CN111239387A - 一种同时检测酪胺和组胺的荧光免疫方法 - Google Patents

一种同时检测酪胺和组胺的荧光免疫方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111239387A
CN111239387A CN202010056556.8A CN202010056556A CN111239387A CN 111239387 A CN111239387 A CN 111239387A CN 202010056556 A CN202010056556 A CN 202010056556A CN 111239387 A CN111239387 A CN 111239387A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tyramine
histamine
soluble
activated carboxyl
fluorescence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010056556.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111239387B (zh
Inventor
生威
张彪
王硕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University of Science and Technology
Original Assignee
Tianjin University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University of Science and Technology filed Critical Tianjin University of Science and Technology
Priority to CN202010056556.8A priority Critical patent/CN111239387B/zh
Publication of CN111239387A publication Critical patent/CN111239387A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111239387B publication Critical patent/CN111239387B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明提供了一种同时检测酪胺和组胺的荧光免疫方法，涉及荧光免疫检测技术领域；利用上转换纳米颗粒作为荧光标记物分别标记酪胺、组胺特异性抗体制备信号探针；利用抗体‑抗原的特异性识别作用，样品中待测物酪胺、组胺分别与磁性聚苯乙烯微球上包被原，竞争结合信号探针中上转换纳米粒子上对应的酪胺、组胺特异性抗体，形成免疫复合物，借助于磁分离作用获得免疫复合物混合物，在980nm激光激发下，在483nm和550nm处有特征发射峰分别代表酪胺和组胺的信号峰，实现混合体系下多种目标物高特异性、高灵敏度的同时检测。

Description

一种同时检测酪胺和组胺的荧光免疫方法
技术领域
本发明属于荧光免疫检测技术领域，具体涉及一种同时检测酪胺和组胺的荧光免疫方法。
背景技术
生物胺广泛存在于肉及其制品、水产品和发酵食品中，适量摄入生物胺能促进生长、增强代谢活力、增强免疫力，但是过量摄入生物胺则会引起头疼、腹部痉挛、呕吐等不良生理反应，严重的甚至引发中毒死亡。美国规定水产品中组胺含量不得超过50mg/kg；澳大利亚和瑞士规定葡萄酒中的组胺含量不得高于10mg/L，法国规定不得高于8mg/L，荷兰规定不得高于3.5mg/L，而德国更加严格，规定不得高于2mg/L；欧盟规定食品中组胺含量不得超过100mg/kg，酪胺含量不得超过100～800mg/kg。目前关于酪胺的检测主要依靠高效液相色谱等大型设备检测，样品前处理复杂，衍生化物质稳定性差，成本高昂。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时检测酪胺和组胺的荧光免疫方法，解决传统快速酶免疫检测只能检测单一目标物，实现食品中酪胺组胺同时检测，解决样品前处理复杂，大型设备检测成本高，衍生化物质稳定性差等问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种同时检测酪胺和组胺的荧光免疫方法，包括以下步骤：(1)利用酪胺抗体修饰活化后的羧基功能化发蓝光水溶性上转换纳米粒子，得酪胺抗体信号探针；
(2)利用组胺抗体修饰活化后的羧基功能化发绿光水溶性上转换纳米粒子，得组胺抗体信号探针；
(3)以酪胺-卵清白蛋白为包被原，偶联活化的羧基磁性聚苯乙烯微球，得特异性识别酪胺的感应探针；
(4)以组胺-卵清白蛋白为包被原，偶联活化的羧基磁性聚苯乙烯微球，得特异性识别组胺的感应探针；
(5)将所述酪胺抗体信号探针、组胺抗体信号探针、特异性识别酪胺的感应探针、特异性识别组胺的感应探针、酪胺标准品和组胺标准品混合后，得荧光免疫体系，将所述荧光免疫体系在18～25℃条件下孵育10～50min；
(6)将经孵育后的反应体系磁性分离后利用PBS缓冲溶液复溶，进行荧光检测，分别以酪胺标准品和组胺标准品的浓度为横坐标，以荧光强度差值的平均值和标准偏差为纵坐标，建立标准曲线；
(7)对待测样品进行酪胺和组胺的荧光强度检测，然后分别带入对应的标准曲线，得酪胺和组胺在所述待测样品中的浓度；
步骤(1)～(4)之间不存在时间上的先后关系。
优选的，步骤(1)所述活化后的羧基功能化发蓝光水溶性上转换纳米粒子的制备方法，包括：将四水合乙酸钇、四水合乙酸镱和四水合乙酸铥按照摩尔比78～90:9～12:1混合后，制备油溶性上转换纳米材料，利用配体交换法在所述油溶性上转换纳米材料表面修饰羧基，得活化后的羧基功能化发蓝光水溶性上转换纳米粒子。
优选的，步骤(1)所述酪胺抗体与活化后的羧基功能化发蓝光水溶性上转换纳米粒子的质量比为5～50:250。
优选的，步骤(2)所述活化后的羧基功能化发绿光水溶性上转换纳米粒子的制备方法，包括：将四水合乙酸钇、四水合乙酸镱和四水合乙酸铒按照摩尔比78～80:18～20:2混合后，制备油溶性上转换纳米材料，利用配体交换法在所述油溶性上转换纳米材料表面修饰羧基，得活化后的羧基功能化发绿光水溶性上转换纳米粒子。
优选的，步骤(2)所述组胺抗体与活化后的羧基功能化发绿光水溶性上转换纳米粒子的质量比为25～55:250。
优选的，步骤(3)所述包被原与活化的羧基磁性聚苯乙烯微球的质量比为30～90:250。
优选的，步骤(4)所述包被原与活化的羧基磁性聚苯乙烯微球的质量比为10～70:250。
优选的，步骤(5)所述荧光免疫体系的体积为300～500μL。
优选的，步骤(7)所述待测样品包括肉、肉制品、水产品和发酵产品。
优选的，在测定待测样品的荧光强度前，还包括预处理；所述预处理包括：取1～2g所述肉、肉制品和水产品，与4mL质量百分含量为3％的三氯乙酸水溶液混合后，斡旋震荡3～5min，10000rpm离心5min，取上清加入正己烷，用NaOH调pH至中性；或者取1～2mL所述发酵产品，调节pH值至中性。
本发明提供了一种同时检测酪胺和组胺的荧光免疫方法，通过合成在980nm激光激发下分别在483nm和550nm处有特征发射峰且没有其他干扰峰的上转换纳米颗粒(两个上转换纳米材料粒子混合液，荧光光谱图如图1所示，油溶性、水溶性混合液均没有干扰峰)，作为荧光标记物分别标记酪胺、组胺特异性抗体制备信号探针。利用抗体-抗原的特异性识别作用，样品中待测物酪胺、组胺分别与磁性聚苯乙烯微球上包被原，竞争结合信号探针中上转换纳米粒子上对应的酪胺、组胺特异性抗体，形成免疫复合物，借助于磁分离作用获得免疫复合物混合物，在980nm激光激发下，在483nm和550nm处有特征发射峰分别代表酪胺和组胺的信号峰，实现混合体系下多种目标物的同时检测。
在本发明所述方法中，待测物酪胺、组胺特异性抗体的使用实现了混合体系目标物的特异性识别，磁性纳米粒子的使用，实现了混合体系中信号免疫复合物的快速磁分离，多色上转换纳米颗粒的使用实现了混合体系中同一个激发光激发，多种信号同时出现，从而实现了复杂体系中多种目标物的同时、高特异性、高灵敏度的快速检测，检测效率提高，实用性强，适合广泛推广使用。
利用本发明所述方法，同时进行蓝光和绿光荧光强度测定，建立的标准曲线对酪胺检测范围为0.5～100μg/L，检测限为0.1μg/L，组胺检测范围为0.1～100μg/L，检测限为0.01μg/L。
附图说明
图1为蓝色与绿色油溶性和水溶性上转换纳米材料混合液的荧光光谱图；
图2为油溶性发蓝光上转换纳米材料透射电镜图；
图3为水溶性发蓝光上转换纳米材料透射电镜图；
图4为油溶性发绿光上转换纳米材料透射电镜图；
图5为水溶性发绿光上转换纳米材料透射电镜图；
图6为发蓝光上转换纳米材料的红外光谱图；
图7为发绿光上转换纳米材料的红外光谱图；
图8为不同酪胺浓度与相对应的荧光强度差值建立的标准曲线；
图9为不同组胺浓度与相对应的荧光强度差值建立的标准曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种同时检测酪胺和组胺的荧光免疫方法，包括以下步骤：(1)利用酪胺抗体修饰活化后的羧基功能化发蓝光水溶性上转换纳米粒子，得酪胺抗体信号探针；
(2)利用组胺抗体修饰活化后的羧基功能化发绿光水溶性上转换纳米粒子，得组胺抗体信号探针；
(3)以酪胺-卵清白蛋白为包被原，偶联活化的羧基磁性聚苯乙烯微球，得特异性识别酪胺的感应探针；
(4)以组胺-卵清白蛋白为包被原，偶联活化的羧基磁性聚苯乙烯微球，得特异性识别组胺的感应探针；
(5)将所述酪胺抗体信号探针、组胺抗体信号探针、特异性识别酪胺的感应探针、特异性识别组胺的感应探针、酪胺标准品和组胺标准品混合后，得荧光免疫体系，将所述荧光免疫体系在18～25℃条件下孵育10～50min；
(6)将经孵育后的反应体系磁性分离后利用PBS缓冲溶液复溶，进行荧光检测，分别以酪胺标准品和组胺标准品的浓度为横坐标，以荧光强度差值的平均值和标准偏差为纵坐标，建立标准曲线；
(7)对待测样品进行酪胺和组胺的荧光强度检测，然后分别带入对应的标准曲线，得酪胺和组胺在所述待测样品中的浓度；
步骤(1)～(4)之间不存在时间上的先后关系。
本发明利用酪胺抗体修饰活化后的羧基功能化发蓝光水溶性上转换纳米粒子，得酪胺抗体信号探针。本发明对所述酪胺抗体的来源和制备方法并没有特殊限定，优选以酪胺偶联牛血清白蛋白为免疫原，通过免疫新西兰大白兔获得含酪胺多克隆抗体的血清，经分离纯化所得。本发明所述活化后的羧基功能化发蓝光水溶性上转换纳米粒子的制备方法，优选包括：将四水合乙酸钇、四水合乙酸镱和四水合乙酸铥按照摩尔比78～90:9～12:1混合后，制备油溶性上转换纳米材料(其透射电镜表征如图2所示，红外表征如图6所示)，利用配体交换法在所述油溶性上转换纳米材料表面修饰羧基，得活化后的羧基功能化发蓝光水溶性上转换纳米粒子(其透射电镜表征如图3所示，红外表征如图6所示)。本发明所述四水合乙酸钇、四水合乙酸镱和四水合乙酸铥的摩尔比优选为90:9:1(参考Sensitivedetection ofbisphenol A in drinking water and river water using anupconversion nanoparticles-based fluorescence immunoassay in combination withmagnetic separation.(10.1039/c8ay01260a))。本发明所述酪胺抗体与活化后的羧基功能化发蓝光水溶性上转换纳米粒子的质量比优选为5～50:250，更优选为15:250。本发明利用所述酪胺抗体修饰活化后的羧基功能化发蓝光水溶性上转换纳米粒子，所述修饰的方法优选包括氨基羧基脱水缩合反应修饰。本发明在制备得到所述酪胺抗体信号探针后，优选还包括利用质量百分含量为10％的牛血清蛋白溶液封闭未结合位点，提高检测的准确性。
本发明利用组胺抗体修饰活化后的羧基功能化发绿光水溶性上转换纳米粒子，得组胺抗体信号探针。本发明对所述组胺抗体的来源和制备方法并没有特殊限定，优选为经杂交瘤技术获得的单克隆抗体。本发明所述活化后的羧基功能化发绿光水溶性上转换纳米粒子的制备方法，优选包括：将四水合乙酸钇、四水合乙酸镱和四水合乙酸铒按照摩尔比78～80:18～20:2混合后，制备油溶性上转换纳米材料(其透射电镜表征如图4所示，红外表征如图7所示)，利用配体交换法在所述油溶性上转换纳米材料表面修饰羧基，得活化后的羧基功能化发绿光水溶性上转换纳米粒子(参考Highly sensitive atrazine fluorescenceimmunoassay by using magnetic separation and upconversionnanoparticles aslabels..(10.1007/s00604-019-3667-3)，其透射电镜表征如图5所示，红外表征如图7所示)。本发明所述四水合乙酸钇、四水合乙酸镱和四水合乙酸铒按照摩尔比优选为79:19:2。
本发明所述油溶性上转换纳米材料的制备方法优选包括溶剂热法制备所述油溶性材料，具体包括：(1)四水合乙酸钇、四水合乙酸镱和四水合乙酸铥的按照所述摩尔比混合，6mL油酸，17mL十八烯依次加入到三颈烧瓶中，剧烈搅拌并在抽真空状态下升高温度至100℃；(2)温度达到100℃后，混合物持续搅拌，并在氩气的保护下，快速加热至160℃反应30min，反应完毕后自然冷却至室温；(3)准确称取100mg NaOH和148mg NH4F溶于10mL的甲醇，将该混合溶液逐滴加入到上述反应溶液中，室温下保持剧烈搅拌30min；(4)升高温度至80℃去除多余的甲醇，然后在抽真空状态下，将反应溶液加热至100℃并保持10min；(5)最后，保持通氩气并将反应溶液升温至300℃，保持1h；随后，自然冷却至室温；离心，并用乙醇洗涤三次后，放置于干燥烘箱中干燥，得到油溶性上转换材料。
本发明所述配体交换法优选的包括采用聚丙烯酸进行配体交换，在油溶性纳米材料表面修饰羧基，比例为1.5g聚丙烯酸：90mg油溶性纳米材料，制备水溶性上转换纳米材料。本发明利用所述组胺抗体修饰活化后的羧基功能化发绿光水溶性上转换纳米粒子，所述组胺抗体与所述活化后的羧基功能化发绿光水溶性上转换纳米粒子的质量比优选为25～55:250，更优选为50:250。本发明所述修饰的方法优选采用抗体氨基与材料的羧基脱水缩合反应，完成抗体在上转换纳米材上的偶联修饰，包被原的氨基与磁球的羧基脱水缩合反应，完成包被原在磁球上的偶联修饰。本发明在制备得到所述组胺抗体信号探针后，优选还包括利用质量百分含量为10％的牛血清蛋白溶液封闭未结合位点，提高检测的准确性。
本发明以酪胺-卵清白蛋白为包被原，偶联活化的羧基磁性聚苯乙烯微球，得特异性识别酪胺的感应探针。本发明所述包被原与活化的羧基磁性聚苯乙烯微球的质量比优选为30～90:250，更优选为50:250。本发明所述偶联和活化方法优选与上述相同，在此不再赘述。本发明所述酪胺-卵清白蛋白的偶联方法优选为戊二醛法偶联，酪胺与卵清蛋白的摩尔比例优选为60～100:1，更优选60:1。本发明将所述包被原与活化的羧基磁性聚苯乙烯微球进行偶联，所述偶联的方法优选参考Development of an Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay for the Detection ofTyramine as an Index ofFreshness inMeat and Seafood.(10.1021/acs.jafc.6b04422)。本发明在制备得到所述特异性识别酪胺的感应探针后，优选还包括利用质量百分含量为10％的牛血清蛋白溶液封闭未结合位点，提高检测的准确性。
本发明以组胺-卵清白蛋白为包被原，偶联活化的羧基磁性聚苯乙烯微球，得特异性识别组胺的感应探针。本发明所述包被原与活化的羧基磁性聚苯乙烯微球的质量比优选为10～70:250，更优选为50:250。本发明所述活化的羧基磁性聚苯乙烯微球的活化方法优选为利用EDC与NHS进行表面基团活化，其中磁球：EDC：NHS的质量比为1:2:1。本发明在制备得到所述特异性识别组胺的感应探针后，优选还包括利用质量百分含量为10％的牛血清蛋白溶液封闭未结合位点，提高检测的准确性。
在本发明中，制备得到两种感应探针和信号探针的顺序并没有特别限定，前后顺序可任意颠倒。
在本发明中，无论是制备水溶性发蓝光的上转换荧光纳米材料时还是在制备制备水溶性发绿光的上转换荧光纳米材料时，其配体交换法操作步骤都相同，以制备水溶性发蓝光的上转换荧光纳米材料时的配体交换法为例，优选包括：(1)称取1.5g聚丙烯酸(PAA)，加入到含有30mL一缩二乙二醇(DEG)的三颈烧瓶中，在氩气的保护下，加热反应溶液使温度升高至110℃，并保持剧烈搅拌反应1h；(2)称取90mg油溶性发蓝光上转换材料溶解于6mL甲苯中，将此混合溶液快速加入到反应液中，同时在110℃保持1h后，继续升高反应体系的温度至240℃保持1h；(3)反应完毕后自然冷却至室温，并加入适量稀盐酸溶液，离心收集沉淀产物；随后继续用超纯水离心洗涤沉淀三次，放置于干燥箱中干燥，得到水溶性上转换材料。
本发明将所述酪胺抗体信号探针、组胺抗体信号探针、特异性识别酪胺的感应探针、特异性识别组胺的感应探针、酪胺标准品和组胺标准品混合后，得荧光免疫体系，将所述荧光免疫体系在18～25℃条件下孵育10～50min。本发明优选先将所述酪胺抗体信号探针和组胺抗体信号探针混合，制备混合信号探针。本发明所述酪胺抗体信号探针和组胺抗体信号探针的混合比例优选为1:1。在本发明一个荧光免疫体系中，优选的包含一种浓度的酪胺标准品和组胺标准品，但是在其他的荧光免疫体系中，包含与之不同浓度的酪胺标准品和组胺标准品，从而形成包含酪胺标准品和组胺标准品浓度梯度的一系列荧光免疫体系，优选如0μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、50.0μg/L和100μg/L。本发明所述荧光免疫体系的体积优选为300～500μL，更优选为400μL。本发明所述荧光免疫体系中优选的包括：混合信号探针5～35μL、特异性识别酪胺的感应探针5～35μL、特异性识别组胺的感应探针5～35μL、酪胺标准品和组胺标准品各50μL，余量为PBS缓冲溶液；更优选包括：混合信号探针25μL、特异性识别酪胺的感应探针25μL、特异性识别组胺的感应探针25μL、酪胺标准品和组胺标准品各50μL，余量为PBS缓冲溶液。本发明所述混合信号探针中酪胺抗体信号探针的浓度优选为5mg/mL，组胺抗体信号探针的浓度优选为2.5mg/mL，溶剂为pH7.4PBS缓冲液。
本发明将所述荧光免疫体系在18～25℃条件下孵育10～50min，所述孵育的时间优选为30min。本发明在所述孵育过程中优选伴随搅拌，所述搅拌的速率优选为200～300rpm，更优选为250rpm。
本发明将经孵育后的反应体系磁性分离后利用PBS缓冲溶液复溶，进行荧光检测，分别以酪胺标准品和组胺标准品的浓度为横坐标，以荧光强度差值的平均值和标准偏差为纵坐标，建立标准曲线。本发明所述磁性分离的方案优选包括商业化磁分离架分离。本发明将经过所述磁性分离后的体系优选利用浓度为0.01mol/L的PBS缓冲溶液(pH 7.4)清洗5次，而后复溶。本发明对所述荧光检测的方法并没有特殊限定，优选在980nm激光激发下，分别收集在483nm和550nm处的信号峰。本发明在建立标准曲线时，优选以单一标准品建立，以酪胺标准品建立的标准曲线为例，其横坐标为酪胺标准品的浓度，纵坐标为荧光强度差值的平均值和标准偏差，其中荧光强度差值优选为无酪胺标准品反应体系的蓝光光谱峰值与不同浓度酪胺标准品反应体系蓝光光谱峰值的差值。
本发明对待测样品进行酪胺和组胺的荧光强度检测，然后带入对应的标准曲线，得酪胺和组胺在所述待测样品中的浓度。本发明所述待测样品优选包括肉、肉制品、水产品和发酵产品。本发明在测定待测样品的荧光强度前，优选还包括预处理；所述预处理优选包括：取1～2g所述肉、肉制品和水产品，与4mL质量百分含量为3％的三氯乙酸水溶液混合后，斡旋震荡3～5min，10000rpm离心5min，取上清加入正己烷，用NaOH调pH至中性；取1～2mL所述发酵产品，调节pH值至中性。本发明所述检测时的体系中包括：中性预处理提取液(含待测物)50μL，混合信号探针25μL，感应探针各25μL，PBS补足体积到400μL，待测物与感应探针竞争信号探针抗体，经磁分离去上清，得信号探针与感应探针复合物，复溶到400μL。
下面结合实施例对本发明提供的同时检测酪胺和组胺的荧光免疫方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)12μg酪胺抗体(酪胺抗体以酪胺偶联牛血清白蛋白为免疫原，通过免疫新西兰大白兔获得含酪胺多克隆抗体的血清，经分离纯化所得)修饰250μg活化后的羧基功能化发蓝光水溶性上转换纳米粒子(由四水合乙酸钇：四水合乙酸镱：四水合乙酸铥摩尔比为90:9:1先制备油溶性上转换纳米材料，后经配体交换法在表面修饰羧基，制备成水溶性上转换纳米材料)，50μg组胺抗体(组胺抗体经杂交瘤技术获得的单克隆抗体)修饰250μg活化后的羧基功能化发绿光水溶性上转换纳米粒子(由四水合乙酸钇：四水合乙酸镱：四水合乙酸铒摩尔比为79:19:2先制备油溶性上转换纳米材料，后经配体交换制备水溶性上转换纳米材料)制备两种信号探针；
(2)50μg酪胺-卵清白蛋白为包被原，偶联250μg活化的羧基磁性聚苯乙烯微球，50μg组胺-卵清白蛋白为包被原，偶联250μg活化的羧基磁性聚苯乙烯微球，分别制备特异性识别酪胺组胺的感应探针；
(3)混合信号探针25μL，不同浓度酪胺组胺标准品50μL，两种感应探针分别为25μL，反应总体积为400μL，室温转速250rpm孵育30min；
(4)反应体系经磁性分离，保留两种信号探针与感应探针的结合物，0.01MpH7.4PBS清洗5次，复溶，进行荧光检测，以酪胺组胺标准品的浓度为横坐标，以荧光强度差值(无酪胺组胺标准品反应体系的蓝光、绿光光谱峰值与不同浓度酪胺组胺标准品反应体系蓝光、绿光光谱峰值的差值)的平均值(A)和标准偏差(SD)为纵坐标，建立标准曲线；利用不同酪胺浓度与相对应的荧光强度差值建立的标准曲线如图8所示，y＝420.2049lg(x)+412.9800，R2＝0.9988，其中x为酪胺浓度，y为荧光差值；利用不同组胺浓度与相对应的荧光强度差值建立的标准曲线如图9所示，y＝728.7510lg(x)+1515.3156，R2＝0.9954，其中x为组胺浓度，y为荧光差值；
(5)在上述操作的基础上利用荧光免疫分析方法，对肉及其制品、水产品及发酵产品提取液中的酪胺和组胺含量进行检测。
肉及其制品和水产品取1g，加入4mL 3％三氯乙酸斡旋震荡5min，10000rpm 5min离心，上清加入正己烷，用NaOH调pH至中性，进行荧光强度检测；发酵产品取1mL，调pH至中性后进行荧光强度检测。
经测算，各样品中酪胺和组胺含量分别为：猪肉酪胺为3.50mg/kg，组胺2.35mg/kg；腊肉酪胺2.17mg/kg，组胺1.56mg/kg；酱油酪胺30.85mg/kg，组胺17.82mg/kg；米酒酪胺1.61mg/kg，组胺1.26mg/kg。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种同时检测酪胺和组胺的荧光免疫方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用酪胺抗体修饰活化后的羧基功能化发蓝光水溶性上转换纳米粒子，得酪胺抗体信号探针；
(2)利用组胺抗体修饰活化后的羧基功能化发绿光水溶性上转换纳米粒子，得组胺抗体信号探针；
(3)以酪胺-卵清白蛋白为包被原，偶联活化的羧基磁性聚苯乙烯微球，得特异性识别酪胺的感应探针；
(4)以组胺-卵清白蛋白为包被原，偶联活化的羧基磁性聚苯乙烯微球，得特异性识别组胺的感应探针；
(5)将所述酪胺抗体信号探针、组胺抗体信号探针、特异性识别酪胺的感应探针、特异性识别组胺的感应探针、酪胺标准品和组胺标准品混合后，得荧光免疫体系，将所述荧光免疫体系在18～25℃条件下孵育10～50min；
(6)将经孵育后的反应体系磁性分离后利用PBS缓冲溶液复溶，进行荧光检测，分别以酪胺标准品和组胺标准品的浓度为横坐标，以荧光强度差值的平均值和标准偏差为纵坐标，建立标准曲线；
(7)对待测样品进行酪胺和组胺的荧光强度检测，然后分别带入对应的标准曲线，得酪胺和组胺在所述待测样品中的浓度；
步骤(1)～(4)之间不存在时间上的先后关系。
2.根据权利要求1所述荧光免疫方法，其特征在于，步骤(1)所述活化后的羧基功能化发蓝光水溶性上转换纳米粒子的制备方法，包括：将四水合乙酸钇、四水合乙酸镱和四水合乙酸铥按照摩尔比78～90:9～12:1混合后，制备油溶性上转换纳米材料，利用配体交换法在所述油溶性上转换纳米材料表面修饰羧基，得活化后的羧基功能化发蓝光水溶性上转换纳米粒子。
3.根据权利要求1或2所述荧光免疫方法，其特征在于，步骤(1)所述酪胺抗体与活化后的羧基功能化发蓝光水溶性上转换纳米粒子的质量比为5～50:250。
4.根据权利要求1所述荧光免疫方法，其特征在于，步骤(2)所述活化后的羧基功能化发绿光水溶性上转换纳米粒子的制备方法，包括：将四水合乙酸钇、四水合乙酸镱和四水合乙酸铒按照摩尔比78～80:18～20:2混合后，制备油溶性上转换纳米材料，利用配体交换法在所述油溶性上转换纳米材料表面修饰羧基，得活化后的羧基功能化发绿光水溶性上转换纳米粒子。
5.根据权利要求1或4所述荧光免疫方法，其特征在于，步骤(2)所述组胺抗体与活化后的羧基功能化发绿光水溶性上转换纳米粒子的质量比为25～55:250。
6.根据权利要求1所述荧光免疫方法，其特征在于，步骤(3)所述包被原与活化的羧基磁性聚苯乙烯微球的质量比为30～90:250。
7.根据权利要求1所述荧光免疫方法，其特征在于，步骤(4)所述包被原与活化的羧基磁性聚苯乙烯微球的质量比为10～70:250。
8.根据权利要求1所述荧光免疫方法，其特征在于，步骤(5)所述荧光免疫体系的体积为300～500μL。
9.根据权利要求1所述荧光免疫方法，其特征在于，步骤(7)所述待测样品包括肉、肉制品、水产品和发酵产品。
10.根据权利要求9所述荧光免疫方法，其特征在于，在测定待测样品的荧光强度前，还包括预处理；所述预处理包括：
取1～2g所述肉、肉制品和水产品，与4mL质量百分含量为3％的三氯乙酸水溶液混合后，斡旋震荡3～5min，10000rpm离心5min，取上清加入正己烷，用NaOH调pH至中性；
或者
取1～2mL所述发酵产品，调节pH值至中性。
CN202010056556.8A 2020-01-18 2020-01-18 一种同时检测酪胺和组胺的荧光免疫方法 Active CN111239387B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010056556.8A CN111239387B (zh) 2020-01-18 2020-01-18 一种同时检测酪胺和组胺的荧光免疫方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010056556.8A CN111239387B (zh) 2020-01-18 2020-01-18 一种同时检测酪胺和组胺的荧光免疫方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111239387A true CN111239387A (zh) 2020-06-05
CN111239387B CN111239387B (zh) 2023-06-23

Family

ID=70871219

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010056556.8A Active CN111239387B (zh) 2020-01-18 2020-01-18 一种同时检测酪胺和组胺的荧光免疫方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111239387B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112028786A (zh) * 2020-08-12 2020-12-04 华南农业大学 一种酪胺半抗原、抗原和抗体及其制备方法与应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4900661A (en) * 1985-02-14 1990-02-13 Institut Pasteur Paris Method for immunological determination of amines, monoclonal antibodies and kit of reagents for carrying out the method
CN102023147A (zh) * 2010-09-29 2011-04-20 江南大学 一种适配体功能化磁性纳米材料磁分离-上转换荧光纳米材料标记检测赭曲霉毒素a的方法
US20120295287A1 (en) * 2009-11-06 2012-11-22 Pharmasan Labs, Inc. Preparing hapten-specific antibodies and their application for immunodiagnostics and research
JP2014021016A (ja) * 2012-07-20 2014-02-03 National Univ Corp Shizuoka Univ 試料中の標的物質を検出又は定量する方法及びキット
CN103940792A (zh) * 2014-02-20 2014-07-23 江南大学 一种基于多色上转换荧光标记同时检测三种食源性致病菌的方法
CN105399639A (zh) * 2015-12-14 2016-03-16 天津科技大学 一种酪胺人工抗原和抗体及其制备方法与应用
CN108562679A (zh) * 2018-04-17 2018-09-21 安徽润安信科检测科技有限公司 一种白酒中八种生物胺的uplc-ms/ms检测方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4900661A (en) * 1985-02-14 1990-02-13 Institut Pasteur Paris Method for immunological determination of amines, monoclonal antibodies and kit of reagents for carrying out the method
US20120295287A1 (en) * 2009-11-06 2012-11-22 Pharmasan Labs, Inc. Preparing hapten-specific antibodies and their application for immunodiagnostics and research
CN102023147A (zh) * 2010-09-29 2011-04-20 江南大学 一种适配体功能化磁性纳米材料磁分离-上转换荧光纳米材料标记检测赭曲霉毒素a的方法
JP2014021016A (ja) * 2012-07-20 2014-02-03 National Univ Corp Shizuoka Univ 試料中の標的物質を検出又は定量する方法及びキット
CN103940792A (zh) * 2014-02-20 2014-07-23 江南大学 一种基于多色上转换荧光标记同时检测三种食源性致病菌的方法
CN105399639A (zh) * 2015-12-14 2016-03-16 天津科技大学 一种酪胺人工抗原和抗体及其制备方法与应用
CN108562679A (zh) * 2018-04-17 2018-09-21 安徽润安信科检测科技有限公司 一种白酒中八种生物胺的uplc-ms/ms检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANNA HERRERA-CHACÓN 等: "Integrating Molecularly Imprinted Polymer Beads in Graphite-Epoxy Electrodes for Voltammetric Biosensing of Histamine in Wines" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112028786A (zh) * 2020-08-12 2020-12-04 华南农业大学 一种酪胺半抗原、抗原和抗体及其制备方法与应用
CN112028786B (zh) * 2020-08-12 2022-02-11 华南农业大学 一种酪胺半抗原、抗原和抗体及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111239387B (zh) 2023-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wu et al. Magnetic nanobead-based immunoassay for the simultaneous detection of aflatoxin B1 and ochratoxin A using upconversion nanoparticles as multicolor labels
CN104280542B (zh) 基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法
US20200408689A1 (en) Method for preparing a ratiometric fluorescent sensor for phycoerythrin based on a magnetic molecularly imprinted core-shell polymer
US6225046B1 (en) Method for detecting microorganisms
CN112014374B (zh) 一种表面增强拉曼免疫分析平面传感器及制备方法和应用
CN112067515B (zh) 一种均相检测大分子抗原的动态光散射免疫方法
CN111551724B (zh) 一种荧光探针、检测四环素的方法及应用
CN107328939B (zh) 一种基于生物素化抗原或抗体-无机盐杂化纳米花的酶联免疫吸附测定方法
CN113092766A (zh) 多种真菌毒素的检测试剂盒，其制备方法及检测方法和应用
CN108333344A (zh) 高灵敏度的化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法和应用
CN111830255B (zh) 一种诺氟沙星的检测方法
Sun et al. A nonenzymatic optical immunoassay strategy for detection of Salmonella infection based on blue silica nanoparticles
CN114152742A (zh) 包含磁性发光微球的光激化学发光免疫检测的试剂盒及其应用
JP4102840B2 (ja) フィコビリソーム、誘導体およびその使用
CN111139288B (zh) 基于适配体识别-杂交链式反应同时检测金黄色葡萄球菌肠毒素a、b的荧光传感器
CN111239387A (zh) 一种同时检测酪胺和组胺的荧光免疫方法
CN108535486A (zh) 一种基于铕标记的氯霉素免疫荧光测定方法
CN109738629A (zh) 一种基于新型sers探针的拉曼免疫检测方法
CN113777297A (zh) 一种基于磁性纳米颗粒的荧光差分快速检测方法
Eliseeva et al. Increasing the efficiency of lanthanide luminescent bioprobes: bioconjugated silica nanoparticles as markers for cancerous cells
CN109870442B (zh) 一种甲基苯丙胺包被抗原、其制备方法及利用其检测甲基苯丙胺的方法
CN116338171A (zh) 一种免洗均相检测方法
CN112697761B (zh) 一种基于上转换、bhq3特异性体系的牛奶中卡那霉素含量检测方法
CN101923089A (zh) 一种黄曲霉毒素b1磁分离荧光定量检测试剂盒的制备方法
CN105181956B (zh) 基于金属离子特异响应的荧光检测法在免疫检测中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant