CN113777297A - 一种基于磁性纳米颗粒的荧光差分快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于磁性纳米颗粒的荧光差分快速检测方法。1）利用双溶剂法和表面修饰制备具有单分散性和稳定性的锰铁氧体磁性纳米颗粒（MNP）；2）修饰后的MNP用于共价或者非共价结合配体Ａ；3）制备荧光标记的配体Ｂ，将荧光标记的配体Ｂ与MNP－配体Ａ复合物、目标物处在同一反应体系时，形成MNP－配体Ａ－目标物－荧光标记的配体Ｂ三聚复合物；4）施加磁场移除三聚复合物，用特定波长的光来激发荧光，检测反应体系中移除三聚复合物前后的荧光强度，利用其荧光强度差值来单调标定目标物浓度。该方法避免了样品前处理过程，运用荧光差值来表征目标物的浓度，提高了信噪比和稳定性，可运用腔增强技术增加荧光激发强度提高检测的灵敏度和检测限。

Description

一种基于磁性纳米颗粒的荧光差分快速检测方法
技术领域
本发明属于光学传感领域，涉及一种基于磁性纳米颗粒的荧光差分快速检测方法。
背景技术
磁性纳米颗粒运用通过物理或者化学方法制备的一种具有众多优异特性的功能材料。其独特的磁响应特性在分析传感领域具有极大的应用价值。通过表面改性或者功能团嫁接等方式在其表面修饰上氨基、羧基或者羟基可以得到功能化的磁性纳米颗粒，对于在生物化学等大分子的偶联创造了便利的条件。
作为近年来发展起来的新型磁性材料，磁性纳米颗粒具有较大的比表面积，较高的饱和磁矩以及超顺磁性等特点，其应用范围已经从传统的磁学范围扩展到与之相关的交叉学科领域。其中以免疫分析领域应用最为广泛。
在人体体液中实现针对一些生物标志物的免疫分析最大的挑战在于目标分析物的分离提纯，由于复杂环境中含有诸多杂质，这些杂质会非特异性的吸附在传感界面上导致信号干扰，而传统的免疫分析方法往往会带来离心，多次洗涤的步骤，导致时间延长，步骤繁琐。而用磁体来控制磁性钠米颗粒的空间位置，根据此特性可以利用其在复杂环境的样品中来捕获、分离、预浓缩分析物并将其带到传感界面上，消除了离心等步骤，缩短了分析时间，提高了检测特异性。
传统的基于荧光的分析检测往往是通过测定荧光标记了的纳米颗粒的荧光强度来表征目标分析物的浓度。此方法忽略了颗粒本身光学性质对信号的影响，比如在磁颗粒的存在下，其对于某些波长的光会有较强的吸收会导致信号的减弱。而且在痕量分析物的情况下，由于仪器自身的限制往往会测不到信号，致使不能达到更低的检测限。且在检测生物大分子时，一般是在水相中进行。水对入射光存在着一定的吸收，因此会提高背景信号。
另外，常用的荧光检测是将目标物置于分析皿中，激发光在分析皿的一端单次入射，接收器在分析皿另一端接收荧光信号。在目标物浓度很低时，激发的荧光信号极弱难以探测。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提出了一种基于磁性纳米颗粒的荧光差分快速检测方法，利用磁性纳米粒子的固有属性，将其作为载体直接在复杂环境中捕获目标物，简化了实验步骤并解决了现有技术中对复杂环境中目标分析物分离提纯的问题；利用荧光差分检测方法，消除了颗粒自身吸光度的影响，选择蓝绿光作为入射光，减少了水对检测结果的影响，提高了系统的稳定性和信噪比；利用腔增强技术提高检测系统的灵敏度。
一种基于磁性纳米颗粒的荧光差分快速检测方法，步骤如下：1）利用双溶剂法和表面修饰制备具有单分散性和稳定性的锰铁氧体磁性纳米颗粒（MNP）；2）修饰后的MNP用于共价或者非共价结合配体Ａ，得到MNP－配体Ａ复合物，所述的配体Ａ可特异性的结合目标物；3）制备荧光标记的配体Ｂ，荧光标记的配体Ｂ可特异性的结合目标物，将荧光标记的配体Ｂ与MNP－配体Ａ复合物、目标物处在同一反应体系时，形成MNP－配体Ａ－目标物－荧光标记的配体Ｂ三聚复合物；4）施加磁场移除三聚复合物，用特定波长的光来激发荧光，检测反应体系中移除三聚复合物前后的荧光强度，利用其荧光强度差值来单调标定目标物浓度。
步骤1）在所述的MNP进行表面修饰，采用聚阳离子化合物聚乙烯亚胺来改变表面的电荷性质并增大zeta绝对值，使其表面带有一层正电荷保证颗粒在液相体系中的单分散性，避免团聚。
所述的方法，利用磁性纳米粒子固有的与磁铁相吸的属性，将其作为载体直接在复杂环境中捕获目标物，通过外加磁场实现目标物分离。
步骤2）中，所述的配体Ａ包括抗原、抗体或者核酸；步骤３）中，所述的配体Ｂ包括抗原、抗体或者核酸；所述的荧光标记包括FITC、Cy系列、 Alexa Flour 系列、eFlour系列、Eu 系列，或者量子点。
所述的方法，在病毒目标物浓度较高时，激发光单次入射，分别检测加入病毒目标物前后的荧光强度并作荧光差值，表征病毒目标物浓度。当病毒目标物浓度较低时，通过外加一对高反镜形成FP腔的腔增强装置来进一步提高检测病毒抗体的灵敏度，此时入射的激发光在高反腔内多次反射增加光程进而增强激发荧光强度，提高检测病毒目标物的检测限。
所述的方法，运用荧光差值法来表征目标物的浓度，消除多余的荧光标记配体Ｂ对荧光检测的贡献；选择蓝绿光作为入射激发光，降低水对入射光的吸收对检测结果的影响。
本发明的有益效果:
本发明的一种基于磁性纳米颗粒的荧光差分检测方法简化了实验步骤、缩短了分析测试时间、消除了磁颗粒本身对于荧光信号的干扰，降低了水对检测体系的干扰，提高了信噪比，利用腔增强技术，即使极低的目标物浓度下，依旧可以得到表征，消除了免疫荧光分析中光电探测器自身的限制，提高了该方法的检测限。
1）通过把磁微粒分离、差分检测整合到一个检测方法中，本发明操作简单、分析时间短、准确性高、检测限低。相较于传统免疫分析方法，该方法不需要样品前处理和离心步骤，只需要施加外加磁场便可实现对于目标物的提取和分离，步骤更加简便，缩短了分析时间，而且适合在复杂环境中对目标物的分析测定。
2）运用荧光差值来表征目标物的浓度，消除了颗粒自身吸光度的影响提高了检测体系的精确度；检测时选择蓝绿光作为入射光，降低了水的吸收对检测结果的影响，提高了检测体系的信噪比。
3）运用由一对高反镜组成的FP腔可以通过激发光在内多次反射增加光程和荧光信号的腔增强技术来进一步提高系统检测灵敏度。
附图说明
图1为本发明实施例的一种原理流程图。
图2为本发明实施例的磁性纳米颗粒的电镜图。
图3为本发明实施例的磁性纳米颗粒的zeta电位图。
图4为本发明实施例2中不同浓度梯度抗原荧光强度图。
图5为本发明实施例2中荧光差值数值表征抗原浓度梯度图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步阐述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种基于磁性纳米颗粒的针对新型冠状病毒的荧光差分快速检测方法，如图1所示。
1、磁性纳米颗粒的制备
(1) 将360mg的FeCl3·6H2O与131.94mg的MnCl2加入到20mL一缩二乙二醇(DEG)与乙二醇(EG)的混合溶液中，其中含有两种溶剂各10mL，磁力搅拌20min，直到溶液呈现澄清透明状态。
(2) 在上述体系中加入2mg的PVP粉末，转移到120℃的烘箱中，加热10min，使得PVP粉末完全溶解，溶液呈现透明状。
(3) 停止加热后，1.5g乙酸钠加入其中，磁力搅拌30min。
(4) 之后将(3)中溶液转移到50mL的高压反应釜中，密封好后放入烘箱中，设置温度为205℃，反应10h。
(5) 反应结束后，待烘箱降温至室温，取出反应釜将产物取出置于锥形瓶中，用磁铁收集，并用乙醇洗涤五次。
(6) 将黑色产物置于真空干燥箱中，干燥24h，得到MnFe2O4磁性纳米颗粒粉末。
(7) 称量1g PEI超声溶解到200mL去离子水中，制备5mg/mL的PEI溶液。
(8) 称量100mg之前制备好的MnFe2O4颗粒粉末加入到制备好的PEI溶液中，超声20分钟，得到PEI功能化的MNP。
(9) 用磁分离的方法，用去离子水清洗5次，将黑色产物置于真空干燥箱中，干燥24h。
(10) 采用透射电镜表征颗粒形态与粒径大小如图2所示，zeta电位表征如图3所示。
2、磁性纳米颗粒偶联S蛋白
(1) 1mg PEI功能化的MNP,4mg Mal-PEG2000-Biotin溶解于THF溶剂中；
(2) 搅拌条件下，逐滴加入到9mL 1×PBS缓冲液中；
(3) 超声处理1分钟，持续搅拌30分钟。
(4) 施加外部磁场分离磁颗粒，用1×PBS缓冲液洗涤三次，重悬于1mL 1×PBS缓冲液中。
(5) 将5uL 链霉亲和素标记的S蛋白(0.6mg/mL)加入到步骤(4)得到的溶液中，孵育1小时。
(6) 通过磁分离的方法，用1×PBS缓冲液洗涤三次，去除过量的S蛋白，重悬于100uL 1×PBS缓冲液中。
3、MNP-S蛋白耦合物抓捕血液中2019-nCoV病毒抗体
(1) 将10uL偶联的磁性纳米颗粒MNP-S蛋白耦合物加入到1.5mL离心管中，加入1mL含有新型冠状病毒2019-nCoV抗体的人体全血样品，在震荡条件下(750rpm，37℃)，孵育30分钟。
(2) 采用磁分离方法，用1×PBS缓冲液洗涤三次，得到MNP-S蛋白-2019-nCoV抗体复合物。
4、免疫荧光分析
(1) 1mL 溶于1×PBS缓冲液中的FITC标记的兔抗人IgM，在相对2019-nCoV病毒抗体为过量的浓度条件下采用490nm波长的光源作为激发光，在520nm波长处探测其荧光发射强度。
(2) 将步骤3中的MNP-S蛋白-2019-nCoV抗体复合物加入其中，振荡条件下(750rpm，37℃),孵育30分钟。
(3) 施加外部磁场，将磁颗粒沉降在试管底部，吸取上清液在同样测量条件下探测其在520nm波长的荧光发射强度。
(4) 将步骤(1)中测得数值与步骤(3)测得数值做差，得到的荧光信号差值来表征样品中抗原浓度。
实施例2
本发明提出一种基于磁性纳米颗粒的荧光差分检测方法，做了量子点修饰抗体抗原荧光差分检测：
1、625nm ZnCdSe/ZnS量子点与驴抗羊抗体的偶联
使用活化酯法对羧基水溶性ZnCdSe/ZnS量子点和驴抗羊抗体进行偶联。
（1）将50μl 625nm量子点加入到1.5ml离心管中，加入6μl EDC活化剂 pH 7.4搅拌均匀。
（2）加入20μg驴抗羊抗体搅拌均匀，随后使用EDC活化剂 pH 10将溶液总体积添加至400μl，置于避光环境下静置反应3h。
（3）将结合的产物溶液在4℃ 10000rpm 条件下离心30min取上清液，即可得到625nm量子点偶联驴抗羊抗体的产物。
2、对不同浓度梯度羊抗兔抗体（抗原）的捕获
（1）使用PBS缓冲液（pH 7.4）对抗原进行不同梯度浓度的稀释。
（2）将10μl 链霉亲和素标记的磁性纳米颗粒加入到离心管中，加入10μl 生物素标记的兔抗体进行结合，室温下孵育1h。
（3）采用磁分离方法，用PBS缓冲液洗涤三次，得到MNP-兔抗体耦合物。
（4）在1.5ml离心管中分别加入10μl 稀释成不同浓度梯度的羊抗兔抗体，使羊抗兔抗体与MNP-兔抗体耦合物进行特异性的结合，室温下孵育1h。
（5）采用磁分离方法，用PBS缓冲液洗涤三次，得到MNP-兔抗体-羊抗兔抗体复合物。
（6）在MNP-兔抗体-羊抗兔抗体复合物中加入定量的625nm量子点偶联的二抗，在室温下孵育1h，使MNP-兔抗体-羊抗兔抗体复合物与其驴抗羊抗体进行特异性的结合。
3、免疫荧光分析
（1）先对加入量子点偶联二抗耦合物的荧光进行测定，用蓝紫光激发起荧光，确定其荧光强度，获取荧光光谱图3。
（2）对步骤2（6）形成的MNP-兔抗体-羊抗兔抗体-驴抗羊抗体耦合物的溶液施加外部磁场，将磁颗粒沉降在试管底部，吸取不同浓度目标物所对应的上清液在相同的测量条件下探测其荧光强度，获得荧光光谱图4。
（3）将步骤(1)中测得数值与步骤(2)测得荧光强度数值做差，得到不同的荧光信号差值来表征抗原的浓度（图5）。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种基于磁性纳米颗粒的荧光差分快速检测方法，其特征在于，步骤如下：1）利用双溶剂法和表面修饰制备具有单分散性和稳定性的锰铁氧体磁性纳米颗粒（MNP）；2）修饰后的MNP用于共价或者非共价结合配体Ａ，得到MNP－配体Ａ复合物，所述的配体Ａ可特异性的结合目标物；3）制备荧光标记的配体Ｂ，荧光标记的配体Ｂ可特异性的结合目标物，将荧光标记的配体Ｂ与MNP－配体Ａ复合物、目标物处在同一反应体系时，形成MNP－配体Ａ－目标物－荧光标记的配体Ｂ三聚复合物；4）施加磁场移除三聚复合物，用特定波长的光来激发荧光，检测反应体系中移除三聚复合物前后的荧光强度，利用其荧光强度差值来单调标定目标物浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）在所述的MNP进行表面修饰，采用聚阳离子化合物聚乙烯亚胺来改变表面的电荷性质并增大zeta绝对值，使其表面带有一层正电荷保证颗粒在液相体系中的单分散性，避免团聚。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用磁性纳米粒子固有的与磁铁相吸的属性，将其作为载体直接在复杂环境中捕获目标物，通过外加磁场实现目标物分离。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述的配体Ａ包括抗原、抗体或者核酸；步骤３）中，所述的配体Ｂ包括抗原、抗体或者核酸；所述的荧光标记包括FITC、Cy系列、 Alexa Flour 系列、eFlour系列、Eu 系列，或者量子点。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在病毒目标物浓度较高时，激发光单次入射，分别检测加入病毒目标物前后的荧光强度并作荧光差值，表征病毒目标物浓度；当病毒目标物浓度较低时，通过外加一对高反镜形成FP腔的腔增强装置来进一步提高检测病毒抗体的灵敏度，此时入射的激发光在高反腔内多次反射增加光程进而增强激发荧光强度，提高检测病毒目标物的检测限。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，运用荧光差值法来表征目标物的浓度，消除多余的荧光标记配体Ｂ对荧光检测的贡献；选择蓝绿光作为入射激发光，降低水对入射光的吸收对检测结果的影响。
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