CN107782893B - 一种检测叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的方法 - Google Patents

一种检测叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的方法，先制备SiO2‑FO包被抗原和免疫原，然后制备抗SiO2‑FO多克隆抗体；再将制备的BODIPY‑PFNPs与抗SiO2‑FO抗体的交联；以SiO2‑FO‑OVA为包被抗原，以BODIPY‑PFNPs标记的抗SiO2‑FO抗体作为一抗，建立直接竞争荧光免疫分析法定量检测SiO2‑FO；以SiO2‑FO标准品浓度的对数为横坐标，荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线，从而定量检测出SiO2‑FO的浓度。与现有技术相比，本发明具有操作简单、灵敏度高、特异性强、可实现高通量检测等特点。

Description

一种检测叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的方法
技术领域
本发明涉及纳米材料的定量检测，具体涉及一种检测叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的方法，利用包裹BODIPY的新型聚合物纳米粒子(BODIPY-PFNPs)标记荧光免疫分析法测定叶酸功能化二氧化硅(SiO2-FO)靶向纳米药物载体的方法。
背景技术
肿瘤是一类由遗传不稳定性和分子多样性突变积累引起的作用机制复杂的疾病，它是当今社会蔓延最快的疾病之一，每年都有约1000多万的新增病例。人们在降低肿瘤发病率和致死率方面做出了巨大努力，但在技术上依然缺乏有效的治疗方法。其主要原因是传统的化学治疗中存在包括化疗药物的难溶性和对患者正常组织系统的毒性，以及肿瘤自身的多药耐药性的制约等问题制约了癌症的治疗效果。
近年来纳米技术结合分子靶向应用于肿瘤化疗已成为治疗肿瘤研究领域的一大热点。二氧化硅纳米材料作为无机纳米材料的重要成员之一，由于制备简便、性质稳定、生物相容性好和表面易修饰等优良性能，使其在生物医学领域发挥了重要作用。因此将二氧化硅纳米材料结合靶向配体叶酸(SiO2-FO)作为一种新型靶向药物载体，其在实现靶向性给药、缓释药物、降低药物的毒副作用等方面表现出良好的应用前景。且目前第一种主动靶向纳米药物(聚合物纳米颗粒)已经进入临床试验阶段，这为癌症的治疗注入了新的活力，是纳米载体应用于肿瘤化疗研究的一个突破性进展，同时也为SiO2-FO纳米药物载体应用于临床分析提供了可行性的理论依据。
纳米药物载体技术结合分子靶向技术，在肿瘤化疗上表现出巨大的发展潜力，然而由于其超微结构及其特有的性质可能对机体产生一定的影响，在充分安全、有效进入临床应用前，纳米药物载体的剂量检测及其毒理研究等一系列问题仍待进一步研究。从现有研究结果来看，对于纳米材料应用于医学领域通常局限于考察其在体内的分布、降解、药物释放效率以及毒性研究等方面，而将其运用于医药领域的实证性研究目前还不是很多，目前常用的检测方法如电感耦合等离子体质谱法等，然而这些方法不仅操作繁琐，仪器昂贵，而且稳定性和灵敏度都不高，检测技术仍不够成熟。因此建立有效的纳米材料毒性评价机制已经成为目前医药市场领域十分迫切的需求。
自1954年Yallow与Berson提出放射性标记免疫分析法以来，免疫分析技术已成为生物化学、临床医学等领域中一个非常重要的方法。其中荧光免疫分析法具有灵敏度高、选择性高、方法简便快捷、试样用量少等优点，不仅可用于测定蛋白质、酶等大分子物质，而且还广泛用于测定小分子量的药物，特别适用于那些色谱法难以分析的药物，已经被广泛应用于生物、化学、医药等领域中。荧光染料常作为荧光检测分析方法的探针，其性能的优劣直接决定了检测方法的可行性及灵敏度，而传统的荧光染料如荧光素、罗丹明、菁类、稀土配合物类荧光染料等有其固有的缺陷如荧光信号弱、稳定性差、灵敏度低等，从而限制了它们的广泛应用。因此，探索和发展高灵敏度新的标记物一直是研究工作者非常关注的课题。
近年来，广大的研究者关注于通过不同的方法来合成具有生物兼容性的荧光染料，进而实现其在生物学上的应用，常用的方法有将荧光材料进行包裹、分散等制成荧光纳米粒子，从而可以减轻生物自荧光的干扰，以观察深层的组织并减少对细胞的损害。这些荧光纳米粒子标记可以有效地提高单个识别分子上标记的荧光量，它们具有比单个荧光染料分子高得多的发光强度和光化学稳定性以及低荧光泄露，将会把分析的灵敏度提高到一个新的水平。因此，荧光纳米粒子作为标记物应用于免疫分析法中测定小分子物质，将大大提高分析的灵敏度及应用范围。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的方法，结合抗原、抗体反应的特异性与荧光的稳定性对SiO2-FO纳米粒子进行定量检测分析。该方法具有操作简单、灵敏度高、特异性强、可实现高通量检测等特点。
本发明提供的一种检测叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的方法，包括以下步骤：
a、SiO2-FO包被抗原和免疫原的制备；
b、抗SiO2-FO多克隆抗体的制备；
c、BODIPY-PFNPs的制备；
d、BODIPY-PFNPs与抗SiO2-FO抗体的交联；
e、以SiO2-FO-OVA为包被抗原，以BODIPY-PFNPs标记的抗SiO2-FO抗体作为一抗，建立直接竞争荧光免疫分析法定量检测SiO2-FO；以SiO2-FO标准品浓度的对数为横坐标，荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线，从而定量检测出SiO2-FO的浓度。
所述步骤a中的SiO2-FO包被抗原和免疫原的制备方法为：
a-1、SiO2-FO半抗原的制备
a-1-1、氨基功能化二氧化硅(SiO2-NH2)纳米粒子的制备
将300～500μL正硅酸乙酯TEOS和10～15mL无水乙醇混合均匀后加入400～600μL氨水，25～30℃下搅拌24h后加入300～500μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES，25～30℃下持续搅拌24h，将反应液离心分离，取沉淀用无水乙醇洗涤，并在25～30℃下干燥24h即可得到SiO2-NH2纳米粒子；
a-1-2、叶酸功能化二氧化硅(SiO2-FO)纳米粒子的制备
将50～70mg叶酸FA溶于2～4mL2-MES缓冲液，再加入35～45mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDAC和10～25mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，25～30℃下搅拌1～2h；称取80～150mg SiO2-NH2溶于4～6mL MES缓冲液后加入到上述混合液中，25～30℃下避光搅拌24h；将反应液离心分离，取沉淀用蒸馏水和无水乙醇洗涤，并在25～30℃下干燥24h即可得到SiO2-FO纳米粒子。
a-2、称取5～15mg SiO2-FO溶于0.5～1mL PBS溶液中，磁力搅拌1～2h即得到水溶性的SiO2-FO溶液；
a-3、称取5～15mg OVA溶于1～2mL PBS溶液中,并在搅拌下加入步骤a-2得到的SiO2-FO溶液，混合均匀后再滴加50～100μL 25％戊二醛溶液，25～30℃下避光搅拌3～5h后，将反应液转移到透析袋中，用PBS透析24h后收集即可得到SiO2-FO包被抗原，其浓度为2～4mg/mL；
a-4、称取5～15mg BSA溶于1～2mL PBS溶液中,并在搅拌下加入步骤a-2得到的SiO2-FO溶液，混合均匀后再滴加50～100μL 25％戊二醛溶液，25～30℃下避光搅拌3～5h后，将反应液转移到透析袋中，用PBS透析24h后收集即可得到SiO2-FO免疫原，其浓度为2～4mg/mL。
所述步骤a-3和a-4中，透析所用透析袋的截留分子量为8000～14000Da。
所述步骤a-2中水溶性的SiO2-FO溶液浓度为10～15mg/mL。
所述步骤b具体包括以下步骤：
b-1、首次免疫：将SiO2-FO免疫原与弗氏完全佐剂等体积比混合后，采用背部皮下多点注射的方式注射到大白兔体内，注射8～10个点，注射量为1～2mL/只；首次免疫三周后进行加强免疫；
b-2、加强免疫：将SiO2-FO免疫原与弗氏不完全佐剂等体积比混合后，采取同样的方式注射到大白兔体内，注射8～10个点，注射量为1～2mL/只；此后每隔一周再进行一次加强免疫，中间周进行耳静脉采血测血清效价，直到效价达到1:64000，再进行最后一次加强免疫，并在免疫一周后从动物颈动脉采血，静置析出抗血清并进行纯化，得到抗SiO2-FO多克隆抗体，冷冻干燥后-20℃保存。
所述步骤c采用沉淀聚合法合成BODIPY-PFNPs，具体包括以下步骤：
c-1、将氟化硼二吡咯BODIPY荧光染料与丙烯酰胺AM溶于乙腈中，充分混匀；
c-2、加入交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯EDGMA，超声混匀；
c-3、再加入引发剂偶氮二异丁腈AIBN，磁力搅拌混匀；
c-4、通氮气，然后密封，置于油浴锅中，50～65℃条件下恒温聚合h；
c-5、聚合完成后，离心分离，先用无水甲醇清洗2次，再用乙腈洗至上清液无荧光，冷冻干燥即得包裹BODIPY的新型聚合物纳米粒子(BODIPY-PFNPs)，4℃保存。
所述步骤c具体包括以下步骤：
c-1、将0.05～0.1mmol氟化硼二吡咯BODIPY荧光染料与0.5～1.0mmol丙烯酰胺AM溶于30～50mL乙腈中，充分混匀；
c-2、加入1.0～1.5mmol交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯EDGMA，超声混匀10～20min；
c-3、再加入3～10mg引发剂偶氮二异丁腈AIBN，磁力搅拌混匀；
c-4、通氮气8～15min，密封，置于油浴锅中，50～65℃条件下恒温聚合24h；
c-5、聚合完成后，离心分离，先用无水甲醇清洗2次，再用乙腈洗至上清液无荧光，冷冻干燥即得包裹BODIPY的新型聚合物纳米粒子(BODIPY-PFNPs)，4℃保存。
其中BODIPY、AM、EDGMA三者之间的物质的量之比1:16:24。
所述氟化硼二吡咯BODIPY的具体制备方法：
取4～6mL N,N-二甲基丁酰胺DMF和8～12mL二氯甲烷DCM放入100mL圆底烧瓶中，冰水浴下逐滴滴加5～10mL三氯氧磷POCl3，滴加完全后撤去冰水浴，25～30℃下反应20～40min，然后向其中缓慢滴加2～5mL吡咯，反应1～2h后加入饱和碳酸钠溶液直到混合液体无气泡冒出为止，反应液经二氯甲烷多次萃取并旋干得到产物2；
取0.4～0.5g产物2和0.5～0.7mL 2,4-二甲基-3-乙基吡咯，溶解到15～30mL二氯甲烷中，再滴加0.1～0.2mL POCl3于上述溶液中，25～28℃下反应1～3h，反应液经二氯甲烷萃取并旋干得到产物3；
将上述得到的产物3用45～60mL甲苯溶解后加入2～3mL三乙胺，磁力搅拌2～5min后，再加入2～3mL三氟化硼乙醚，90～110℃下反应2～3h，反应液经二氯甲烷萃取，浓缩，柱分离后得到产物4即氟化硼二吡咯BODIPY。
所述步骤d采用碳二亚胺法将BODIPY-PFNPs与抗SiO2-FO抗体进行交联，包括以下步骤：
d-1、将步骤c制备的BODIPY-PFNPs洗涤后，分散在PBS缓冲液中；
d-2、将EDAC和NHS溶于水中，混合后加入到步骤d-1制备的BODIPY-PFNPs溶液中，搅拌反应；
d-3、将反应液离心分离，洗涤沉淀，然后重新分散在PBS溶液中；
d-4、用PBS将抗SiO2-FO多克隆抗体稀释，取该抗体溶液加入到步骤d-3制备的BODIPY-PFNPs溶液中，搅拌反应；
d-5、反应结束后，离心分离，洗涤沉淀，然后分散于PBS缓冲液中即为BODIPY-PFNPs标记的抗SiO2-FO抗体，4℃保存。
所述步骤d具体包括以下步骤：
d-1、将2～10mg BODIPY-PFNPs用PBS洗涤3次，并分散在1～2mL PBS缓冲液中；
d-2、将5～15mg EDAC和0.5～1.5mg NHS溶于1～2mL水中，混合后加入到上所述所得的溶液中，25～30℃搅拌反应10～20min；
d-3、将反应液离心分离，沉淀用PBS洗涤2次，并分散在1～2mL PBS溶液中；
d-4、用PBS将抗SiO2-FO抗体稀释成2mg/mL，取1～2mL该抗体溶液加入到步骤d-3制备的BODIPY-PFNPs溶液中，25～30℃搅拌反应3～5h；
d-5、离心分离，沉淀用PBS洗涤2次，然后分散于1～2mL PBS缓冲液中即为BODIPY-PFNPs标记的抗SiO2-FO抗体，4℃保存。
所述步骤e具体包括以下步骤：
e-1、包被：用包被缓冲液将SiO2-FO包被抗原稀释200倍，包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃冰箱过夜；
e-2、封闭：甩干，PBST溶液洗涤3次，每次3～5min，洗去多余的SiO2-FO包被抗原,加入1.5wt％酪蛋白进行封闭，每孔200μL，37℃烘箱温育1～2h；
e-3、加样竞争：甩干，PBST溶液洗涤3次，每次3～5min，洗去多余的封闭液,然后将50μL不同浓度的SiO2-FO标准品溶液和50μL一定浓度的BODIPY-PFNPs标记的抗SiO2-FO抗体溶液分梯度加入各孔中，使之发生竞争反应，37℃烘箱温育3～5h；
e-4、检测：甩干，PBST溶液洗涤3次，每次3～5min，除去游离态的SiO2-FO标准品或抗体结合物,用多功能酶标仪测定各孔在激发波长为485nm，发射波长为528nm处的荧光强度值；以SiO2-FO标准品浓度的对数为横坐标，荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线，从而定量检测出SiO2-FO的浓度。
步骤e-4所述标准曲线的线性方程为A＝38918-3593logC，其中A为荧光强度值，C为SiO2-FO浓度。其相关系数R＝-0.998，线性范围为10-3-102ng/mL，检出限为0.43pg/mL。
本发明提供了一种包裹BODIPY的新型聚合物纳米粒子(BODIPY-PFNPs)标记荧光免疫分析法测定叶酸功能化二氧化硅(SiO2-FO)靶向纳米药物载体的方法。结合抗原、抗体反应的特异性与荧光的稳定性实现了该免疫方法对SiO2-FO的定量检测。
与现有技术相比，本发明具有以下几个特点：
(1)利用简单的沉淀聚合法制备的BODIPY-PFNPs，该方法不需在反应体系中加入任何稳定剂，操作过程简单，条件温和，聚合物产率高，使得该BODIPY-PFNPs在后期的标记过程中避免了繁琐的后处理过程；
(2)裸露的荧光染料与溶剂相互作用会发生光漂白现象，本发明将其进行包裹后，一方面可以阻断其与溶剂直接接触，保持稳定的荧光特性，且聚合物的亲水性解决了该类疏水型荧光染料的生物标记问题；另一方面，荧光染料与聚合物之间以氢键和物理包埋为主要作用力，且聚合物结构紧密，三维孔径较小，使得其泄露率明显降低。本发明中，由于荧光染料被包裹在亲水型聚合物纳米粒子中，因而该BODIPY-PFNPs具有光稳定性好、泄露率低、易于标记、分散性好和粒度均一等独特优势，为生物医学领域如荧光标记、细胞成像等提供了一种性能较好的的荧光标记物；
(3)一个BODIPY-PFNPs中包埋了成百上千个荧光染料，具有显著的信号放大作用，因此，将其标记抗体用于免疫分析中可以大大提高检测的灵敏度；
(4)利用抗原、抗体反应的特异性与荧光的稳定性建立了一种基于直接竞争荧光免疫分析法定量检测SiO2-FO的新方法，为今后纳米材料提供了一种快速、准确定量检测的方法；
(5)该方法操作简单、灵敏度高、特异性强、可实现高通量检测。
附图说明
图1为以SiO2-FO标准品浓度的对数为横坐标，荧光强度值为纵坐标建立的标准曲线图；
图2为氟化硼二吡咯BODIPY的制备流程图。
具体实施方式
弗氏完全佐剂、牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)购买自生工生物工程(上海)股份有限公司。
其他试剂均可从市场上的销售厂家购买得到。
本发明涉及到的各溶液的制备方法为：
磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/L pH＝7.4)：称取NaCl 8.0g、KCl 0.1g、NaH2PO4·2H20 0.29g、Na2HPO4·12H2O 2.96g溶解于蒸馏水中并定容至1000mL。
PBST溶液(0.01mol/L pH＝7.4)：在1000mL PBS中加入500μL Tween-20，混合均匀。
包被缓冲液CB(0.05mol/L pH＝9.6)：称取Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.94g溶解于蒸馏水中并定容至1000mL。
1.5wt％酪蛋白溶液：其为封闭液，称取0.15g酪蛋白溶解于10mL PBS中，混合均匀。
乙磺酸缓冲液(MES，0.1M，pH＝5.5)：称0.1921g MES溶解于10mL蒸馏水中，用NaOH溶液调节其pH至5.5。
实施例1
一种检测叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的方法，包括以下步骤：
a、SiO2-FO包被抗原和免疫原的制备
a-1、SiO2-FO半抗原的制备
a-1-1、氨基功能化二氧化硅(SiO2-NH2)纳米粒子的制备
将380μL正硅酸乙酯TEOS和12mL无水乙醇混合均匀后加入570μL 25％氨水，28℃下搅拌24h后加入400μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES，28℃下持续搅拌24h，将反应液离心分离(10000rpm/min，20min)，取沉淀用无水乙醇洗涤，并在28℃下干燥24h即可得到SiO2-NH2纳米粒子；
a-1-2、叶酸功能化二氧化硅(SiO2-FO)纳米粒子的制备
将57.5mg叶酸FA溶于2mL MES缓冲液，再加入40.3mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDAC和17.25mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，28℃下搅拌1h；称取100mgSiO2-NH2溶于5mL MES缓冲液后加入到上述混合液中，28℃下避光搅拌24h；将反应液离心分离(10000rpm/min，10min)，取沉淀用蒸馏水和无水乙醇洗涤，并在28℃下干燥24h即可得到SiO2-FO纳米粒子。
a-2、称取上述制备的SiO2-FO 10mg溶于1mL PBS溶液中，磁力搅拌1h即得到浓度为10mg/mL的SiO2-FO溶液；
a-3、称取10mg OVA溶于2mL PBS中，并在搅拌下加入步骤a-2得到的SiO2-FO溶液，混合均匀后再滴加90μL 25％戊二醛溶液，28℃下避光搅拌4h；将反应液转移到截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，用PBS透析24h后收集即可得到SiO2-FO包被抗原，其浓度为3.0mg/mL，4℃储存待用；
a-4、称取10mg BSA溶于2mL PBS中，并在搅拌下加入步骤a-2得到的SiO2-FO溶液，混合均匀后再滴加90μL 25％戊二醛溶液，28℃下避光搅拌4h；将反应液转移到截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，用PBS透析24h后收集即可得到SiO2-FO免疫原，其浓度为3.0mg/mL，4℃储存待用。
b、抗SiO2-FO多克隆抗体的制备
选用4只体重为2～2.5kg的雄性新西兰大白兔为免疫对象，实验之前首先将新西兰大白兔饲养2周左右，维持其健康状态，其中3只作为免疫对象，第4只作为空白对照，空白对照组不进行任何免疫。
b-1、首次免疫：将SiO2-FO免疫原与弗氏完全佐剂等体积比混合后，采用背部皮下多点注射的方式注射到3只实验兔体内，注射8～10个点，注射量为1mL/只；免疫接种的方式有注射免疫、口服免疫、气雾免疫等，其中注射免疫又有皮下注射、皮内注射、肌肉注射静脉注射等方式，背部皮下注射操作方便，药物扩散较慢，有利于刺激机体产生免疫应答，继而产生抗体；
b-2、加强免疫：首次免疫三周后进行加强免疫。将SiO2-FO免疫原与弗氏不完全佐剂等体积比混合后，采取同样的方式注射到3只实验兔体内，注射8～10个点，注射量为1mL/只；此后每两周进行再次加强免疫，中间周进行耳静脉采血测血清效价，直到效价达到1:64000，再进行最后一次加强免疫，并在免疫一周后从动物颈动脉采血，静置析出抗血清并进行纯化，得到抗SiO2-FO抗体，冷冻干燥后-20℃保存。
弗氏不完全佐剂的制备方法为：称取50g的无水羊毛脂，量取100mL的液体石蜡混合，超声仪多次超声，每次不超过20min，防止超声过程中温度过高，不能及时散热，超声使之混合均匀，直到将该混合液体滴到水中并且半分钟内不扩散为止，得到的油状液体即为弗氏不完全佐剂，4℃冰箱储存待用。
抗体效价鉴定的具体方法为：用包被缓冲液CB将包被抗原稀释400倍，包被在96孔酶标板上，4℃冰箱过夜；甩干，用PBST溶液洗3次，每次3min，每孔加200μL 1wt％酪蛋白封闭液，37℃封闭1h；甩干，PBST洗3次，每次3min，每孔加入100μL用PBS稀释成不同浓度的抗血清，其稀释比为1/1000～1/128000，37℃温育2h；甩干，PBST洗3次，每次3min，每孔加入100μL用PBS稀释的稀释比为1/5000的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃温育2h；甩干，PBST洗3次，每次3min，每孔加入100μL邻苯二胺底物液进行显色反应，37℃温育0.5h；每孔再加入50μL2mol/L H2SO4终止反应；最后用多功能酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度值A。比较实验组与空白对照组在同一抗血清稀释倍数下的吸光值A，当A实验组≥2倍A空白组时对应的最大稀释倍数即抗血清的效价。
c、BODIPY-PFNPs的制备
c-1、将0.05mmol氟化硼二吡咯BODIPY荧光染料与0.8mmol丙烯酰胺AM溶于45mL乙腈中，充分混匀；
c-2、加入1.2mmol交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯EDGMA，超声混匀15min；
c-3、再加入5mg引发剂偶氮二异丁腈AIBN，磁力搅拌混匀；
c-4、通氮气10min，然后，密封，置于油浴锅中，58℃条件下恒温聚合24h；
c-5、聚合完成后，离心分离(10000rpm/min，10min)，先用无水甲醇清洗2次，再用乙腈洗至上清液无荧光，冷冻干燥即得包裹BODIPY的新型聚合物纳米粒子(BODIPY-PFNPs)，4℃保存。
所述氟化硼二吡咯BODIPY的具体制备方法：
取5mL N,N-二甲基丁酰胺DMF和10mL二氯甲烷DCM放入100mL圆底烧瓶中，冰水浴下逐滴滴加5mL三氯氧磷POCl3，滴加完全后撤去冰水浴，25℃下反应30min，然后向其中缓慢滴加3mL吡咯，反应1h后加入饱和碳酸钠溶液直到混合液体无气泡冒出为止，反应液经二氯甲烷多次萃取并旋干得到产物2；
取0.475g(5mmol)产物2和0.664mL(5mmol)2,4-二甲基-3-乙基吡咯，溶解到20mL二氯甲烷中，再滴加0.1mL POCl3于上述溶液中，25℃下反应2h，反应液经二氯甲烷萃取并旋干得到产物3；
将上述得到的产物3用50mL甲苯溶解后加入2mL三乙胺，磁力搅拌2min后，再加入2mL三氟化硼乙醚，100℃下反应2h，反应液经二氯甲烷萃取，浓缩，柱分离后得到产物4即氟化硼二吡咯BODIPY。制备方法流程图见图2。
d、BODIPY-PFNPs与抗SiO2-FO抗体的交联
d-1、将8mg BODIPY-PFNPs用PBS洗涤3次，并分散在1mL PBS缓冲液中；
d-2、将10mg EDAC和1mg NHS溶于1mL水中，混合后加入到步骤d-1所得的BODIPY-PFNPs溶液中，28℃搅拌反应15min；
d-3、将反应液离心分离(10000rpm/min，10min)，沉淀用PBS洗涤2次，并分散在1mLPBS溶液中；
d-4、用PBS将抗SiO2-FO抗体稀释成2mg/mL，取1mL该抗体溶液加入到步骤d-3制备的BODIPY-PFNPs溶液中，28℃搅拌反应4h；
d-5、离心分离(10000rpm/min，10min)，沉淀用PBS洗涤2次，然后分散于2mL PBS缓冲液中即为BODIPY-PFNPs标记的抗SiO2-FO抗体，4℃保存。
e、建立直接竞争荧光免疫分析实验，在最优条件下建立标准曲线从而达到定量检测SiO2-FO的目的。
e-1、包被：用CB包被缓冲液将SiO2-FO包被抗原稀释200倍，包被96孔酶标板。每孔100μL，4℃冰箱过夜；
e-2、封闭：甩干，PBST溶液洗涤3次，每次3min，洗去多余的SiO2-FO包被抗原。加入1.5wt％酪蛋白进行封闭(减少非特异性吸附)，每孔200μL，37℃烘箱温育1.5h；
e-3、加样竞争：甩干，PBST溶液洗涤3次，每次3min，洗去多余的封闭液。将50μL浓度分别为10-3ng/mL、5×10-3ng/mL、10-2ng/mL、5×10-2ng/mL、10-1ng/mL、5×10-1ng/mL、100ng/mL、5×100ng/mL、101ng/mL、5×101ng/mL、102ng/mL的SiO2-FO标准品依次加入到酶标板中，每个浓度梯度重复六次，然后向各孔中加入50μL稀释度为1/100的BODIPY-PFNPs标记的抗SiO2-FO抗体溶液，使之发生竞争反应，37℃烘箱温育4h；
不同浓度的SiO2-FO标准品的制备方法为：用0.01mol/L pH＝7.4的PBS缓冲溶液将SiO2-FO稀释到指定的浓度。
BODIPY-PFNPs标记的抗SiO2-FO抗体溶液的制备方法为：用0.01mol/L pH＝7.4的PBS缓冲溶液将BODIPY-PFNPs标记的抗SiO2-FO抗体溶液稀释100倍。
e-4、检测：甩干，PBST溶液洗涤3次，每次3min，除去游离态的SiO2-FO标准品或抗体结合物。用多功能酶标仪测定各孔在激发波长为485nm，发射波长为528nm处的荧光强度值，同一浓度梯度的取平均值计算荧光强度值。
e-5、以SiO2-FO标准品浓度的对数为横坐标，荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线。制得的标准曲线如图1所示，标准曲线的线性方程为A＝38918-3593logC，其中A为荧光强度值，C为SiO2-FO浓度。其相关系数R＝-0.998，线性范围为10-3-102ng/mL，检出限为0.43pg/mL。
f、重复以上各步骤，只是将步骤e-3中的不同浓度的SiO2-FO标准品替换为未知浓度的SiO2-FO待测液，然后用多功能酶标仪测定各孔在激发波长为485nm，发射波长为528nm处的荧光强度值，求取平均荧光强度值。根据上述标准曲线的线性方程A＝38918-3593logC，即可计算出SiO2-FO待测液的浓度。
以上方法为多次实验验证后的最优的实验方法，此方法所得到的标准曲线的线性关系最好，线性范围最宽。
上述参照实施例对一种包裹BODIPY的新型聚合物纳米粒子标记荧光免疫分析法测定叶酸功能化二氧化硅(SiO2-FO)靶向纳米药物载体的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种检测叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a、SiO2-FO包被抗原和免疫原的制备；
b、抗SiO2-FO多克隆抗体的制备；
c、BODIPY-PFNPs的制备；
d、BODIPY-PFNPs与抗SiO2-FO抗体的交联；
e、以SiO2-FO-OVA为包被抗原，以BODIPY-PFNPs标记的抗SiO2-FO抗体作为一抗，建立直接竞争荧光免疫分析法定量检测SiO2-FO；以SiO2-FO标准品浓度的对数为横坐标，荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线，从而定量检测出SiO2-FO的浓度；
所述步骤c采用沉淀聚合法合成BODIPY-PFNPs，具体包括以下步骤：
c-1、将氟化硼二吡咯BODIPY荧光染料与丙烯酰胺AM溶于乙腈中，充分混匀；
c-2、加入交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯EDGMA，超声混匀；
c-3、再加入引发剂偶氮二异丁腈AIBN，磁力搅拌混匀；
c-4、通氮气，然后密封，置于油浴锅中，50～65℃条件下恒温聚合；
c-5、聚合完成后，离心分离，先用无水甲醇清洗2次，再用乙腈洗至上清液无荧光，冷冻干燥即得包裹BODIPY的新型聚合物纳米粒子(BODIPY-PFNPs)，4℃保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c具体包括以下步骤：
c-1、将0.05～0.1mmol氟化硼二吡咯BODIPY荧光染料与0.5～1.0mmol丙烯酰胺AM溶于30～50mL乙腈中，充分混匀；
c-2、加入1.0～1.5mmol交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯EDGMA，超声混匀10～20min；
c-3、再加入3～10mg引发剂偶氮二异丁腈AIBN，磁力搅拌混匀；
c-4、通氮气8～15min，密封，置于油浴锅中，50～65℃条件下恒温聚合24h；
c-5、聚合完成后，离心分离，先用无水甲醇清洗2次，再用乙腈洗至上清液无荧光，冷冻干燥即得包裹BODIPY的新型聚合物纳米粒子(BODIPY-PFNPs)，4℃保存。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中BODIPY、AM、EDGMA三者之间的物质的量之比1:16:24。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d采用碳二亚胺法将BODIPY-PFNPs与抗SiO2-FO抗体进行交联，包括以下步骤：
d-1、将步骤c制备的BODIPY-PFNPs洗涤后，分散在PBS缓冲液中；
d-2、将EDAC和NHS溶于水中，混合后加入到步骤d-1制备的BODIPY-PFNPs溶液中，搅拌反应；
d-3、将反应液离心分离，洗涤沉淀，然后重新分散在PBS溶液中；
d-4、用PBS将抗SiO2-FO多克隆抗体稀释，取该抗体溶液加入到步骤d-3制备的BODIPY-PFNPs溶液中，搅拌反应；
d-5、反应结束后，离心分离，洗涤沉淀，然后分散于PBS缓冲液中即为BODIPY-PFNPs标记的抗SiO2-FO抗体，4℃保存。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述步骤d具体包括以下步骤：
d-1、将2～10mg BODIPY-PFNPs用PBS洗涤3次，并分散在1～2mL PBS缓冲液中；
d-2、将5～15mg EDAC和0.5～1.5mg NHS溶于1～2mL水中，混合后加入到步骤d-1所得的溶液中，25～30℃搅拌反应10～20min；
d-3、将反应液离心分离，沉淀用PBS洗涤2次，并分散在1～2mL PBS溶液中；
d-4、用PBS将抗SiO2-FO抗体稀释成2mg/mL，取1～2mL该抗体溶液加入到步骤d-3制备的BODIPY-PFNPs溶液中，25～30℃搅拌反应3～5h；
d-5、离心分离，沉淀用PBS洗涤2次，然后分散于1～2mL PBS缓冲液中即为BODIPY-PFNPs标记的抗SiO2-FO抗体，4℃保存。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤e具体包括以下步骤：
e-1、包被：用包被缓冲液将SiO2-FO-OVA包被抗原稀释200倍，包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃冰箱过夜；
e-2、封闭：甩干，PBST溶液洗涤3次，每次3～5min，洗去多余的SiO2-FO-OVA包被抗原,加入1.5wt％酪蛋白进行封闭，每孔200μL，37℃烘箱温育1～2h；
e-3、加样竞争：甩干，PBST溶液洗涤3次，每次3～5min，洗去多余的封闭液,然后将50μL不同浓度的SiO2-FO标准品溶液和50μL一定浓度的BODIPY-PFNPs标记的抗SiO2-FO抗体溶液分梯度加入各孔中，使之发生竞争反应，37℃烘箱温育3～5h；
e-4、检测：甩干，PBST溶液洗涤3次，每次3～5min，除去游离态的SiO2-FO标准品或抗体结合物,用多功能酶标仪测定各孔在激发波长为485nm，发射波长为528nm处的荧光强度值；以SiO2-FO标准品浓度的对数为横坐标，荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线，从而定量检测出SiO2-FO的浓度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤e-4所述标准曲线的线性方程为A＝38918-3593logC，其中A为荧光强度值，C为SiO2-FO浓度，其相关系数R＝-0.998，线性范围为10-3-102ng/mL，检出限为0.43pg/mL。
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