ES2259791T3 - Conjugados sumamente fluorescentes de polimeros e intermedios. - Google Patents

Abstract

EN LA PRESENTE INVENCION SE PRESENTA UN CONJUGADO MUY FLUORESCENTE QUE ES UTIL PARA ENSAYOS DE ENLACES ESPECIFICOS, Y QUE CONTIENE UN MIEMBRO DE ENLACE ESPECIFICO UNIDO A UN POLIMERO FLUORESCENTE. EL POLIMERO FLUORESCENTE CONTIENE UN POLIMERO PRINCIPAL QUE TIENE MULTIPLES GRUPOS QUE GENERAN SEÑALES INMOVILIZADOS SOBRE EL MISMO Y, OPCIONALMENTE, UNIDADES DE CICLODEXTRINA ASOCIADAS AL POLIMERO. TAMBIEN SE PRESENTA UN NUEVO PROCESO PARA LA CREACION DE UN MONOALDEHIDO DE 6-CICLODEXTRINA.

Description

Conjugados sumamente fluorescente de polímeros e intermedios.

Campo técnico

La presente invención tiene que ver con un conjugado fluorescente que es útil en ensayos de unión específica. Más concretamente, la invención se refiere a composiciones e intermedios para un conjugado hidrosoluble, sumamente fluorescente, que consta de un miembro de unión específica unido a un polímero muy fluorescente.

Antecedentes de la invención

La afinidad de unión mostrada por anticuerpos hacia las superficies celulares es a menudo explotada como base para sistemas de diagnóstico por imagen utilizados para análisis citométrico y/o hematológico de muestras celulares (de ahora en adelante muestras de ensayo). Los sistemas de diagnóstico por imagen emplean con frecuencia anticuerpos como moléculas de unión que se unen específicamente a sitios en las superficies de células específicas contenidas en una muestra de ensayo. Para detectar si el anticuerpo se ha unido a la superficie de una célula, es marcado o etiquetado con una molécula fluorescente. El anticuerpo y su molécula fluorescente son mencionados colectivamente como conjugado.

En un típico análisis citométrico y/o hematológico, el conjugado es puesto en contacto con una muestra de ensayo, que por lo general es sangre o una fracción de la misma que contiene diversas poblaciones celulares, para formar una mezcla de ensayo. La mezcla es incubada durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que el conjugado se una a sitios diana en la superficie de ciertas poblaciones celulares. Después del periodo de incubación, una fuente de energía excita la molécula fluorescente del conjugado, causando de ese modo que fluorezca. Esta fluorescencia es detectada utilizando, por ejemplo, una cámara que detecte imágenes celulares vía la fluorescencia del conjugado unido. Las cámaras actualmente utilizadas en sistemas de diagnóstico por imagen son sumamente sensibles y, por consiguiente, son muy caras. Estas cámaras son necesariamente sensibles porque tienen que detectar conjugados que tienen una fluorescencia relativamente baja. Por ejemplo, los conjugados actualmente utilizados en sistemas de diagnóstico por imagen tienen, típicamente, un valor de moléculas de fluorocromo soluble equivalente (MESF) de aproximadamente 12.000. Una célula teñida fluorescentemente, que tenga un valor MESF de 12.000, puede ser revelada fidedignamente mediante una cámara fotométrica con dispositivo de carga enfriado (CCD) con 12 bits, 4.096 niveles y 500x386 píxeles. Este tipo de cámara cuesta aproximadamente 20.000 dólares, y es un coste importante asociado con la producción de un sistema de diagnóstico por imagen.

Ha habido varios intentos para producir un conjugado que tenga un valor MESF que sea detectable mediante una cámara menos sensible y, de ese modo, menos cara. Los intentos previos para intensificar la fluorescencia de conjugados han sacrificado la eficacia de unión de los conjugados por un conjugado más brillante. Por ejemplo, en un intento para aumentar la fluorescencia de un conjugado, el anticuerpo ha sido marcado al azar con múltiples moléculas fluorescentes (mencionadas a veces como fluoróforos). Aunque este marcado al azar aumenta el número de fluoróforos por anticuerpo, también se unen fluoróforos a la región de unión del anticuerpo. Cuando esta región está así unida mediante un fluoróforo, es incapaz de unirse a su diana y, de ese modo, no puede revelar las superficies celulares y ser útil para su fin pretendido. Además, marcar un anticuerpo con múltiples fluoróforos deja no impedida a menudo la porción FC del anticuerpo y capaz de unirse a receptores Fc que pueden estar presentes en la superficie de células contenidas en una muestra de ensayo. Debido a su habilidad para unirse de esta manera, ocurre una unión no específica del conjugado, y el resultado son imágenes erróneas.

En otro intento para aumentar la fluorescencia de conjugados para diagnóstico por imagen, se han unido múltiples fluoróforos a un polímero, y el polímero fue unido a un anticuerpo. Sin embargo, este conjugado no es útil para su fin pretendido debido a que adolece de una importante atenuación y, por lo tanto, la pérdida de señal causada por el inadecuado espaciamiento entre los múltiples fluoróforos en el esqueleto polímero, que tiene una cantidad limitada de espacio.

En todavía otro intento para aumentar la fluorescencia de conjugados para diagnóstico por imagen, se han unido micropartículas fluorescentes o partículas coloidales a un anticuerpo, incrementando de ese modo la fluorescencia del conjugado. Sin embargo, este tipo de conjugado adolece de la enfermedad de ser insoluble. Debido a que estos conjugados son insolubles, son identificados como cuerpos extraños por los fagotitos que están a menudo presentes en las muestras de ensayo. Por consiguiente, estos conjugados son ingeridos por los fagotitos, y la fluorescencia asociada con tal célula es debida a la partícula fluorescente en el fagocito, no el resultado de un conjugado unido a un marcador en la superficie de una célula.

En la técnica de la síntesis de conjugados han sido utilizadas moléculas conocidas como ciclodextrinas. La ciclodextrina es un oligosacárido cíclico hidrosoluble conocido que tiene una cavidad central hidrófoba y una región externa hidrófila. Generalmente, la forma de una molécula de ciclodextrina es cilíndrica, con un extremo del cilindro teniendo una abertura mayor que la otra. La abertura mayor es conocida como el borde secundario y la otra abertura es conocida como el borde primario. Entre las dos aberturas de la molécula de ciclodextrina está presente una cavidad dentro de la cual pueden entrar moléculas pequeñas a través del borde secundario mayor y, en sistemas acuosos, la cavidad de una molécula de ciclodextrina (el "huésped") proporciona un microentorno hidrófobo para la complejación de moléculas hidrófobas de pequeño peso molecular (el "invitado").

También se han hecho esfuerzos para generar ciclodextrina polímera, en un intento de aumentar la fluorescencia asociada con conjugados. Teóricamente, las propiedades de complejación de una molécula de ciclodextrina individual pueden ser magnificadas teniendo varias moléculas de ciclodextrina en estrecha proximidad entre sí (esto es, el tener varias moléculas de ciclodextrina en estrecha proximidad entre sí aumenta la probabilidad de que una molécula invitada entre en la cavidad de una molécula de ciclodextrina). De este modo, como teoría que funciona, si se creara una molécula de ciclodextrina polímera, sería capaz de alojar una pluralidad de moléculas invitadas. Además, si las moléculas invitadas de una molécula de ciclodextrina polímera fueran grupos generadores de señales, estarían varios, por ejemplo, fluoróforos en estrecha proximidad entre sí, y la fluorescencia asociada con el polímero sería mayor que la de un fluoróforo individual. Por lo tanto, si un conjugado estuviera fabricado con un fluoróforo que contuviera ciclodextrina polímera, su fluorescencia sería teóricamente mayor que la de un conjugado fabricado con un solo fluoróforo.

Se han fabricados varios polímeros basados en ciclodextrina para validar la teoría anteriormente mencionada. Sin embargo, estos polímeros adolecen de problemas que limitan severamente su efecto deseado. Estos polímeros basados en ciclodextrina son sintetizados utilizando monómeros de ciclodextrina que han sido modificados para que contengan varios grupos reactivos en los bordes primario y secundario de la ciclodextrina, lo que permite que estos monómeros reaccionen vía sus bordes primario y secundario, y reaccionen múltiples veces vía sus múltiples grupos reactivos. Cuando una molécula de ciclodextrina se une mediante su borde secundario, se impide la abertura mayor hacia la cavidad hidrófoba. Por consiguiente, es difícil para una molécula invitada entrar en la cavidad de la ciclodextrina, y se sacrifica la utilidad de las ciclodextrinas como huésped. Además, formar polímeros con ciclodextrinas que tengan múltiples grupos reactivos permite un alto grado de reticulación. Cuando sucede la reticulación, no solamente están las ciclodextrinas unidas por el borde secundario, causando los problemas mencionados antes, sino que se forma una matriz de ciclodextrinas. Por consiguiente, se limita el número de ciclodextrinas polimerizadas y muchas de las ciclodextrinas quedan enterradas dentro de la matriz. Aunque muchas ciclodextrinas están en estrecha proximidad, muy pocas de ellas tienen las aberturas secundarias accesibles, y son capaces de formar muy pocos complejos invitado/huésped. Los problemas asociados con los polímeros anteriores provienen de sus métodos de producción. Específicamente, las ciclodextrinas monómeras empleadas para sintetizar los polímeros son sobrerreactivas.

Para sintetizar una ciclodextrina polímera útil es necesario tener un componente básico de ciclodextrina monómera adecuadamente reactiva. Un ejemplo de tal ciclodextrina reactiva es 6-ciclodextrina monoaldehído. Se han descrito rutas anteriores para la 6-ciclodextrina monoaldehído, pero estos procedimientos sintéticos requieren múltiples etapas que incluyen la síntesis de intermedios tóxicos y potencialmente explosivos. Adicionalmente, estos procedimientos requieren materias que son difíciles de obtener y caras. De este modo, para utilizar eficazmente las propiedades complejantes de la ciclodextrina, particularmente con relación a la síntesis de conjugados, se necesita una ruta más segura y más eficaz para la 6-ciclodextrina monoaldehído.

USP 4.169.137 revela un reactivo detector de antígenos que consta de una molécula esqueleto polímera polifuncional, conteniendo aminas primarias, que tiene acoplada a ella una pluralidad de radicales de colorante fluorescente, estando limitado el número de dichos radicales de colorante fluorescente ya que no evita la formación de un complejo entre un anticuerpo, que tenga una porción amina primaria unida a la molécula esqueleto, y el antígeno, en donde el anticuerpo y la molécula esqueleto están unidos mediante un dianhídrido.

USP 5.068.227 revela derivados de ciclodextrina acoplados a moléculas de biorreconocimiento (tales como oligopéptidos de bajo peso molecular, poliaminoácidos macromoleculares, proteínas de superior peso molecular), la ciclodextrina así acoplada proporcionando una cavidad, o zona de complejación, dentro de la que se pueden incorporar marcadores fluorescentes.

WO 91 02040 revela una molécula de ciclodextrina que incluye compuestos de inclusión fluoróforos, acoplados a una sustancia de unión específica tal como un ligando, un ligador o un ácido nucleico.

WO 91 05605 revela composiciones de ciclodextrina y marcador que proporcionan un grupo de acoplamiento en la molécula de ciclodextrina, e incluyen una sustancia fluorescente y una sustancia de unión específica como ligando o ligador.

Reducir el gasto de los sistemas de diagnóstico por imagen se puede llevar a cabo reduciendo el coste de uno de sus componentes más caros. Específicamente, si se pudiera utilizar una cámara de bajo coste en un sistema de diagnóstico por imagen, el coste del sistema completo sería sumamente reducido. Esto no es práctico dado el estado presente de la tecnología de conjugados para diagnóstico por imagen. Existe, por lo tanto, la necesidad de un conjugado capaz de emitir una señal capaz de detección mediante una cámara de bajo coste.

Sumario de la invención

Conforme a la presente invención, se proporciona un conjugado que emite una cantidad de fluorescencia que es detectable por un dispositivo de detección que tiene un grado de sensibilidad relativamente bajo. Adicionalmente, se proporcionan intermedios y nuevos métodos útiles para sintetizar los intermedios. El conjugado de la presente invención puede ser empleado en, esencialmente, cualquier aplicación que utilice una entidad fluorescente inmovilizada sobre un miembro de unión específica.

El conjugado proporcionado aquí consta de un miembro de unión específica que está unido covalentemente a, por lo menos, un polímero muy fluorescente. El polímero sumamente fluorescente consta de un polímero esqueleto que tiene compuestos fluorescentes directamente unidos a él. Alternativamente, el polímero esqueleto puede tener moléculas de ciclodextrina unidas covalentemente a él, y los compuestos fluorescentes pueden estar alojados dentro de los microentornos hidrófobos de las moléculas de ciclodextrina, asociándose directamente de ese modo los grupos generadores de señales con el polímero. Cuando los compuestos fluorescentes están directamente unidos al polímero esqueleto, se pueden añadir indirectamente moléculas de ciclodextrina al polímero, teniéndolas asociadas con los grupos generadores de señales unidos, o se puede añadir ciclodextrina al polímero fluorescente uniendo covalentemente ciclodextrina a él.

Se describe un proceso para crear 6-ciclodextrina monoaldehído. El proceso permite la introducción sitio-específica de un grupo aldehído en una molécula de ciclodextrina. El proceso introduce un único grupo aldehído en el borde primario de una molécula de ciclodextrina, creando de ese modo una molécula de ciclodextrina reactiva que, cuando reacciona, no se reticula y evita el estorbar la abertura del borde secundario mayor.

El proceso para preparar 6-ciclodextrina monoaldehído comprende las etapas de:

a) transformar una molécula de ciclodextrina de la fórmula

1

en donde X es

2

y n es 5, 6 ó 7,

en su derivado monotosilato de la fórmula

3

en donde X y n son definidos como antes; y

b) transformar el derivado monotosilato de la etapa (a) en 6-ciclodextrina monoaldehído de la fórmula

4

en donde X y n son definidos como antes.

Breve descripción del dibujo

La Fig. 1 muestra la alfa (\alpha), beta (\beta) y gamma (\gamma) ciclodextrinas, y el sistema para numerar las unidades de glucosa allí.

Descripción detallada de la invención

Las definiciones siguientes son aplicables a la invención:

Definiciones

El término "analito", como se utiliza aquí, se refiere al compuesto o composición a ser detectado o medido, y que tiene al menos un epítopo o sitio de unión. El analito puede ser cualquier substancia para la que existe un miembro de unión de origen natural, o para la que se puede preparar un miembro de unión. Los analitos abarcan, pero no se pretende que estén limitados a, toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptidos, microorganismos, células contenidas en sangre humana o animal, antígenos de la superficie celular, aminoácidos, carbohidratos, hormonas, esteroides, vitaminas, fármacos (incluyendo aquellos administrados con fines terapéuticos así como aquellos administrados con fines ilícitos), partículas de virus y metabolitos de o anticuerpos para cualquiera de las sustancias anteriores. Por ejemplo, tales analitos abarcan, pero no se pretende que estén limitados a, ferritina, creatinina quinasa (CK-MB), digoxina, fenitoína, fenobarbitol, carbamazepina, vancomicina, gentamicina, teofilina, ácido valproico, quinidina, hormona luteinizante (LH), hormona foliculoestimulante (FSH), estradiol, progesterona, anticuerpos IgE, vitamina B2-microglobulina, hemoglobina glicosilada (HbA1c), cortisol, digitoxina, N-acetilprocainamida (NAPA), procainamida, anticuerpos para la rubéola tales como rubéola-IgG y rubéola-IgM, anticuerpo para la toxoplasmosis tales como toxoplasmosis IgG (Toxo-IgG) y toxoplasmosis IgM (Toxo-IgM), testosterona, salicilatos, acetaminofeno, antígeno de la superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg), anticuerpos para el antígeno del núcleo de la hepatitis B tales como IgG e IgM anti-antígeno del núcleo de la hepatitis B (anti-HBc), virus 1 y 2 de la inmunodeficiencia humana (VIH), antígeno e de la hepatitis B (HBeAg), anticuerpos para el antígeno e de la hepatitis B (anti-HBeAg), hormona estimulante del tiroides (TSH), tiroxina (T4), triyodotironina total (T3 total), triyodotironina libre (T3 libre), antígeno carcinoembriónico (CEA), alfa fetoproteína (AFP) y fármacos de sustancias ilícitas y controladas incluyendo, pero no se pretende que estén limitados a, anfetamina, metanfetamina, barbituratos tales como amobarbital, secobarbital, pentobarbital, fenobarbital y barbital, benzodiazepinas tales como librium y valium, cannabinoides tales como hachís y marihuana, cocaína, fentanilo, LSD, metacualona, opiatos tales como heroína, morfina, codeína, hidromorfona, hidrocodona, metadona, oxicodona, oximorfona y opio, fenciclidina, propoxifeno, y otros. El término "analito" también incluye cualquier substancia antigénica, haptenos, anticuerpos, macromoléculas y combinaciones de los mismos.

El término "ciclodextrina", como se utiliza aquí, se refiere a \alpha, \beta o \gamma-ciclodextrina.

El término "polímero optimizado sumamente fluorescente", como se utiliza aquí, se refiere a un polímero que tiene múltiples grupos generadores de señales, inmovilizados en él. Los grupos generadores de señales inmovilizados están espaciados a lo largo del polímero de manera tal que se maximice la señal generada a partir de los grupos generadores de señales, y se minimice el efecto de atenuación asociado con tener múltiples grupos generadores de señales demasiado cercanos entre sí.

El término "reactivo primario", como se utiliza aquí, se refiere a un agente que se une específicamente a un analito, y se utiliza como puente entre el analito, al cual se une, y un conjugado que se une al reactivo primario.

El término "grupo generador de señales", como se utiliza aquí, se refiere a un compuesto fluorescente (a veces mencionado como fluoróforo) que es capaz de absorber energía y emitir luz o fluorescencia. Ejemplos de grupos generadores de señales incluyen, pero no se pretende que estén limitados a, fluoresceína, Cascade Blue, rojo de Texas^{TM}, p-ftalocianinas, colorantes de cianina, tiazoles, dansilo, naftaleno, ácido (p-toluidinil)naftalensulfónico, cumarina, ficoeritrina, aloficocianina y otros.

"Miembro de unión específica", como se utiliza aquí, significa un miembro de un par de unión específica, esto es, dos moléculas diferentes donde una de las moléculas se une específicamente a la otra molécula mediante un medio químico o físico. Además de los pares de unión específica antígeno y anticuerpo, otros pares de unión específica incluyen, pero no se limitan a, avidina y biotina, carbohidratos y lectinas, secuencias nucleotídicas complementarias, secuencias peptídicas complementarias, moléculas efectoras y receptoras, un cofactor o sustrato enzimático y una enzima, un inhibidor enzimático y una enzima, ácidos y bases polímeros, colorantes y aglutinantes proteicos, péptidos y aglutinantes proteicos específicos (por ejemplo, ribonucleasa, péptido S y proteína S de la ribonucleasa), y otros. Además, los pares de unión pueden incluir miembros que sean análogos del miembro de unión original, por ejemplo, un análogo de analito o un miembro de unión fabricado mediante técnicas recombinantes o ingeniería molecular. Si el miembro de unión es un inmunorreactante puede ser, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o policlonal, una proteína recombinante o anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico, una mezcla(s) o fragmento(s) de los anteriores.

El término "muestra de ensayo", como se utiliza aquí, se refiere a una materia sospechosa de contener analitos. La muestra de ensayo puede ser utilizada directamente como se obtiene de la fuente, o a continuación de un pretratamiento para modificar el carácter de la muestra. La muestra de ensayo puede ser obtenida a partir de cualquier fuente biológica, tal como un fluido fisiológico abarcando saliva, fluido de los cristalinos oculares, fluido cerebroespinal, sudor, orina, leche, líquido ascitis, mucosa, líquido sinovial, líquido peritoneal, líquido amniótico y otros, y cultivos celulares de caldos de fermentación, y mezclas de reacciones químicas y otras. Además de los líquidos biológicos o fisiológicos, se pueden utilizar otras muestras líquidas tales como agua, productos alimenticios y otros, para la ejecución de ensayos medioambientales o de producción de alimentos. Además, como muestra de ensayo se puede utilizar una materia sólida sospechosa de contener un analito. En algunos casos, puede ser beneficioso modificar una muestra de ensayo sólida para formar un medio líquido, o para liberar un analito. La muestra de ensayo puede ser pretratada antes de su uso, por ejemplo, preparando plasma a partir de sangre, diluyendo líquidos viscosos, filtrando líquidos, destilando líquidos, concentrando líquidos, inactivando componentes interferentes, añadiendo reactivos, y otros.

Conforme a la presente invención, el polímero esqueleto hidrosoluble, utilizado para la producción del conjugado proporcionado aquí, consta de un polímero amino-funcional, que es típicamente amino-funcional con los siguientes grupos amino-funcionales:

---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- NH --- NH_{2}, --- NH_{2},

\hskip1cm

y

\hskip1cm

---

\uelm{N}{\uelm{\para}{H}}

--- R

en donde R se selecciona del grupo que se compone alquilo C_{1}-C_{3}, isopropilo,

-(CH_{2})_{2}CO_{2}^{-}, -(CH_{2})_{2}SO_{3}^{-}, -(CH_{2})_{2}NH_{3}^{+}, -(CH_{2})_{2}NH_{2}^{+}(CH_{2})_{2}SO_{3}^{-}, -(CH_{2})_{2}O(CH_{2})_{2}O(CH_{2})_{2}OH y -(CHOH)_{4}
CH_{2}OH. El polímero amino-funcional puede tener también combinaciones de las funcionalidades amino anteriormente listadas. Preferentemente, el polímero tiene un peso molecular promedio entre aproximadamente 20.000 y 300.000, más preferentemente entre aproximadamente 100.00 y 250.000, y muy preferentemente entre aproximadamente 150.000 y aproximadamente 200.000.

Cuando los grupos generadores de señales son para ser directamente unidos al polímero esqueleto, los grupos generadores de señales tienen, preferentemente, un grupo reactivo que es apropiado para formar enlaces covalentes con el polímero amino-funcional. Los grupos generadores de señales que sean capaces de tal reacción abarcan, pero no se limitan a, aquellos que tengan grupos ésteres activos de succinimidilo, haluros de ácido, haluros de sulfonilo, aldehídos, yodoacetilos, o maleimido. Ejemplos de grupos generadores de señales que pueden llevar las funcionalidades mencionadas incluyen fluoresceína, Cascade Blue, rojo de Texas^{TM}, p-ftalocianinas, colorantes de cianina, tiazoles, dansilo, naftaleno, ácido (p-toluidinil)naftalensulfónico, cumarina, ficoeritrina, aloficocianina y otros.

Como se mencionó anteriormente, los grupos generadores de señales pueden ser alojados, no covalentemente, dentro de una cavidad hidrófoba de una molécula de ciclodextrina que está unida covalentemente al esqueleto del polímero. En esta situación, los grupos generadores de señales no necesitan llevar ningún grupo reactivo. Sin embargo, como se comprenderá por un especializado en la técnica, el grupo generador de señales será uno que sea capaz de ser alojado por la molécula de ciclodextrina concreta a utilizar.

Como se declaró previamente, la atenuación de las señales se origina cuando múltiples colorantes están puestos al azar en un único polímero. Esta atenuación es reducida sustancialmente mediante la optimización del número de colorantes asociados con un polímero esqueleto individual. Optimizando el número de colorantes puestos en un único polímero esqueleto, los colorantes individuales no son tan susceptibles de atenuación. Mediante la optimización de los grupos generadores de señales en el polímero esqueleto, el conjugado de la invención actual es capaz de emitir una señal que puede ser detectada mediante un dispositivo de detección que tiene una sensibilidad relativamente baja y es relativamente barato. Además, mezclando ciclodextrina monómera, bajo condiciones apropiadas, con una preparación de conjugado de polímero fluorescente optimizado, la señal emitida por el polímero es intensificada aún más. Se ha descubierto, sorprendente e inesperadamente, que la señal generada por el conjugado de la invención actual puede ser aumentada hasta aproximadamente 35 veces sobre la de los conjugados disponibles actualmente.

El polímero fluorescente puede ser unido a cualquier miembro de unión específica que sea reactivo con un grupo amino-funcional presente en el polímero esqueleto. Aunque muchos miembros de unión específica son apropiados para su uso en el conjugado de la invención actual, se prefieren los anticuerpos.

El conjugado de la invención actual se puede utilizar en diversas aplicaciones que utilicen fluorescencia para detectar un suceso de unión específica. Tales aplicaciones abarcan, pero no se limitan a, análisis de imágenes, citometría de flujo, inmunoensayos, tinción celular fluorescente, microscopia fluorescente y otras.

El unir grupos generadores de señales a un polímero esqueleto se puede llevar a cabo haciendo reaccionar los grupos amino, que están presentes en el polímero esqueleto, con los grupos reactivos presentes en los grupos generadores de señales. Este proceso de unir los grupos generadores de señales al polímero es mencionado como cargar el polímero. Sin embargo, cargar simplemente un polímero con grupos generadores de señales puede no producir un polímero que emita la mayor cantidad de fluorescencia conseguible. Esto puede ser el resultado de sobrecargar un polímero, lo que produce atenuación, o infracargar un polímero que pudiera alojar más grupos generadores de señales sin experimentar atenuación. De este modo, se prefiere que el número de grupos generadores de señales cargados en el polímero sea optimizado para generar un polímero capaz de emitir la mayor cantidad de señal.

El optimizar el número de fluoróforos en un polímero amino-funcional se puede llevar a cabo ejecutando una serie de cargas de optimización y, después, determinando qué carga produce el polímero que emita la mayor cantidad de señal. Generalmente, este procedimiento puede ser ejecutado creando un panel de cargas de prueba que combinen concentraciones cambiantes de grupos generadores de señales, con una cantidad constante de polímero. Los polímeros cargados pueden ser después purificados de cualquier compuesto sin reaccionar mediante diversas metodologías conocidas por aquellos especializados en la técnica tales como precipitación, isoelectroenfoque o, preferentemente, cromatografía de exclusión granulométrica. Después, los polímeros purificados pueden ser comprobados por su capacidad para emitir una señal y determinar qué concentración de cargas produce el polímero que emita la mayor cantidad de señal. Típicamente, el polímero que muestre la mayor cantidad de señal ha sido óptimamente cargado y, la concentración a la que fue cargado a la que puede ser utilizado para cargar óptimamente cantidades preparativas del polímero fluorescente.

El método preferido para optimizar el número de grupos generadores de señales en un polímero concreto se puede llevar a cabo calculando en primer lugar el peso molecular del polímero hidrosoluble deseado, y determinando la cantidad molar total de grupos amino-funcionales presentes en el polímero. A continuación, se crea un panel constando de una serie de soluciones, cada una de las cuales conteniendo una concentración diferente de grupo generador de señales. Las soluciones del panel comprenden concentraciones diversas del grupo generador de señales disuelto en un disolvente apropiado, por ejemplo, dimetilformamida (DMF) o dimetilsulfóxido (DMSO). Las diversas concentraciones están basadas en la cantidad molar total de funcionalidad amina presente en el polímero amino-funcional, y un panel típico puede incluir las concentraciones siguientes: 5%, 10%, 15%, 20%, 40%, 75%, 100%, 140% y 200% de la cantidad molar total de grupos amino-funcionales presentes en el polímero elegido. Las concentraciones del panel son preferentemente llevadas a cabo bastante lejos a fin de que ocurra la atenuación, de ese modo delineando claramente el punto en el que el polímero está óptimamente cargado. Después de que el panel haya sido constituido, cada miembro del panel se añade a soluciones individuales y equimolares del polímero.

Cada solución de polímero cargado puede ser después purificada de polímero y/o grupos generadores de señales sin reaccionar, utilizando técnicas conocidas en la técnica. Como se mencionó previamente, después de que los polímeros sean purificados pueden ser analizados por su capacidad para emitir señal, y luego se puede producir una cantidad preparativa de polímero utilizando los datos así obtenidos. Alternativamente, se pueden ejecutar paneles de optimización adicionales para determinar más exactamente la concentración óptima de carga. Se comprende, por supuesto, que la manera mediante la que se optimiza un polímero no se pretende que esté limitada a los métodos descritos aquí, y que también se pueden emplear otros métodos.

El polímero sumamente fluorescente puede ser unido a un miembro del par de unión específica utilizando varias técnicas conocidas en la técnica. Una característica preferida de esta invención es unir covalentemente el polímero o polímeros fluorescentes en, o cerca de, la porción Fc de un anticuerpo. Uniendo el polímero a un anticuerpo de esta manera, se estorba estéricamente la porción Fc del anticuerpo, evitando de ese modo que se unan, por ejemplo, receptores Fc presentes en la superficie de ciertas poblaciones celulares. Adicionalmente, la unión sitio-específica deja no impedidas las regiones hipervariables de los anticuerpos y capaces de unirse a su diana pretendida. Se comprende, por supuesto, que la manera mediante la que un miembro de unión específica se une a un polímero fluorescente no se pretende ser limitar a los métodos descritos aquí, y que también se pueden emplear otros métodos conocidos en la técnica.

Se puede unir un polímero fluorescente a un anticuerpo oxidando la región Fc del anticuerpo, y después haciendo reaccionar el anticuerpo oxidado con un polímero del tipo descrito aquí. El anticuerpo es oxidado, preferentemente, a una concentración entre aproximadamente 1'0 mg/ml y unos 20'0 mg/ml, más preferentemente entre aproximadamente 1'0 mg/ml y unos 10'0 mg/ml, y muy preferentemente entre unos 2'0 mg/ml y unos 5'0 mg/ml. Si se obtiene el anticuerpo en concentraciones fuera de estos intervalos, puede ser concentrado por métodos conocidos por aquellos especializados en la técnica, o diluidos con un tampón adecuado. El anticuerpo es oxidado, preferentemente, en un tampón apropiado teniendo un pH entre aproximadamente 6'5 y aproximadamente 8'0, más preferentemente entre aproximadamente 7'0 y aproximadamente 8'0, y muy preferentemente entre aproximadamente 7'5 y aproximadamente 8'0. La oxidación de la región Fc del anticuerpo puede ser efectuada utilizando un agente oxidante conocido por aquellos especializados en la técnica. Tales agentes oxidantes abarcan, pero no se limitan a, peryodato sódico, dióxido de cromo, permanganato potásico, dióxido de manganeso, bromo y otros. La solución de agente oxidante tiene típicamente una concentración entre aproximadamente 100 mM y aproximadamente 200 mM, preferentemente entre aproximadamente 150 mM y aproximadamente 200 mM, y muy preferentemente entre aproximadamente 175 mM y aproximadamente 200 mM. La oxidación del anticuerpo puede tener lugar a una temperatura entre unos 2ºC y unos 30ºC, preferentemente la oxidación tiene lugar a una temperatura entre unos 2ºC y unos 8ºC, durante aproximadamente entre 15 minutos y unas 5 horas, preferentemente entre aproximadamente 1 hora y 2 horas. Después de que el anticuerpo haya sido oxidado puede ser purificado por métodos conocidos en la técnica, y puesto en un tampón apropiado que tenga un pH en el intervalo de aproximadamente 3 y aproximadamente 6, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 4 y aproximadamente 5. Después, el anticuerpo oxidado está listo para ser acoplado al polímero fluorescente. Se comprende, por supuesto, que la manera mediante la que se oxida el anticuerpo no pretende estar limitada a los métodos descritos aquí, y que también se pueden emplear otros métodos conocidos en la técnica.

Cuando reaccionan, por ejemplo, un anticuerpo oxidado con un polímero fluorescente, la concentración de polímero puede estar en el intervalo de aproximadamente 1'0 mg/ml y unos 20'0 mg/ml, preferentemente en el intervalo de unos 2'0 mg/ml y unos 5'0 mg/ml, en un tampón adecuado que tenga un pH en el intervalo de aproximadamente 4'0 y aproximadamente 7'0, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 4'0 y aproximadamente 5'0. Aunque son apropiados muchos tampones, el tampón preferido es un tampón de acetato sódico teniendo entre unos 50 mM y 200 mM de acetato sódico, y entre unos 75 mM y 150 mM de cloruro sódico. La cantidad de polímero añadida al anticuerpo oxidado puede estar en el intervalo de unos 1'0 y unos 20 equivalentes de polímero a anticuerpo, basados en el peso en el peso molecular del anticuerpo y el peso molecular estimado del polímero fluorescente. La reacción entre el anticuerpo oxidado y el polímero fluorescente puede tener lugar a una temperatura entre unos 2ºC y unos 30ºC, preferentemente entre unos 2ºC y unos 8ºC, en un recipiente hermético a la luz. Se puede dejar que la reacción se ejecute durante entre unas 2 y unas 48 horas, preferentemente entre unas 12 y unas 15 horas. A la terminación de la reacción, se puede purificar el conjugado de los componentes sin reaccionar de la mezcla de reacción, utilizando metodologías de purificación conocidas por aquellos especializados en la técnica.

En casos donde los polímeros fluorescentes funcionales amina primaria o secundaria estén unidos covalentemente a un miembro de unión específica, se prefiere una etapa adicional. Específicamente, como resultado de la reacción inicial entre el anticuerpo y el polímero se forma una base de Schiff, y la reducción de la base de Schiff se puede llevar a cabo mediante métodos conocidos en la técnica, tales como el empleo de un agente reductor apropiado tal como CNBH_{3}Na a una concentración en el intervalo de entre unos 0'25 mg/ml y 2'0 mg/ml. Después, el conjugado reducido puede ser purificado del exceso de reactantes utilizando técnicas de purificación conocidas en la técnica y mencionadas antes. Se comprende, por supuesto, que la manera mediante la que una base de Schiff es reducida no pretende estar limitada a los métodos descritos aquí, y que también se pueden emplear otros métodos.

Como se mencionó anteriormente, se puede utilizar ciclodextrina para intensificar la fluorescencia del conjugado proporcionado aquí. Una manera en la que se puede intensificar la fluorescencia del conjugado es añadiendo ciclodextrina a un conjugado ensamblado (esto es, un miembro de unión específica unido covalentemente a un polímero sumamente fluorescente). La ciclodextrina utilizada de esta manera no necesita que se haga ninguna modificación a la molécula de ciclodextrina o el conjugado. Aunque no se conoce el modo exacto de asociación, se cree que la ciclodextrina se asocia con los grupos generadores de señales presentes en el esqueleto del polímero, alojando los grupos generadores de señales unidos dentro del centro hidrófobo de la molécula de ciclodextrina. Cuando se utiliza ciclodextrina de esta manera, es utilizada preferentemente en concentraciones en el intervalo de entre unos 5 mM y 200 mM, preferentemente en el intervalo de entre unos 10 mM y 20 mM.

La intensificación de la señal generada por el conjugado aquí descrito también puede ser lograda uniendo directamente ciclodextrina al esqueleto del polímero del conjugado. La ciclodextrina puede ser unida covalentemente al esqueleto del polímero al que están unidos covalentemente grupos generadores de señales, o covalentemente unida al polímero esqueleto por sí misma. En la segunda situación, los grupos generadores de señales pueden llegar a estar asociados con el polímero fluorescente vía una relación invitado/huésped, con las moléculas de ciclodextrina polímera unidas covalentemente. Después de que haya ocurrido esta relación, se puede purificar el polímero de los grupos generadores de señales restantes sin alojar, mediante métodos conocidos en la técnica. Para permitir que ocurra esta relación invitado/huésped, la molécula de ciclodextrina debería estar unida de manera tal que permita que el borde secundario de la molécula de ciclodextrina permanezca no impedido y, por lo tanto, abierto para recibir un grupo generador de señales dentro de la cavidad hidrófoba.

Añadiendo selectivamente un único grupo reactivo al borde primario de la molécula de ciclodextrina, la molécula de ciclodextrina se puede unir al polímero esqueleto mediante su borde primario. De este modo, el borde secundario no estará impedido y la cavidad hidrófoba será accesible a moléculas invitadas.

El unir covalentemente el borde primario de una molécula de ciclodextrina a un polímero amino-funcional se puede llevar a cabo añadiendo un único grupo aldehído al borde primario de la molécula de ciclodextrina. Una vez que el único aldehído es añadido a la molécula de ciclodextrina, se puede hacer reaccionar directamente con un grupo amino presente en el polímero amino-funcional, por lo que la ciclodextrina se une al polímero, vía un único enlace covalente en el borde primario de la ciclodextrina. De este modo, la ciclodextrina se une al polímero de manera tal que deja el borde secundario no impedido y, por lo tanto, accesible a moléculas invitadas.

Como se mencionó anteriormente, la adición de un único grupo aldehído al borde primario de una molécula de ciclodextrina se puede llevar a cabo utilizando metodologías conocidas en la técnica. Sin embargo, estos métodos implican la producción de intermedios que son potencialmente peligrosos. Por ejemplo, se puede añadir un aldehído al borde primario de la ciclodextrina utilizando el reactivo peryodinano de Dess-Martin. D. B. Dess y col., J. Org. Chem., 48, 4.155-4.156 (1983). Esta reacción se puede realizar en un sistema heterogéneo conteniendo cantidades estequiométricas de reactivo de Dess-Martin y ciclodextrina disueltas en tetrahidrofurano (THF). Aunque se produce 6-ciclodextrina monoaldehído, el reactivo de Dess-Martin es potencialmente explosivo y no hace mucho tiempo que está fácilmente disponible de una fuente comercial. Otras rutas hacia el monoaldehído implican tres a cuatro etapas que producen intermedios azida tóxicos y potencialmente explosivos.

Alternativamente, se describe un método para producir 6-ciclodextrina monoaldehído que no supone la producción de intermedios peligrosos, y se lleva a cabo utilizando materias que están fácilmente disponibles comercialmente. Generalmente, el método es un proceso de dos etapas que se puede realizar como se muestra a continuación en el Esquema I.

Esquema I

5

La primera etapa del método es transformar una ciclodextrina de la fórmula 1 en su derivado monotosilato de la fórmula 2. El derivado tosilato de fórmula 2 es oxidado después para producir la ciclodextrina monoaldehído de la fórmula 3.

Existen varios métodos aceptables para transformar la ciclodextrina de la fórmula 1 en su derivado monotosilato de la fórmula 2. Ver L. D. Melton y col., Carbohyd. Res., 18, 29-37 (1971) o R. C. Petter y col., J. Am. Chem. Soc., 112, 3.360-3.868 (1990). Después de que haya sido formado el monotosilato de la fórmula 2, se puede purificar de la mezcla de reacción utilizando metodologías conocidas por aquellos especializados en la técnica, preferentemente, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). El monotosilato sólido puede ser luego recuperado secando el disolvente del monotosilato de ciclodextrina disuelto, utilizando métodos conocidos por aquellos especializados en la técnica. La ciclodextrina monoaldehído sólida está luego lista para su uso en la segunda etapa del proceso.

La segunda etapa oxidativa de la transformación se puede conseguir utilizando múltiples métodos. Generalmente, la etapa de oxidación es una reacción mediada por dimetilsulfóxido (DMSO), que puede ser catalizada mediante la adición de una base. Se descubrió que calentando el derivado monotosilato entre unos 75ºC y unos 85ºC en DMSO, producía la transformación lenta (aproximadamente 1-3 días) del derivado tosilato en el monoaldehído de la
fórmula 3.

La adición de una base a la reacción mediada por DMSO acelera la velocidad de transformación del monotosilato en el monoaldehído de la fórmula 3. Por ejemplo, una cantidad traza de NaOH aceleraba la reacción. Las bases preferidas para su uso en esta etapa del proceso abarcan bases amina impedidas tales como diisopropilamina, N-metilmorfolina, trietilamina, trimetilamina y otras. La diisopropiletilamina (también conocida como base de Hunig) es una base amina impedida particularmente preferida. Preferentemente, la transformación del monotosilato en el monoaldehído se lleva a cabo cuando el monotosilato está en solución a una concentración entre aproximadamente el 0'5% y aproximadamente el 20%, más preferentemente entre aproximadamente el 1% y un 15%, y muy preferentemente entre un 2% y un 10%. La cantidad de base amina impedida utilizada para la transformación puede estar entre aproximadamente 0'1 y aproximadamente 1'0 equivalentes molares de monotosilato en la solución, preferentemente entre aproximadamente 0'3 y aproximadamente 0'7 equivalentes molares de monotosilato en la solución. La ciclodextrina monoaldehído así formada puede ser purificada de cualquier materia sin reaccionar, utilizando métodos conocidos en la técnica, y hecha reaccionar con un polímero amino-funcional, o la mezcla de reacción final puede ser hecha reaccionar directamente con un polímero amino-funcional.

Utilizando métodos patrón de la química covalente conocidos por aquellos especializados en la técnica, la ciclodextrina monoaldehído proporcionada aquí es fácilmente unida a compuestos que tengan funcionalidades amino. Ejemplos de tales funcionalidades amino abarcan, pero no se pretende que estén limitadas a

---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- NH --- NH_{2}, ---NH_{2}

\hskip1cm

y

\hskip1cm

---

\uelm{N}{\uelm{\para}{H}}

--- R

en donde R se selecciona del grupo que se compone de alquilo C_{1}-C_{3}, isopropilo, -(CH_{2})_{2}CO_{2}^{-}, -(CH_{2})_{2}SO_{3}^{-}, -(CH_{2})_{2}
NH_{3}^{+}, -(CH_{2})_{2}NH_{2}^{+}(CH_{2})_{2}SO_{3}^{-}, -(CH_{2})_{2}O(CH_{2})_{2}O(CH_{2})_{2}OH y -(CHOH)_{4}CH_{2}OH. Ejemplos de compuestos que son amino-funcionales con estos grupos abarcan polímeros amino-funcionales tales como poliacrilamida-hidrazida o fases sólidas amino-funcionales tales como micropartículas aminadas.

En casos donde los compuestos funcionales amina primaria o secundaria sean hechos reaccionar covalentemente con ciclodextrina monoaldehído, se prefiere una etapa adicional. Específicamente, después de que tenga lugar la reacción inicial entre el compuesto y el monoaldehído se forma una base de Schiff, y la reducción de la base de Schiff se puede llevar a cabo de la manera descrita anteriormente.

La ciclodextrina monoaldehído puede ser unida a polímeros amino-funcionales o polímeros amino-funcionales que estén óptimamente cargados con grupos generadores de señales. Si la ciclodextrina monoaldehído se añade a un polímero amino-funcional, el polímero de policiclodextrina puede ser después hecho fluorescente con grupos generadores de señales. Una forma por la que el polímero de policiclodextrina puede ser hecho fluorescente es mediante la unión covalente de los grupos generadores de señales al polímero amino-funcional. Si el polímero es hecho fluorescente de esta manera, se comprenderá que alguno de los grupos amino-funcionales del polímero tiene que estar disponible para reacción.

Otra manera por la que la policiclodextrina puede ser hecha fluorescente es añadiendo grupos generadores de señales a una solución conteniendo el polímero de policiclodextrina, o a una solución conteniendo la policiclodextrina unida a un miembro de unión específica. Cuando se utiliza este método de derivación, la capacidad hospedadora de la ciclodextrina es explotada como se perfiló antes. Además, después de que haya sido explotada la capacidad hospedadora, se puede eliminar el exceso de grupos generadores de señales como se bosquejó antes.

Después de que se produzca un polímero de policiclodextrina/grupos generadores poliseñales, puede ser unido entonces a un miembro de unión específica como se perfiló antes.

Como se mencionó anteriormente, el conjugado completado tiene varios usos. El método preferido para utilizar el conjugado de la invención actual es en una aplicación de citometría de flujo, la cual emplea un conjugado fluorescente, o múltiples conjugados fluorescentes, para detectar células contenidas en una muestra de ensayo. Un ejemplo de un citómetro de flujo abarca el Clasificador Celular Activado por Fluorescencia (FACS II), fabricado por Becton, Dickinson & Co., Franklin Lakes, N.J. En general, un sistema de diagnóstico por imagen contiene una fuente de excitación y un dispositivo de detección. La fuente de excitación excita el grupo generador de señales asociado con el conjugado, y el dispositivo de detección detecta la señal emitida por el grupo generado de señales excitado.

En un análisis por sistemas de diagnóstico por imagen típico, se incuba una muestra de ensayo con un conjugado fluorescente, el cual se une específicamente a ciertas moléculas que pueden estar presentes en la muestra de ensayo. La incubación tiene lugar durante un tiempo y a una temperatura propicia para la unión del conjugado a poblaciones celulares específicas contenidas en la muestra. Las células unidas con el conjugado son aludidas comúnmente como estando teñidas, y el procedimiento de tinción se puede ejecutar múltiples veces, secuencialmente o al mismo tiempo, con múltiples conjugados que emitan señales de diversas longitudes de onda. Después de que se termina el procedimiento de tinción, se puede analizar la muestra utilizando un citómetro de flujo.

En una forma de realización preferida alternativa de la presente invención, se incuba una muestra de ensayo con una solución de reactivo primario que se une específicamente a ciertas moléculas, que puedan estar presentes en la muestra de ensayo, para formar complejos primarios. El reactivo no unido, si hubiera, puede ser quitado de la muestra lavando, y después se incuba un conjugado fluorescente, específico para el reactivo primario unido, con los complejos primarios. El conjugado no unido, si hubiera, puede ser después eliminado de los complejos primarios, y entonces se puede determinar como antes la fluorescencia asociada con las células. Se comprenderá que el procedimiento de tinción puede ser repetido múltiples veces con los reactivos primarios específicos para diferentes marcadores celulares y conjugados que fluorezcan a las mismas o diferentes longitudes de onda. También se comprenderá, por supuesto, que el procedimiento de tinción se puede llevar a cabo de una manera secuencial, o de una manera del tipo por lotes, en donde todos los componentes necesarios para la tinción celular son añadidos a la muestra antes de que se determine la fluorescencia asociada con las células.

En otra forma de realización alternativa, el conjugado y el método de la presente invención pueden ser adaptados para su uso en inmunoensayos en fase sólida tales como, por ejemplo, un ensayo tipo sándwich. Un ensayo tipo sándwich implica, típicamente, poner en contacto una muestra de ensayo, sospechosa de contener un analito, con una cuenta o micropartícula inerte sustancialmente sólida de plástico, látex o vidrio, u otro material soporte que haya sido recubierto con un miembro de unión específica que forme un par de unión con el analito. El material soporte recubierto con el miembro de unión es mencionado comúnmente como "reactivo de captura". Después de que el analito se haya unido al material soporte, se elimina la muestra de ensayo restante del soporte, y el material soporte unido al analito es tratado con un conjugado que consta, generalmente, de un segundo miembro de unión marcado con un grupo generador de señales. El conjugado se llega a unir al analito que está unido al soporte, y el soporte sólido, que tienen el primer miembro de unión, el analito y el conjugado unido con ese, es separado de cualquier conjugado sin unir, típicamente con una o más etapas de lavado. Después, la señal generada por el grupo generador de señales, mediante una excitación adecuada, puede ser observada visualmente o, más preferentemente, mediante un instrumento para indicar la presencia o cantidad de analito en la muestra de ensayo. Se comprenderá, por supuesto, que el orden y número de las etapas empleadas para realizar tales ensayos no pretenden limitar la invención aquí proporcionada.

En la técnica se conocen sistemas automatizados apropiados para realizar ensayos tipo sándwich tales como, por ejemplo, inmunoensayos enzimáticos por micropartículas (MEIAs). Un instrumento automatizado particularmente preferido y disponible comercialmente, que se puede emplear para realizar el método aquí proporcionado, es el sistema IMx® que está disponible por Abbott Laboratories, Abbott Park, IL. En la técnica se conocen protocolos para MEIAs tales como aquellos realizados mediante el instrumento IMx® de Abbott, y han sido descritos en Fiore, M. y col., Clin. Chem., 34/9: 1.726-1.732 (1988). Un protocolo ejemplar es como sigue. Se pipetean 100 \mul de una muestra de ensayo dentro del pocillo para muestras de una célula de reacción IMx®. Después se pipetean 30-50 \mul de la muestra y una suspensión de micropartículas recubiertas con anti-analito dentro del pocillo de incubación de la célula de reacción. Sigue un periodo de incubación apropiado, que permite la formación de complejos de micropartícula/analito. Los complejos son luego pipeteados sobre la matriz de captura de fibra de vidrio de la célula de reacción, y también se pipetea, sobre la matriz de fibra de vidrio de la célula de reacción, el conjugado que consta de un anticuerpo anti-analito marcado con un grupo generador de señales tal como, por ejemplo, un fluoróforo.

Los complejos de micropartícula/analito/conjugado son así formados y capturados por la matriz de fibra de vidrio. Mediante medios apropiados se puede excitar el grupo generador de señales, y la fluorescencia resultante, si hubiera, puede ser medida. La cantidad de tal fluorescencia está directamente relacionada con la cantidad de analito en la muestra de ensayo.

Los ejemplos siguientes son suministrados para ayudar a ilustrar la invención, y no pretenden limitar la invención. Todos los reactivos y equipo necesario para llevar a cabo los ejemplos están disponibles comercialmente, y conocidos por aquellos especializados en la técnica.

Ejemplo 1 Determinación de la concentración óptima de carga de fluoresceína en polímero de poliacrilamida-hidrazida

Se obtuvo polímero de poliacrilamida-hidrazida (180.000 de PM, 160 hidrazidas/polímero) de Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo. Se produjeron siete soluciones de polímero, todas las cuales contenían 10 mg de polímero (5'55x10^{-5} mmoles, 8'89x10^{-3} mmoles de hidrazidas) disueltos en 2'0 ml de PBS a pH 7'0 (fosfato sódico 0'1N, ClNa 0'1N). Se fabricó una solución madre de 6'0 mg/ml de N-hidroxisuccinimida éster activo de 5',6'-carboxifluoresceina (grupo generador de señales disponible por Molecular Probes, Eugene, Oregón) en DMF, y se añadió a las soluciones de polímero a las concentraciones siguientes; 5%, 10%, 15%, 25%, 35%, 75% y 90% de la cantidad molar total de hidrazidas reactivas presentes en el polímero de poliacrilamida-hidrazida. En la Tabla 1, abajo, se muestran las cantidades de fluoresceína y DMF utilizado para disolver la fluoresceína.

Cada alícuota de grupo generador de señales fue después añadida a una solución de polímero. Mientras que las soluciones de grupo generador de señales eran añadidas al polímero, las soluciones de polímero eran agitadas, y las soluciones resultantes fueron agitadas a temperatura ambiente en la oscuridad, durante aproximadamente 12 horas.

Después del periodo de mezcla, cada una de las siete soluciones fueron purificadas utilizando gel Sephadex® de 100-300 \mu de malla (disponible por Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en una columna de 1'8x30 cm. Los polímeros de polifluoresceína fueron elucionados de la columna con agua destilada, y se recogieron fracciones de 4'0 ml a medida que los polímeros elucionaban.

La pureza de cada fracción de cada solución se determinó mediante cromatografía en capa fina de fase normal (TLC), utilizando CHCl_{3}/CH_{3}OH 90/10 como eluyente. La TLC mostró que las primeras fracciones recogidas contenían compuestos de bajo peso molecular, seguidas por fracciones conteniendo compuestos de alto peso molecular. Las fracciones conteniendo compuestos de alto peso molecular fueron combinadas hasta (como se evidenció mediante una lámpara ultravioleta portátil de longitud de onda larga) que las fracciones empezaron a mostrar un valor R_{f} mayor de 0'05-0'1.

Las fracciones combinadas fueron concentradas hasta 4'87 mg/ml, utilizando un concentrador Amicon® Centiprep-30 (Amicon Inc., Danvers, Ma.) equipado con una membrana de corte de peso molecular 30.000. El concentrador fue centrifugado a 3.000 rpm durante 3 horas.

Después, las fracciones concentradas fueron de nuevo purificadas utilizando gel Sephadex® G-25 en una columna de 1'8x30 cm, y elucionadas como antes. Las fracciones resultantes fueron examinadas por su pureza, combinadas y concentradas como antes.

El procedimiento produjo siete soluciones de polímero de polifluoresceína purificado que había sido cargado con diferentes concentraciones de grupo generador de señales. Estas soluciones polímeras fueron ensayadas después por su capacidad para fluorescer, con un espectrofotómetro de fluorescencia. En la Tabla 1 se muestran los resultados de las pruebas de fluorescencia, la cual muestra la concentración de carga probada y el valor de fluorescencia asociado con las concentraciones de carga individuales. Como muestra la Tabla 1, hay un aumento en fluorescencia hasta que se logra el 90% de concentración de carga. A una carga probada del 90% empieza a suceder atenuación, y cae el valor de fluorescencia. Por lo tanto, es óptima una carga probada del 75%, y se utilizó para producir una cantidad preparativa de poliacrilamida-hidrazida-polifluoresceína.

TABLA 1

Carga probada (%)	Fluoresceína (mg)	DMF (\mul)	Fluorescencia relativa
5	0'20	34	40
10	0'41	68	157
15	0'61	102	300
25	1'02	169	417
35	1'42	237	529
75	3'05	470	650
90	3'67	610	640

Ejemplo 2 Síntesis de polímero de poliacrilamida-hidrazida-polifluoresceína óptimo

Se obtuvo polímero de poliacrilamida-hidrazida (180.000 de PM, 160 hidrazidas/polímero) de Sigma Chemical Company. El polímero (50'0 mg, 2'8x10^{-4} mmoles de polímero, 4'4x10^{-2} mmoles de hidrazida) fue disuelto en 10'0 ml de PBS pH 7'0, vía agitación inducida magnéticamente durante aproximadamente 7 horas. Luego, a la solución de polímero con agitación se añadió 15'2 mg (3'3x10^{-2} mmoles) de N-hidroxisuccinimida éster activo de 5',6'-carboxifluoresceina (disponible de Molecular Probes), que había sido disuelto en 500 \mul de DMF. La solución de reacción resultante fue agitada a temperatura ambiente en la oscuridad, durante aproximadamente 12 horas.

Después de mezclar, la solución de reacción fue puesta en una columna (2'5x50 cm) con Sephadex® G-25 de 100-300 \mu de tamaño de malla, y elucionada con agua destilada/desionizada. A medida que la mezcla de reacción estaba corriendo a través de la columna a 2'0 ml/minuto, se recogieron fracciones de aproximadamente 400 gotas (o aproximadamente 14 ml). Se evaluó la pureza de cada fracción mediante TLC de fase normal, utilizando CHCl_{3}/CH_{3}OH 90/10 como eluyente. La TLC mostró que las primeras fracciones recogidas contenían compuestos de alto peso molecular, y que las fracciones posteriores contenían compuestos de bajo peso molecular. Las fracciones conteniendo compuestos de alto peso molecular fueron combinadas hasta (como se evidenció mediante una lámpara ultravioleta portátil de longitud de onda larga) que las fracciones empezaron a mostrar un valor R_{f} mayor de 0'05-0'1. Las fracciones combinadas fueron concentradas hasta un volumen de 10'0 ml, utilizando un concentrador Centiprep-30 teniendo un corte de peso molecular de 30.000. El concentrador Centiprep-30, que contenía las fracciones combinadas, fue centrifugado a una velocidad de 3.000 rpm durante aproximadamente 3 horas, a una temperatura de entre 15-30ºC.

Después, las fracciones concentradas fueron de nuevo purificadas utilizando una columna de Sephadex® G-25 (2'5x50 cm) como antes. Las fracciones resultantes fueron examinadas por su pureza, y combinadas basadas en los resultados de la TLP y la prueba con la lámpara ultravioleta portátil de longitud de onda larga, como se especificó antes. Se combinaron las fracciones aceptables, y la solución madre de polímero fue después reconcentrada utilizando un concentrador Amicon® Centiprep-30 como se describió antes.

Se hizo un ensayo para determinar la concentración de la solución madre de polímero, extrayendo cinco muestras de 2 ml y eliminando el disolvente de cada una a vacío, utilizando un aparato de evaporación rotativo. De cada muestra se eliminó el agua residual utilizando un aparato de alto vacío equipado con una trampa de hielo seco/isopropanol. Las muestras de polvo rojo resultantes fueron pesadas después para determinar la concentración de polímero en mg/ml.

Para obtener una estimación de cuantas fluoresceínas fueron realmente cargadas en el polímero, se produjeron curvas patrón para el polímero de carboxifluoresceína y un estándar de carboxifluoresceína (cada uno de los cuales estaba en PBS pH 8'0). Las curvas fueron producidas determinando la absorción ( a \lambda = 490 nm) del estándar y el polímero a varias concentraciones diferentes. Debido a que las pendientes (\varepsilon) de tales curvas son representativas de la absortividad molar de una especie molecular simple (esto es, cumarina libre o un polímero fluorescente simple), se utilizó la relación de pendientes para determinar el número de cumarinas unidas al polímero. Bajo idénticas condiciones, se determinó una \varepsilon de 1.459.000 mol^{-1} para el polímero, y una \varepsilon de 36.500 mol^{-1} para la carboxifluoresceína libre. De este modo, se determinó que la sustitución de carboxifluoresceína en el polímero era de 40/polímero.

También se determinó la equivalencia de fluorescencia para el polímero, comparando la emisión de fluorescencia del polímero a la emisión de fluorescencia de la fluoresceína libre. Se determinó que la equivalencia de fluorescencia del polímero era 14 carboxifluoresceínas/polímero, basada en una \lambda de excitación de 490 nm y una \lambda de emisión de 520 nm.

Ejemplo 3 Síntesis de polímero de poliacrilamida-hidrazida-poliCascade Blue

Se determinó el porcentaje de carga óptimo para cargar Cascade Blue sobre poliacrilamida-hidrazida, como se describe en el Ejemplo 1. Se encontró que el porcentaje de carga probada óptimo era el 72% de las hidrazidas disponibles. Para producir un polímero fluorescente óptimo utilizando Cascade Blue, se hizo reaccionar Cascade Blue acil azida (disponible por Molecular Probes) con poliacrilamida-hidrazida mediante el procedimiento siguiente.

Se obtuvo polímero de poliacrilamida-hidrazida (180.000 de PM, 160 hidrazidas/polímero) de Sigma Chemical Company. Se disolvió el polímero (20'0 mg, 1'1x10^{-4} mmoles de polímero, 1'8x10^{-2} mmoles de hidrazidas) en 4'0 ml de PBS pH 7'0, vía agitación inducida magnéticamente durante aproximadamente 7 horas. Después, se dejó que 12'0 mg (1'3x10^{-2} mmoles) de Cascade Blue acil azida (disponible por Molecular Probes, Eugene, Oregón) se disolvieran en 400 \mul de DMSO, antes de ser añadido a la solución de polímero con agitación. La solución resultante fue agitada a temperatura ambiente en la oscuridad, durante 12 horas.

Después de mezclar, la solución de reacción fue puesta en una columna (2'5x50 cm) con Sephadex® G-25 de 100-300 \mu de tamaño de malla, y elucionada con agua destilada/desionizada. A medida que la mezcla de reacción estaba corriendo a través de la columna a 2'0 ml/minuto, se recogieron fracciones de aproximadamente 400 gotas (o aproximadamente 14 ml). Se evaluó la pureza de cada fracción mediante TLC de fase normal, utilizando CHCl_{3}/CH_{3}OH 90/10 como eluyente. Como en el Ejemplo 2, las fracciones conteniendo compuestos de alto peso molecular fueron combinadas hasta (como se evidenció mediante una lámpara ultravioleta portátil de longitud de onda larga) que las fracciones empezaron a mostrar un valor R_{f} mayor de 0'05-0'1. Las fracciones combinadas fueron concentradas hasta un volumen de 10'0 ml, utilizando un concentrador Amicon® Centiprep-30 teniendo un corte de peso molecular de 30.000. El concentrador, que contenía las fracciones combinadas, fue centrifugado a una velocidad de 3.000 rpm durante aproximadamente 3 horas, a una temperatura de entre 15-30ºC.

Después, las fracciones concentradas fueron de nuevo purificadas utilizando una columna de Sephadex® G-25 (2'5x50 cm) como antes. Las fracciones resultantes fueron examinadas por su pureza, y combinadas basadas en los resultados de la TLP y la prueba con la lámpara ultravioleta portátil de longitud de onda larga, como se especificó antes. Se combinaron las fracciones aceptables, y el solución madre de polímero fue después reconcentrada utilizando un concentrador Amicon® Centiprep-30 como se describió antes.

Se hizo un ensayo para la concentración de la solución madre de polímero, extrayendo cinco muestras de 2 ml y eliminando el disolvente de cada una a vacío, utilizando un aparato de evaporación rotativo. De cada muestra se eliminó el agua residual utilizando un aparato de alto vacío equipado con una trampa de hielo seco/isopropanol. Las muestras de polvo azul resultantes fueron pesadas después para determinar la concentración de polímero en mg/ml.

De la misma manera que se estableció en el Ejemplo 2, se determinó el número estimado de moléculas de Cascade Blue cargadas en el polímero. Sin embargo, debido a que el Cascade Blue absorbe a \lambda = 365 nm, las curvas patrón fueron fabricadas utilizando una \lambda = 365 nm. Bajo idénticas condiciones, se determinó una \varepsilon de 460.000 mol^{-1} para el polímero fluorescente, y una \varepsilon de 19.200 mol^{-1} para el patrón de Cascade Blue. De este modo, se determinó que el número de colorantes cargados en el polímero era de 24/polímero.

Ejemplo 4 Síntesis de poliacrilamida-hidrazida-poliaminometilcumarina

Se utilizó el procedimiento siguiente para producir un polímero fluorescente con una fluorescencia equivalente de aproximadamente 22 aminometilcumarinas por polímero.

El polímero de poliacrilamida-hidrazida (180.000 de PM, 160 hidrazidas/polímero) utilizado en este Ejemplo fue obtenido de Sigma Chemical Co., y el succinimidiléster del ácido 7-amino-4-metilcumarina-3-acético se obtuvo de Molecular Probes.

Se disolvió el polímero (100 mg, 5'6x10^{-4} mmoles, 8'8x10^{-2} mmoles de hidrazidas) en 10'0 ml de PBS pH 7'0, mediante agitación inducida magnéticamente durante aproximadamente 7 horas. La N-hidroxisuccinimida de aminometilcumarina (14'68 mg ó 7'1x10^{-2} mmoles disueltos en 600 \mul de DMF) se añadió a la solución con agitación de polímero disuelto, y la solución resultante fue agitada a temperatura ambiente en la oscuridad, durante 12 horas.

Se realizó una purificación inicial cargando la anterior solución en una columna (2'5x50 cm) con Sephadex® G-25 de 100-300 \mu de tamaño de malla, y elucionando el polímero con agua destilada/desionizada. Se recogieron fracciones de aproximadamente 14 ml y se evaluaron por su pureza mediante TLC de fase normal, utilizando CHCl_{3}/CH_{3}OH 90/10 como eluyente. Como en los Ejemplos primeros, las fracciones cromogénicas tempranas de alto peso molecular fueron combinadas hasta que las fracciones empezaron a mostrar un valor R_{f} mayor de 0'05-0'1 en el examen con una lámpara UV portátil de longitud de onda larga. Las fracciones combinadas fueron concentradas hasta un volumen de 20'0 ml, añadiéndolas a un concentrador Centiprep-30 (Amicon®) que tenía un corte de peso molecular de 30.000, y centrifugándolas a 3.000 rpm durante 3 horas.

Las fracciones concentradas fueron de nuevo purificadas utilizando una columna de Sephadex® G-25 (2'5x50 cm), y las fracciones resultantes fueron examinadas por su pureza utilizando TLC como antes. Se combinaron las fracciones aceptables, y las fracciones combinadas fueron reconcentradas como antes.

Después, se determinó la concentración de las fracciones concentradas, y se aplicó un ensayo para determinar el número de aminometilcumarinas unidas al polímero. Para determinar la concentración de las fracciones concentradas, se tomaron muestras (4x2 ml) de las fracciones concentradas y se eliminó el disolvente de ellas a vacío, vía un aparato evaporador rotativo. Se eliminó el agua residual mediante un aparato de alto vacío equipado con una trampa de hielo seco/isopropanol. Después, se pesaron las muestras desecadas y se determinó la concentración (mg/ml) de polímero.

Utilizando el método expuesto en el Ejemplo 2, se determinó el número estimado de moléculas de aminometilcumarina cargadas en el polímero. Sin embargo, debido a que la aminometilcumarina absorbe a \lambda = 325 nm, se fabricaron las curvas patrón utilizando una \lambda = 325 nm. Bajo condiciones idénticas, se determinó una \varepsilon de 91'882 mol^{-1} para el polímero fluorescente, y se determinó una \varepsilon de 803'5 mol^{-1} para el estándar de aminometilcumarina. De este modo, se determinó que el número de colorantes cargados en el polímero era de 114/polímero.

También se determinó la equivalencia de fluorescencia para el polímero, comparando la emisión de fluorescencia del polímero con la emisión de fluorescencia de la cumarina libre. Se determinó que la equivalencia de fluorescencia del polímero era de 22'4 aminometilcumarinas/polímero, basada en una \lambda de excitación de 325 nm y una \lambda de emisión de 450 nm.

Ejemplo 5 Síntesis de poliacrilamida-hidrazida-polihidroximetilcumarina

Se utilizó el siguiente procedimiento para producir un polímero fluorescente con una fluorescencia equivalente de aproximadamente 40 hidroxicumarinas por polímero.

El polímero de poliacrilamida-hidrazida (180.000 de PM, 160 hidrazidas/polímero) utilizado en este Ejemplo fue obtenido de Sigma Chemical Co., y el succinimidiléster del ácido 7-hidroxi-4-metilcumarina-3-acético se obtuvo de Molecular Probes.

Se disolvió el polímero (50 mg, 2'8x10^{-4} mmoles, 4'4x10^{-2} mmoles de hidrazidas) en 10'0 ml de PBS pH 7'0, mediante agitación inducida magnéticamente durante aproximadamente 7 horas. La N-hidroxisuccinimida de hidroxicumarina (6'9 mg ó 2'1x10^{-2} mmoles disueltos en 500 \mul de DMF) se añadió a la solución con agitación de polímero disuelto, y la solución resultante fue agitada a temperatura ambiente en la oscuridad, durante 12 horas.

Se realizó una purificación inicial cargando la anterior solución en una columna (2'5x50 cm) con Sephadex® G-25 de 100-300 \mu de tamaño de malla, y elucionando el polímero con agua destilada/desionizada. Se recogieron fracciones de aproximadamente 14 ml y se evaluaron por su pureza mediante TLC de fase normal, utilizando CHCl_{3}/CH_{3}OH 90/10 como eluyente. Como en los Ejemplos primeros, las fracciones cromogénicas tempranas de alto peso molecular fueron combinadas hasta que las fracciones empezaron a mostrar un valor R_{f} mayor de 0'05-0'1 en el examen con una lámpara UV portátil de longitud de onda larga. Las fracciones combinadas fueron concentradas hasta un volumen de 20'0 ml, añadiéndolas a un concentrador Centiprep-30 (Amicon®) que tenía un corte de peso molecular de 30.000, y centrifugándolas a 3.000 rpm durante 3 horas.

Las fracciones concentradas fueron de nuevo purificadas utilizando una columna de Sephadex® G-25 (2'5x50 cm), y las fracciones resultantes fueron examinadas por su pureza utilizando TLC como antes. Se combinaron las fracciones aceptables, y las fracciones combinadas fueron reconcentradas como antes.

Después, se determinó la concentración de las fracciones concentradas, y se aplicó un ensayo para determinar el número de hidroximetilcumarinas unidas al polímero. Para determinar la concentración de la fracciones concentradas, se tomaron muestras (4x2 ml) de las fracciones concentradas y se eliminó el disolvente de ellas a vacío, vía un aparato evaporador rotativo. Se eliminó el agua residual mediante un aparato de alto vacío equipado con una trampa de hielo seco/isopropanol. Después se pesaron las muestras desecadas y se determinó la concentración (mg/ml) del polímero.

Utilizando el método expuesto en el Ejemplo 4, se determinó el número estimado de moléculas de hidroximetilcumarinas cargadas en el polímero. Bajo condiciones idénticas, se determinó una \varepsilon de 209'820 mol^{-1} para el polímero fluorescente, y se determinó una \varepsilon de 2.158 mol^{-1} para el estándar de hidroximetilcumarina. De este modo, se determinó que el número de colorantes cargados en el polímero era de 100/polímero.

También se determinó la equivalencia de fluorescencia para el polímero, comparando la emisión de fluorescencia del polímero con la emisión de fluorescencia de la cumarina libre. Se determinó que la equivalencia de fluorescencia del polímero era de 40 hidroximetilcumarinas/polímero, basada en una \lambda de excitación de 325 nm y una \lambda de emisión de 450 nm.

Ejemplo 6 Unión de poliacrilamida-hidrazida-polifluoresceína a IgG

Inicialmente, la región carbohidrato de un anticuerpo monoclonal de ratón fue oxidada con peryodato sódico, utilizando el procedimiento siguiente.

En un vial de color ámbar se puso anticuerpo anti-dansilo (2'05 mg en 1'0 ml de tampón TEA, trietanolamina 50 mM, ClNa 160 mM, pH 8'0). Después se añadió peryodato sódico (100 \mul de una solución 200 mM en tampón TEA) al vial, y la mezcla resultante fue estadísticamente incubada a 2'8ºC durante 1 hora. Luego, la mezcla de reacción fue pasada por una columna con Sephadex® G-25 (1x45 cm, 100-300 \mu de tamaño de malla), a una velocidad de flujo de de 1-2 ml por minuto, y elucionada con un tampón de acetato pH 5'5 (acetato sódico 0'1M, ClNa 0'1M). A medida que la columna era elucionada, se supervisó el eluyente de la columna a A_{280}, y se recogieron fracciones de 1 ml. El perfil de elución mostró dos picos, y se combinaron las fracciones del primer pico teniendo una A_{280} mayor de 0'3. Después, se concentraron las fracciones combinadas hasta 2'35 mg/ml (0'8 ml), utilizando un microconcentrador Amicon® Centricon-30 equipado con una membrana de corte de peso molecular 30.000, para dar 1'88 mg del anticuerpo oxidado purificado. El anticuerpo purificado fue mantenido a 2-8ºC, y utilizado inmediatamente después de la oxidación.

Se calculó la cantidad de polímero utilizada para conjugación al anticuerpo, a partir de los pesos moleculares del anticuerpo (180.000) y polímero (estimado en 218.000, basado en un ensayo UV para sustitución de fluoresceína en el polímero). En este Ejemplo, se reconstituyó 4'5 mg del polímero fluorescente, del Ejemplo 2, en 1'0 ml de tampón de acetato pH 4'5 (acetato sódico 0'1M, ClNa 0'1M), para formar una solución de 4'5 mg/ml de poliacrilamida-hidrazida-polifluoresceína. Luego, se añadió esta solución a 0'8 ml de la solución de 2'35 mg/ml de anticuerpo oxidado anti-dansilo y formar una mezcla de conjugación que fue suavemente sacudida a una temperatura entre unos 2-8ºC.

Después de que se terminase la conjugación del anticuerpo al polímero fluorescente, se aplicó la mezcla de conjugación en una columna de 1x45 cm con gel de Sephacryl® S-300 (Pharmacia LKB, Sollentuna, Suecia). El anticuerpo conjugado fue elucionado de la columna con PBS pH 8'0, a una velocidad de flujo de 1-2 ml por minuto. Se recogió el eluyente de la columna en fracciones de 3 ml. También se supervisó el eluyente a A_{280}, y el perfil de elución mostró que de la columna elucionaron dos picos. Se recogieron y combinaron las fracciones del primer pico que tenían una A_{280} mayor de 0'3.

Ejemplo 7 Síntesis de 6-\beta-ciclodextrina monoaldehído a partir de ciclodextrina

Se preparó el derivado monotosilato de \beta-ciclodextrina conforme al método de Petter, R. C. y col., J. Am. Chem. Soc., 112, 3.360-3.868, 1990. El derivado monotosilato fue purificado mediante RP-HPLC preparativa, utilizando una separación por gradiente a 40'0 ml/min., en una columna de compresión radial Rainin Dynamax^{TM}. El gradiente utilizado para esta separación fue como sigue: un gradiente lineal a partir de H_{2}O/CH_{3}OH 90/10 por 30 minutos, seguido por rampas para H_{2}O/CH_{3}OH 0/100 en 35 minutos de tiempo transcurrido total. El monotosilato elucionó a los 20'7 minutos, utilizando este gradiente con detección UV a una \lambda de 230 nm. Se eliminó el disolvente a presión reducida, y el agua que quedaba fue extraída del sólido poniéndolo bajo alto vació durante la noche.

Después, el monotosilato resultante (1'0 g, 0'77 mmoles) fue disuelto en 20'0 ml de DMSO. Luego se añadió base de Hunig (diisopropiletilamina, 0'5 equivalentes del monotosilato, 0'060 g, 0'38 mmoles) a la solución de monotosilato/DMSO, y se calentó la mezcla resultante durante aproximadamente 72 horas, a una temperatura de entre 70-80ºC. Durante el periodo de calentamiento, se puso la mezcla de reacción bajo nitrógeno. Después del periodo de calentamiento, se enfrió la mezcla de reacción a temperatura ambiente, y con 200 ml de acetona precipitó un producto bruto. Después, la mezcla de reacción fue enfriada a 0ºC, y se aisló el sólido resultante mediante filtración a vacío.

El sólido aislado fue resuspendido en una cantidad de acetona a temperatura ambiente, adecuada para recristalización al enfriar a 0ºC. Se recuperó nuevamente el precipitado resultante, utilizando filtración a vacío. Se repitió dos veces el procedimiento de resuspensión y recuperación.

El producto de 6-\beta-ciclodextrina monoaldehído final tenía las características siguientes: PDMS obs. 1.155'5, calculada 1.155'9 (M+Na^{+}); ESIMS obs. 1.133'9, calculada 1.134'0 (M+H^{+}); RMN-^{1}H (300 MHz) d_{6}-DMSO \delta 9'7 (s, 1H), 5'75 (m ancho, 14H), 4'85 (m, 7H), 4'48 (m, 6H), 3'6 (m, 14H), 3'4 (m ancho, 7H); RMN-^{13}C (125'6 MHz) mezcla de reacción bruta en d_{6}-DMSO, sin contar los picos de tosilato. d_{6}-DMSO \delta 198'2, 1.201'9, 87'5, 82'5, 81'7, 81'5, 73'0, 72'7, 72'4, 72'0, 68'9, 59'9, 59'6; TLC (mezcla 1/1 de n-butanol/etanol/agua 10:8:3 y butanona/metanol/ácido acético 12:3:4): R_{f} 0'5; IR (cm^{-1}).

Ejemplo 8 Síntesis de polímero de poliacrilamida-hidrazida-policiclodextrina

Se sintetizó 6-\beta-ciclodextrina monoaldehído como se describió antes en el Ejemplo 5. Se obtuvo polímero de poliacrilamida-hidrazida (180.000 de PM, 160 hidrazidas/polímero) de Sigma Chemical Company. El polímero (5'0 mg, 2'28x10^{-5} mmoles de polímero, 3'65x10^{-3} mmoles de hidrazidas) fue disuelto en 1'0 ml de PBS pH 7'0. Se añadió luego otra solución, constando de 5'0 mg de 6-\beta-ciclodextrina monoaldehído (4'44x10^{-3} mmoles) disueltos en 150 ml de DMSO, a la solución de polímero con agitación. Después, la solución resultante fue calentada a 70ºC durante 2 horas. Después de calentar, se dejó que la solución enfriara a temperatura ambiente antes de que pasara por una columna de filtración con gel de Sephadex® G-25. Se utilizó PBS (pH 7'0) para elucionar el polímero de policiclodextrina-poliacrilamida-hidrazida de la columna. A medida que el polímero iba elucionando de la columna, se recogieron fracciones de 1'0 ml y analizaron para el contenido de carbohidrato, utilizando el método de fenol-ácido sulfúrico revelado en Analytical Chemistry, Vol. 28, 350-386 (marzo de 1956). Los datos obtenidos se utilizaron para construir un perfil de filtración en gel para las fracciones resultantes de \beta-ciclodextrina polímera. Este perfil de filtración en gel fue después comparado a un perfil de filtración en gel para \beta-ciclodextrina monómera. La comparación reveló que la mayor parte de la \beta-ciclodextrina polímera había elucionado en las fracciones 7-11, mientras que la mayoría de \beta-ciclodextrina monómera elucionó en las fracciones 9-16. Las fracciones 7-10 fueron combinadas y concentradas utilizando un microconcentrador Amicon® equipado con una membrana de corte de peso molecular 30.000. El concentrado fue diluido con PBS pH 7'0 y vuelto a concentrar 3 veces para eliminar la \beta-ciclodextrina monómera monoaldehído. Se determinó la ausencia de \beta-ciclodextrina monómera monoaldehído en el filtrado mediante el método fenol-ácido sulfúrico de análisis de carbohidratos.

Ejemplo 9 Síntesis de polímero de polilisina-policiclodextrina

Se sintetizó 6-\beta-ciclodextrina monoaldehído como se describió antes en el Ejemplo 5. El polímero de polilisina (138.000 de PM, 1.000 lisinas/polímero, 5'0 mg, 3'6x10^{-5} mmoles de polímero, 3'6x10^{-2} mmoles de amina) se disuelve en 2'0 ml de PBS pH 7'0. Otra solución, constando de 40'8 mg (3'6x10^{-2} mmoles) de 6-\beta-ciclodextrina monoaldehído disuelta en 500 ml de DMSO, es luego añadida a la solución de polímero con agitación. Después, la solución resultante es agitada durante 3 horas a temperatura ambiente. Después del periodo de mezcla de 3 horas, a la mezcla de reacción se añade una solución de CNBH_{3}Na (3'6 mmoles) disuelto en 1'0 ml de PBS pH 7'0. Después de 2 horas de mezclar a temperatura ambiente, la mezcla se pasa por una columna de filtración en gel Sephadex® G-25. Se utiliza PBS (pH 7'0) para elucionar la columna, y se recogen fracciones de 1'0 ml. Las fracciones son analizadas por el contenido de carbohidrato, utilizando el método fenol-ácido sulfúrico. Se utilizan los datos obtenidos para construir un perfil de filtración en gel para la \beta-ciclodextrina polímera resultante. Este perfil de filtración en gel es después comparado a un perfil de filtración en gel para \beta-ciclodextrina monómera. Aquellas fracciones conteniendo \beta-ciclodextrina polímera son combinadas y concentradas utilizando un microconcentrador Amicon® equipado con una membrana de corte de peso molecular 30.000. El concentrado es diluido (con fosfato sódico 0'1N pH 7'0, ClNa 0'1N) y vuelto a concentrar 3 veces o hasta que no se observa \beta-ciclodextrina monómera en el filtrado, como se indica por el método fenol-ácido sulfúrico de análisis de carbohidrato.

Ejemplo 10 Uniendo monoaldehídos de ciclodextrina a fases sólidas aminadas

Utilizando modificaciones estequiométricas en el Ejemplo 7, se pueden unir monoaldehídos de ciclodextrina a fases sólidas aminadas. Además, cuando se derivan fases sólidas, se modifica adicionalmente el Ejemplo 7 separando la ciclodextrina monómera monoaldehído de la fase sólida derivatizada, mediante decantación, lavado o centrifugación, en comparación con utilizar la separación por exclusión granulométrica utilizada en el Ejemplo 7.

Ejemplo 11 Unión de poliacrilamida-hidrazida-policiclodextrina a anticuerpo

El polímero de poliacrilamida-hidrazida-policiclodextrina es unido a un anticuerpo utilizando el mismo protocolo establecido en el Ejemplo 4.

Ejemplo 12 Introducción de grupos generadores de señales en las cavidades hidrófobas de polímeros de policiclodextrina que están unidos a un miembro de unión específica

Se produce poliacrilamida-hidrazida-policiclodextrina como se muestra en el Ejemplo 6. Se añade una solución 10^{-10}M a 10^{-6}M de fluoresceína, en PBS pH 7'0, a una solución 10^{-10}M a 10^{-6}M del polímero obtenido del Ejemplo 6. Esta solución es después mezclada durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente. Después del periodo de mezcla, se pasa la solución por una columna de filtración en gel Sephadex® G-25 utilizando PBS pH 7'0 para elucionar el conjugado fluorescente de la columna, a una velocidad de flujo entre 1-2 ml/min. A medida que el conjugado eluciona de la columna, se recogen fracciones de entre 1-4 ml. Además, se toma la A_{280} del eluyente a medida que el conjugado eluye de la columna, y se combinan las fracciones del primer pico elucionado de la columna que tengan un valor A_{280} mayor de 0'3.

Ejemplo 13 Comparación entre conjugado fluorescente comercial y conjugado de poliacrilamida-hidrazida-polifluoresceína

En este ejemplo, se utilizó citometría de flujo para hacer la comparación entre las señales generadas por conjugados comercialmente disponibles actualmente y el conjugado aquí proporcionado. Se hizo la comparación entre conjugados que son específicos para los marcadores superficiales linfocitarios CD2, CD3 y LEU4. Los conjugados disponibles comercialmente fueron conjugados FITC que eran directamente específicos para los marcadores celulares específicos, o conjugados AVIDINA-FITC que eran específicos para reactivos primarios de BIOTINA, que eran específicos para uno de los marcadores celulares. Todos los reactivos primarios de BIOTINA y los CD2-FITC están disponibles comercialmente por Coulter Inc. (Hialeah, Fla.), mientras que los conjugados AVIDINA-FITC están disponibles por Becton-Dickinson Inc. Los conjugados de poliacrilamida-hidrazida-polifluoresceína (PAH-F) fueron preparados conforme a las metodologías expuestas en el Ejemplo 2 y Ejemplo 6. Otros reactivos utilizados en este Ejemplo incluían PBS pH 7'0, teniendo 0'1% de azida sódica y 1'0% de albúmina de suero bovino (BSA), añadido a la formulación anterior, y solución para lisis de cloruro amónico. La solución para lisis se preparó como
sigue:

Ingrediente	Cantidad (g)
ClNH_{4}	8'26
CO_{3}HK	1'0
EDTANa	0'037

Los ingredientes listados arriba fueron disueltos en 1'0 litros de agua destilada, y la solución resultante se ajustó a un pH de 7'3 con tampón Hepes, el cual está disponible comercialmente por Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Antes de su uso, la solución para lisis fue calentada a 41ºC.

Protocolo

Los tubos 1-5, mostrados abajo en la Tabla 2, sirvieron como tubos de control para este ejemplo y, excepto el tubo 1 que contenía exclusivamente PBS modificado, contenían el reactivo primario o secundario listado en tampón PBS modificado. Los reactivos primarios, o en el caso donde el conjugado era directamente específico para un marcador celular (tubo 6), los reactivos secundarios, fueron añadidos a los tubos 6-15 en las cantidades mostradas abajo en la Tabla 2. Después se pusieron 200 \mul de sangre entera reciente en cada uno de los tubos marcados 6-15, antes de que los contenidos de cada tubo fueran mezclados suavemente con remolino e incubados a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 minutos. Después de la incubación, todos los tubos, excepto el tubo 6, fueron lavados una vez con 3 ml del PBS modificado. Luego, los tubos lavados fueron centrifugados durante 3 minutos a 500xg, después se aspiró el sobrenadante de estos tubos, y el gránulo de células fue resuspendido en el PBS
modificado.

Los reactivos secundarios (mostrados en la Tabla 2) fueron añadidos a sus tubos respectivos, los cuales contenían los gránulos resuspendidos, antes de ser mezclados con remolino, e incubados como antes. Después de la incubación, los tubos fueron tratados con la solución para lisis de cloruro amónico, según el siguiente protocolo.

1.

a cada tubo se añadió 3'0 ml de solución para lisis

2.

cada tubo fue mezclado a fondo, con una pipeta desechable

3.

cada tubo fue incubado a temperatura ambiente durante 7 minutos

4.

se centrifugaron los tubos durante 3 minutos a 2.000 rpm

5.

se aspiraron casi 100 \mul de los sobrenadantes de cada tubo

6.

los tubos se mezclaron con remolino para resuspender los gránulos

7.

después se añadió 3'0 ml de PBS, teniendo 0'1% de azida sódica y 1'0% de BSA, a los gránulos resuspendidos

8.

se repitieron las etapas 4-7

9.

después se añadió 0'5 ml de PBS, teniendo 0'1% de azida sódica y 1'0% de BSA, a los gránulos resuspendidos

El tubo número 6 también se trató con la solución para lisis de cloruro amónico, según el protocolo establecido antes.

Se analizó el contenido de cada tubo utilizando un clasificador celular activado por fluorescencia Facscan II, disponible por Becton-Dickinson Inc. Se optimizaron los ajustes del instrumento para la visualización de linfocitos, monocitos y granulocitos frente a parámetros de dispersión frontal frente a lateral. Se aplicaron cuentas "Quick Cal" (disponibles por Flow Cytometry Standards Corporation, Durham, N.C.), como se instruye por el programa de software que se adjunta, para generar una curva de calibración. Se determinó el porcentaje de sucesos fluorescentes en el histograma para cada tubo, utilizando las tres aberturas de dispersión de luz. Se calcularon los valores MESF utilizando la ecuación generada por el software "Quick Cal".

Resultados

En la Tabla 3 se muestran los resultados obtenidos de los tubos 6-15. Como tema inicial, puesto que el peso molecular de un conjugado IgG-PAH-F es aproximadamente 300.000 y el peso molecular de un conjugado IgG-FITC es aproximadamente 150.000, partiendo de la base del peso molecular, 1 \mug de conjugado PAH-F es igual a aproximadamente 2 \mug del conjugado FITC. Como se evidenció por los datos en la Tabla 3, el conjugado sumamente fluorescente de la invención actual es capaz de emitir una señal aproximadamente treinta y cinco veces más fuerte que los conjugados disponibles comercialmente. Además, la especificidad de la unión del conjugado PAH-F es comparable a la del conjugado FITC. Las señales asociadas con los granulocitos y monocitos para los conjugados FITC y los conjugados PAH-F son relativamente equivalentes y, de este modo, sirven como evidencia de que el conjugado PAH-F es por lo menos tan específico como el conjugado FITC.

TABLA 2

Tubo nº	Reactivo primario	Reactivo secundario
1	PBS modificado	- - -
2	5 \mug de polibiotina	- - -
3	- - -	2 \mug de Avidina-FITC
4	- - -	4 \mug de Avidina-FITC
5	- - -	4 \mug de anti-biotina-PAH-F
6	- - -	2'5 \mug de CD2-FITC
7	5 \mug de CD2-BIOTINA	2 \mug de Avidina-FITC
8	5 \mug de CD2-BIOTINA	4 \mug de Avidina-FITC
9	5 \mug de CD2-BIOTINA	4 \mug de ANTI-BIO-PAH-F
10	5 \mug de CD2-BIOTINA (T11)	6 \mug de anti-BIO-PAH-F mono.
11	5 \mug de CD2-BIOTINA (T11)	4 \mug de anti-BIO-PAH-F mono.
12	5 \mug de CD2-BIOTINA (T11)	2 \mug de anti-BIO-PAH-F mono.
13	5 \mug de LEU4-BIOTINA	4 \mug de Avidina-FITC
14	5 \mug de LEU4-BIOTINA	6 \mug de anti-BIO-PAH-F mono.
15	5 \mug de LEU4-BIOTINA	6 \mug de anti-BIO-PAH-F poli.

Ejemplo 14 Intensificación de la fluorescencia de fluoresceína polímera mediante \beta-ciclodextrina

Se prepararon dos lotes de poliacrilamida-hidrazida-polifluoresceína mediante el método expuesto en el Ejemplo 2. El primer lote, polímero de poliacrilamida-hidrazida (180.000 de PM, 160 hidrazidas/polímero) cargado con N-hidroxisuccinimida éster activo de 5',6'-carboxifluoresceina en un porcentaje de carga probada del 10%. El segundo lote, polímero de poliacrilamida-hidrazida (180.000 de PM, 160 hidrazidas/polímero) cargado con N-hidroxisuccinimida éster activo de 5',6'-carboxifluoresceina en un porcentaje de carga probada del 75%.

Se determinó el número real de fluoresceínas cargadas en los dos lotes de polímero comparando la fluorescencia de los polímeros con la fluorescencia de la carboxifluoresceína como antes. El número de fluoresceínas observadas fue determinado después mediante espectroscopia de UV como en el Ejemplo 2. A partir de estos datos, se determinó la cantidad de atenuación para cada polímero. Por ejemplo, se determinó que, para el lote 1, el número de fluoresceínas por polímero era 11, y el número de fluoresceínas observadas era 5'5. De este modo, las fluoresceínas en el polímero lote 1 estaban atenuadas aproximadamente el 50%.

Después, se añadió \beta-ciclodextrina a las soluciones de polímero para que la \beta-ciclodextrina estuviera presente en una concentración 0'01M. A continuación de la adición de \beta-ciclodextrina, se volvió a determinar el número de fluoresceínas observadas en los polímeros. Mediante la adición de \beta-ciclodextrina a los dos lotes de polímero fluorescente, se incrementó el número de fluoresceínas observadas. Los resultados de este Ejemplo están mostrados en la Tabla 4, en donde A es la absortividad molar, B es el número de fluoresceínas/polímero, C es el número de fluoresceínas observadas, D es el número de fluoresceínas observadas después de la adición de \beta-ciclodextrina, y E es la cantidad de intensificación proporcionada por la \beta-ciclodextrina 0'01M.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3

Muestra	A	B	C	D	E
Carboxifluoresceína Hidracida	36.000	-	-	-	-
Lote 1	400.000	11	5'5	8'8	1'5
Lote 2	1.490.000	40	c	28'8	1'95

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 15 Comparación de polifluoresceína y copolímero de polifluoresceína-\beta-ciclodextrina aldehído

Se sintetizó poliacrilamida-hidrazida-polifluoresceína como en el Ejemplo 2. Una porción de 3'0 ml de la solución madre del polímero de poliacrilamida-hidrazida-polifluoresceína optimizado fue diluida hasta 0'7 mg/ml con tampón de fosfato 0'1N, a pH 5'5, con ClNa 0'1N. Se extrajeron 3'0 ml del polímero diluido para que sirvieran al final como control, y a la solución de polímero diluida restante se añadió 3'0 mg de \beta-ciclodextrina aldehído, preparada como en el Ejemplo 7. Se dejó que la \beta-ciclodextrina aldehído sólida se disolviera en la solución de polímero antes de incubar durante la noche, a temperatura ambiente, la solución recién formada. Después de la incubación, se purificaron las soluciones de control y de polímero/\beta-ciclodextrina en columnas de exclusión granulométrica de Sephadex® G-25 independientes, de 1x45 cm. La velocidad de elución fue de 45 gotas por tubo, utilizando tampón de fosfato 0'1N a pH 7'0, ClNa 0'1N como tampón de elución. Las concentraciones iniciales de polímero se estimaron en 0'26 mg/ml. Basado en las lecturas exactas de volumen y diluciones 1 a 10 de los tubos de control y de polímero/\beta-ciclodextrina, se obtuvieron concentraciones de polímero de 0'026 mg/ml, ó 1'44x10^{-7}M.

Después, se realizó una comparación entre las intensidades de fluorescencia del control (poliacrilamida-hidrazida-polifluoresceína no derivatizado con \beta-ciclodextrina) y del experimento (poliacrilamida-hidrazida-polifluoresceína derivatizado con ciclodextrina aldehído). Específicamente, las dos soluciones fueron excitadas a 488 nm y se leyó la fluorescencia a 525 nm. Abajo, en la Tabla 4, se muestran los resultados de fluorescencia para las dos so-
luciones.

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TABLA 4

Polímero	Fluorescencia
Poliacrilamida-hidrazida-polifluoresceína	108
Poliacrilamida-hidrazida-polifluoresceína-poli-\beta-ciclodextrina	138

Para el experimento sobre el control se observó una relación de fluorescencia de 138:108, en intensidad de fluorescencia relativa. Por lo tanto, la fluorescencia del polímero experimental fue 1'3 veces la del polímero de control. Esto corresponde a un incremento del 30% en la señal para el polímero experimental, lo que se traduce en unas 20 fluoresceínas por equivalente de polímero, en comparación con unas 15 fluoresceínas por equivalente de polímero en comparación a unas 15 fluoresceínas por equivalente de polímero (como se mostró anteriormente en la Tabla 3, lote 2, columna C). En este caso, la intensificación siendo debida a la \beta-ciclodextrina unida covalentemente antes que a la \beta-ciclodextrina no unida covalentemente.

Claims (5)

1. Un conjugado fluorescente constando de: un miembro de unión específica unido covalentemente a, por lo menos, un polímero fluorescente; en donde dicho polímero fluorescente consta de un polímero esqueleto, ciclodextrinas seleccionadas del grupo que se compone de \alpha-ciclodextrina, \beta-ciclodextrina, \gamma-ciclodextrina y combinaciones de las mismas, y grupos fluorescentes, en donde dichas ciclodextrinas están unidas covalentemente a dicho polímero esqueleto, y dichos grupos fluorescentes están unidos covalentemente a dicho polímero esqueleto o alojados dentro de dichas ciclodextrinas, o en donde dichos grupos fluorescentes están unidos covalentemente a dicho polímero esqueleto y dichas ciclodextrinas están acomplejadas con dichos grupos fluorescentes, y en donde dichos grupos fluorescentes están espaciados a lo largo de dicho polímero a fin de maximizar la señal generada a partir de dichos grupos fluorescentes, y minimizar el efecto de atenuación.

2. El conjugado de la reivindicación 1, en donde dicho polímero esqueleto comprende el residuo de un polímero amino-funcional.

3. Un método para determinar la presencia y/o cantidad de un analito en una muestra de ensayo, dicho método comprendiendo las etapas de:

a. formar complejos conjugado/analito poniendo en contacto dicha muestra de ensayo con un conjugado fluorescente, según la reivindicación 1, para formar una mezcla;

b. separar dichos complejos conjugado/analito de dicha mezcla;

c. detectar una señal fluorescente medible en donde la presencia y/o cantidad de dicha señal fluorescente está relacionada con la cantidad de dicho analito en dicha muestra de ensayo.

4. El método de la reivindicación 3, en donde dicho polímero esqueleto comprende el residuo de un polímero amino-funcional.

5. El método de la reivindicación 4, en donde dicho polímero amino-funcional lleva residuos de funcionalidades amino seleccionadas del grupo que se compone de:

a)

---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- NH --- NH_{2},

b)

-NH_{2},

c)

---

\uelm{N}{\uelm{\para}{H}}

--- R

en donde R se selecciona del grupo que se compone de:

alquilo C_{1}-C_{3}, isopropilo, (CH_{2})_{2}CO_{2}^{-}, (CH_{2})_{2}SO_{3}^{-}, (CH_{2})_{2}NH_{3}^{+}, (CH_{2})_{2}NH_{2}^{+}(CH_{2})_{2}SO_{3}^{-}, (CH_{2})_{2}O(CH_{2})_{2}O
(CH_{2})_{2}OH y (CHOH)_{4}CH_{2}OH, y

d) combinaciones de los mismos.