は、「重複抗体分 離−１検定法と呼ばれる形式の競合的放射し完投検定法を記述し一〇いる。この 手法では、抗原を含んでいると思われる試料を、初めに第一の特異的抗体及び既 知の放躬糾枦識された抗原と一緒に培養）−る。このるとで、第一の拐体に対し て！＋：、異的な第二の抗体をポリエチレングリコールと一緒に加える。

第二の抗体とポリエチレングリコールは、抗原−に−抗体の反応生成物と錯体を 形成し、これが凝集して培養混合物から沈殿する。沈殿物は遊離抗原を含有する 上澄液から分離される。分離された沈殿物の数豹°能をシンチレーション計数胎 で直接に読み取シ、試料中の抗原饋度は、標準的放豹能−抗原濃度曲線に読取シ 値を比べることによって決定でれる。これらの放躬糾免疫検定法は、感度がよい が、高度に熟練した操作者が細心の注意を払いながら取扱い、使用、処分をしな ければならないという、放射性試薬を伴うすべての放射線免疫検定εに共通の欠 ７Φをもっている。これに対して、固体相の蛍光を読み取るような先膜蛍光検定 法が知られている。このような検定法は、固体相自体と散ｉ＋からの強い蛍光バ ックグラウンドに問題がある。

チャート、ティ（Ｃｈａｒｄ　、　’Ｊ’−）とサイクス、エイ（Ｓ″ｙｋｅｓ 　、　Ａ、　）　［Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　（１９７９年）２６巻（６）号９ ７３〜９７６頁〕ハ、ヒトのコリオマンモトロビンに対する蛍光免疫検定法を教 示しているが、そこでは血漿試料をフルオレセインで標識したヒトのコリオマン モトロビン及びヒツジのホルモンＫ　匍ｆｆｔ　トー緒に培養している。培養後 、免疫錯体葡ポリエチレングリコール水溶液の添加によって遊離ホルモンから分 離する。混合物を遠ル分離にかり°、上澄液の蛍光を読み取シ、基準値と比較す る。上澄液の蛍光を読み取るこのような検定法は、上澄液（血漿又は血清）中の 干渉材料による蛍光の問題がある。

プールファーザネ、エム（Ｐｏｕｒｆａｒｚａｎｅｈ、　Ｍ、　）ら［Ｃ１１ｎ ’、　Ｃｈｅｍ、　（１９８０年）２６巻（６号）７３０〜７３３頁〕は、血清 中のコーチゾルに対する競合的免疫蛍光検定法を記述している。血へ試料をフル オレセインで標識されたコーチゾル、及び磁化用層なセルロース／酸化鉄粒子に 結合された抗コーチゾル抗体と一緒に培養する。培養後、固体相全分離し、遊離 標識済み抗原を除くために尻浄し、メタノールと０．０２ＭＮａＯＨとの同量混 合物で溶離する。溶離液の蛍光を蛍光計で読み取シ、標準曲線との比較から試料 中のコーチゾルｅ＜　ｋを決定する。

特願昭第１５０５４７／７９号は、種々の抗原に対する直接的・間接的免役蛍光 検定法を記述しでいる。試料をまず、抗体（直接検定ではフルオロクロームで標 識し、間接検定では未標識）と−緒に培養する。次に混合物を先膜吸着剤と共に 培養する。間接検定法では、更に第一抗体に対するフルオロクロームｈＨａされ た抗体と免役吸着剤との培養も行なう。画検定方式とも、免疫錯体を０．０２〜 ０．０４　Ｎ　ＮａＯＨで免投臥着剤から分離し、溶離液の蛍光を読み取り、基 準値と比較する。

免疫吸着や固定化を伴ったこれらの先行の検定εに−１、幾つかの欠点かある。

第一に、固定化の再現精度かしばしば一貫性を欠き、検定精度に悪影舎を及ぼし でいる。咬着は免疫錯体の安定性にも悪影塗、・シ、免疫蛍光強度の人為的な低 読取り値を生ずる。溶離の非能率や似てＪｌ−なる溶届杓刺からの干渉も、蛍光 強度の人為的に低い読敗り値を生ずることがある。

上記の先行技術の競合的免役蛍九倹足η、とは対照的に、水炎、明の検定法は固 体相の読取り、又は干渉材料を含有しうる十澄液や溶離液の読取りを行なわない 。

その代わりに、本発明の検定法は非蛍光性の光散乱しない免疫沈殿剤と一緒に免 疫錯体を沈殿させ、背景的な蛍光又は散乱光を句加しないよりな浴奴で生ずる免 疫沈殿物を溶解させ、この溶液の蛍光を読み取るものである。従来の競合的免役 蛍光検定法に比べ、本発明の検定法は感度が高く、再現性も投与量一応答特性も 精度も改善をれ、必裏七する抗体試薬量も少ない。

本発明の一つの面は、抗原を含ひと思われる試料中の抗原量を画定するだめの競 合的免役蛍光検定法である。この検定ａ：は、蛍光剤で標識された抗ルと抗抗原 抗１：４・、それに抗ｒ７し原抗体に対１する抗体からなる溶液と共に試料を培 養し、蛍光のない光散乱しない免役沈殿剤を培養混合物に加えて免疫沈穎物を形 ｆ５Ｊ−’Ｌぜることからなる。この杉・”定法の特徴は、免役沈殿物ｊを分離 し、低イオン強度をもっており生ずる溶液のｐＩ−］を実質的に一定に保つよう な非蛍元性溶妊中に溶解し、生ずる溶液の蛍元強朋を測定しで行、準１川線と比 較する。ぐＶ−ある。

本発明のもつ一つの面（竹、上ｈヒの競合的免役蛍光検定法を行なうための試峡 てノドである。これは、蛍光標識された抗原試薬、抗お・ル抗体試兵、抗抗原抗 体に対する抗体、及び非蛍光性の光散乱しない免疫沈殿剤の組合せで構成され、 とのセットに低イオン弥１８ニと免役沈松砂物溶液ｐＨを実質的に一足に保つ聴 力とを１゛、・へえた、免役沈殿剤の免疫沈＃、物）溶解用の非蛍光溶奴を包含 することが特徴となっている。

漿、尿、１ツノか液、胆汁、骨髄液等のような体液である。分析葛れる特定体液 は、検定しようとする抗原に応じて変わりつる。はとんどの場合、血精か用いら れよう。１検定当たり約０．１ないし約５００μＬの液が使用芒れる。必要な活 １合、試料を分析時￥にて゛低益貯蔵しておける。

本発明方法で検定でさる牧１質は、抗原（を椎動物宿主の血如中に導入さ）する と免疫応答を誘発する分子）と、それ自体免役原性ではない刀・、蛋白質相体Ｖ Ｃ結び付いて複合体を形成するハン゛テン類（この複合１．ｌ、は免疫原作であ って、ハフ′テンに対する抗体を活性化できる）を包含する。「抗原」という用 語は、抗原及びハプテン組成物を総体的に指すために本明細畳で使われている。

このような物りは薬剤、ホルモン、殺云剤、トキシン、ビタミン、ヒト・細菌・ ウィルスの蛋白質などを包含している。本発明方法で極短できる抗原の１多りは チロキシン（Ｔ４）、１・１ノヨートチロニン（’ｌ’３）、ル、黄体４５Ｘホ ルモ／、ジギトキノン、ビタミン旧２、プロゲステロン、ヒト絨毛カ！、：性生 淘腺刺敞示ルモン、テオフィリン、アンジオテンシン、ヒト成長ホルモン等であ る。

抗原を含有するものとカえられる試料と一緒に培？εされて免疫錯体を形ｂｙす る試薬は、［１）蛍九枚識された抗原、（２）抗抗原抗体、ｉ３１８’ｉ：抗原 抗体に対する抗体、及び（４）非蛍光性の光散乱しない免疫沈殿剤である。蛍光 標識いれた抗原は、アルテヒト類やカルボジイミド類、シマレイミド類、イミテ ート類、ザクシンイミド類のような多官能価の結合剤を使用して、フル万しセイ ン（例ｋ　Ｉｉフルオレセインイノチオツィアネート（１＝’　Ｉ　ＴＣ）　及 Ｕフルオレセインアミン）、ロタミン又はタン７ルのような蛍光助剤の反応性訪 導体に抗原をπ古ひ伺けることに」、ってつくられる。フル１２士インが好オし い標識剤である。、抗原に７丁する抗体をつくるには、宿主背椎動物に抗原を、 典型的には数（ｓｅ　ｖｅｒａｌ　）日おさにくシ返し接種し、宿主から採皿し て、血液がらＩｇを分離する。抗抗原抗体に対する抗体？つくるに嬬、力１１の 宿主背析動物釉をＩｇで免疫化し、第二の宿主からＩｇを集める。非蛍光性で光 散乱しない免疫沈殿剤は、免疫錯体を沈殿させろが、免疫錯体の沈殿速度を高め る化合物である。蛋白質全沈殿σぜるのに慣用的に使用され、必搬な非蛍光助長 性をもった化合物類が使用できる。このような杓料の例は杓３０００ないし約１ ．２０００、好寸しくけ約４．０００ないし］　００００の範囲の分子量をもつ ポリエチレングリコール、及び硫酸アンモニウムのような無機塩類でるる。

ボ゛リエチレングリコールか斡ましい免疫沈殿剤である。

試薬類の杷対的使用九は、当然ながら試料容量（で左右される。徐鐘初体は既知 量で使用きれる。使用の抗ｎｏ／Ｈに対して化学量論的に孤愁的な試菜を提供す るために、状識扮原全希釈でさる、っ１・）ノス（ト１１ス（ヒドロキシメチル ）アミノメタン水浴ｅ−）　、バルヒタール、硼酸塩、燐酸塩等のような音道の 水性終制液を標識抗原の希釈に使用できと・。、抗原にダ１′３−る抗血？Ｆｒ は、通常、反応媒体中の全抗原幇より逝剰に加えられるだろう。

これも水性緩淘液で希釈でき２．。第二の抗血？腎も、抗原にｉ４する抗血？ｔ ’＋’より相対的に応ノ剰穿で添カ［」されるだろう。第二の抗血清は抗原と相 互反応しないものとすべきである。免役沈殿剤は通常、希求溶液（約５ないし８ 重量カ）として、第二抗血清に基づいて溶液の約２％ないし約２０％、好ましく 　Ｉ′ｉ５．７ｚいし約８重ｉ％の範囲内の量で添７Ｊ［］でれよう。

試薬を試料を加える順序は概して決定的なものではない。普通には標識抗原、第 一の抗血清及び第二の抗血清孕試料と一諸に別に培％し、免疫沈被剤を後から加 える。培養は、免疫錯体の形成を可能とする温度とｐＨで行なわれる。約１５℃ ないし約５５℃の範囲の温和々温度で有オリには室温、ｐＨは約６ないし９、好 ましくは７〜８が通常用いられる。培養期間は、試料に試薬を加える順序にある 程度左右されるだろう。標識抗原と２種９抗血栖を土の条件で一緒に加える場合 は、約１力ないし２時間の培養時間が、抗原と抗体を反応させ、て免疫錯体を形 成させる時間として十分であろう。抗原（標識されたものと試料中の標識の々い もの）及び２わ−の抗血清によって形成でれる錯体は、免疫沈殿剤を加える脣で は溶液中に残り、凝集も沈殿もしないかも知れない。培養液中に免疫沈殿剤が包 含される場合は、免疫沈殿は免疫錯体の形成と同時に起る。

後から沈殿剤を加えることによって、別の段階で免疫沈殿を行なう時には、沈殿 剤が錯体中へ取り入れられて沈殿物を形成するには、約１分ないし１時間が見込 捷れる。

免疫沈殿に続いて、沈殿物を遠心分離などによって上澄液から分離し、上澄液を 捨てる。沈殿物を所望によシ緩衝液で洗う。次に、低イオン強度（すなわち典型 的には約帆２未満及びもつと普通は約０．００１と０．０６の間）をもち、生ず る溶液のｐＨを実質的に一定（す々わち±０．００５　）に保つような非蛍光性 溶媒中に沈殿物を溶解する。好ｌしくはｐＨを８よシ上に、更に好ましくは９よ ジ上に保つ。このような溶媒の例は、アルカリ金属（例えばＮａ、Ｋ）の水巖化 物及び硼酸塩、バルビタール及びトリスの水溶液である。溶媒に、特定されたｐ Ｈで溶液を緩衝する能力かめるのが好捷しい。距太眼の蛍光強度を提供するイオ ン強要は、特定使用溶媒に応じて変わる。例えば、水酸化す）　１１ウムの場合 、イオン強度は約０．０４未調、普通には０．０２ないし０．０４、好ましくは 約０．０３である。硼酸′す）　ＩＩウムでは、イオン強度は約０．２床満、普 通には０．０１ないしＯｏＪ、好ましくは約０．０６とすべきである。最少量の 溶媒（すなわち沈殿物をちょうど溶解するだけの量）を使用するのが好ましい。

この量は上記の量の試料では普通約１００ないし５００μＬの範囲にある。溶解 は温和な温度で行ない、周囲率度が好都合である。次に蛍光強度の読取りのため 、生ずる溶液−ｔｈ当な容器、例えば７０−セルに移す。既知量の抗原を含有す る一連の試料の検定から導ひかれる蛍光強度対抗原濃度の標準曲線に、蛍光強度 を対比ざぞる。

この比較から試料中の抗原の量が決定される。

本発明検定法を実施するだめの試験セットの基本成分は、（１）蛍光剤で標識さ れた抗原、（２）抗原に対する第一の抗血清、（３）第一の抗血清に効する抗血 清、（４）免疫沈殿剤、及び（５）溶媒である。これらの成分をセットで別個に 包装するのが好ましく、典型的には複数回の検定を行なうのに十分な量で提供で れる。試験セントには、適当な紗衝液、標準及び対照試料をつくる標識の々い抗 原試薬１．検定を行なう設備ないしバイアル、検定実施の手引きを含めることが できる。セントの成分を診断セット製造に慣用的に用いられる方法で包装で以下 の実施例は、本発明と、他の検定技法に対する不発明の利点を更に例示している 。これらの実施例は、いかなる形においても本発明を限定する意図をもたない。

他に指示かなりれば、百分率は重介゛による。

実施例１　本発明方法と従来法によるＴ４の検定既知量のＴ４を含有する血清２ ５μｔずつを、炭踪塩＆、：衝液中のＦ　Ｉ　ｉ’　Ｃで標識いれたＴ４２５μ ２　（０，ＯＩＭ。

ｐＨ８，６）、燐酸塩で緩衝された食塩水中のウザギ抗Ｔ４血清とヤギ抗ウサギ １ｇ血清との混合物２５μｔと一緒に、それぞれ２５℃で２０分培養した。培養 に続いて、６，５％ポリエチレンクリコール（分子３１８００ｏ）の冷水溶液１ μｔを混合物に加えた。生する沈殿物を遠心分離によって分離し、上澄液を拮で た。沈殿物をそれぞれ０．０３　Ｎ　ＮａＯＨ７Ｊ（溶液２００　ｔｔＬに溶解 した。

溶液をフローセルキュベツトに移し、その蛍光強度を蛍光計で読み取った。

′１゛４含有液の同じ一組を％願昭第５４−１５０５４７告の実’５ｉ！１ｆ１ ｊ　１の手順によって検定した。

両俵定結果を下の第１表に示づ一０ 比較のため正規化された 第１表のテークに示すとお匂、ＲＦＩ　の有効検定範囲は、本発明方法では従来 法に比べて約１０倍太きい。

本発明方法でのＲＦｌ　の変動係数は、従米法での約１０％に対し２％未満とな っている。これは、本発明のＴ４検定精度が比較従来広の１゛４検定精度より実 質的によい実施例］に記述された一般手順を用い一〇、標準及び未知試料につい てＴ３検定を行なった。試薬及び培狭条血清試料ル模　１００μｔ Ｆ　Ｉ　’Ｊ、’　Ｃで標識されたＴ３試桑　２５μＬウサキ抗Ｔ３抗体−ヤギ 抗ウザキＩｇ抗体　２５μ１２培養温庭　３７℃ 培養時１’１ｉｊ　］時間 これらの検定の結果を次の第２表に示す。

第　２　表 茜度（ｎ、ｇ　％　） 標準／試料　１ぼ■　得られた値　実際の値１、標準　１７３Ｊ−００ ５、ｔｔ　３　６８４−］、００ ６、　ｕ　３　６９７　−　１００ ７、　ＩＩ　４　５８３　−　・　４００８　〃　４　（コ０１．　−　４．０ ０９、　ｔｔ　５　５２８　−　８００ ］０．　ｌ／　５　５２６　−　８００１１、　試料　ａ７０５　６　Ｂ　６２ １２、　／ｌ　ａ　７］２　５２　６２］：ｉ　／ｌ　ｂ　６７８　１３２　１ ７２１４、　／Ｊ　ｂ　６７２　１４３　＋７２］　５　、　５６９　５２３　 ４８６ ］６．　／／　ｃ　５７４　４７０　４８６実施例３　ジゴキシン検だ 実施伸」１に記述子れた一＠　”ｆ−、ｌｌａ’：’を片、い１、標準及び未知 試料についてシコ゛キシン検定を行なった。

ＦＩＴＣｔ柿識きわだジコキザン試薬　２５μｌウザギ抗ジゴギサンＤｊ７体− ヤギ抗つサギＩｇｋ体　２５　ｔｔｌ培倭温度　３７℃ 培養時ｆ、ｉ＋　１珪）山ｊ これらの検定の結果を下の第３表に示す。

コ　イＪへ４）１〆４　］、　２９２０　０．０８、　／／　４　２０２０　１ １０ １１　試木１ａ１８２］−７，０５６，７１２、／／　ａ　１８３３　６．６　 ６．７］：う　／／　ｌ）　２５３２　１．９０　２．０１Ｊ、　／／　ｂ　２ ５４］、　１８６　２．０１５、　／／　ｃ　１．９２２　４８２　５．１１０ 、　／／　Ｃ１９］０　５．００　５．１実施例４　ジエンタマイシン検定 実施例１にｍｌ述された一般」順を使用して柾裾及び未知試料についてジエンタ マイ７ン検ボを行なった。

試薬さ培を条ｒｉ−は次のとおりでめった。

１−”　丁Ｔ　Ｃて標識されたに云賭ｈ　］０μｌこれらの検定の結果を下の紀 ４岩に示す。

第　４　表 良度（μｇ／ゴ） １、　標準　０　７０８６　−　０．０２、／／　］、６７９３　Ｑ、５ ３、／Ｉ　２　４４５３　２．０ ４、／／　３　２８２２　４．０ ５、Ｉ／　４　１２３４　−　１６．０６、　試料　１　１９０２　７．９　８ ．０７、／／　２　２７９１　４．１５　４．０８、／／　３　１２００　１７ ．０　１６．０９、／／　４　１８５３　８．２　８．０１０、／ｌ　５　６４ ８０　０．６６　０．５１１、／ｌ　６　３８２８　２．４５　２．０１２、　 〃７　５８１４　０．９９　１．０１３、　／／　８　６９２１　０．５　０． ０１４、／／　９　５６６６　１．０８　１．０１５、ｌ／　７　５８００　１ ．００　１．０１６、／／　７　５８２１　０．９９　１．０１７、／／　７　 ５７６２　１．０３　１．０１８、／／　７　５７４８　１．０３　１．０１． ９．　ｐ　７　５８１９　０．９９　１，０２０、ｔｔ　７　５７０９　１．０ ５　１．０２１、ｕ　７　５７９８　１．００　１．０２２、／／　７　５８１ ０　０．９９　］、、（１２３、／／　４　１８７０　８．１　８，０２４、ｔ ｔ　４　１８５４　８．２　８．０２５、／／　４　１９００　７．９　８．０ ２６、ｔｔ　４　１８８Ｂ　８．０　８゜０２７、／Ｉ　４　１９０９　７．９ 　８．０２８、／／　４　１８４４　８．３　８．０２９、／Ｉ　４　１８６５ 　８．２　８．０３０、ｔｔ　４　１８６６　８．２　８゜０実施例５　アミカ シン検定 実施例１に記述された一般手順を用いて、標準及び未知試料についてアミカシン 検定を行なった。

ＦＩＴＣで標識それたアミカシン　１ｏ／ｉｌ培楚温度　２５℃ 培養時間　１０分 これらの検定の結果を次の第５表に示す。

第　５　表 標準／試料　ＲＦＩ　得られた値　笑除の値１、　標準１　２８１５　０．０ ２、　／／　２　２１２８　３．０ ３、　／／　３　１６４４　−　１０．０４、　ｔｔ　４　１３５７　２０−０ ５、　／／　５　１０１．１　５０．０６、　試料ｉ　１６４０　１０．１　１ ０．０７、　／／　２　１１４２　３６．０　３５．０８、　ｌ／　３　２５６ ２　３．０　０．０９、　／／　４　１００８　５１．０　５０．０１０、　／ ／　５　１１８０　３２．５　３５．０１１、　／／　６　２１６９　２．７　 ３０１２、　ｐ　７　１４００　１８．７　２０，０１３、　ｌ／　２　１１５ ０　３５．２　３５．２１４、　／／　２　１１６１　３４．３　３５．０１５ 、　／Ｉ　２　１１５４　３５．１　３５，０１６、　／／　２　１２０’５　 ３８．Ｏ３５，０１７、ｔｔ　２　１１．７２　３３．３　３５，０１８、　ｔ ｔ　’２　１１３１　３７．０　３５．０１９、　／／　２　１１４１　３６． ０　３５．０２０、　／／　２　１１３９　３６．０　３５．０２］、　ｎ　］ 　１６５２　９．９　１０．０２２、　ｔｔ　１　１６３９　１０．１　１０． ０２３、　ｌ／　１　１６３９　１０．０　１０．０２４、　／／　１　１６４ ６　１０．０　１０．０２５、　ｔｔ　１　１６６１　９．７　１０．０２６、 　ｎ　１　１６３２　１０．３　１０．０２７、　／／　１　１６４２　１０． ０　１０．０２８、　／／　１　１６５８　９．８　１０．０２９、　／／　１ 　１６４０　１０．１　１０．０実施例６　トブラマイシン検定 実施例１の一般手順を使用を使用して、樵進及び未知試料についてトブラマイシ ン検定を行なった。試薬及び培養条件は次のとおりでめった。

項　目　貌　明 試料規＠　２５μｔ ＦＩＴＣで標識された試薬　１０　μを培養温度　２５℃ 培養時間　１０分 これらの検定の結果を次の＆−、６表に示す。

第　６　表 磯＃（μｇ／ゴ） １、標準　０　１９５７　０．０ ２、ｔｔ　１　１８８２　０．５ ３、ｕ　２　１５０２　２．０ ４、ｔｔ　３　．１０５７　４．０ ５、／／　４　６１０　−　１６．０ ６、試料　１　８０１　８．００　８．０７、ｔｔ　２　１．７５２　０．９９ 　１．０８、ｐ　３　６２１　１５．７０　１６．０ｇ、ｔｔ　４　７８２　８ ，４０　８，０１０、／／　５　１８７２　０．５５　０．５１１、／／　６　 １７３３　１．０７　１．０１２、／／　７　１４５２　２．２２　２．０１３ 、ｌ／　８　１０９５　３．７３　４．０１４、ｔｔ　９　１９４９　０．５　 ０．０１５、／／　２　１７４８　１．００　１．．０１６、／、　２　１７５ ３　０．９９　１．０１．７．　ｐ　２　１７４０　１．０３　ＬＯ１８、／／ 　２　１７３９　１．０３　１．０１９、ｌ／　２　１７５１　０．９９　１， ０２０、ＩＩ　２　１７４５　］、、０１　１．０２１、ＩＩ　２　１７４８　 １．００　１．０２２、／／　２　１７４９　１．００　１．０２３、ｔｔ　］ 　７９９　８．０　８．０２４、ｔｔ　１　８２０　７．４　８．０２５、ＩＩ 　ｌ　８１９　７．４　８．０２５、ｔｔ　ｌ　８０６　７．９　８．０２７、 ＩＩ　ｌ　７８８　８．３　８−０２８、／／　１　７９３　８−１　８．０２ ９、ｔｔ　ｌ　８２５　７．３　８．０３０、　ＩＩ　１　８００　８．０　８ ．０実施例７　銀酸ナトリウムを使用するトブラマイシン検定 ０．０３Ｎ水酸化ナトリウムの代わシに帆０３　Ｍ　ｈ’ｒ酸ナトリウムを溶媒 として使用した以外は実施例６の手順を使用して、標準試料についでトブラマイ シン検定を行なった。硼酸塩溶液８００μｔを各沈殿物に対して使用した。比較 のため、０．０３Ｍ水肢化す）　ＩＪウムを使用する検定も行なった。これらの 検定の結果を下の第７辰に示す。

１　０　２５００　３０９４ ２　１．０　２２３０　２５１３ ３　２．０　１９５０　１６５３ ４　４．０　１３６０　１５１９ ５　８．０　９９０　１１０６ ６　１６．０　７６０　７９３ 実施例８ Ｔ４及びジエンタマイシンの検定での溶媒として、実施例７のｆ＃：撃す）　Ｉ Ｊウム溶液の有効性は次のように示された。実施例１の炭酸塩緩衝液中の既知量 のｉ；”ＩＴＣ標識された抗原を、実施例１のように、抗抗原ウサギ血清及びヤ ギ抗ウサギ血清と一席に培養した。標識されたＴ４溶液は帆８２　ｎｇのＴ４を 含有・する一方、標識されたジエンタマイシン溶液は帆５ｎｇのジエンタマイシ ンを含有した。生ずる免投鈴体をポリエチレングリコール水溶液で沈殿させ、沈 殿物を分離し、土な液を実Ｆ４ｆｉｉｌのように捨てた。生ずる沈殿物を帆０３ Ｎ水酸化す）　ＩＩウム又は帆０３　Ｍ砺取ナトリウムに溶解し、蛍光計で蛍光 強暦を玩み取った。これらの試験を重複して行ない、結果を下に示した。

１６５８　１８３５ ４ １６９０　１８Ｂ２ １９６２　２３７７ ジエンタマイシン １９７３　２４１８ 上記の不発明実施の態様の、血清学的診断学の技術及び／又は関連技術の当業者 に自明の衷更は、以下の特許請求のホし四日に属するものと考えられる。

手続補正書（パラ 昭和５９年２月２２日 特許庁長官　若杉和夫　殿 ■、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８３１００６７５ （昭和５９年１月７日翻訳文提出） ２、発明の名称　競合的免疫蛍光検定法及び試験セット３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名称　パラボン・ダイアグノスティクスφ５、補正命令の日付　昭和５９年１月 ２６日（発送日　昭和５９年１月３１日） ６、補正により増加する発明の数　なし７、補正の対象 ｌ）仁嘴…横酩剣凱明細書及び請求の範囲の翻訳文の浄書２）特許出願人の代表 書名 ３）特許出願人の名称 ８、補正の内容 別紙の通り（出願人名称の証明書添付）国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　抗原を含むと思われる試料中の抗原量を測定するための競合的免疫蛍光検定 法であって、蛍光標識された抗原、抗抗原抗体、及び抗抗原抗体に対する抗体か らなる溶液と一緒に試料を培養することと、非蛍光性の光散乱しない免疫沈殿剤 を加えて免役沈殿物を形成きせるとと金含む検定法において、免疫沈殿物を分離 し、低イオン強度をもつと共に生する溶液のｐ）ｉ　を実質的に一定に保つよう な非蛍光性溶媒中に該沈殿物を溶解し、生成溶液の蛍光強度を測定して標準１騨 と比較することを特徴とする競合的免疫蛍光検定法。 ２　溶媒が約８よｐ上の溶液ｐＨを維持することを更に特徴とする論不の範囲第 １項に記載の杉・定法。 ３　溶媒が緩衝液であることを更に特徴とする請求−の亀Ｊ囲第１又は２項に記 載の検定法。 ４　溶媒がアルカリ金属水酸化物又はアルカリ金属破酸塩の水溶液でるることを 更に特徴とする請求の範囲第１項記載の検定法。 ５　溶媒が約帆０４未渦のイオン強度をもつ水酸化ナト１１ウム水溶液でるる請 求の範囲第１項に記載の検定法。 ６　イオン強度が約０．０３であることを更に特徴とする請求の範囲第５項に記 載の検定法。 ７　溶媒が約０．２未満のイオン強度をもった碌叡ナトリウム水溶液であること を更に特徴とする請求の範囲第１項に記載の検定法。 ８　免疫沈殿物を溶解するために最少量の溶媒が用いられることを更に特徴とす る請求の範囲第１項に記載の検定法。 ９、　前記蛍光標識された抗原がフルオレセインで標識された抗原であシ、免役 沈殿剤がポリエチレングリコールであることを更に特徴とする請求の範囲第１〜 ８項の−に記載の検定法。 １０、蛍光標識された抗原試梨、抗抗原抗体試奈、抗抗原抗体に対する抗体、及 び非蛍光性の光散乱しない免疫沈殿剤の組合せから成る、抗原を営むと思われる 試料中の抗原量を渥」定するための競合的免疫蛍光検定実施用の試験セットにお いて、低イオン強度と免役沈殿物溶液ｐＨを実質的に一定に保つ能力とを伽えた 、免疫沈殿剤の免疫沈殿物溶解用の非蛍光溶媒を包含することを特徴とする競合 的免疫蛍光検定法のお験セット。 １１、溶媒に約８よシ土のｐＨを維持する能力があることを更に特徴とする請求 の範囲：第１０項に記載の試ナトＩＩウム水溶液又は約０．２未満のイオン強度 をもつＦｈｉ酸ナトナトリウム水溶液ることを更に特徴とする梢求の虻囲第１０ 項（ｒ（記載の試験セット。 １３　前ａ口虫元傍証された抗原がフルオレセインで標識された抗原であり、免 役沈穀剤がポリエチレングリコールでろることを更にそ・徴とする話求の１ｈ　 Ｋ＝　１０．１１父（ｄ１２項に記載の試験キット。