CN108267575B

CN108267575B - CuO标记技术用于厚度可控蛋白质分子印迹膜的制备

Info

Publication number: CN108267575B
Application number: CN201810065176.3A
Authority: CN
Inventors: 李艳霞; 陈毅挺; 黄露; 娄本勇
Original assignee: Minjiang University
Current assignee: Minjiang University
Priority date: 2018-01-23
Filing date: 2018-01-23
Publication date: 2020-07-07
Anticipated expiration: 2038-01-23
Also published as: CN108267575A

Abstract

本发明提供一种CuO标记技术用于厚度可控蛋白质分子印迹膜的制备，具体是将模板蛋白固定于96孔微板，接着通过控制聚合时间制备一层厚度可控的聚苯胺薄膜，用于印迹模板蛋白，模板蛋白经洗脱形成分子印迹膜，通过CuO NPs直接标记信号转换技术，对分子印迹膜识别的目标蛋白进行直接标记，被标记的CuO NPs的量与目标蛋白的浓度有直接关系，经转换成Cu²⁺可直接电化学分析，从而构建一种新型电化学仿生传感器。该厚度可控的印迹膜提供了一种高效，特异性和稳定的目标蛋白的识别元件，CuO NPs直接标记信号转换技术提供了一种便捷、高效、灵敏的检测方法。

Description

CuO标记技术用于厚度可控蛋白质分子印迹膜的制备

技术领域

本发明涉及CuO标记技术用于厚度可控蛋白质分子印迹膜的制备，属于分子检测技术领域。

背景技术

分子印迹技术，是模拟自然界所存在的分子识别作用，制备包裹模板分子的聚合物网状结构的人工受体。所制备的聚合物称为分子印迹聚合物（Molecular imprintedpolymer, MIPs）。分子印迹聚合物是一种具有较强分子识别能力的新型高分子仿生材料。

传统的酶联免疫分析（ELISA）是将抗原或抗体结合到某种固相载体表面，利用其对目标物的特异性识别能力，采用酶标记技术进行信号的转换和放大，达到定性与定量分析的目的。如能将这种具有人工抗体性质的分子印迹材料与免疫技术相结合，将为生物分子分析提供一个全新的手段，而这一手段的优势在于对那些低丰度或难以获取抗体的生物分子可以实现直接的分析与检测，所消耗的模板分子量少，且有着比抗体更好的稳定性，如果设计一种单分子印迹层平铺于免疫板的底板上，一定程度上可以取代免疫分析中的抗体。

近年来，具有量子点效应和比表面积高等物化性质的金属氧化物，如铁氧化物（FeO，Fe₂O₃和Fe₃O₄），铜氧化物（CuO和Cu₂O）逐渐运用到分析化学领域中。

CuO NPs的粒径介于1-100nm，相较于普通的CuO，具有量子点效应和高的比表面积等特殊的物理化学性质，逐渐被引入到分析化学领域。CuO NPs成本低，合成步骤简单，物理及化学性质稳定，据文献报道，CuO NPs对生物样品具有较强的吸附能力，因此CuO NPs受到人们普遍的关注，并成为用途十分广泛的无机材料之一。

发明内容

本发明的目的是为了提供CuO标记技术用于厚度可控蛋白质分子印迹膜的制备，构建一种新型仿生传感器。该化学传感器提供了一种简单，特异性，灵敏和稳定的目标蛋白的识别与检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

CuO标记技术用于厚度可控蛋白质分子印迹膜的制备，是将模板蛋白固定于96孔微板，接着通过控制聚合时间制备一层厚度可控的蛋白质分子印迹膜，用于印迹模板蛋白，模板蛋白经洗脱形成分子印迹膜；通过CuO标记信号转换技术对分子印迹膜识别的目标蛋白进行直接标记，被标记的CuO NPs的量与目标蛋白的浓度有直接关系，经转换成Cu²⁺可直接电化学分析，从而构建一种新型电化学仿生传感器。

其中所述一种基于96孔板的蛋白质分子印迹膜的制备方法，具体步骤如下：

1）模板分子的固定：取洁净的96孔微型板，每孔加入50 μL 100 μg/mL的模板蛋白，适当的振晃孵育1小时。接着吸尽板孔中蛋白液体，加入100 μL超纯水清洗，每次浸泡5min，反复二次。

2）聚合物薄膜的制备：取一定浓度的苯胺作为功能单体，过硫酸铵APS为引发剂，苯胺与APS的摩尔比例为3∶1，在试剂管中先进行预聚合，以确保混合完全，并迅速加入板孔中，每孔加入80 μL，孵育一定时间，孵育过程可适当的振晃以避免聚合物分层，同时促进聚合完全，制成聚合物膜。反应过程中控制聚合时间，以制备符合要求的聚合物膜。

3）模板蛋白的洗脱：吸尽板孔中未反应完全的溶液，每孔加入100 μL超纯水，洗涤两次；加入100 μL 1 mol/L NaCl溶液进行洗脱蛋白，洗脱120min再加入300 μL超纯水清洗5次。

在步骤（1）中，模板蛋白为胰蛋白酶（Try）、牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、牛血红蛋白（BHb）、溶菌酶（Lyz）中的一种。

在步骤（2）中，苯胺的浓度为0.003 ~0.6 mol/L，APS的浓度为0.001 ~0.2 mol/L，孵育时间为5 ~50 min。

在步骤（3）中， NaCl溶液的浓度为0.1 ~2 mol/L。

其中所述CuO标记信号转换技术，具体步骤如下：

1）CuO NPs的制备：取1 mmol醋酸铜，2 mmol冰醋酸，依次溶解到100 mL的无水乙醇中，充分混匀并水浴加热到78℃，接着在磁力搅拌下，往混合液中加入4 mmol NaCl粉末，78℃下反应1小时，然后将所制备的CuO NPs悬浊液离心10 min，弃上清液，依次用乙醇、超纯水清洗沉淀数遍，60℃恒温干燥24 h。

2）目标蛋白的孵化：将目标蛋白稀释一定浓度，于制备好的印迹聚合物膜的96孔板中，每孔加入50 μL，孵育一定时间，然后吸尽板孔中的蛋白液体，加入100 μL超纯水，反复两次。

3）CuO NPs颗粒标记：配制一定质量浓度的CuO NPs悬浊液，超声分散。然后每孔加入30 μL，孵化一定时间，吸尽板孔中的CuO NPs悬浊液体，加入100 μL超纯水，反复洗涤两次。

4）Cu²⁺的电化学检测：每孔加入30 μL一定浓度的HCl溶液，将孔板溶液静置2~3min以确保CuO NPs充分溶解，转换成轻Cu²⁺，然后进行电化学检测。

在步骤（2）中，目标蛋白的浓度范围0~0.5 μg/mL，孵育时间为20 ~80 min。

在步骤（3）中，CuO NPs悬浊液的浓度为2~10 mg/mL，孵化时间为10~60 min。

在步骤（4）中，HCl的浓度为0.1~2 mol/L。

本发明得到的蛋白质分子印迹膜有如下的优点：

（1）本发明结合分子印迹技术的高选择性及电化学分析的高灵敏性，大大提高了所构建传感器的灵敏度、选择性和稳定性；

（2）采用CuO NPs取代常规酶联反应中的酶用于标记蛋白，降低了测试成本，扩大了该方法的应用范围；

（3）通过标记的CuO NPs转换成Cu²⁺，所产生的电化学信号可以控制印迹膜的厚度；

（4）CuO NPs与印迹蛋白直接结合，简化了标记步骤。

附图说明

图1 厚度可控的蛋白质分子印迹膜的制备方法及CuO NPs标记信号转换示意图；

图2 电化学信号随Try印迹聚合物膜聚合时间变化的曲线图；

图3 实施例2制备印迹聚合物膜识别Lys的吸附等温线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种厚度可控的蛋白质分子印迹膜的制备方法和CuO标记信号转换技术，具体步骤如下：

1）模板分子的固定：取的96孔微型板，每孔加入50 μL 100 μg/mL的模板蛋白胰蛋白酶（Try），适当的振晃孵育1小时。接着吸尽板孔中蛋白液体，加入100 μL超纯水清洗，每次浸泡5 min，反复二次。

2）聚合物薄膜的制备：取一定浓度（0.3 mol/L）的苯胺作为功能单体， APS（0.1mol/L）为引发剂，苯胺与APS的摩尔比例为3∶1，在试剂管中先进行预聚合，以确保混合完全，并迅速加入板孔中，每孔加入80 μL，孵育一定时间（20 min），孵育过程可适当的振晃以避免聚合物分层，同时促进聚合完全，制成聚合物膜。反应过程中控制聚合时间，以制备符合要求的聚合物膜，聚合物膜的厚度与电化学信号之间的关系见图2。

4）CuO NPs的制备：取1 mmol醋酸铜，2 mmol冰醋酸，依次溶解到100 mL的无水乙醇中，充分混匀并水浴加热到78℃，接着在磁力搅拌下，往混合液中加入4 mmol NaCl粉末，78℃下反应1小时，然后将所制备的CuO NPs悬浊液离心10 min，弃上清液，依次用乙醇、超纯水清洗沉淀数遍，60℃恒温干燥24 h。

5）目标蛋白的孵化：将目标蛋白胰蛋白酶（Try）(0.1 μg/mL)，每孔加入50 μL，孵育一定时间（40 min），然后吸尽板孔中的蛋白液体，加入100 μL超纯水，反复两次。

6）CuO NPs颗粒标记：配制为的CuO NPs悬浊液(6.0 mg/mL)，超声分散。然后每孔加入30 μL，吸附(30 min)，吸尽板孔中的CuO NPs悬浊液体，加入100 μL超纯水，反复洗涤两次。

7）Cu²⁺的电化学检测：每孔加入30 μL的HCl溶液(1 mol/L)，将孔板溶液静置2~3min以确保CuO NPs充分溶解，转换成轻Cu²⁺，然后进行电化学检测。

实施例2

将实施例1步骤（1）中的模板蛋白“胰蛋白酶（Try）”改为“溶菌酶（Lys）”，将目步骤（5）目标蛋白“胰蛋白酶（Try）”改为“溶菌酶（Lys）”，其余步骤同实施例1，电化学检测结果见图3。

Claims

1.CuO标记技术用于厚度可控蛋白质分子印迹膜的制备，其特征在于：将模板蛋白固定于96孔微板，接着通过控制聚合时间制备一层厚度可控的蛋白质分子印迹膜，用于印迹模板蛋白，模板蛋白经洗脱形成分子印迹膜；并通过CuO标记信号转换技术对分子印迹膜识别的目标蛋白进行直接标记，经转换成Cu²⁺可直接电化学分析，从而构建一种电化学仿生传感器；所述CuO标记信号转换技术，包括以下几个步骤：

1）CuO NPs的制备：取1 mmol醋酸铜，2 mmol冰醋酸，依次溶解到100 mL的无水乙醇中，充分混匀并水浴加热到78℃，接着在磁力搅拌下，往混合液中加入4 mmol NaCl粉末，78℃下反应1小时，然后将所制备的CuO NPs悬浊液离心10 min，弃上清液，依次用乙醇、超纯水清洗沉淀数遍，60℃恒温干燥24 h；

2）目标蛋白的孵化：将目标蛋白稀释一定浓度，于制备好的印迹聚合物膜的96孔板中，每孔加入50 μL，孵育一定时间，然后吸尽板孔中的蛋白液体，加入100 μL超纯水，反复两次；

3）CuO NPs颗粒标记：配制一定质量浓度的CuO NPs悬浊液，超声分散；然后每孔加入30μL，孵化一定时间，吸尽板孔中的CuO NPs悬浊液体，加入100 μL超纯水，反复洗涤两次；

4）Cu²⁺的电化学检测：每孔加入30 μL一定浓度的HCl溶液，将孔板溶液静置2~3 min以确保CuO NPs充分溶解，转换成轻Cu²⁺，然后进行电化学检测；所述的步骤2）中，目标蛋白的浓度范围为0~0.5 μg/mL，孵育时间为20 ~80 min；步骤3）中，CuO NPs悬浊液的浓度为2~10mg/mL，孵化时间为10~60 min；步骤4）中，HCl的浓度为0.1~2 mol/L。

2.根据权利要求1所述的CuO标记技术用于厚度可控蛋白质分子印迹膜的制备，其特征在于：所述厚度可控的蛋白质分子印迹膜的制备，具体步骤如下：

1）模板分子的固定：取洁净的96孔微型板，每孔加入50 μL 100 μg/mL的模板蛋白，振晃孵育1小时；接着吸尽板孔中蛋白液体，加入100 μL超纯水清洗，每次浸泡5 min，反复二次；

2）聚合物薄膜的制备：取一定浓度的苯胺作为功能单体，过硫酸铵APS为引发剂，苯胺与APS的摩尔比例为3∶1，在试剂管中先进行预聚合，以确保混合完全，并迅速加入板孔中，每孔加入80 μL，孵育一定时间，孵育过程适当的振晃以避免聚合物分层，同时促进聚合完全，反应过程中控制聚合时间，以制备符合要求的聚合物膜；

3）模板蛋白的洗脱：吸尽板孔中未反应完全的溶液，每孔加入100 μL超纯水，洗涤两次；加入100 μL 一定浓度的 NaCl溶液洗脱模板蛋白，孵化洗脱120min，再加入300 μL超纯水清洗5次；

步骤2）中聚合物膜孵育时间为5 ~50 min，不同蛋白因结构、空间大小不一，聚合时间也有所不同；

所述的苯胺的浓度为0.003 ~0.6 mol/L；

所述的过硫酸铵APS的浓度为0.001 ~0.2 mol/L；

NaCl溶液的浓度为0.1 ~2 mol/L。

3.根据权利要求2所述的CuO标记技术用于厚度可控蛋白质分子印迹膜的制备，其特征在于：所述的模板蛋白为胰蛋白酶Try、牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白OVA、牛血红蛋白BHb、溶菌酶Lyz中的一种。