WO2011150542A1

WO2011150542A1 - 氧化铜纳米颗粒标记抗体的方法、试剂盒及其应用

Info

Publication number: WO2011150542A1
Application number: PCT/CN2010/001853
Authority: WO
Inventors: 蒋兴宇; 曲伟思; 刘颖昳; 王卓
Original assignee: 国家纳米科学中心
Priority date: 2010-06-04
Filing date: 2010-11-18
Publication date: 2011-12-08
Also published as: CN102269760A; CN102269760B

Description

氧化铜纳米颗粒标记抗体的方法、试剂盒及其应用技术领域

本发明属于免疫分析和诊断技术领域。具体地，本发明涉及一种采用纳米颗粒标记抗体的方法及其应用。背景技术

在对某些抗原或特异性蛋白进行检测时，通常会应用到免疫标记技术。免疫标记技术是将一些既容易测定又具有高敏感性的物质标记到特异性抗原或者抗体分子上，通过这些标记物的增强放大作用来显示反应体系中抗原或者抗体的性质和含量。目前常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等。但在实际应用中，这三大免疫标记技术都存在不同缺陷。例如在荧光素标记技术中，荧光素存在荧光寿命和荧光效率的问题，且标记到抗原或抗体上的方法复杂；酶标记技术中，酶容易失活，从而影响待测物的检出限；放射性核素标记技术中，核素具有放射性，存在强烈的环境污染和健康危害。此外，采用以上三种方法在对某些抗原或特异性蛋白进行检测时，在读出方式上需要借助各类仪器才能进行。其中，荧光素标记技术需要荧光显微镜，酶标技术需要酶标仪，放射性核素技术需要自动计数器等探测仪器，对仪器的依赖决定了很多检测不能在条件落后及不发达地区开展。因此，现在存在对操作筒单、反应体系稳定、便于开展、对环境无污染以及对人体无危害的免疫标记和检测技术的需求。

目前，纳米技术是当前的热门研究领域，其中金纳米粒子由于其表面等离子共振效应而显示独特的颜色，被广泛应用于可视化检测。 Mirkin小组首次报道了用表面功能化的金纳米粒子通过比色的方法检测 DNA (参考文献： Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C, Storhoff, J. J. Nature, 1996, 382, 607-609 )。蒋兴宇小组报道了通过合成功能化金纳米粒子，利用 click反应来检测溶液中的铜离子（参考文献： Yang Zhou, Shixing Wang, Ke Zhang, Xingyu Jiang*. Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 7454-7456 )。发明内容

本发明的一个目的是提供一种抗体标记的方法，该方法采用氧化铜纳米颗粒对抗体进行标记，所标记的抗体无需借助于特殊和吊贵的仪器即可实现方便、快速的检测。本发明的另一个目的是提供所述方法的应用。本发明的又一个目的是提供一种用于标记抗体的试剂盒。本发明的再一个目的是提供所述试剂盒的应用。用于实现上述目的的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种抗体标记方法，该方法包括以下步骤：

1 )将氧化铜纳米颗粒制成分散液；

2 )将待标记的抗体加入到步骤 1 )中制备的氧化铜纳米颗粒分散液中进行低速振荡标记，之后离心并去除上清；

3 )将步骤 2 ) 中获得的沉淀重新分散，离心，之后去除沉淀。

采用上述方法即可获得氧化铜纳米颗粒标记的抗体。

优选地，所述抗体标记方法在 PBS緩沖液中进行。

优选地，用于标记抗体的氧化铜纳米颗粒与待标记抗体的质量比为 5: 1-100: 1 ; 进一步优选地，质量比为 50: 1。

优选地，在步骤 1 ) 中，采用选自涡旋振荡和超声方法对氧化铜纳米颗粒进行分散，进一步优选地采用超声进行分散，超声时间为 5~30分钟。更优选地，超声时间为 10~20分钟。

优选地，在步骤 2 ) 中，标记反应时间为 2~4小时；进一步优选地，标¾反应时间为 3小时。

优选地，在步骤 2 )中，离心速度为 8000~10000 rpm。进一步优选地，离心速度为 9000 rpm; 优选地，离心时间为 5~15分钟。进一步优选地，离心时间为 10分钟。

优选地，在步骤 3 ) 中，在将步骤 2 ) 中获得的沉淀重新分散后，加入稳定剂进行稳定。优选地，加入的稳定剂选自 BSA、十二烷基苯蹟酸钠、十二烷基蹟酸钠，进一步优选为 BSA。优选地，加入的稳定剂在反应体系中的浓度为 0.5%~2%, 稳定反应时间为 20~60分钟；进一步优选地，所述稳定剂在反应体系中的浓度 1%, 稳定反应时间为 30分钟。

优选地，在步骤 3 ) 中离心速度为 5000~8000 rpm。进一步优选地，离心速度为 6000 rpm; 优选地，离心时间为 5~15分钟。进一步优选地，离心时间为 10分钟。

另一方面，本发明提供所述方法在生物、生物医学、医学检验等领域的应用。

优选地，本发明提供所述方法在免疫相关疾病的检测和诊断中的应用，进一步优选地，所述免疫相关疾病为病毒引起的免疫相关疾病。

优选地，本发明提供所述方法在制备用于疾病检测和诊断的试剂中的应用。进一步优选地，所述疾病为免疫相关疾病；更优选地，所述免疫相关疾病为病毒引起的免疫相关疾病。

又一方面，本发明提供一种用于抗体标记的试剂盒，该试剂盒包括：氧化铜纳米颗粒、緩沖液以及稳定剂。

优选地，所述试剂盒中的稳定剂选自 BSA、十二烷基苯蹟酸钠、十二烷基橫酸钠，进一步优选为 BSA。

再一方面，本发明提供所述试剂盒在生物、生物医学、医学检验等领域的应用。

优选地，本发明提供所述试剂盒在疾病检测和诊断中的应用。进一步优选地，所述试剂盒应用于免疫相关疾病的检测和诊断中，更优选地，所述免疫相关疾病为病毒引起的免疫相关疾病。本发明的抗体标记方法的应用可具体在于：当采用本发明的方法对抗体进行纳米氧化铜标记后，标记了纳米氧化铜颗粒的抗体可以与待检测样品中的检测目标（例如抗原或其它能够与被标记抗体相结合的蛋白质等 )进行稳定、有效的结合，进而通过检测氧化铜纳米颗粒实现对待检测目标或反应的检测，并且这一检测结果可通过肉眼进行判断。对于标记在抗体上的纳米氧化铜颗粒的检测将在下文的发明详述部分进行具体描述。

与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

1、本发明提供的抗体标记的方法在读出方面不需要借助于任何仪器，直接用肉眼就可读取检测结果，摆脱了目前通常采用的三大免疫检测技术对测量仪器的依赖。

2、在对本发明的标记抗体方法的检测中，除了目前现有技术中对铜离子进行检测的方法和产品外，还可以采用改进的功能化金纳米颗粒对其进行检测，使得纳米氧化铜颗粒的检出限更低，可达到 Ι μΜ, 并且在 10分钟之内可以完成检测，因此检测更为迅速、方便。

3、本发明提供的抗体标记技术可以克服现有抗体标记技术的缺点，标记方法筒单，稳定性好，便于开展，对环境无污染并且对人体无危害。 4、本发明的方法及试剂盒不需要昂贵仪器，操作流程筒单，成本低，便于开展，有望改善非洲等落后不发达地区的检测条件。以下是本发明的详细描述：

本发明的目的是建立一种抗体标记的新方法，通过采用氧化铜纳米颗粒对抗体进行标记，提供标记有氧化铜纳米颗粒的抗体。基于氧化铜纳米颗粒可以迅速、方便地进行检测，为基于免疫反应的疾病检测和诊断提供了一种新工具。

本发明采用的示例性的技术方案如下：

1 )称取 1~5 mg市售氧化铜纳米颗粒（购于 Sigma公司，粒径小于 50 nm ), 加入 1~5 mL PBS緩沖液中，超声分散 10-20分钟；

2 )将浓度为 0.1~0.4 mg/mL的抗体稀释液 50~500 μΐ^在 3分钟内逐滴加入含有氧化铜纳米颗粒的溶液中，低速振荡 2-4小时后， 8000~11000 rpm离心 5~15分钟，去掉含有没有标记氧化铜纳米颗粒抗体的上清液；

3 )将离心管中的沉淀用 l~5mL PBS緩沖液重新分散，并向溶液中加入 20-200 μΐ 10%的 BSA溶液， BSA溶液在这里起到稳定剂的作用，搅拌 30~60 分钟， 5000-8000 rpm 离心 5~15分钟，去掉沉淀得到氧化铜纳米颗粒标记的抗体， 4 °C保存待用。这里抗体可以是一抗也可以是二抗。

采用上述方法即可获得氧化铜纳米颗粒标记的抗体。该被标记的抗体可以与待检测样品中的检测目标（例如抗原或其它能够与被标记抗体相结合的蛋白质等）进行稳定、有效的结合，然后采用现有技术中检测铜离子的检测试剂或检测体系即可实现对氧化铜纳米颗粒的检测，从而实现对待检测目标或抗原抗体结合反应的检测。这一检测结果直接通过肉眼即可获得，因此，本发明所提供的标记方法可以有效应用于涉及抗体标记的生物、生物医学、医学检验等领域的研究和实践的应用。此外 ,抗体上的氧化铜纳米颗粒还可以通过特殊的功能化金纳米颗粒检测体系进行检测，这一功能化金纳米颗粒检测体系在检测时，可以在很短的时间内发生颜色变化，可以直接通过肉眼进行判断，从而实现检测。本申请在此提供了这一功能化金纳米颗粒检测体系及其检测方法。

来自实施例、示例性的被标记抗体的检测如下：

首先，使标记了纳米氧化铜颗粒的抗体与待检测抗原相结合。在 96孔板中加入浓度为 0.01-0.05 mg/mL的抗原 100 μΐ^, 4 °C过夜，然后用 200 μΐ PBST洗液（含有 0.1%吐温的 PBS緩沖液 )洗板三次，每孔加入 200 μΐ 5% 的胎牛血清作为封闭剂进行封闭， 37 °C孵育 1~2小时。然后用 200 L PBST 洗液洗板三次，每孔加入经过氧化铜纳米颗粒标记的抗体 100 μΐ, 37 °〇孵育 1 ~2小时。然后用 200 去离子水洗板三次，完成抗原抗体免疫反应。

然后，在孔中加入 20 μΐ 0.1~lmM的 HC1溶液，通过酸碱中和反应将标记在抗体上氧化铜纳米颗粒中的 Cu²⁺释放出来，反应 10分钟后，加入表面功能化的金纳米粒子检测体系（其制备请见实施例 1-13 ), 检测体系中的还原剂将 Cu²⁺还原成 Cu(I), Cu(I)作为催化剂在常温常压下使金纳米粒子检测体系中的金纳米粒子末端炔基和叠氮基发生成环反应（图 1 ),从而使功能化的金纳米粒子发生反应而产生聚积和沉淀现象，进而通过肉眼观察金纳米粒子颜色和沉淀现象的变化即可实现对溶液中 Cu²⁺的检测，间接的实现对抗体表面氧化铜纳米颗粒标记物的检测。本发明的有益效果在于：

1、与同类标记方法相比，本发明的抗体标记方法筒单，只需将氧化铜纳米颗粒与待标记抗体震荡搅拌 3小时即可，不需要进行化学反应，操作筒便。

2、与同类标记的检测方法相比，本发明的抗体标记方法不需要借助精密仪器实施检测，仅凭肉眼即可完成对抗原抗体标记的定性检测。

3、与同位素标记方法相比，本发明采用非放射性标记法，可以避免放射性物质对人体、环境的伤害；避免使用有毒或者对人体有害、对环境有污染的试剂。本发明方法是一种新的抗体标记方法，可以应用于基于免疫反应的重大疾病的诊断和检测，例如 HBV, AIDS等，同时可以被制成试剂盒，实现商品化，因为整个标记反应的成本低，有望改善非洲等落后不发达地区的诊断条件。附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图 1 : 在 Cu(I)催化下，功能化金纳米粒子上的末端炔基和叠氮基发生成环反应的示意图。图 2: 化合物 6的质谱（图 2A )和红外图谱（图 2B )。

图 3: 化合物 9的质谱（图 3A )和红外图谱（图 3B )。

图 4: 在对本发明的氧化铜纳米颗粒标记的抗体进行检测时，检测体系发生颜色变化的紫外吸收光谱。实施发明的最佳方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。应当理解给出的实施例仅为了对制备和使用本发明的特定方法进行说明，而不是为了限制本发明的范围。

本发明所使用的主要试剂或原料的商购途径如下表所示：原料名称规格来源

三苯基氯甲烷 CR 国药集团化学试剂有限公司

Λ^ Λ^二异丙基乙胺（DIEA) 99 % Alfa-Aesar

11-巯基十一烷酸 95 % Sigma- Aldrich

1-乙基- (3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐 (EDC-HC1) 99 % 上海共价化学科技有限公司

4-二甲氨基吡啶（DMAP) 99 % Alfa-Aesar

三聚乙二醇 (EG3) 97 % Sigma-Aldrich

三氟乙酸（TFA) CR 国药集团化学试剂有限公司三乙基硅烷（TESi) 97 % Sigma-Aldrich

羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 99 % 上海共价化学科技有限公司其余未列出常见试剂皆购于北京化工厂，规格为 AR, 不需要做进一步纯化处理。实施例 1: 化合物 1的合成 trityl chloride, DIEA

HSC₁₀H₂₀COOH TrSC₁₀H₂₀COOH ft n ^M

toluene

步骤：

1、将 lOO mL的两口烧瓶 (19#)抽真空，充入氮气。

2、氮气保护下向该烧瓶中加入 50 mL曱苯，将三苯基氯曱烷 (4.60 g, 16.5 mmol)和 N，N-二异丙基乙胺 (DIEA, 4.20 g, 33.0 mmol)溶解于该曱苯里面，磁力搅拌下加入 11 -巯基十一烷酸 (3.00 g, 13.8 mmol) , 氮气保护下在室温反应 5 小时。

3、反应毕，将溶剂减压蒸出，向残余的产物中加入 50 mL二氯曱烷，充分溶解后，用饱和食盐水 (3x 100 mL)洗三次，再用无水硫酸钠干燥二氯曱烷溶液，静置过夜。

4、过滤去掉干燥剂无水硫酸钠，将滤液减压蒸馏，浓缩得到化合物 1的粗品。用少许二氯曱烷溶解该粗品后，用柱层析的方法进行纯化。洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯 =10: 1 , 最后得到纯品为无色油状液体，共 5.80 g (12.6 mmol), 产率为 92%。实施例 2: 化合物 2的合成

EDC,NHS,DMAP 仆 A物

TrSC₁₀H₂₀COOH ―— 化口物 2

步骤：

1、向一个 50 mL的单口烧瓶（ 19# ) 中加入化合物 1 (1.50 g, 3.3 mmol), EDC-HCl (0.69 g, 3.6 mmol)催化量的 DMAP, 加入 25 mL无水二氯曱烷，磁力搅拌使之溶解，最后向该混合液中加入 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS, 0.45 g, 3.9 mmol)。

2、该混合溶液在 5 °C搅拌一个小时，随后在室温下反应 24小时。

3、反应毕，用 25 mL二氯曱烷稀释反应液，再用饱和食盐水 (3x50 mL) 洗三次，用无水硫酸钠干燥有机相，浓缩得到化合物 2 ( 1.80 g, 3.23 mmol ) , 该化合物为化合物 1的活化酯。产率为 99%。实施例 3: 化合物 3的合成 TrSC₁₀H₂₀COO~N、 J

步骤：

1、 NH₂C₂H₄OC₂H₄OC₂H₄NH₂ (8 mL, 55 mmol)溶解到无水二氯曱烷中，搅拌下向该混合溶液中緩慢滴加化合物 2 (1.80 g, 3.23 mmol)的二氯曱烷溶液 10 mL , 滴加完毕后，再在室温下反应过夜。

2、用 50 mL二氯曱烷稀释反应液，再用饱和食盐水 (3 x50 mL)洗有机相三次，用无水硫酸钠干燥有机相，减压浓缩，得到化合物 3的粗品。

3、用少许二氯曱烷溶解粗品后上样，进行柱层析分离，洗脱剂为氯仿：曱醇：氨水 =20: 1 : 0.05 , 得到纯品为无色油状液体，共 1.78 g ( 3.0 mmol ) , 产率为 94%。实施例 4: 化合物 4的合成

HC≡CCH₂CH₂COOH 化合物 4

步骤：

1、将 4-戊炔酸 ( 490.5 mg, 5 mmol ), NHS ( 690 mg, 6 mmol ), DMAP ( 100 mg )溶于 30 mL无水 DCM中，搅拌下加入 EDC ( 1.152 g, 6 mmol )

5 °C反应 1小时，室温搅拌过夜。

2、反应完毕，有机相用饱和食盐水（3 X 50 mL ) 洗三次，用无水硫酸钠干燥，旋去溶剂，得黄色油状液体，产率为 99%。

实施例 5: 化合物 5的合成

o o

TrSC₁₀H₂₀¾NH(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₂NHfccH₂CH₂C≡CH 化合物 5 步骤：

1、将化合物 4 ( 1.0 g, 5 mmol )溶于 30 mL无水 DCM中，搅拌下加入化合物 3 ( 3.25 g, 5.5 mmol ), 室温下搅拌过夜。

2、反应完毕，浓缩粗产品，用柱层析的方法进行纯化，洗脱剂为（氯仿：曱醇 =50: 1 ), 得到纯品为白色粉末，共 3 g, 产率为 79%。

实施例 6: 化合物 6的合成

0 0 CF₃COOH

TrSC₁oH2ofcNH(CH₂CH20)2CH₂CH2NH^l6cH₂CH₂C≡CH ~ _CH2ci₂ ，

0 0

HSC₁₍₎H₂。feNH(CH₂CH₂0)₂CH₂CH₂NHfccH₂CH₂C≡CH 化合物 6 步骤：

1、将 25 mL的两口烧瓶 (19#)抽真空，充入氮气。

2、氮气保护下将 0.5 mL三氟乙酸（TFA) 加入 9.5 mL无水二氯曱烷里，得到 5% (v/v)的三氟乙酸溶液。搅拌下向该溶液中加入化合物 5 (2.01g, 3 mmol), 随后加入三乙基硅烷（TESi, 2.3 mL, 15 mmol), 室温搅拌过夜。

3、反应完毕，反应完毕后用 0.2 M的氢氧化钠溶液（3 x5 mL ) 洗三次，然后用饱和食盐水（ 2x5 mL )洗两次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，将残余物用少许二氯曱烷溶解后上样，进行柱层析分离，洗脱剂为氯仿：曱醇 =50: 1 , 得到白色固体，共 960 mg, 产率为 77 %, 化合物 6即为功能化金纳米粒子的炔基配体。其中，化合物 6的质谱图见图 2A, 红外谱图见图 2B。实施例 7: 化合物 7的合成

BrCHpCH COOH N₃CH₂CH₂COOH 化合物 7

^{2 2} CH₃CN

步骤：

1、将 3-溴丙酸（ 1.5 g, 9.8 mmol )加入到 10 mL乙腈中，搅拌下加入叠氮钠 ( 1.27 g, 19.6 mmol ), 70 °C回流 6小时。

2、反应完毕后，加入 30 mL DCM稀释，加入 50 mL 0.1 M的 HC1洗，然后用氯仿萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，得到棕色液体。产率为 99%。

实施例 8: 化合物 8的合成

0

TrSC₁₀H₂₀fcNH(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₂NH₂

N₃CH₂CH₂COOH - »_ \ i. i a i i i

CH CI

O O

TrSC₁₀H₂₍^NH(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₂NHfccH₂CH₂N₃ 化合物 8

步骤：

1、将化合物 7 ( 654 mg, 5.7 mmol )和化合物 3 ( 2.8 g, 4.75 mmol )溶于 40 mL无水 DCM中，然后加入 EDC ( 1.09 g, 5.7 mmol )和 DMAP ( 100 mg), 室温搅拌过夜。

2、反应完毕，用饱和食盐水洗有机相（2xl5mL)两次，然后用氯仿萃取水相，合并有机相，无水硫酸钠干燥，粗产品进行柱层析分离，洗脱剂为氯仿：曱醇 =20: 1, 得到白色固体，共 2.82 g, 产率为 86%。

实施例 9: 化合物 9的合成

0 0 CF₃COOH

TrSC₁₀H₂ofcNH(CH₂CH₂0)2CH₂CH₂NH( cH₂CH₂N3 ~ CH₂C\₂ "

O o

HSC H^fcNhKCH CH O^CH CH NHtCH CH Ns 化合物 9 步骤：

1、将 25mL的两口烧瓶 (19#)抽真空，充入氮气。

2、氮气保护下将 0.5 mL三氟乙酸（TFA) 加入 9.5 mL无水二氯曱烷里，得到 5% (v/v)的三氟乙酸溶液。搅拌下向该溶液中加入化合物 8 (1.93 g, 2.8 mmol), 随后加入三乙基硅烷（TESi, 2.3mL, 15 mmol), 室温搅拌过夜。

3、反应完毕后用 0.2 M的氢氧化钠溶液（ 3x5 mL )洗三次，然后用饱和食盐水（2x5 mL)洗两次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，将残余物用少许二氯曱烷溶解后上样，进行柱层析分离，洗脱剂为氯仿：曱醇 =50: 1, 得到白色固体，共 830mg, 产率为 68%, 化合物 9即为功能化金纳米粒子的叠氮基配体。其中，化合物 9的质谱图见图 3A, 红外谱图见图 3B。实施例 10: 金纳米粒子的合成

将 41.2 mg氯金酸（ 99.95% ) 溶于 100 mL水中，搅拌状态下加热至沸腾，将 114 mg柠檬酸钠溶于 10 mL水，然后迅速加入到沸腾的氯金酸溶液中，溶液从黄色变为无色，到紫色再到酒红色，继续加热搅拌 15分钟，自然冷却到室温搅拌 2 小时，得柠檬酸钠稳定的酒红色的金纳米粒子。实施例 11: 块基功能化金纳米粒子的合成

将制得柠檬酸钠稳定的金纳米粒子 1.5 mL,用去离子水稀释成 10mL溶液，然后滴加浓度为 0.5 M的氢氧化钠溶液，直至调节 pH值为 9, 搅拌状态下，同时加入共稳定剂（ 11-巯基烷基聚乙二醇 (3), 3 μηιοΐ )和末端炔基功能化的硫醇配体（化合物 6, 0.5 μηιοΐ ),搅拌 24 小时，离心分离 20 分钟，经过水洗三次，再离心分离后得到表面炔基功能化的金纳米粒子。实施例 12: 叠氮基功能化金纳米粒子的合成

将制得柠檬酸钠稳定的金纳米粒子 1.5 mL,用去离子水稀释成 10mL溶液，然后滴加浓度为 0.5 M的氢氧化钠溶液，直至调节 pH值为 9, 搅拌状态下，同时加入共稳定剂（ 11-巯基烷基聚乙二醇 (3), 3 μηιοΐ )和末端叠氮基功能化的硫醇配体（化合物 9, 0.5 μηιοΐ ), 搅拌 24小时，离心分离 20 分钟，经过水洗三次，再离心分离后得到表面叠氮基功能化的金纳米粒子。实施例 13: 功能化金纳米粒子检测体系的制备

将制备好的炔基功能化金纳米粒子溶液和叠氮基功能化金纳米粒子溶液各取 1 mL加入到离心管中，向溶液中加入浓度为 0.05 M的还原剂抗坏血酸钠 20 L, 超声振荡 5分钟，即得到功能化金纳米粒子的检测体系。实施例 14: 功能化金纳米粒子检测体系对铜离子的检测

取 7只玻璃小瓶，在每个小瓶中加入 1 mL功能化金纳米粒子检测体系溶液，然后在小瓶中依次加入浓度为 10 mM、 1 mM、 100 μΜ、 10 μΜ、 1 μΜ、 100 ηΜ和 10 ηΜ的石克酸铜溶液 10 μΐ^, 10分钟后瓶中铜离子浓度大于 1 μΜ (包括 1 μΜ ) 的检测体系都发生了颜色变化，由红色变为蓝紫色，检出限为 1 μΜ。实施例 15: 用氧化铜纳米颗粒标记兔抗 OVA (鸡卵白蛋白， ovalbumin, OVA )抗体

称取 1 mg 市售氧化铜纳米颗粒（购于 Sigma公司，粒径小于 50 nm ), 加入 l mL PBS緩沖液中，超声分散 10 分钟，然后将浓度为 0.2 mg/mL 的兔抗 OVA抗体（购于博奥森公司，产品货号 bs-0283R )稀释液 500 μΐ^在 3 分钟内逐滴加入含有氧化铜纳米颗粒的溶液中，低速振荡 3 小时后， 10000 rpm 离心 10 分钟，去掉含有没有标记氧化铜纳米颗粒抗体的上清液，然后再将离心管中的氧化铜用 1.5 mL PBS緩沖液重新分散，并向溶液中加入 200 μΐ 10%的 BSA溶液， BSA溶液在这里起到稳定剂的作用，搅拌 30分钟， 5000 rpm 离心 10分钟，去掉没有标记在抗体上的过量氧化铜，得到氧化铜纳米颗粒标记的兔抗 OVA抗体复合体， 4 保存待用。实施例 16: OVA抗原与氧化铜标记的兔抗 OVA抗体反应

在 96孔板中加入浓度为 0.02 mg/mL 的 OVA抗原（购于 Sigma公司，货号为 A 5503 ) 100 μΐ, 4 °C过夜，然后用 200 μΐ PBST洗液（含有 0.1% 吐温的 PBS緩沖液）洗板三次，每孔加入 200 μΐ 5% 的胎牛血清作为封闭剂进行封闭， 37 °C孵育 1 小时。然后用 200 PBST洗液洗板三次，每孔加入经过氧化铜纳米颗粒标记的兔抗 OVA抗体 100 L, 37 °C孵育 1 小时。然后用 200 去离子水洗板三次，去除未反应的多余氧化铜标记的兔抗 OVA 抗体，完成抗原抗体免疫反应。同时，为了确保后续的检测结果可信，在完成抗原抗体反应的过程中，在板上其他孔内还加入了兔 IgG作为阴性对照， BSA作为无关蛋白对照，以及空白对照。制备方法同 OVA抗原与氧化铜标记的兔抗 OVA抗体反应。在另一孔内加入 10 的浓度为 10 μΜ铜离子作为阳性对照。实施例 17: 标记氧化铜纳米颗粒兔抗 OVA抗体的可视化检测

在孔板每孔中加入 20 μL lmmol/L的 HC1溶液，通过酸碱中和反应将标记在抗体上氧化铜纳米颗粒中的 Cu²⁺释放出来，反应 10分钟后，加入表面功能化的金纳米粒子检测体系 200 μΐ,检测体系中的还原剂抗坏血酸钠会将 Cu²⁺还原成 Cu(I), Cu(I)作为催化剂在常温常压下使末端炔基和叠氮基发生成环反应，从而使功能化的金纳米粒子发生反应而产生聚集和沉淀现象。反应 10分钟后，通过肉眼观察到，待测孔内的检测体系从红色变成紫色，阳性对照孔内的检测体系由红色变为了蓝色，阴性对照、无关蛋白对照和空白对照孔内的检测体系没有发生颜色变化，通过酶标仪对各孔的紫外吸收光谱，可以明显的看到待测孔和阳性对照孔的紫外吸收峰发生了红移（图 4 )。因此，实现了对溶液中 Cu²⁺的检测，从而间接的实现了对氧化铜纳米颗粒标记抗体的检测，并且该检测可通过肉眼进行判断。实施例 18: 用氧化铜纳米颗粒标记羊抗兔 IgG

参考实施例 15的制备方法，将其中的兔抗 OVA抗体换为羊抗兔 IgG(购于博奥森公司，货号为 bs-0295G )。实施例 19: OVA抗原、兔抗 OVA抗体与与氧化铜标记的羊抗兔 IgG反应在 96孔板中加入浓度为 0.02 mg/mL 的 OVA抗原 100 μ , 4 °C过夜，然后用 200 PBST洗液（含有 0.1% 吐温的 PBS緩沖液）洗板三次，每孔加入 200 L 5% 的胎牛血清作为封闭剂进行封闭， 37 °C孵育 1 小时。然后用 200 μΐ PBST洗液洗板三次，每孔加入兔抗 OVA抗体 100 μΐ, 37 °C孵育 1 小时。然后用 200 PBST洗液洗板三次，每孔加入经过氧化铜纳米颗粒标记的羊抗兔 IgG ΙΟΟ μ , 37°C孵育 1 小时。然后用 200 去离子水洗板三次，去除未反应的多余氧化铜标记的羊抗兔 IgG, 完成抗原、一抗、二抗免疫反应。同时，为了确保后续的检测结果可信，在完成抗原、一抗、二抗反应的过程中，在板上其他孔内还加入了兔 IgG作为阴性对照， BSA作为无关蛋白对照，以及空白对照。制备方法同该实施例中前面所述的抗原、一抗、二抗的制备方法。在另一孔内加入 10 的浓度为 10 μΜ铜离子作为阳性对照。实施例 20: 标记氧化铜纳米颗粒羊抗兔 IgG的可视化检测

在孔板每孔中加入 20 μL 1 mmol/L的 HC1溶液，通过酸碱中和反应将标记在羊抗兔 IgG上氧化铜纳米颗粒中的 Cu²⁺释放出来，反应 10分钟后，加入表面功能化的金纳米粒子检测体系 200 μL,检测体系中的还原剂抗坏血酸钠会将 Cu²⁺还原成 Cu(I), Cu(I)作为催化剂在常温常压下使末端炔基和叠氮基发生成环反应，从而使功能化的金纳米粒子发生反应而产生聚集和沉淀现象。反应 10分钟后，通过肉眼观察到，待测孔内的检测体系从红色变成紫色，阳性对照孔内的检测体系由红色变为了蓝色，阴性对照、无关蛋白对照和空白对照孔内的检测体系没有发生颜色变化，通过酶标仪对各孔的紫外吸收光谱，可以明显的看到待测孔和阳性对照孔的紫外吸收峰发生了红移。因此，实现了对溶液中 Cu²⁺的检测，从而间接的实现了对氧化铜纳米颗粒标记羊抗兔 IgG的检测。实施例 21: 用氧化铜纳米颗粒标记兔抗人 IgG

参考实施例 15的制备方法，将其中的兔抗 OVA抗体换为兔抗人 IgG(购于博奥森公司，货号为 bs-0297R )。实施例 22: HIV-1 gp41抗原、人血清与氧化铜标记的兔抗人 IgG反应

在 96孔板中加入浓度为 0.02 mg/mL 的 HIV-1 gp41抗原（购于博奥森公司，货号为 bs-0239P ) 100 μΐ, 4 °C过夜，然后用 200 μΐ PBST洗液（含有 0.1%吐温的 PBS緩沖液）洗板三次，每孔加入 200 μΐ 5%的胎牛血清作为封闭剂进行封闭， 37 °C孵育 1 小时。然后用 200 PBST洗液洗板三次，每孔加入 HIV阳性血清 10倍稀释液 100 μΐ, 37 °C孵育 1小时。然后用 200 μΐ PBST 洗液洗板三次，每孔加入经过氧化铜纳米颗粒标记的兔抗人 IgG 100 μΐ, 37 °C孵育 1 小时。然后用 200 去离子水洗板三次，去除未反应的多余氧化铜标记的兔抗人 IgG, 完成抗原、一抗、二抗免疫反应。同时，为了确保后续的检测结果可信，在完成抗原、一抗、二抗反应的过程中，在板上其他孔内还加入了阴性血清作为阴性对照， BSA作为无关蛋白对照，以及空白对照。制备方法同该实施例中前面所述的抗原、一抗、二抗的制备方法。在另一孔内加入 10 的浓度为 10 μΜ铜离子作为阳性对照。实施例 23: 标记氧化铜纳米颗粒兔抗人 IgG的可视化检测

在 96孔板每孔中加入 20 μL 1 mmol/L的 HC1溶液，通过酸碱中和反应将标记在兔抗人 IgG上氧化铜纳米颗粒中的 Cu²⁺释放出来，反应 10分钟后，加入表面功能化的金纳米粒子检测体系 200 μL,检测体系中的还原剂抗坏血酸钠会将 Cu²⁺还原成 Cu(I), Cu(I)作为催化剂在常温常压下使末端炔基和叠氮基发生成环反应，从而使功能化的金纳米粒子发生反应而产生聚集和沉淀现象。反应 10分钟后，通过肉眼观察到，待测孔内的检测体系从红色变成紫色，阳性对照孔内的检测体系由红色变为了蓝色，阴性对照、无关蛋白对照和空白对照孔内的检测体系没有发生颜色变化。因此，实现了对溶液中 Cu²⁺的检测，从而间接的实现了对氧化铜纳米颗粒标记兔抗人 IgG的检测。同时，该实施例也证明，该检测方法可以用来定性的检测 HIV血清样品, 基于免疫的疾病检测提供了一种新的检测方法。

Claims

权利要求

1、一种抗体标记方法，所述方法包括以下步骤：

1 )将氧化铜纳米颗粒制成分散液；

2、如权利要求 1的方法，其特征为，所述抗体标记方法在 PBS緩沖液中进行。

3、如权利要求 1或 2中任一项的方法，其特征为，所述用于标记抗体的氧化铜纳米颗粒与待标记抗体的质量比为 5: 1-100: 1 ; 进一步优选地，质量比为 50: 1。

4、如权利要求 1-3 中任一项的方法，其特征为，步骤 1 ) 采用涡旋振荡和超声方法对氧化铜纳米颗粒进行分散，进一步优选地采用超声进行分散，超声时间为 5~30分钟。更优选地，超声时间为 10~20分钟。

5、如权利要求 1-4中任一项的方法，其特征为，步骤 2 ) 标记反应时间为 2~4小时；进一步优选地，标记反应时间为 3小时；

优选地，步骤 2 ) 中离心速度为 8000~10000 rpm, 进一步优选地，离心速度为 9000 rpm; 优选地，离心时间为 5~15分钟；进一步优选地，离心时间为 10分钟。

6、如权利要求 1-5中任一项的方法，其特征为，步骤 3 ) 中，在将步骤 2 ) 中获得的沉淀重新分散后，加入稳定剂进行稳定；

优选地，加入的稳定剂选自 BSA、十二烷基苯橫酸钠、十二烷基磺酸钠，进一步优选为 BSA;

优选地，加入的稳定剂在反应体系中的浓度为 0.5%~2%, 稳定反应时间为 20~60分钟；进一步优选地，所述稳定剂在反应体系中的浓度 1%, 稳定反应时间为 30分钟。

7、如权利要求 1-6中任一项的方法，其特征为，步骤 3 ) 中离心速度为 5000~8000 rpm, 进一步优选地，离心速度为 6000 rpm; 优选地，离心时间为 5~15分钟；进一步优选地，离心时间为 10分钟。

8、如权利要求 1-7中任一项的方法在生物、生物医学、医学检验等领域中的应用；

优选地，所述方法在免疫相关疾病的检测和诊断中的应用；进一步优选地，所述免疫相关疾病为病毒引起的免疫相关疾病；

优选地，所述方法在制备用于疾病检测和诊断的试剂中的应用，进一步优选地，所述疾病为免疫相关疾病；更优选地，所述免疫相关疾病为病毒引起的免疫相关疾病。

9、一种用于抗体标记的试剂盒，所述试剂盒包括：氧化铜纳米颗粒、緩沖液以及稳定剂；

10、如权利要求 9的试剂盒在生物、生物医学、医学检验等领域的应用；优选地，所述试剂盒在疾病检测和诊断中的应用；进一步优选地，所述试剂盒应用于免疫相关疾病的检测和诊断中；更优选地，所述免疫相关疾病为病毒引起的免疫相关疾病。