KR101743150B1 - 체외진단 시약용 형광 실리카 나노입자, 이의 제조 방법 및 이를 이용하는 분자 면역 진단 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 체외진단 시약용 형광 실리카 나노입자, 이의 제조 방법 및 이를 이용하는 분자 면역 진단 키트에 관한 것으로서, (1) 란탄족 금속 이온과 배위 결합할 수 있는 킬레이트 리간드; 및 증감제를 결합하여 킬레이트 전구체를 제조하는 단계; 및 (2) 상기 킬레이트 전구체, 실리카 전구체 및 란탄족 금속염을 반응시켜, 상기 란탄족 금속을 담지한 실리카 나노입자를 제조하는 단계를 포함하는, 시분할 형광 실리카 나노입자의 제조방법을 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 분석 대상 항원에 특이적인 항체를 표면에 고정시킨 형광 실리카 나노입자를 시료와 접촉시킴으로써, 항원-항체 결합을 일으키고 이를 형광 발광으로 확인하는 간단한 방법을 통해 질병을 진단하는 효과가 있다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 분석 대상 항원에 특이적인 항체를 표면에 고정시킨 형광 실리카 나노입자를 시료와 접촉시킴으로써, 항원-항체 결합을 일으키고 이를 형광 발광으로 확인하는 간단한 방법을 통해 질병을 진단하는 효과가 있다.
Description
본 발명은 체외진단 시약용 형광 실리카 나노입자, 이의 제조 방법 및 이를 이용하는 분자 면역 진단 키트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 형광 발광을 일으키는 란탄족 금속을 담지하고 분석 대상 항원에 특이적인 항체를 고정함으로써 체외진단 시약용으로 이용할 수 있는 형광 실리카 나노입자, 이의 제조 방법 및 이를 이용하는 분자 면역 진단 키트에 관한 것이다.
건강 및 질병에 대한 관심이 높아지는 현 시점에서, 질병의 조기 진단을 통해 건강을 관리하고 치료비를 절감하는 효과가 있는 조기 진단이 주목을 받고 있다. 다양한 질병에 대한 진단 방법이 쏟아지는 가운데 간단한 방법으로 질병을 진단하고 즉시 결과를 알아볼 수 있는 몇 가지 진단 방법들이 개발되어 또한 소개되고 있다. 체외진단은 방법이 간단하고 결과 도출이 빠르다는 장점을 가지고 있는 반면, 그 부정확성과 측정 시료의 한계성 때문에 발생하는 단점을 극복하고자 형광을 이용한 분자 진단 방법을 통한 다양한 도전이 시도되고 있다. 한국등록특허 제10-1522560호(2015.05.18)에 따르면, 양자점을 부착한 실리카 입자 표면을 개질하여 소광체를 부착함으로써 이를 생체분자 검출용 형광 소광 입자로 이용하는 구성이 개시되어 있다.
분자면역진단 시스템에서 형광을 담지한 나노입자를 사용하는 플랫폼은 높은 진단 감도와 신뢰성을 가진 시스템이다. 진단에 사용되는 염료로는 대다수 유기형광 염료가 사용되지만, 진단의 감도를 더 증가시키는 데에는 한계가 있기 때문에 란탄족 금속을 이용한 형광 염료 개발이 활발히 진행되고 있는 추세이다. 란탄족 금속은 스토크 이동(Stokes Shift)이 넓고 발광 시간이 길기 때문에 진단에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명자들은 유기형광 염료인 Alexa Fluor® 647을 담지한 실리카 나노입자와 란탄족 금속인 유로피움을 담지한 실리카 나노입자를 합성하여 그 성능을 비교하고자 하였다. 킬레이트 구조를 형성하기 위한 전구체를 먼저 제조한 뒤 란탄족 금속을 담지한 실리카 나노입자를 제조하고, 이후 카르복실기로 개질한 덱스트란으로 코팅하여 수용성 용액에서의 분산력을 높였다. 최종적으로 심근경색 마커 Troponin I 항원을 이용한 항원-항체 테스트에서 높은 감도(검출한계 10 fg/mL)를 보이는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 형광 실리카 나노입자를 이용한 간단한 체외진단 방법으로 질병을 진단하여 건강을 관리하고 치료비를 절감하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 형광 실리카 나노입자를 이용하여 체외진단을 수행하여 진단 감도와 신뢰성을 높임으로써 질병 진단의 정확성을 높이는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 란탄족 금속 이온과 배위 결합할 수 있는 킬레이트 리간드; 및 증감제를 결합하여 킬레이트 전구체를 제조하는 단계; 및 (2) 상기 킬레이트 전구체, 실리카 전구체 및 란탄족 금속염을 반응시켜, 상기 란탄족 금속을 담지한 실리카 나노입자를 제조하는 단계를 포함하는, 시분할 형광 실리카 나노입자의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 또는 일 실시태양에 따른 방법으로 제조된 시분할 형광 실리카 나노입자를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 상기 또는 일 실시태양에 따른 방법으로 제조된 시분할 형광 실리카 나노입자를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 얻어진 상기 시분할 형광 실리카 나노입자에 생체 분자를 콘쥬게이션시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 체외진단 시약용 형광 실리카 나노입자의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 또는 일 실시태양에 따른 방법으로 제조된 체외진단 시약용 형광 실리카 나노입자를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 또는 일 실시태양에 따른 체외진단 시약용 형광 실리카 나노입자를 포함하는 분자 면역 진단 키트를 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 분석 대상 항원에 특이적인 항체를 표면에 고정시킨 형광 실리카 나노입자를 시료와 접촉시킴으로써, 항원-항체 결합을 일으키고 이를 형광 발광으로 확인하는 간단한 방법을 통해 질병을 진단하는 효과가 있다.
또한 본 발명에 따르면, 검출한계가 낮아 신뢰도가 높고, 형광수명이 길며 스토크 이동 범위가 넓은 형광 실리카 나노입자를 제공함으로써, 입자 표면에 고정된 항체에 따라 정확하게 질병을 진단할 수 있는 효과가 있다.
또한 본 발명에 따르면, 시분할 형광 실리카 나노입자를 이용하여 체외진단을 수행할 수 있고 이에 활용할 수 있는 분자 면역 진단 키트를 제공할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 (A) AF647-APTES 및 (B) AF647@SiNPs-NH2의 합성 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 (A) APTES-EDTA-aminophenol 및 (B) Eu(DPA)@SiNPs-NH2의 합성 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 Dex-COOH의 합성 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 실리카 나노입자의 표면을 Dex-COOH로 코팅하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 바이오틴을 결합시킨 (A 및 B) 형광 실리카 나노입자 및 (C) 마그네틱 비드를 나타낸 모식도이다.
도 6은 TnI 항체를 고정한 (A) 형광 실리카 나노입자 및 (B) 마그네틱 비드를 나타낸 모식도이다.
도 7은 실리카 나노입자 및 마그네틱 비드에 대한 샌드위치 결합 과정을 나타낸 모식도이다.
도 8은 AF647@SiNPs의 형광 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 Eu(DPA)@SiNPs의 (A) 형광 측정 결과 및 (B) 시분할 형광 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 (A) AF647@SiNPs 및 (B) Eu(DPA)@SiNPs의 TEM 이미지를 나타낸 사진이다.
도 11은 (A) AF647@SiNPs 및 (B) Eu(DPA)@SiNPs의 입자추적기 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 덱스트란과 Dex-COOH의 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 13은 (A) AF647@SiNPs 및 (B) Eu(DPA)@SiNPs의 스트렙타비딘 정량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 AF647@SiNPs 및 스트렙타비딘의 샌드위치 결합을 SEM으로 나타낸 사진이다.
도 15는 Eu(DPA)@SiNPs를 이용한 TnI 정량 분석을 나타낸 그래프이다.
도 16은 APTES-EDTA-APTES의 합성 과정을 나타낸 모식도이다.
도 17은 APTES-EDTA-APTES를 전구체로 하여 제조된 (A) Eu(DPA)@SiNPs 및 (B) Eu(DPA)@SiNPs-DEX-COOH의 TEM 이미지를 나타낸 사진이다.
도 18은 실시예 8에 따라 용매조건을 달리한 (A 및 B) Eu(DPA)@SiNPs의 TEM 이미지를 나타낸 사진이다.
도 19는 실시예 8에 따라 용매조건을 달리한 Eu(DPA)@SiNPs의 형광 분석 결과 그래프이다.
도 2는 (A) APTES-EDTA-aminophenol 및 (B) Eu(DPA)@SiNPs-NH2의 합성 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 Dex-COOH의 합성 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 실리카 나노입자의 표면을 Dex-COOH로 코팅하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 바이오틴을 결합시킨 (A 및 B) 형광 실리카 나노입자 및 (C) 마그네틱 비드를 나타낸 모식도이다.
도 6은 TnI 항체를 고정한 (A) 형광 실리카 나노입자 및 (B) 마그네틱 비드를 나타낸 모식도이다.
도 7은 실리카 나노입자 및 마그네틱 비드에 대한 샌드위치 결합 과정을 나타낸 모식도이다.
도 8은 AF647@SiNPs의 형광 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 Eu(DPA)@SiNPs의 (A) 형광 측정 결과 및 (B) 시분할 형광 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 (A) AF647@SiNPs 및 (B) Eu(DPA)@SiNPs의 TEM 이미지를 나타낸 사진이다.
도 11은 (A) AF647@SiNPs 및 (B) Eu(DPA)@SiNPs의 입자추적기 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 덱스트란과 Dex-COOH의 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 13은 (A) AF647@SiNPs 및 (B) Eu(DPA)@SiNPs의 스트렙타비딘 정량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 AF647@SiNPs 및 스트렙타비딘의 샌드위치 결합을 SEM으로 나타낸 사진이다.
도 15는 Eu(DPA)@SiNPs를 이용한 TnI 정량 분석을 나타낸 그래프이다.
도 16은 APTES-EDTA-APTES의 합성 과정을 나타낸 모식도이다.
도 17은 APTES-EDTA-APTES를 전구체로 하여 제조된 (A) Eu(DPA)@SiNPs 및 (B) Eu(DPA)@SiNPs-DEX-COOH의 TEM 이미지를 나타낸 사진이다.
도 18은 실시예 8에 따라 용매조건을 달리한 (A 및 B) Eu(DPA)@SiNPs의 TEM 이미지를 나타낸 사진이다.
도 19는 실시예 8에 따라 용매조건을 달리한 Eu(DPA)@SiNPs의 형광 분석 결과 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 란탄족 금속 이온과 배위 결합할 수 있는 킬레이트 리간드; 및 증감제(sensitizer)를 결합하여 킬레이트 전구체를 제조하는 단계; 및 (2) 상기 킬레이트 전구체, 실리카 전구체 및 란탄족 금속염을 반응시켜, 상기 란탄족 금속을 담지한 실리카 나노입자를 제조하는 단계를 포함하는, 시분할 형광 실리카 나노입자의 제조방법을 제공한다.
상기 또는 본 발명의 일 실시태양에 있어서, 상기 (2)단계에서 제조된 실리카 나노입자를 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyl triethoxysilane, APTES)과 반응시켜, 상기 란탄족 금속 담지 실리카 나노입자 표면에 아민기를 도입하는 단계를 더 포함하는 시분할 형광 실리카 나노입자의 제조방법을 제공한다.
상기 또는 본 발명의 일 실시태양에 있어서, 수용성 고분자를 친수성기(hydrophilic group)로 개질하여 상기 란탄족 금속 담지 실리카 나노입자를 코팅하는 단계를 더 포함하는 시분할 형광 실리카 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 상기 수용성 고분자는 헤파린(Heparin), 히알루론산(hyaluronic acid), 카복시메틸 셀룰로오스(Carboxymethylcellulose), 더마탄 설페이트(dermatan sulfate), 키토산(chitosan), 덱스트란(dextran), 알지네이트(alginate, Alginat), 콘드로이틴 설페이트(Chondroitin Sulfate)를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 상기 친수성기는 티올기(-SH), 아민기(-NH2) 및 카르복실기(-COOH)를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 상기 킬레이트 리간드는 EDTA(Ethylendiamine tetraacetic acid)일 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 상기 증감제는 아미노페놀(aminophenol), 2,6-피리딘디카르복시산(2,6-pyridinedicarboxylic acid, DPA), 테노일트리플루오로아세토네이트(thenoyltrifluoroacetonate), 1,1,4,7,7-디에틸렌트리아민펜타아세테이트(1,1,4,7,7-diethylenetriaminepentaacetate), 헥사플루오로아세틴아세토네이트(hexafluoroacetylacetonate), 2-(N,N디에틸아닐린-4-yl)-4,6-비스(3,5-디메틸피라졸-1-yl)-1,3,5-트리아진)[2-(N,Ndiethylanilin-4-yl)-4,6-bis(3,5-dimethylpyrazol-1-yl)-1,3,5-triazine)], 염소(chlorine), 루테늄(II)-트리스(바이피리딘)[ruthenium(II)-tris(bipyridine)], 페로센(ferrocene), 폴리(m-페닐렌비닐렌)[poly(m-phenylenevinylene)], 2-하이드록시벤조페논 파생물(2-hydroxybenzophenone derivatives)을 포함하는 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 상기 실리카 전구체가 테트라에톡시 실란(tetraethoxy silane, TEOS), 또는 테트라메톡시 실란(tetramethoxy silane, TMOS)일 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 상기 란탄족 금속이 유로피움(europium, Eu), 디스프로슘(dysprosium, Dy), 사마륨(samarium, Sm), 루테늄(ruthenium, Ru), 가돌륨(gadolium, Ga) 및 터븀(terbium, Tb)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 또는 일 실시태양에 따른 방법으로 제조된 시분할 형광 실리카 나노입자를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 상기 또는 일 실시태양에 따른 방법으로 제조된 시분할 형광 실리카 나노입자를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 얻어진 상기 시분할 형광 실리카 나노입자에 생체 분자를 콘쥬게이션시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 체외진단 시약용 형광 실리카 나노입자의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 상기 생체 분자는 항체, 항원, RNA, DNA, PNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin) 및 방사선 동위원소 표지 물질으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 또는 일 실시태양에 따른 방법으로 제조된 체외진단 시약용 형광 실리카 나노입자를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 또는 일 실시태양에 따른 체외진단 시약용 형광 실리카 나노입자를 포함하는 분자 면역 진단 키트를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험재료
실험에 사용된 시약으로는 Sigma Aldrich에서 TEOS(tetraethoxy silane), APTES[(3-aminopropyl) triethoxysilane], DMOS(dimethyl sulfoxide), 염화유로피움[europium(III) chloride], EDTA(ethylendiamine tetraacetic acid), 아세트산 무수물(acetic anhydride), 피리딘(pyridine), 에테르(ether), 아미노페놀(aminophenol), 에탄올(ethanol), 덱스트란[Dextran (w/m 10,000)], 디메틸아미노피리딘(dimethyl aminopyridine), 석신산 무수물(succinic anhydride), 바이오틴 히드라지드(Biotin hydrazide), EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimidehydrochloride), NHS(N-Hydroxysuccinimide), 에탄올아민(ethanolamine), 스트렙타비딘(Streptavidin), BSA(bovine serum albumin), 글리신(glycine), 수크로스(sucrose)를 구입하였으며 Dae-Jung에서 수산화암모늄(ammonium hydroxide) 50 %를 구입하였다. Life Technologies에서 Alexa Fluor® 647과 Fitzgerald사의 Troponin I antigen(Troponin I, TnI)과 Troponin I antibody 1, Troponin I antibody 2b을 구입하였다. 또한 Bioneer의 Silica Coated Magnetic Bead(size : 1 ~ 5 μm)를 구입하였다. 3차 증류수(Millipo)와 PBS 버퍼(pH 7.4, 10 mM, 제작)이 사용하였다.
측정기기로는 PL 분광기[Photoluminescence(FS-2, SCINCO)], 마이크로플레이트리더[Microplate reader, Spectramax M5, Molecualr devices), 형광광도계(Fluorometer, i-CHROMA, Boditech Med), TEM(LIBRA® EFTEM, Carl Zeiss), SEM(S-4800, Hitachi), 입자추적분석기(Nanoparticle tracking analysis, LM10, NANO SIGHT), FT-IR(Fourier transform infrared spectroscopy, FTLA2000-104, ABB), ICP-OES(OPTIMA 7300 DV, Perkin Elmer)를 사용하였다.
실시예 1. 실리카 나노입자의 합성
실시예
1-1.
Alexa
Fluor
®
647을
담지한
실리카 나노입자의 합성
APTES 14.4 μL 및 DMSO 985.6 μL을 섞고 10 μL 분취하여, Alexa Fluor® 647(이하 AF647) 0.2 mg과 DMSO 90 μL를 섞은 후, 2 mL 튜브 안에서 상온 조건으로 3시간 동안 교반하여 AF647-APTES를 만들었다(도 1A).
100 mL 둥근바닥 플라스크에 15.6 mL의 에탄올을 넣고 1 mL의 TEOS를 넣었다. 이후 위에 만들어진 AF647-APTES를 넣고 증류수 2 mL와 50 %(v/v) 암모니아수 200 μL를 넣었다. 플라스크는 암조건에서 달걀형 마그네틱 바를 넣어 900 rpm으로 상온에서 18시간 동안 반응시켰다. 이후 아민기 도입을 위해 10 μL의 APTES를 추가로 넣고 위와 같은 조건에서 12시간 동안 반응시켜 AF647@SiNPs-NH2를 합성하였다. 이후 에탄올로 세 차례 세척한 후 냉장 보관하였다(도 1B).
실시예 1-2. Eu
3+
을 담지한 구형의 실리카 나노입자 합성
EDTA 2 g, 아세트산 무수물 3.28 mL 및 피리딘 2.55 mL를 63 ℃에서 24시간 동안 교반하고 에테르로 3번 세척하였다. 그리고 완전히 건조시켜 밀봉된 환경에서 보관하였다. 위 과정에서 만들어진 EDTAD 25.6 mg 및 아미노페놀 10.9 mg을 DMSO 1 mL에 녹여 2시간 동안 교반하였다. 이후 APTES 93.6 μL를 더 투입하고 6시간 동안 교반함으로써 APTES-EDTA-aminophenol을 제조하였다(도 2A).
100 mL 라운드 플라스크에 15.6 mL의 에탄올을 넣고 1 mL의 TEOS를 넣었다. 이에 따라 제조된 APTES-EDTA-aminophenol 0.2 mL를 넣고 염화유로피움(III) 15.4 mg, 2,6-피리딘디카르복시산(2,6-pyridinedicarboxylic acid, DPA) 10 mg, 증류수 2 mL 및 50 %(v/v) 암모니아수 200 μL를 넣었다. 플라스크는 암조건에서 달걀형 마그네틱 바를 넣어 900 rpm으로 상온에서 18시간 동안 반응하였다. 이후 아민기 도입을 위해 10 μL의 APTES를 추가로 넣고 동일한 조건에서 12시간 동안 반응시켜 Eu(DPA)@SiNPs-NH2를 합성하였다. 마지막으로 에탄올로 세 차례 세척한 후 냉장 보관하였다(도 2B).
실시예 2. 실리카 나노입자 표면의 덱스트란 코팅
덱스트란(10,000 w/M) 1.18 g, 석신산 무수물 0.5 g 및 디메틸아미노피리딘 0.1 M을 50 mL의 DMSO에서 16시간 동안 반응시켰다. 이후 만들어진 Dex-COOH를 증류수로 여과하였다. 여과된 Dex-COOH는 동결건조기를 이용하여 -30 ℃, 20 mmTorr에서 동결건조시킨 다음 건조한 조건에서 보관하였다(도 3).
AF647@SiNPs-NH2, Eu(DPA)@SiNPs-NH2 및 MB-NH2(APTES가 코팅된 마그네틱 비드)를 EDC 20 mM, NHS 40 mM을 포함하는 PBS 버퍼 내에서 14 mg/mL의 농도가 되도록 준비하였다. 마그네틱 비드(magnetic beads, 이하 MB)는 분리 정제를 위한 지지체로서 이용되었다. 상기 AF647@SiNPs-NH2, Eu(DPA)@SiNPs-NH2 및 MB-NH2를 1 mL씩 준비한 후 여기에 Dex-COOH 2 mg을 각각 넣고 암조건에서 12시간 동안 교반하였다. 제조된 AF647@SiNPs-Dex-COOH, Eu(DPA)@SiNPs-Dex-COOH 및 MB-Dex-COOH를 각각 PBS 버퍼로 세 번 세척하였다(도 4).
실시예 3. 실리카 나노입자 표면의 바이오틴 또는 항체 고정
실시예 3-1. 바이오틴의 고정
실시예 2에서 제조된 AF647@SiNPs-Dex-COOH, Eu(DPA)@SiNPs-Dex-COOH 및 MB-Dex-COOH 각 1 mL을 기반으로 바이오틴 히드라지드의 농도를 10 mM로 조성하였다. 이후 암조건에서 12시간 동안 교반하여 AF647@SiNPs-Dex-Biotin, Eu(DPA)@SiNPs-Dex-Biotin 및 MB-Dex-Biotin을 제조하였다. 반응이 완료된 후 미반응 COOH 반응기의 불필요한 반응을 방지하기 위해 에탄올아민을 10 %(v/v) 투입하여 다시 12시간 동안 교반하였다. 이후 PBS 버퍼로 세 번 세척하였다(도 5).
실시예 3-2. Troponin I 항체의 고정
실시예 2의 방법에 따라 제조된 Eu(DPA)@SiNPs-Dex-COOH 포함 용액에 심근경색 마커 Troponin I 특이적인 1 mg/mL 농도의 Troponin I antibody 2b(검출 항체, detection antibody)를 20 μL 투입하였다. 이후 암조건에서 12시간 동안 교반하여 Eu(DPA)@SiNPs-Dex-TnI antibody 2b를 제조하였다. 반응이 완료된 후 미반응 COOH 반응기의 불필요한 반응을 방지하기 위해 블로킹 버퍼로 BSA 2 %, 글리신 1 %, 수크로스 4 %를 포함하는 PBS 버퍼를 넣은 후 다시 12시간 동안 교반하였으며 이후 PBS 버퍼로 3번 세척하였다. MB-Dex-COOH에는 같은 방법으로 심근경색 마커 Troponin I에 특이적이나 Troponin I antibody 2b와 결합부위가 다른 Troponin I antibody 1(포획 항체, capture antibody)을 고정시켜 MB-Dex-TnI antibody 1을 제조하고 블로킹하였다(도 6).
실시예 4. 합성된 실리카 나노입자의 분석
실시예 4-1. PL 분광기를 이용한 입자의 형광 측정
에탄올을 용매로 하여 AF647@SiNPs 및 Eu(DPA)@SiNPs 를 14 mg/mL의 농도로 준비하여 셀(Starna cell, 18-F)에 시료를 투입하고 형광 발광을 측정하였다. Eu(DPA)@SiNPs는 여기 270 nm, 형광 615 nm 및 PMT(광전증배관, photomultiplier tube) 600 V 조건에서 관찰하였으며, AF647@SiNPs는 여기 650 nm, 형광 665 nm 및 동일한 PMT 조건으로 관찰하였다.
실시예 4-2. 마이크로플레이트리더를 이용한 입자의 형광 측정
에탄올을 용매로 하여 Eu(DPA)@SiNPs-NH2의 농도를 1.8 mg/mL로 설정하고 검은 마이크로플레이트(black microplate 96 well)에 50 μL 투입하여, 지연시간 0 μs 및 노출시간 1000 μs의 조건으로 마이크로플레이트리더를 이용하여 측정하였다.
실시예 4-3. TEM 이미지를 이용한 입자의 크기 분석
AF647@SiNPs 및 Eu(DPA)@SiNPs를 1 mg/mL씩 준비하여 카본그리드에 용액을 건조시킨 후, TEM 장비를 이용하여 측정하였다.
실시예 4-4. 입자추적분석기를 이용한 입자의 크기 분석
입자의 크기를 측정하기 위해 입자의 브라운 운동을 이용하는 입자추적분석기(NTA)를 사용하였다. 1 mg/mL의 AF647@SiNPs 및 Eu(DPA)@SiNPs를 1 mL씩 주사기를 이용하여 셀(cell)에 채웠다. 405 nm 파장의 레이저를 조사하고 NTA 2.3 분석 소프트웨어(Copyrightⓒ2012 NanoSight Ltd)를 실행하여 나노입자의 움직임을 촬영하였다. 이에 따라 온도 및 점도의 특성을 분석함으로써 나노입자의 크기를 측정하였다.
실시예 4-5. ICP를 이용한 입자의 유로피움 담지 비율 분석
염산 3 mL, 질산 1 mL 및 증류수 1 mL을 혼합하여 제조한 왕수 및 14 mg/mL의 Eu(DPA)@SiNPs-NH2 1 mL를 20 mL 바이알에 투입하고 12시간 동안 교반하였다. 혼합 용액 중 1 mL을 분취하여 9 mL의 증류수에 희석시키고 유로피움의 밀도를 ICP-OES로 측정하였다. 음성 대조군(Blank) 샘플로는 염산 3 mL, 질산 1 mL에 나머지를 증류수로 채운 100 mL를 이용하였다.
실시예 4-6. FT-IR을 이용한 화학 작용기 분석
FT-IR 측정을 위해 Dex-COOH 0.6 mg 및 KBr(브롬화칼륨) 50 mg를 섞은 후 펠렛 압축기를 이용해 펠렛을 제조하였다. 비교 분석을 위해 덱스트란 0.6 mg과 KBr 50 mg으로 만든 펠렛을 대조군으로 준비하였다. 분석은 먼저 KBr 50 mg만이 들어간 펠렛을 이용하여 측정 기준(Background)을 설정한 후 수행하였다.
실시예 5. 스트렙타비딘을 이용한 형광 정량 분석
실시예 5-1. 스트렙타비딘 농도별 샌드위치 결합
MB-Dex-Biotin은 분리 정제를 위한 지지체로 이용되었다. 14 mg/mL의 MB-Dex-Biotin을 100 μL씩 30개의 2 mL 마이크로튜브에 각각 넣었다. 이후 스트렙타비딘의 농도를 100 ng/mL, 10 ng/mL, 1 ng/mL, 100 pg/mL, 10 pg/mL 및 1 pg/mL으로 달리하여 투입하고 MB-Dex-Biotin과의 바이오틴-스트렙타비딘 결합을 유도하였다. 제조된 MB-streptavidin을 PBS 버퍼로 세척한 후 반응시킨 스트렙타비딘의 농도에 따라 구분하여 100 μL의 샘플들을 각각 준비하였다.
정량 분석을 위한 형광 나노입자로는 14 mg/mL의 AF647@SiNPs-Dex-Biotin 또는 Eu(DPA)@SiNPs-Dex-Biotin 각 100 μL씩을 상기 MB-streptavidin 100 μL과 결합시켜 이용하였다. 스트렙타비딘 대신 BSA를 사용한 경우 및 형광 나노입자에 바이오틴을 붙이지 않은 경우를 음성 대조군 1 및 2로 설정하였다. 반응이 완료된 후 PBS 버퍼로 세 차례 세척하였다.
실시예 5-2. 형광광도계를 이용한 형광 분석
형광광도계를 이용하여 형광 분석을 수행하기 위해 멤브레인을 폭 3 mm, 길이 8 cm로 자른 뒤 기구에 설치하였다. 이후 실시예 5-1에 따라 스트렙타비딘의 농도를 달리하여 샌드위치 결합된 AF647@SiNPs-Streptavidin-MB를 3 μL 씩 각각 다른 지점에 떨어뜨려 30분간 건조시켰다. 이후 형광광도계를 이용해 형광을 측정하였다.
실시예 5-3. 마이크로플레이트리더를 이용한 형광 분석
실시예 5-1에 따라 샌드위치 결합된 Eu(DPA)@SiNPs-Streptavidin-MB를 검은 마이크로플레이트에 농도별로 50 μL씩 분취하였다. 음성 대조군 1 및 2 또한 같은 양으로 분취하고, 마이크로플레이트리더를 이용하여 측정하였다. 형광 노출이 끝나는 시간은 1000 μs, 지연 시간은 0 μs으로 설정하였다. 270 nm에서 여기시켰으며 610 ~ 615 nm 범위에서 형광을 측정하였다.
실시예 5-4. 마그네틱 비드의 SEM 분석
SEM 분석에 사용되는 시료로는 실시예 5-1에서 제조된 AF647@SiNPs-Streptavidin-MB(스트렙타비딘 농도 100 ng/mL) 결합체를 사용하였다. 상기 결합체를 건조시킨 후 카본 테이프에 붙여 SEM 이미지를 촬영하였다.
실시예 6. Troponin I 정량 분석
실시예 6-1. Troponin I 항체 농도별 샌드위치 결합 반응
실시예 3-2에 따라 제조된 Eu(DPA)@SiNPs-Dex-TnI antibody 2b를 형광 입자로 사용하고 MB-Dex-TnI antibody 1은 분리 정제를 위한 지지체로 이용하여 정량 분석을 수행하였다. 14 mg/mL의 MB-Dex-TnI antibody 1을 100 μL씩 각각 45개의 2 mL 마이크로튜브에 넣었다. 이후 TnI를 각각 100 ng/mL, 10 ng/mL, 1 ng/mL, 100 pg/mL, 10 pg/mL, 1 pg/mL, 100 fg/mL, 10 fg/mL 및 1 fg/mL의 농도로 100 μL씩 넣어 30분 동안 반응시키고 PBS 버퍼로 세척하면서 100 μL로 부피를 조정하였다. 14 mg/mL의 Eu(DPA)@SiNPs-Dex-TnI antibody 2b를 100 μL씩 MB-TnI가 들어있는 튜브에 넣어 30분 동안 반응시키고 PBS 버퍼로 세척하였다. Troponin I 대신 BSA를 넣는 경우 및 형광 나노입자에 TnI antibody 2b를 고정하지 않은 경우를 음성 대조군 1 및 2로 설정하였다(도 7).
실시예 6-2. 마이크로플레이트리더를 이용한 시분할 형광 분석
실시예 5-4와 같은 방법으로 수행하되, 상기 실시예 6-1에 따라 결합된 Eu(DPA)@SiNPs-TnI-MB를 시료로 이용하여 수행하였다. 항원 대신 BSA를 이용한 경우 및 형광 나노입자에 항체를 고정하지 않은 경우를 음성 대조군 1 및 2로 설정하였다.
측정예 1. 형광 실리카 나노입자의 형광 특성 분석
측정예 1-1. AF647@SiNPs의 형광분석
실시예 4-1에 따라 AF647@SiNPs의 형광 유무와 형광 세기를 측정하였으며, AF647이 실리카와 결합하여도 고유의 형광을 잃지 않는다는 것을 확인하였다. 수행 조건으로는 650 nm에서 여기시켰으며 형광은 671 nm에서 관찰하였다. 이는 AF647의 형광 피크인 665 nm보다 6 nm 가량 장파장 측으로 벗어난 적색 이동(red shift)을 나타내는데, APTES와의 결합으로 인해 발생한 것이라고 판단할 수 있다. 유기 형광 염료는 스토크 이동이 짧은 것이 단점이므로 형광 피크가 여기되는 영역과 겹치는 문제가 발생하였기 때문에, 본 발명에서는 겹치지 않는 부분만을 결과로 사용하였다(도 8).
측정예 1-2. Eu(DPA)@SiNPs의 형광분석
실시예 4-1에 따라 Eu(DPA)@SiNPs의 형광을 측정하였다. 270 nm에서 여기를 한 결과 각각 592, 613, 648 및 693 nm에서 형광 피크가 측정 되었다. 가장 큰 피크는 613 nm이고 기존의 유로피움이 가지는 형광 피크인 615 nm에서 2 nm 단파장 측으로 이동하는 청색 이동(blue shift)이 나타났다. 이것은 유로피움이 킬레이트 구조체와 실리카에 담지되면서 생기는 변화라고 판단된다. 란탄족 금속에서 보이는 넓은 스토크 이동 또한 확인하였다(도 9A).
유로피움을 담지한 나노입자의 시분할 형광(time resolved fluorescence, TRF)을 확인하기 위해 실시예 4-2와 같이 지연 시간을 부여하여 입자의 형광을 측정하였다. 기존의 유기 형광 염료의 경우 형광 발광이 나타나는 시간이 수 μs인 것에 반해 Eu(DPA)@SiNPs의 경우 형광의 양이 절반으로 감소하기까지 500 μs가 소요되었다. 또한 총 형광 수명(life time)이 대략 921 μs 임을 유추할 수 있었다. 이것으로 유로피움 나노입자의 형광 수명을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명에 따라 제조된 Eu(DPA)@SiNPs가 수십 나노 초의 형광 수명을 가진 유기 형광염료와 달리 노이즈 영역을 피해 형광을 측정 할 수 있는 시분할 형광 측정 가능성을 확인할 수 있었다(도 9B).
측정예 1-3. TEM 이미지 및 입자 크기 확인
촬영된 TEM 이미지를 통해 입자의 크기를 측정하였다. 실시예 4-3에 따라 수행한 AF647@SiNP의 TEM 측정 결과, 입자의 평균 크기가 약 120 nm인 것으로 확인되었다(도 10A). Eu(DPA)@SiNPs의 TEM 측정 결과, 입자의 평균 크기는 약 30 nm로 나타났다(도 10B).
입자의 브라운 운동을 이용한 더욱 정확한 측정을 위해 실시예 4-4에 따라 입자추적분석기를 통한 AF647@SiNP의 크기를 측정하였다. 입자의 평균 크기는 약 110 nm 로 측정되었다(도 11A). 측정 결과 Eu(DPA)@SiNPs 입자의 평균 사이즈는 약 69 nm로 측정되었으며, 129 및 200 nm의 입자들도 다수 발견되었다(도 11B).
측정예 1-4. 실리카 나노입자의 수율 분석
제조 과정을 역추적하여, 입자 내 담지된 형광 염료 및 유로피움의 양과 합성 수율을 계산하였다.
AF647@SiNPs에 담지된 AF647의 양과 합성 수율을 계산하기 위해 AF647 및 AF647@SiNPs의 형광을 각각 측정해 입자 내 AF647의 양을 측정하였다. 측정 결과를 이용한 계산(형광 측정으로 계산된 농도 ÷ AF647 분자량 ÷ AF647@SiNPs의 농도)을 통해 평균 2.4 nmolAF647/gNPs임을 도출할 수 있었다(표 1).
실시예 4-5에 따라 Eu(DPA)@SiNPs에 담지된 유로피움의 양과 나노입자의 합성 수율을 계산하기 위해, ICP-OES를 통해 4.3 mgEu/LNPs의 유로피움 농도를 구할 수 있었고 이를 이용하여 입자 내 유로피움의 양을 측정하였다. 측정 결과를 이용한 계산(ICP-OES 측정으로 계산된 농도 X 측정 시료부피 ÷ 전체합성시료 대비 측정시료 ÷ Eu 분자량 ÷ Eu(DPA)@SiNPs 농도)을 통해 103.25 μmolEu/gNPs임을 도출할 수 있었다(표 1).
또한 AF647@SiNPs의 수득률을 바탕으로 투입된 AF647의 수득율을 계산한 결과, 13 %의 AF647 합성 수율을 도출할 수 있었으며, Eu(DPA)@SiNPs의 수득률을 바탕으로 투입된 유로피움을 계산한 결과, 52 %의 유로피움 합성 수율을 계산할 수 있었다(표 2).
| AF647@SiNPs | Eu(DPA)@SiNPs | ||
| 구분 | 값 | 구분 | 값 |
| 실리카 입자내 AF647 |
2.9 ngAF647/mgNPs | 실리카 입자내 유로피움 |
16.0 μgEu/mgNPs |
| 합성된 총 입자 | 270.0 mg | 합성된 총 입자 | 291.6 mg |
| 합성에 사용된 AF647 |
6 mg | 합성에 사용된 Europium |
9 mg |
| 합성 수율 | 13 % | 합성 수율 | 52 % |
측정예 1-5. 입자 표면 코팅용 Dex-COOH의 FT-IR 분석
덱스트란에 석신산 무수물을 이용하여 도입한 카르복실기 존재 여부를 확인하기 위해 실시예 4-6에 따라 Dex-COOH에서 FT-IR을 이용하여 덱스트란의 구조 내에 존재하지 않는 C=O 결합을 확인하였다. O=C-O-는 1565 cm-1, C=O는 1734 cm-1에서 흡수가 일어난 것을 확인하였으며 이 결과로 덱스트란이 카르복실기를 이용하여 성공적으로 개질된 것을 확인하였다(도 12).
측정예 2. 스트렙타비딘 정량 분석
실시예 5-2에 따라 수행된 형광광도계 분석에서는 100 ng/mL, 10 ng/mL, 1 ng/mL 및 0.1 ng/mL의 농도의 스트렙타비딘을 측정하였으며, 최소 검출 한계가 0.1 ng/mL로 측정되었다. AF647@SiNPs의 형광 세기가 스트렙타비딘의 형광 세기와 비례하는 것을 보아 진단에 적용 가능하나, 0.1 ng/mL의 검출 한계로 판단할 때 극미량을 검출하는 것은 어려울 것으로 판단된다(도 13A).
실시예 5-3에 따라 Eu(DPA)@SiNPs의 형광 또한 측정하였다. 측정 결과 스트렙타비딘의 검출 한계가 1 pg/mL임을 확인하였으며, 큰 오차 없이 농도와 형광이 균일하게 비례하는 것을 확인하였다. 이것으로 Eu(DPA)@SiNPs가 진단에 사용하기에 적합하다는 것을 확인하였고, 비교 대상인 AF647을 담지한 나노입자보다 뛰어난 성능을 보여주었다. 음성 대조군에서 나타난 스트렙타비딘 농도 증가에 따른 형광 발광 증가에 대해서는, 나노입자에 블로킹 처리를 하였음에도 불구하고 스트렙타비딘의 농도에 따라 미세한 물리적인 흡착이나 변화가 생길 수 있고 이러한 점이 형광 나노입자와 MB 간의 물리적 흡착에 관여했다고 판단할 수 있다(도 13B).
실시예 5-4에 따른 MB와 형광 나노입자의 결합 여부를 확인하기 위해, 형광 나노입자와 샌드위치 결합한 MB(AF647@SiNPs-Streptavidin-MB)의 표면 및 샌드위치 결합 없이 Dex-COOH까지만 코팅된 MB(MB-Dex-COOH)의 표면을 SEM 이미지로 촬영하여 비교하였다. 샌드위치 결합한 MB의 표면에는 약 120 nm의 형광 나노입자가 부착되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 14).
측정예 3. Eu(DPA)@SiNPs를 이용한 Troponin I 정량분석
Troponin I(TnI)을 검출하기 위한 항원-항체 반응을 이용하기 위하여, 실시예 6-2에 따라 TnI의 농도별 Eu(DPA)@SiNPs-Dex-TnI antibody 2b의 시분할 형광을 측정하였다. 테스트 결과, TnI의 경우 검출한계는 10 fg/mL로 극미량의 TnI까지 측정이 가능하다는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 검출 성능은 실제 심근경색 조기 진단에 적용할 수 있을 것이라고 판단된다. 10 ng/mL 이상의 TnI 농도를 테스트했을 때 형광의 증가가 멈추는 특징이 나타내는데 이는 반응 포화상태에 이르기 때문인 것으로 판단된다. 이에 따라 검출 가능 범위는 최소 10 fg/mL에서 최대 10 ng/mL인 것으로 판단된다(도 15).
실시예 7. 전구체 합성 방법을 달리한 Eu(DPA)@SiNPs의 합성
EDTAD는 에탄올에서 잘 녹지 않기 때문에 유기용매로는 DMSO를 이용하는 것이 일반적이나, EDTAD를 APTES와 결합시켜 APTES-EDTA-APTES를 합성하면 에탄올에 용이하게 용해되었다. 따라서 APTES를 먼저 에탄올에 분산시킨 후 EDTAD를 첨가하면 반응이 서서히 진행됨에 따라 APTES-EDTA-APTES가 형성된다. 이러한 경우 증감제인 아미노페놀을 도입하기 어려우나, 이를 제외하더라도 DPA가 증감제의 역할을 하므로 이에 따른 형광감소 효과는 미비했다.
EDTAD는 실시예 1-2와 동일한 방법에 따라 제조하였다. 100 mL 라운드 플라스크에 에탄올 10 mL 와 APTES 0.0187 mL을 투입하고 적당히 교반한 후, EDTAD 5.12 mg을 넣고 상온에서 600 rpm으로 1시간 동안 교반하여 전구체를 제조하였다(도 16).
이후 염화유로피움(III) 15.4 mg을 에탄올 3.8 mL에 녹인 후 첨가하고 4시간 더 반응시킨 후, DPA 10 mg을 에탄올 3 mL에 용해시킨 후 첨가하여 2시간 더 반응시켰다. TEOS 1 mL, 증류수 1.88 mL, 28 ~ 30 % 수산화암모늄(Ammonium hydroxide) 0.32 mL를 넣고 상온에서 900 rpm으로 18시간 동안 교반하였다. 반응 후 에탄올 20 mL로 5차례 세척하였다. 상기 방법에 따라 제조된 실리카 나노입자를 TEM으로 촬영하였다(도 17A). 이후, 실시예 2의 방법을 동일하게 수행하여 덱스트란을 코팅함으로써 Eu(DPA)@SiNPs-DEX-COOH를 제조하고 마찬가지로 TEM으로 촬영하였다(도 17B).
실시예 8. 용매조건을 달리한 Eu(DPA)@SiNPs의 합성
실리카 나노입자 형성에 사용되는 TEOS의 알콕시기 교환(Alkoxy exchange)을 이용하면 실리카 나노입자의 크기를 조절할 수 있다. TEOS의 말단은 4개의 에틸(ethyl)기를 포함하고 있어 가수분해 및 축합반응을 통해 실리카 나노입자의 핵을 형성하게 된다. 에틸기가 메틸(methyl)기로 알콕시기 교환을 일으키면, 가수분해와 축합결합 속도가 증대하여 초기 과포화점에 도달하는 속도가 빨라지게 된다. 이에 따라 많고 작은 핵을 형성하게 되어 작은 크기의 실리카 나노입자가 합성될 수 있다.
따라서, 기존의 비교적 큰 크기의 실리카 나노입자를 합성하는 에탄올 기반의 합성법을 버리고, 에탄올 및 메탄올 혼합용매에서 알콕시기 교환을 유도하여 작은 크기의 실리카 나노입자를 합성하였다.
전구체 제조 방법은 실시예 7과 동일하게 수행하되, 에탄올을 메탄올로 대체하였다. 상기 전구체에 메탄올 19.5 mL, 에탄올 9 mL, TEOS 0.6 mL, 증류수 1 mL, 28 ~ 30 % 수산화암모늄 3 mL를 넣고 상온에서 500 rpm으로 12시간 동안 교반하였다. 이후 에탄올 20 mL로 5차례 세척하였다. 상기 방법에 따라 용매 조건을 달리한 방법을 통해 제조된 실리카 나노입자를 TEM으로 촬영하였다(도 18). 실리카 나노입자의 합성과 동시에 유로피움이 담지되기 때문에 입자의 크기에 따른 유로피움의 양 변화를 확인하기 위해 형광광도계를 이용하여 형광 스펙트럼을 측정하였다(도 19). 270 nm에서 여기시켜 615 nm에서 형광을 측정할 수 있었다. PMT 조건은 600 V로 설정하였다. 입자 사이즈가 작아짐에 따라 유발될 수 있는 형광 감소는 없는 것으로 판단되었다.
Claims (14)
- EDTAD(ethylen diamine tetraacetic acid dianhydride) 및 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyl triethoxysilane, APTES)를 결합하여 킬레이트 전구체(APTES-EDTA-APTES)를 제조하는 단계; 및
(2) 상기 킬레이트 전구체, 실리카 전구체 및 란탄족 금속염을 에탄올 및 메탄올의 혼합 용매에서 반응시켜, 란탄족 금속을 담지한 실리카 나노입자를 제조하는 단계를 포함하는, 시분할 형광 실리카 나노입자의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 (2)단계에서 제조된 실리카 나노입자를 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyl triethoxysilane, APTES)과 반응시켜, 상기 란탄족 금속 담지 실리카 나노입자 표면에 아민기를 도입하는 단계를 더 포함하는 시분할 형광 실리카 나노입자의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 수용성 고분자를 친수성기(hydrophilic group)로 개질하여 상기 란탄족 금속 담지 실리카 나노입자를 코팅하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시분할 형광 실리카 나노입자의 제조방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 수용성 고분자가 헤파린(Heparin), 히알루론산(hyaluronic acid), 카복시메틸 셀룰로오스(Carboxymethylcellulose), 더마탄 설페이트(dermatan sulfate), 키토산(chitosan), 덱스트란(dextran), 알지네이트(alginate, Alginat), 콘드로이틴 설페이트(Chondroitin Sulfate)를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 시분할 형광 실리카 나노입자의 제조방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 친수성기가 티올기(-SH), 아민기(-NH2) 및 카르복실기(-COOH)를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 시분할 형광 실리카 나노입자의 제조방법.
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- 제 1 항에 있어서, 상기 실리카 전구체가 테트라에톡시 실란(tetraethoxy silane, TEOS), 또는 테트라메톡시 실란(tetramethoxy silane, TMOS)인 것을 특징으로 하는 시분할 형광 실리카 나노입자의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 란탄족 금속이 유로피움(europium, Eu), 디스프로슘(dysprosium, Dy), 사마륨(samarium, Sm), 루테늄(ruthenium, Ru), 가돌륨(gadolium, Ga) 및 터븀(terbium, Tb)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 시분할 형광 실리카 나노입자의 제조방법.
- 제 1 항에 따른 방법으로 제조된 시분할 형광 실리카 나노입자.
- (a) 제1항 내지 제5항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 기재된 제조방법에 따라 시분할 형광 실리카 나노입자를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 얻어진 상기 시분할 형광 실리카 나노입자에 생체 분자를 콘쥬게이션시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 체외진단 시약용 형광 실리카 나노입자의 제조 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 생체 분자는 항체, 항원, RNA, DNA, PNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin) 및 방사선 동위원소 표지 물질으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 체외진단 시약용 형광 실리카 나노입자의 제조 방법.
- 제 11 항에 기재된 방법으로 제조된 체외진단 시약용 형광 실리카 나노입자.
- 제 13 항에 기재된 체외진단 시약용 형광 실리카 나노입자를 포함하는 분자 면역 진단 키트.
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|---|---|---|---|
| KR1020150188376A KR101743150B1 (ko) | 2015-12-29 | 2015-12-29 | 체외진단 시약용 형광 실리카 나노입자, 이의 제조 방법 및 이를 이용하는 분자 면역 진단 키트 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020150188376A KR101743150B1 (ko) | 2015-12-29 | 2015-12-29 | 체외진단 시약용 형광 실리카 나노입자, 이의 제조 방법 및 이를 이용하는 분자 면역 진단 키트 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101743150B1 true KR101743150B1 (ko) | 2017-06-02 |
Family
ID=59222607
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020150188376A KR101743150B1 (ko) | 2015-12-29 | 2015-12-29 | 체외진단 시약용 형광 실리카 나노입자, 이의 제조 방법 및 이를 이용하는 분자 면역 진단 키트 |
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| KR (1) | KR101743150B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111115635A (zh) * | 2019-12-13 | 2020-05-08 | 南京林业大学 | 一种硅量子点水溶液及其制备方法与应用 |
-
2015
- 2015-12-29 KR KR1020150188376A patent/KR101743150B1/ko active IP Right Grant
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| Title |
|---|
| PLOS ONE., 10(6):e0129689 (2015.06.09.)* |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111115635A (zh) * | 2019-12-13 | 2020-05-08 | 南京林业大学 | 一种硅量子点水溶液及其制备方法与应用 |
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