CN112697761B - 一种基于上转换、bhq3特异性体系的牛奶中卡那霉素含量检测方法 - Google Patents
一种基于上转换、bhq3特异性体系的牛奶中卡那霉素含量检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于上转换、BHQ3特异性体系的牛奶中卡那霉素含量检测方法，属于食品安全检测技术领域，以六水氯化钇、六水氯化镱、六水氯化铒、聚乙烯亚胺、氯化钠和氟化铵的乙二醇混合液为原料，制备上转换荧光纳米材料；通过戊二醛交联法将上转换材料与卡那霉素适配体连接起来；与卡那霉素适配体互补链‑BHQ3溶液混合孵育，得到特异性检测体系；加入卡那霉素溶液后，测定检测溶液的荧光强度信号特征值为纵坐标，以卡那霉素浓度为横坐标，建立卡那霉素检测标准曲线，实现待测牛奶中卡那霉素含量的测定；本发明通过构建稳态特异性卡那霉素荧光检测体系，实现牛奶中卡那霉素的高灵敏、特异性检测，具有较宽的线性检测范围和较低的检测限。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体设计一种基于上转换荧光与BHQ3猝灭剂对食品中卡那霉素含量的检测方法。
背景技术
卡那霉素是一种氨基糖苷类抗生素，通过与30S核糖体结合从而致使mRNA密码误读,从而抑制蛋白质的合成。卡那霉素对某些微生物的生长和存活有很大的抑制作用，可以用来治疗有革兰氏革兰氏阳性菌和阴性菌引起的感染，被广泛用于食品生产和畜牧业。与此同时，卡那霉素的不合理使用会导致在肉类、牛奶和其他动物性食品中残留，然后通过食物链进入人体,可对人体产生极大的毒性，包括肾毒性、抗生素耐药性、神经肌肉阻滞作用和过敏反应等。为保护人类健康，欧盟规定牛奶中卡那霉素的最大允许残留量不超过150μg/kg,最近，中国颁布的标准是牛奶中卡那霉素的最大允许残留量不超过200μg/kg.传统的检测方法例如气相色谱，高效液相色谱法，液相色谱质谱联用法，酶联免疫法,毛细管电泳法等，虽然这些方法都是稳定可靠的，具有足够的精确性，但大多都存在耗时长，样品预处理繁琐，成本高等缺点，不能满足卡那霉素的实时快速检测要求。本发明提出了一种快速准确的卡那霉素检测方法，克服传统方法的不足，提高卡那霉素检测的灵敏度和准确性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有检测技术中存在的不足，如：检测成本高、时间长、预处理和检测步骤繁琐等，本发明提供了一种食品中卡那霉素的上转换荧光检测方法，通过纳米可控自组装制备荧光供体，构建稳态特异性卡那霉素的检测体系，消除背景荧光、其他因素干扰的影响，实现食品中卡那霉素的低成本、高灵敏和特异性检测。
为实现以上目的，本发明采取的技术方案如下：
步骤一，上转换荧光纳米材料的制备：将稀土氯化物(六水氯化钇、六水氯化镱、六水氯化钬和六水氯化铒)氯化钠以及聚乙烯亚胺加入到乙二醇剧烈搅拌溶解；然后再次向混合液中加入含氟化铵的乙二醇溶液，剧烈搅拌至溶液均一透明；反应液转移至反应釜中密封加热；冷却后用乙醇和水的混合液对反应产物清洗，真空干燥得到上转换荧光纳米材料。
步骤二，荧光纳米探针的制备：将一步合成法得到的上转换荧光纳米材料溶解于缓冲溶液中，通过戊二醛交联法，将卡那霉素适配体与上转换荧光纳米材料连接起来。
步骤三，特异性检测体系的构建：将卡那霉素适配体与上转换材料的耦合物分散在缓冲液中，然后加入与卡那霉素适配体互补链连接的BHQ3溶液，孵育，通过碱基互补配对原则形成上转换/卡那霉素适配体/适配体互补链/BHQ3复合物。
步骤四，卡那霉素检测标准曲线的建立：分别将不同浓度的卡那霉素溶液依次加入到特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值Y，建立卡那霉素浓度c与荧光强度信号特征值Y的关系，即得到卡那霉素检测标准曲线。
步骤五，牛奶中卡那霉素的检测：向牛奶样品中加入乙腈，沉淀蛋白之后，离心，去掉上层脂肪和下层沉淀，再用缓冲溶液稀释，加入到特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值，通过所构建的卡那霉素检测标准曲线，计算出食品样本中卡那霉素的含量。
步骤一中，所述六水氯化钇、六水氯化镱、六水氯化钆、六水氯化铒的用量比为0.53mmol：0.2mmol：0.25mmol：0.02mmol；所述聚乙烯亚胺和氯化钠的用量比为0.3g：0.15g；乙二醇的用量为15ml，所述搅拌溶解的时间为15min；氟化铵和乙二醇的用量比：0.18g：5mL；所述再次搅拌时间为20min；所述反应釜中反应条件为200℃反应12h。
步骤二中，所述上转换溶液与25％戊二醛的用量比为10ml：1.25ml；孵育时间为2h；加入的卡那霉素适配体的量为0.5OD，孵育时间为12h；缓冲液为PBS缓冲液，pH为7.4。
步骤三中，上转换适配体耦合物与BHQ3互补链用量比为10ml：0.8ml,所述BHQ3互补链浓度为1OD·ml-1，孵育时间为40min。
步骤四中，所述卡那霉素溶液的终浓度范围0.5-50μM；特异性检测体系总体积为1ml；所述测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值Y，具体是测定980nm激发光激发下654nm处的荧光强度值；所述卡那霉素检测标准曲线，是指构建特异性检测体系的荧光强度信号特征值与卡那霉素浓度关系的标准曲线，即Y＝165.64c+12015，决定系数R2＝0.9847。
步骤五中，所述牛奶样品与乙腈的用量比1：1，所述离心转速为7000rpm，时间为10min；最终检测终体积为1ml；所述测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值是980nm激发光激发下654nm处的荧光强度值。
上述的上转换荧光与BHQ3猝灭剂对食品中卡那霉素含量的检测方法中，所述的卡那霉素适配体序列为：5'-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3'，互补链序列为：5'-TCGGCTTAGCCTCAACCCCCA-3'。
与现有检测技术相比，本发明的有益效果如下：
1.本发明公开一种牛奶中卡那霉素的荧光检测方法，通过纳米可控自组装制备荧光供体，构建稳态特异性卡那霉素检测体系，消除背景荧光、蛋白质和脂肪等的干扰，实现牛奶中卡那霉素的低成本、高灵敏和快速特异性检测。
2.本发明构建的特异性混合检测体系，具体优化设计的适配体功能化上转换荧光纳米材料-互补链BHQ3混合体系，对卡那霉素具有强的荧光响应性，可有效消除背景荧光及其他因素的干扰，对卡那霉素的检测具有特异性。
3.本发明建立的卡那霉素浓度与荧光强度信号特征值的线性浓度范围为0.05-50μM，具有较宽的线性检测范围，检测限LOD为6nM，可以满足国标要求的牛奶中卡那霉素残留量检测。
附图说明
图1本发明制备的上转换荧光纳米材料的透射电镜图；
图2本发明不同卡那霉素浓度条件下检测体系的荧光信号；
图3本发明基于适配体功能化上转换与BHQ3互补链混合体系的卡那霉素检测标准曲线；
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
实施例1：
步骤一，上转换荧光纳米材料的制备：准确称取0.53mmol六水氯化钇、0.2mmol六水氯化镱、0.25mmol六水氯化钆、0.02mmol六水氯化铒、2.5mmol氯化钠以及0.3g聚乙烯亚胺溶解在15ml的乙二醇中，猛烈搅拌至溶液透明。5mmol氟化铵溶解于5mL乙二醇中并逐滴加入至上述透明溶液中搅拌30min；将混合溶液转移至50mL反应釜中，放置于200℃烘箱中反应12h；自然冷却至室温，用乙醇和水混合溶液对反应产物清洗2-3次，真空干燥得到上转换荧光纳米材料。
步骤二，荧光纳米探针的制备：将一步合成法得到的上转换荧光纳米材料溶解于缓冲溶液中，通过戊二醛交联法，将卡那霉素适配体与上转换荧光纳米材料连接起来。
荧光纳米探针的制备：准确称取10mg UCNPs分散在5ml的磷酸盐缓冲液(PBS)中，超声分散15min。然后加入25％的戊二醛1.25mL，在摇床上37℃缓慢摇动2小时。8500rpm，10min离心3次，去除多余的戊二醛。将活化的UCNPs分散在5mlPBS中，加入0.5OD卡那霉素适配体，在摇床上37℃缓慢摇动12小时，然后用PBS离心洗涤三次，去除多余的适配子，最后将材料分散在10ml的PBS缓冲液中,得到1mg·ml-1适配体-UCNPs复合物。
步骤三，特异性检测体系的构建：将卡那霉素适配体与上转换材料的耦合物分散在缓冲液中，然后加入800μL1 OD·ml-1的BHQ3-cDNA，37℃，孵育40min，通过碱基互补配对原则形成上转换/卡那霉素适配体/适配体互补链/BHQ3复合物。
BHQ3-cDNA用量的优化分析：向800μL的1mg·ml-1适配体-UCNPs溶液中，分别加入0μL，20μL，40μL，60μL，80μL，100μL1 OD·ml-1的BHQ3-cDNA，然后用PBS缓冲液将溶液体积补充至1ml，37℃，孵育30min，依次采集加入不同量的BHQ3-cDNA溶液的荧光光谱。当浓度梯度在0-80μL范围内，溶液荧光强度逐渐降低，达到80μL后，溶液荧光强度基本保持不变。
适配体-UCNPs耦合物与适配体互补链孵育时间的优化分析：向800μL的1mg·ml-1适配体-UCNPs溶液中，加入80μL 1OD·ml-1的cDNA-BHQ3，然后用PBS缓冲液将溶液体积补充至1ml，37℃，孵育0min，10min，20min，30min，40min，50min，依次采集孵育不同时间溶液的荧光光谱。当孵育时间在0-40min内，，溶液荧光强度逐渐降低，达到40min后，溶液荧光强度基本保持不变。
步骤四，卡那霉素检测标准曲线的建立：分别将不同浓度的卡那霉素溶液依次加入到上述构建的特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值Y，建立卡那霉素浓度c与荧光强度信号特征值Y的关系，即得到卡那霉素检测标准曲线。具体为，图2显示了0.5μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM不同浓度的卡那霉素溶液下特异性检测体系的荧光信号，随着卡那霉素浓度增加，654nm处的上转换荧光强度不断升高，构建654nm处的荧光强度与卡那霉素浓度关系的标准曲线。654nm处的荧光强度与卡那霉素浓度关系的标准曲线如图3。在最佳优化条件下，卡那霉素浓度在0.5-50μM内与荧光强度呈现出良好的线性关系，其线性关系为Y＝165.64c+12015，决定系数R2＝0.9847，检测限LOD为6nM。
特异性检测体系与卡那霉素溶液孵育时间的优化分析：向800μL的1mg·ml-1适配体-UCNPs溶液中，加入80μL 1OD·ml-1的BHQ3-cDNA，然后用PBS缓冲液将溶液体积补充至900μl，37℃，孵育40min，加入卡那霉素溶液，使溶液终浓度为30μM，用PBS缓冲液将溶液体积补充至1ml。依次测定孵育0min，10min，20min，30min，40min，50min后的荧光强度，当孵育时间在0-40min内，溶液荧光强度逐渐恢复，达到40min后，溶液荧光强度基本保持不变。
步骤五，牛奶中卡那霉素的检测：5ml牛奶以7000rpm的速度离心10min，去除上部脂肪。然后加入5ml乙腈，在4000rpm下离心10min，去除蛋白质。样品用PBS缓冲液稀释，得到不同浓度的卡那霉素乳样，加入到特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值，通过所构建的卡那霉素检测标准曲线，计算出牛奶样本中卡那霉素的含量。
实施例2：对7个卡那霉素标准样品，采用本发明实施例1所述方法和步骤，对卡那霉素含量进行测定，测定结果表1所示，可以看出本发明的方法与高效液相色谱法具有较高的符合度，表明本发明的方法具有较高准确度。
表1本发明方法与高效液相色谱法检测标准样品中卡那霉素的结果(单位，μM)
t＝0.34＜t0.05(6)＝2.447，P＞0.05
对3个牛奶样品，采用本发明实施例1所述方法和步骤，对牛奶中卡那霉素含量进行测定，测定结果表2所示，可以看出本发明的方法在实际样品中具有较好的准确度，应用前景较好。
表1本发明方法对牛奶中卡那霉素的检测结果(单位，μM)
将所构建的检测方法用于空白和其他抗生素标准液的检测时，如氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、四环素等不会引起体系荧光信号的变化，只有在体系中加入卡那霉素溶液时体系的荧光强度才会有明显的变化，结果表明，所构建的特异性检测体系对丙烯酰胺具有高特异性、高选择性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种基于上转换、BHQ3特异性体系的牛奶中卡那霉素含量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：上转换荧光纳米材料的制备：
将稀土氯化物、氯化钠以及聚乙烯亚胺加入到乙二醇剧烈搅拌溶解，稀土氯化物包括六水氯化钇、六水氯化镱、六水氯化钬和六水氯化铒；然后再次向混合液中加入含氟化铵的乙二醇溶液，剧烈搅拌至溶液均一透明；反应液转移至反应釜中密封加热；冷却后用乙醇和水的混合液对反应产物清洗，真空干燥得到上转换荧光纳米材料；
步骤二，荧光纳米探针的制备：将一步合成法得到的上转换荧光纳米材料溶解于缓冲溶液中，通过戊二醛交联法，将卡那霉素适配体与上转换荧光纳米材料连接起来；
步骤三，特异性检测体系的构建：将卡那霉素适配体与上转换荧光纳米材料的耦合物分散在缓冲液中，然后加入与卡那霉素适配体互补链连接的BHQ3溶液，孵育，通过碱基互补配对原则形成上转换/卡那霉素适配体/适配体互补链/BHQ3复合物；
步骤四，卡那霉素检测标准曲线的建立：分别将不同浓度的卡那霉素溶液依次加入到特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值Y，建立卡那霉素浓度c与荧光强度信号特征值Y的关系，即得到卡那霉素检测标准曲线；
步骤五，牛奶中卡那霉素的检测：向牛奶样品中加入乙腈，沉淀蛋白之后，离心，去掉上层脂肪和下层沉淀，再用缓冲溶液稀释，加入到特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值，通过所构建的卡那霉素检测标准曲线，计算出牛奶中卡那霉素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种基于上转换、BHQ3特异性体系的牛奶中卡那霉素含量检测方法，其特征在于，步骤二中，所述上转换荧光纳米材料溶液浓度为1mg·ml-1；上转换荧光纳米材料溶液与25％戊二醛的用量比为10ml：1.25ml；孵育时间为2h。
3.根据权利要求1所述的一种基于上转换、BHQ3特异性体系的牛奶中卡那霉素含量检测方法，其特征在于，步骤二中，加入的卡那霉素适配体的量为0.5OD，孵育时间为12h。
4.根据权利要求1所述的一种基于上转换、BHQ3特异性体系的牛奶中卡那霉素含量检测方法，其特征在于，步骤二中，所述缓冲液为PBS缓冲液，pH为7.4。
5.根据权利要求1所述的一种基于上转换、BHQ3特异性体系的牛奶中卡那霉素含量检测方法，其特征在于，步骤三中，卡那霉素适配体与上转换荧光纳米材料的耦合物和BHQ3溶液互补链用量比为10ml：0.8ml，所述BHQ3溶液互补链浓度为1OD·ml-1，孵育时间为40min。
6.根据权利要求1所述的一种基于上转换、BHQ3特异性体系的牛奶中卡那霉素含量检测方法，其特征在于，步骤四中，所述卡那霉素溶液的终浓度范围0.5-50μM；特异性检测体系总体积为1ml。
7.根据权利要求1所述的一种基于上转换、BHQ3特异性体系的牛奶中卡那霉素含量检测方法，其特征在于，步骤四中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值Y为：具体是测定980nm激发光激发下654nm处的荧光强度值为检测溶液的荧光强度信号特征值。
8.根据权利要求1所述的一种基于上转换、BHQ3特异性体系的牛奶中卡那霉素含量检测方法，其特征在于，步骤五中，牛奶样品与乙腈的用量比1：1，离心转速为7000rpm，时间为10min；最终检测终体积为1ml。
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Inventor after: Chen Quansheng Inventor after: Zhang Yunlian Inventor after: Li Huanhuan Inventor after: Liu Rui Inventor after: OuYang Qin Inventor before: Zhang Yunlian Inventor before: Chen Quansheng Inventor before: Liu Rui Inventor before: OuYang Qin Inventor before: Li Huanhuan |
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |